CN111072781A - 能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv - Google Patents

能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv Download PDF

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Abstract

本发明涉及医疗领域，尤其涉及能够治疗肾脏间质纤维化的DR‑scFv。小鼠的免疫；ScFv 基因的构建及扩增；噬菌体抗体库的筛选及富集；ELISA 检测；DR‑scFv基因序列鉴定。采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：本项研究引入了分子质量小，免疫原性弱，容易进入组织，易大批量制备，不易引起超敏反应和排斥反应的DR‑scFv。

Description

能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv
技术领域
本发明涉及医疗领域，尤其涉及能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv。
背景技术
1 缺血再灌注损伤与肾脏间质纤维化
严重的急性肾损伤(AKI)可以影响移植物结局。轻微的AKI，肾脏可以自我修复。然而，当损伤更严重或存在肾脏异常，修复过程会导致纤维化，可促进慢性肾脏疾病进展。受伤上皮细胞的上皮细胞间质转型(Epithelial -to-mesenchymal transition, EMT)在间质纤维化（IF）的发展过程中起着重要作用。在这个过程中，管状上皮细胞逐渐失去上皮细胞特征，并获得间充质细胞的特性。缺氧和几个信号通路参与EMT的过程。在众多的影响因素以不同的方式调节EMT的进程中，转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）是最有效的诱导物，它能够启动和完成整个EMT过程，而肝细胞生长因子（Hepatocytegrowth factor,HGF）和骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7）充当EMT抑制剂。在AKI之后其他促进肾脏纤维化的因素包括肾脏损伤蛋白-1（Kidney injury molecule-1,KIM-1），AKI后瞬时表达的上皮磷脂酰丝氨酸受体（Epithelial phosphatidylserinereceptor, EPSR），肾脏上皮细胞内调节细胞凋亡、增殖和炎症反应的肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor, TNF），都是促纤维基因因子（Profibrogenetic factors）的产生因素。
与单纯DGF相比，普遍认为DGF结合急性排斥反应的移植物长期存活效果较差。除了上述的原因，值得注意的是内皮细胞是DGF和排斥反应最容易损伤的目标。内皮细胞对任何类型损伤的反应都包括对血管壁的重塑。这个过程包括细胞生长、死亡、迁移和降解或产生细胞基质。这些变化最终导致内膜层平滑肌纤维细胞和相关的细胞外基质的积累，内侧平滑肌细胞变性，外膜纤维化和血管腔流速受阻。
2. 钠钾ATP酶DR区特异性单链抗体为治疗肾脏间质纤维化发生提供新的思路；
单链抗体(single chain Fv,scFv)是小分子抗体中的一种，也是目前研究最活跃的基因工程抗体之一。ScFv是由抗体重链Ｖ区与轻链Ｖ区间通过人工合成的连接肽（Linker）连接而成的抗体，其相对分子质量约为2.5kDa，仅为完整抗体的1/6。完整抗体的相对分子质量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。相对于完整抗体，单链抗体具有如下优点： 1）相对分子质量小，易通过血管壁进入组织发挥作用；2）免疫原性弱，不易引起超敏反应和 排斥反应；3）无Ｆｃ段，不与非靶细胞的Ｆｃ受体结合，非特异性少；4）易于构建和表达，大批 量制备。
发明内容
发明的目的：为了提供一种效果更好的能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。
为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：
能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv，其特征在于，其采用如下方法制备而成，小鼠的免疫：将人工合成的KLH耦合的DR区多肽100μg加等体积弗氏完全佐剂（Freunds completeadjuvant,FCA），充分混匀成乳剂（200μl），碘酒、酒精消毒，分别于8周龄BALB/c雌鼠背部靠后左右四个部位皮下注射免疫；随后加强免疫为50μg的KLH耦合的DR区多肽免疫加等体积弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant,FIA），充分混匀，间隔一周加强免疫2次，免疫部位同上；用ELISA法检测抗体效价；
ScFv 基因的构建及扩增：脾总RNA的提取，第3次免疫后的第5天,选效价最高的3只小鼠提取脾脏组织混合，并抽提细胞总RNA；RNA的提取按试剂盒操作；ScFv 基因的构建及扩增按BALB/c鼠scFv构建试剂盒操作；扩增时在scFv 基因的5’端引入 SfiⅠ位点，3’端引入NotⅠ位点；ScFv 基因和pCANTAB/5E 噬菌体载体分别经SfiⅠ、NotⅠ酶切后，经T4 DNA 连接酶连接，CaCl2 法转化入TG1，转化产物铺于SOB琼脂平板，30 ℃过夜至长出克隆；
噬菌体抗体库的筛选及富集：2×YT 洗SOB琼脂板上的转化克隆，稀释，37 ℃摇培1小时，加入M13K07(4×1010 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2%)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜；经过如此4 轮吸附、2洗脱、2富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量；
ELISA 检测：随机挑取SOB琼脂板上的90个克隆进行ELISA检测，阳性克隆进行重复验证；
DR-scFv基因序列鉴定：提取阳性克隆DNA，用pCANTAB 5E 噬菌体载体特异性引物pCANTAB5-S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’) 和 pCANTAB5-S6 (5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行测序分析；利用BLAST对比寻找同源序列核酸蛋白。
2.DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）在制备治疗肾脏间质纤维化的药物中的用途。
3.一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）的对肾脏纤维化影响的判定模型，其特征在于，包含如下步骤，
(1)大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型的建立
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型；
(2) 实验分组
实验分为3组，每小组10只大鼠；
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）。术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎。每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦。实验结束后，大鼠在笼中以4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死；
(3) 观察指标于手术后6周，12周，24周分批留取标本；
间质纤维化进展监测：移植后6周，12周，24周取各组肾脏组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm厚的切片，进行HE、Masson染色，光镜下观察病理改变，计算阳性面积，参照Banff标准，进行间质纤维化严重程度评分。
一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）对应的抗体重链核酸序列：
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGGCTATGGCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTATAAGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATTCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGAACCTATAGGTACGACGGGTTTGGTCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）对应的抗体重链氨基酸序列为：
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGLSWVRQTPEKRLEWVASIISGGITYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCTRTYRYDGFGHWGQGTLVTVSA。
一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）对应的抗体轻链核酸序列：
GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGTATCTCTAGGGGAGAAGGTCACCGTGAACTGCAGGGCCAGCTCGAGTGTTAATTACATGTACTGGTACCAACAGAAGTCAGATGCCTCCCCCAAACTTTGGATTTCTTTCACATCCAACCTGGCTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAACTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCGTGGAGGGTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTTTACTAGTTCCCCATCCATCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAGCTGAAACGG。
一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）对应的抗体轻链氨基酸序列：
DIQLTQSPAIMSVSLGEKVTVNCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWISFTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSVEGEDAATYYCQQFTSSPSITFGSGTKLELKR。
采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：本项研究引入了分子质量小，免疫原性弱，容易进入组织，易大批量制备，不易引起超敏反应和排斥反应的DR-scFv。
附图说明：
图1.抗体基因双链DNA扩增图；
图2. 单链抗体纯化SDS-PAGE分析，其中Line 1:单链抗体对照；Line 2：Marker；Line3：单链抗体scfv-DR；
图3. DR-scFv对HK2细胞的保护作用；
图4为Masson's染色，DR-scFv降低肾脏脏纤维化模型大鼠肾脏纤维化面积。即肾脏组织细胞纤维化程度对比；
图5为图4的柱状图。
具体实施方式
本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。
术语解释：
ScFv： 单链抗体 ELISA：酶联免疫吸附剂测定 PCR：聚合酶联反应 KLH：血蓝蛋白FCA：弗氏完全佐剂 FIA：弗氏不完全佐剂 M13K07： 噬菌体抗体库 pCANTAB 5E： 噬菌体载体 HE：苏木精 - 伊红染色法 Masson：Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。HK-2：肾小管上皮细胞系 EMT：上皮细胞间质转型 IF：间质纤维化 SfiⅠ、NotⅠ：核酸内切酶位点 H2O2：过氧化氢 BALB/c：小鼠品系 TGF-β1、IL-1、PDGF、CTGF、MMP-2、EGF、HGF：上皮细胞间质转型和纤维化相关因子 PI3K/Akt，PKC ε及ERK，TGF-β1，HGF，BMP-7，TGF-β1/Smad、PI3K/Akt、MAPK:上皮细胞间质转型和间质纤维化相关的信号通路蛋白。
2.1.1 DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）对人近曲小管上皮细胞株（HK-2）的保护作用
(1) DR-scFv的制备: 利用噬菌体展示技术建立及筛选DR-scFv；
(2) DR-scFv生物学特性的检测；
(3) 体外模拟缺血再灌注条件检测DR-scFv 对HK-2缺血再灌注损伤的保护作用；
(4) DR-scFv 对HK-2缺血再灌注损伤保护作用的机制。
2.1.2 DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤的影响
(1) 建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型
(2) 检测DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用
(3) DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究
2.1.3 DR-scFv对移植肾脏间质纤维化的影响
(1) 建立大鼠肾脏慢性损伤间质纤维化模型
(2) 研究DR-scFv对肾脏间质纤维化的影响
(3) DR-scFv影响肾脏间质纤维化的作用机制
有益效果（与已有技术比较后的）
在前期研究工组中，我们已经证实了钠钾ATP酶DR区特异性抗体（DRSAb）通过激活PI3K/Akt，PKC ε及ERK等蛋白激酶在肾缺血再灌注损伤中的保护作用。本项研究引入了分子质量小，免疫原性弱，容易进入组织，易大批量制备，不易引起超敏反应和排斥反应的DR-scFv，并且将对DR-scFv通过对IRI的保护，调节TLRs表达，DC功能，补体水平及细胞间质转型（EMT）相关信号通路蛋白（TGF-β1，HGF，BMP-7）进行深入细致的研究。本研究的完成在DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤，及间质纤维化的预防作用机制及产生创新性的研究成果。
1 .DR-scFV的制备及生物学特性检测
(1) DR-scFv的制备
小鼠的免疫：将人工合成的KLH耦合的DR区多肽100μg加等体积弗氏完全佐剂（Freundscomplete adjuvant,FCA），充分混匀成乳剂（200μl），常规碘酒、酒精消毒，分别于8周龄BALB/c雌鼠背部靠后左右四个部位皮下注射免疫。随后加强免疫为50μg的KLH耦合的DR区多肽免疫加等体积弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant,FIA），充分混匀，间隔一周加强免疫2次，免疫部位同上。用ELISA法检测抗体效价。
ScFv 基因的构建及扩增：脾总RNA的提取，第3次免疫后的第5天,选效价最高的3只小鼠提取脾脏组织混合，并抽提细胞总RNA。RNA的提取按试剂盒操作。ScFv 基因的构建及扩增按BALB/c鼠scFv构建试剂盒操作。扩增时在scFv 基因的5’端引入 SfiⅠ位点，3’端引入NotⅠ位点。ScFv 基因和pCANTAB/5E 噬菌体载体分别经SfiⅠ、NotⅠ酶切后，经T4 DNA连接酶连接，CaCl2 法转化入TG1，转化产物铺于SOB琼脂平板，30 ℃过夜至长出克隆。
噬菌体抗体库的筛选及富集：2×YT 洗SOB琼脂板上的转化克隆，适量稀释，37 ℃摇培1小时，加入M13K07(4×1010 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2 %)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜。经过如此4 轮吸附、2次洗脱、2次富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量。
ELISA 检测：随机挑取SOB琼脂板上的90个克隆进行ELISA检测，阳性克隆进行重复验证。
DR-scFv基因序列鉴定：提取阳性克隆DNA，用pCANTAB 5E 噬菌体载体特异性引物pCANTAB5-S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’) 和 pCANTAB5-S6 (5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行测序分析。利用BLAST对比寻找同源序列核酸蛋白。DR-scFv基因序列上报NCBI GeneBank。
DR-scFv的表达与纯化：将DR-scFv基因序列重新克隆至pET-15b原核表达载体，采用BL21宿主菌进行表达，Ni-NTA-His柱对DR-scFv进行纯化。紫外分光光度法测定纯化抗体的蛋白含量，10% SDS-PAGE分析纯化抗体分子量及纯度。
(2) DR-scFv生物学特性检测：
ELISA:以人工合成的DR区多肽包被酶标板，封闭后加入对比稀释的纯化抗体，室温孵育2小时后充分洗涤，加入anti-His酶标抗体，如上孵育洗涤，加底物显色（对照scFv为阴性对照）。
Western blot法：以纯化的钠钾ATP酶为抗原蛋白，检测所制备抗体是否可以结合钠钾ATP酶（抗鼠钠钾ATP酶a1亚单位抗体为阳性对照）。
免疫荧光组织化学：HK-2细胞爬片培养24小时，10%牛血清白蛋白封闭，滴加纯化抗体4℃孵育过夜，洗涤后滴加Alexa Fluor 568标记的anti-His抗体，封片后荧光显微镜观察。
钠钾ATP酶活性试验：将纯化的大鼠，小鼠及人体组织细胞的钠钾ATP酶(10 µg/ml)与不同浓度的DR-scFv混合，37°C 孵育60分钟，然后加入Mg-ATP (3mM)诱导活化反应，37°C 孵育30分钟后，终止反应后，酶标仪测定OD700光密度值，确定抗体最佳有效浓度。
2.大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型的建立
(1)大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型的建立
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型。
(2) 实验分组
实验分为3组，每小组10只大鼠；
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）。术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎。每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦。实验结束后，大鼠在笼中以4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死。
(3) 观察指标于手术后6周，12周，24周分批留取标本。
1)间质纤维化进展监测：移植后6周，12周，24周取各组肾脏组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm厚的切片，进行HE、Masson染色，光镜下观察病理改变，计算阳性面积，参照Banff标准，进行间质纤维化严重程度评分。
2)各组血清及移植肾组织EMT和IF相关细胞因子mRNA水平的检测：Luminex技术检测血清中相关因子水平；RT-PCR法测定肾组织内相关因子水平；包括TGF-β1、IL-1、PDGF、CTGF、MMP-2、EGF、HGF等。
3)各组移植肾组织EMT和IF相关信号通路检测：Western Blot技术检测TGF-β1/Smad、PI3K/Akt、MAPK等信号通路及Akt、JNK、ERK等相关蛋白活性改变。
4)统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学意义。
体外试验结果表明（图3）， H2O2处理（300μM,3h）的HK-2细胞，在没有DR-scFv的情况下，近60%的细胞死亡，而1µm DR-scFv可以保护HK-2细胞，耐受H2O2的缺氧处理。进一步，我们采用肾脏纤维化模型对DR-scFv的作用进行在体试验。图4结果表明，1µm DR-scFv处理的治疗组，肾脏组织纤维化面积显著低于未处理的对照组。以上结果表明：本专利所制备的单链抗体（DR-scFv）在防止肾脏纤维化中效果明显，具有突出的数据支持。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
序列表
<110> 西安交通大学第一附属医院
<120> 能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr
20 25 30
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys
100 105 110
Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys
130 135 140
Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala Ala Gly Thr Gly
145 150 155 160
Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala
165 170 175
Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly
180 185 190
Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr
195 200 205
Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Gly
210 215 220
Gly Ala Ala Cys Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly
225 230 235 240
Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala
245 250 255
Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys
260 265 270
Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala
275 280 285
Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Gly Gly Thr Ala Cys Gly
290 295 300
Ala Cys Gly Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly
325 330 335
Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala
340 345 350
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(amino acid)
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ile Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Thr Tyr Arg Tyr Asp Gly Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr
20 25 30
Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala
50 55 60
Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys
65 70 75 80
Gly Ala Gly Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Gly
85 90 95
Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys
115 120 125
Cys Ala Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr
130 135 140
Thr Thr Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly
145 150 155 160
Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys
165 170 175
Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr
180 185 190
Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Thr
195 200 205
Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly
210 215 220
Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Cys
260 265 270
Thr Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Thr Cys
275 280 285
Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala
290 295 300
Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala
305 310 315 320
Ala Cys Gly Gly
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(amino acid)
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Val Asn Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Ser
35 40 45
Phe Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Ser Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105

Claims (8)

1.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv，其特征在于，其采用如下方法制备而成，小鼠的免疫：将人工合成的KLH耦合的DR区多肽100μg加等体积弗氏完全佐剂（Freundscomplete adjuvant,FCA），充分混匀成乳剂（200μl），碘酒、酒精消毒，分别于8周龄BALB/c雌鼠背部靠后左右四个部位皮下注射免疫；随后加强免疫为50μg的KLH耦合的DR区多肽免疫加等体积弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant,FIA），充分混匀，间隔一周加强免疫2次，免疫部位同上；用ELISA法检测抗体效价；
ScFv 基因的构建及扩增：脾总RNA的提取，第3次免疫后的第5天,选效价最高的3只小鼠提取脾脏组织混合，并抽提细胞总RNA；RNA的提取按试剂盒操作；ScFv 基因的构建及扩增按BALB/c鼠scFv构建试剂盒操作；扩增时在scFv 基因的5’端引入 SfiⅠ位点，3’端引入NotⅠ位点；ScFv 基因和pCANTAB/5E 噬菌体载体分别经SfiⅠ、NotⅠ酶切后，经T4 DNA 连接酶连接，CaCl2 法转化入TG1，转化产物铺于SOB琼脂平板，30 ℃过夜至长出克隆；
噬菌体抗体库的筛选及富集：2×YT 洗SOB琼脂板上的转化克隆，稀释，37 ℃摇培1小时，加入M13K07(4×1010 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2%)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜；经过如此4 轮吸附、2洗脱、2富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量；
ELISA 检测：随机挑取SOB琼脂板上的90个克隆进行ELISA检测，阳性克隆进行重复验证；
DR-scFv基因序列鉴定：提取阳性克隆DNA，用pCANTAB 5E 噬菌体载体特异性引物pCANTAB5-S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’) 和 pCANTAB5-S6 (5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行测序分析；利用BLAST对比寻找同源序列核酸蛋白。
2.DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）在制备治疗肾脏间质纤维化的药物中的用途。
3.一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）的对肾脏纤维化影响的判定模型，其特征在于，包含如下步骤，
(1)大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型的建立
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型；
(2) 实验分组
实验分为3组，每小组10只大鼠；
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）；
术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎；
每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦；
实验结束后，大鼠在笼中以4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死；
(3) 观察指标于手术后6周，12周，24周分批留取标本；
间质纤维化进展监测：移植后6周，12周，24周取各组肾脏组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm厚的切片，进行HE、Masson染色，光镜下观察病理改变，计算阳性面积，参照Banff标准，进行间质纤维化严重程度评分。
4.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体重链核酸序列，其特征为：序列为
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGGCTATGGCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTATAAGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATTCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGAACCTATAGGTACGACGGGTTTGGTCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
5.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体重链氨基酸序列为，其特征为：序列为
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGLSWVRQTPEKRLEWVASIISGGITYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCTRTYRYDGFGHWGQGTLVTVSA。
6.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体轻链核酸序列，其特征为：序列为
GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGTATCTCTAGGGGAGAAGGTCACCGTGAACTGCAGGGCCAGCTCGAGTGTTAATTACATGTACTGGTACCAACAGAAGTCAGATGCCTCCCCCAAACTTTGGATTTCTTTCACATCCAACCTGGCTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAACTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCGTGGAGGGTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTTTACTAGTTCCCCATCCATCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAGCTGAAACGG。
7.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体轻链氨基酸序列，其特征为：序列为
DIQLTQSPAIMSVSLGEKVTVNCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWISFTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSVEGEDAATYYCQQFTSSPSITFGSGTKLELKR。
8.权利要求4-7任意一项或者多项的序列在制备防止肾脏纤维化的药物中的用途。
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