CN111068798A - 微孔膜截留集聚微球的微流控芯片及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其内部设有容积不超过100微升的第一溶液反应区，第一溶液反应区的某个端面偏中心位置设置了唯一的面积小于10平方毫米的溶液出口，所述溶液出口贴合覆盖有孔径基本均匀且孔径大于20nm的微孔膜，溶液只能穿越微孔膜流出。本发明还公开了所述微流控芯片的检测方法，当样品溶液并充满第一溶液反应区后，捕获试剂、标记试剂、待测样品在样品溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物。本发明的微流控芯片，其有意效果是：检测时溶液受到压力时它从检测区溶液出口流出，游离的标记试剂流出微孔膜，所述微孔膜截留住表面形成的反应复合物的微球，形成聚集浓缩效果。

Description

微孔膜截留集聚微球的微流控芯片及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学诊断领域的免疫检测技术，具体地说，是关于一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片及其检测方法。
背景技术
免疫分析技术是其利用抗原与抗体之间高特异性产生的识别和结合反应实现生物分子的检测，具备灵敏度高、特异性强、适用面广、所需设备简单、线性范围较宽等优点，已成为当今最具竞争力和挑战性的分析测试技术之一，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。免疫标记分析技术主要包括：放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记等方法。用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)是美国科学Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应，改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。
以荧光标记的荧光免疫分析(fluorescein immunoassay,FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高，但荧光素常会产生生物学毒性,导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降。
酶标记分析技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall Van Weemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。
发光标记分析是20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。狭义的发光免疫分析LIA主要是指化学发光免疫分析CLIA，另外还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析ECLIA。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的，该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。其基本原理同酶标记分析法,是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定。
目前免疫分析技术主要采用以微孔板为实验平台的非均相分析模式，需要包埋、洗脱、分离等多步操作，分析过程繁琐，分析时间长，不能满足快速检测和诊断的要求。生物反应中通过微孔膜进行不同分子量的蛋白及微粒微球的穿越，是一个很常用的技术手段，尤其是在蛋白纯化中常用的离心滤管。但离心滤管一般是溶液手动加入，离心后添加复溶液将穿越的蛋白溶解回收。
国内专利文献CN201310228708.8公开了一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法：将标记蛋白的包被微球放入深孔滤板，与标记试剂进行静态的混合孵育反应，随后通过离心力作用将样品溶液及洗涤溶液从滤板的滤膜流尽，标记试剂等小分子或小粒径的物质随溶液流出了深孔滤板，包被微球则在穿越底部滤膜时被部分截留，随后通过光学对膜表面进行检测得到相关检测信号的实验。这个方法的意义在于免疫反应试剂在均相环境中进行了静态孵育，可以降低对免疫抗体抗原的亲和力要求；同时孵育反应后溶液中承载着反应复合物的包被微球被集聚到滤膜中，起到了良好的反应物质浓缩作用。但是，该专利文献中的包被微球的粒径与滤膜的孔径的关系没有明确界定，微球将渗入滤膜一定深度，这将导致部分微球穿越滤膜，从而导致检测结果不准确。同时，也将导致滤膜不同深度的微球反射的光谱信号的差异。
近年来微流控芯片技术迅速普及，它是一种全新的微量分析技术，可以实现从样品处理到检测的微型化、自动化、集成化及便携化，因此它可以在食品安全检测方面展现出强大的发展活力，提供了一种崭新的技术工具和平台。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构，如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA杂交反应的微型反应器、免疫学检测反应等。无论在传统的ELISA方法，还是新兴的化学发光方法中，绝大部分的免疫检测方法中都需要多种溶液的添加混合反应，因此也就需要多步操作。如何在微流控芯片中尽量减少溶液的种类，并且能让微流控免疫芯片能更自动地运行，减少人员的手动操作，是目前重要的发展方向。在溶液种类少，手动介入步骤也少的目标指导下设计出合适的微流控免疫芯片，同时还能借助微孔膜穿越的作用，将相关免疫学信号更好地检测到，也是具有相当挑战的方向。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片；以解决现有的微流控芯片操作复杂的问题。本发明的第二个目的是提供一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，所述微流控芯片的内部设有容积不超过100微升的第一溶液反应区，第一溶液反应区的某个端面设置了信号检测区，所述信号检测区偏中心位置设置了唯一的面积小于10平方毫米的溶液出口，所述溶液出口贴合覆盖有孔径基本均匀且孔径大于20nm的微孔膜，溶液只能穿越微孔膜流出；第一溶液反应区还设置有溶液入口。
根据本发明，微流控芯片内设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中具有互为直接或间接的配位体关系的物质。
根据本发明，包被微球及标记试剂的物理尺寸匹配关系为：当包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在微孔膜表面形成堆积时，游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从微孔膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
进一步的，包被微球具备水溶液溶解悬浮特征，选自聚苯乙烯微球、磁微球、硅微球及其他纳米材料为核心而表面被亲水修饰的微球中的一种或几种。
进一步的，所述标记试剂包括可呈现光谱信号的荧光物质或颜色微粒，所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、以及荧光蛋白等中的一种或几种。
根据本发明，微孔膜截留集聚微球的微流控芯片还包括对微孔膜表面截留的反应复合物中的标记试剂的至少一个波长的光谱信号进行光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在微球表面的标记试剂的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
根据本发明，所述第一溶液反应区设有第一排气口，所述第一排气口设于所述第一溶液反应区流入的溶液最后充满该第一溶液反应区的位置，所述溶液出口设置于所述第一溶液反应区的中心底部，所述溶液入口设于所述第一溶液反应区的边缘区域；其中，所述第一溶液反应区内设有所述微孔膜，微孔膜紧贴于所述第一溶液反应区的中心底部且将所述溶液出口与所述第一溶液反应区分隔开。
根据本发明，所述第一溶液反应区的溶液入口至少为两个，溶液从不同的溶液入口流入第一溶液反应区时，对第一溶液反应区底部或顶部的微孔膜表面达到了均匀冲刷的结果。
根据本发明，微流控芯片还包括第二溶液反应区、第二出液口和第二进液口，溶液自所述第二进液口充满所述第二溶液反应区，并从所述第二出液口排出再流向第一溶液反应区，所述第二出液口处设置有控制区，能够调控第二溶液反应区的溶液流出后进入第一溶液反应区的时间；同时，当第二溶液反应区内进入溶液后，控制区打开，溶液才能从第二出液口流出。
根据本发明，微流控芯片还设置了定容点和溢流区；所述定容点设置在第二溶液反应区内流入溶液最后充满的附近位置，进入第二溶液反应区的溶液量超过第二溶液反应区的溶液量后，多余溶液将从定容点流向溢流区。
根据本发明，所述捕获试剂、标记试剂固化在所述第二溶液反应区内或者捕获试剂和标记试剂中的至少一种固化在第二溶液反应区的上游，所述记捕获试剂、标记试剂至少一个从第二溶液反应区的第二进液口流入。
作为本发明的第二个方面，一种上述所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片的检测方法，所述第一溶液反应区的溶液入口流入样品溶液并充满第一溶液反应区后，捕获试剂、标记试剂、待测样品在样品溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物；当样品溶液受到驱动从溶液出口穿越微孔膜后，另有洗涤溶液从溶液入口流入第一溶液反应区，持续穿越微孔膜并对集聚在微孔膜表面的微球进行洗涤，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，避免游离标记试剂被阻截残留在微孔膜表面。
本发明的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其有益效果是：
1、采用孔径均匀的微孔膜和直径均匀且大于微孔膜孔径的捕获微球，离心-洗涤操作对反应复合物的分离效果好，因此其检测效果好；而且所述水溶性微球表面的反应更接近于液相，有利于蛋白保持天然构象，有利于特异性结合反应；
2、在反应区以及反应区上游区域预固化定量和适量的捕获微球和标记试剂，只需要加两种液体：待测样品和洗涤液，其操作简便；
3、在反应体系中加入带有捕获试剂的微球和标记试剂的操作被简化：捕获试剂和标记试剂固化在微流控芯片的不同区域，待测样品溶液流经上述试剂固化的区域时，上述试剂即溶解；捕获试剂与目标分子结合并且标记试剂参与反应。在一定时间的静态孵育反应后，可以在捕获微球表面形成免疫反应复合物。
4、微孔膜贴在出液端并截留住表面形成的反应复合物的微球，可形成聚集浓缩效果；这种微孔膜截留微球的微流控芯片可实现两种溶液两步操作的快速反应方法，将免疫反应的步骤简化为抗体抗原的静态孵育，随后洗涤液对反应区域进行洗涤后就能进行信号检测；同时静态孵育免疫反应中形成免疫反应微球复合物到达滤膜截留区域时，直径小于滤膜孔径的标记试剂能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物却被截留下来并浓缩集聚栽滤膜表面，因此该发明能大大提高免疫反应的效率及灵敏度。
附图说明
图1为微流控芯片的第一溶液反应区的俯视图示意图。
图2为微流控芯片的第一溶液反应区的左视图示意图。
图3为微流控芯片的第一溶液反应区的主视图示意图。
图4为微流控芯片的第二溶液反应区与第一溶液反应区相连接的结构示意图。
图5为实施例3的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
如图1所示，为本发明的一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，所述微流控芯片的内部设有容积不超过100微升的第一溶液反应区200，第一溶液反应区200的底面的中心位置设置了单一的面积小于10平方毫米的溶液出口202，所述溶液出口202被孔径基本均匀且孔径为0.1um的硝酸纤维素类滤膜(即微孔膜1)贴合覆盖，溶液只能穿越该硝酸纤维素类滤膜流出；第一溶液反应区还设置有溶液入口203。
微流控芯片的流道内还添加至少一种直径基本均匀且大于滤膜孔径的包被微球(粒径为800nm)、固定于包被微球表面的配位体如某蛋白的单抗A、以及直径小于微孔膜孔径的量子点微粒(直径20nm)标记的乙肝表面抗原蛋白的单抗B；当该蛋白的样品溶液加入该微流控芯片时，包被微球、单抗A、标记量子点微粒的单抗B一起进入第一溶液反应区进行混合孵育反应。当溶液受到驱动力时将穿越滤膜从出口流出，直径小于滤膜孔径的量子点微粒标记的单抗B能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及单抗A、抗体免疫反应复合物(包被微球及量子点微粒)却被截留下来并浓缩集聚在滤膜表面。
本实施例的包被微球及量子点微粒的粒径差异关系：游离包被微球及反应复合物微球在滤膜表面形成堆积时，游离的量子点微粒能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带从堆积的微球间隙中穿越后再次穿越滤膜流出，不会形成阻截残留，因此滤膜表面截留的量子点微粒属于反应复合物，当荧光被激发时，荧光强度与该蛋白的含量存在特定的对应关系。
包被微球具备水溶液溶解悬浮特征，选自聚苯乙烯微球、磁微球、硅微球及其他纳米材料为核心而表面被亲水修饰的微球中的一种或几种。
所述标记试剂包括可呈现光谱信号的荧光物质或颜色微粒，所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、以及荧光蛋白等中的一种或几种。
微孔膜截留集聚微球的微流控芯片还包括对微孔膜表面截留的反应复合物中的标记试剂的至少一个波长的光谱信号进行光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在微球表面的标记试剂的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
微孔膜截留集聚微球的微流控芯片还包括对微孔膜表面截留的反应复合物中标记试剂的光谱信号同时进行多重波长信号光学探测的检测设备。
如图2和图3所示，所述第一溶液反应区设有第一排气口201，所述第一排气口201设于所述第一溶液反应区200流入的溶液最后充满该第一溶液反应区的位置，所述溶液出口202设置于所述第一溶液反应区200的中心底部，所述溶液入口203设于所述第一溶液反应区200的底部边缘区域；其中，所述第一溶液反应区200内设有所述微孔膜1，微孔膜1紧贴于所述第一溶液反应区200的中心底部且将所述溶液出口202与所述第一溶液反应区200分隔开。
所述第一溶液反应区200的溶液入口203至少为两个，溶液从不同的溶液入口203流入第一溶液反应区200时，对第一溶液反应区200底部或顶部的微孔膜表面达到了均匀冲刷的结果。
如图2所示，为本发明的一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，所述微流控芯片还包括第二溶液反应区600及第二排气口601、第二出液口602和第二进液口603，所述第二排气口602设于所述第二溶液反应区600的溶液进入后最后才充满的位置，所述第二出液口602处设置有控制区800，能够调控第二溶液反应区600的溶液流出后进入第一溶液反应区200的时间；同时，当第二溶液反应区600内进入溶液后，控制区800打开，溶液才能从第二出液口602流出。
微流控芯片还设置了定容点604和溢流区1000；所述定容点604设置在第二溶液反应区内流入溶液最后充满的附近位置，进入第二溶液反应区600的溶液量超过第二溶液反应区600的溶液量后，多余溶液将从定容点604流向溢流区1000。
所述捕获试剂、标记试剂固化在所述第二溶液反应区内或者捕获试剂和标记试剂中的至少一种固化在第二溶液反应区的上游，所述记捕获试剂、标记试剂至少一个从第二溶液反应区的第二进液口流入。
上述所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片的检测方法，所述第一溶液反应区200的溶液入口203流入样品溶液并充满第一溶液反应区200后，捕获试剂、标记试剂、待测样品在样品溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物；当样品溶液受到驱动从溶液出口穿越微孔膜后，另有洗涤溶液从溶液入口流入第一溶液反应区，持续穿越微孔膜并对集聚在微孔膜表面的微球进行洗涤，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，避免游离标记试剂被阻截残留在微孔膜表面。
实施例1
如图1所示，在微流控芯片的第一溶液反应区200的某个端面设置了溶液出口202，该溶液出口202是溶液的唯一出口，所述溶液出口202贴合孔径基本均匀的微孔膜1，溶液只能穿越微孔膜1流出。
反应复合物中粒径大于微孔膜孔径的被微孔膜截留，且只有粒径大的组分被截留；捕获微球及其反应复合物被微孔膜截留，其它分子都能穿越微孔膜，即微孔膜截留的都含有捕获微球。
本实施例与微孔膜配套的是直径均匀且大于微孔膜孔径的水溶性微球C。水溶性微球C具备水溶液溶解悬浮特征，选自聚苯乙烯微球、磁微球、硅微球及其他纳米材料为核心而表面被亲水修饰的微球中的一种或几种。水溶性微球C与识别目标分子的蛋白(捕获试剂)共价偶联是非选择性，偶联之前微球表面要活化，之后要封闭。捕获微球不可以与蛋白非特异性结合。
本实施例做检测的信号来自反应复合物中的标记试剂。所述标记试剂的信号包括荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒。所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种。所述荧光物质选自荧光分子、量子点微球、上转换发光微球、时间分辨荧光微球、以及荧光蛋白等中的一种或几种。本实施例是用荧光微球作标记信号。微孔膜1上被截留的反应复合物受到特定波长的光线照射激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
检测多种目标分子时，选择若干种荧光物质与不同的目标分子的结构相配合的分子共价连接成为针对各种目标分子的标记试剂；相应的，对微孔膜表面集聚的反应复合物进行检测的设备可以同时进行多重波长信号光学探测。
实施例2在第二溶液反应区定容待测溶液和进行免疫(结合)反应
所述捕获试剂和标记试剂在溶液中与目标分子反应，它们可以被固化在第二溶液反应区或第二溶液反应区上游的区域。免疫竞争法试剂的实验表明在10ul及以下的反应体系中，捕获微球优选的的方式是，不要和标记试剂放在一个位置中。
如图2所示，所述第二溶液反应区600设有第二排气口601、第二出液口602和第二进液口603以及定容点604，所述第二排气口601设于第二溶液反应区600朝向芯片旋转离心中心点的顶部，所述第二进液口603、定容点604设于朝向芯片旋转离心中心点，其中所述第二进液口603在芯片表面，所述定容点604在由溶液体积确定的位置；所述第二出液口602置于第二溶液反应区600的远离旋转离心中心。
所述第二溶液反应区的第二出液口602设有水化膜，所述水化膜为遇水后逐渐溶解的膜状物质，在第二溶液反应区600内有液体之后须要经过一段时间浸润并且在远高于重力的离心力作用下，溶液才能从第二出液口602流出。
第二溶液反应区600设有定容点604，定容点604连溢流区1000。如图2所示，定容点604设了一个阻止溶液从反应区600流向溢流区1000的“坝”，超出“坝”高的部分被溢流区1000容纳，定容点604限定了第二溶液反应区600的溶液体积。
如图4所示，所述第二排气口601设于所述第二溶液反应区600朝向芯片旋转离心中心点的顶部。第二排气口601的作用是容纳溶液中逸出的气体，减少小气泡对检测的影响。第二排气口601的位置比定容点604接近离心中心，溶液不会超出定容点604，因此不会进入第二排气口601。
实施例3
检测牛奶中黄曲霉毒素M1(AFM1)
捕获微球：偶联BSA-AFM1抗原的500nm SiO2微球
荧光标记试剂：偶联AFM1鼠单克隆抗体的300nm荧光微球
微孔膜：0.45um
芯片检测区的离心半径：3cm
900rpm、2500rpm、3000rpm时离心加速度分别是27.2g、209.6g、301.9g。
所需材料、设备：
酶标仪(KHB-360)；洗板机(BIO-TEK ELX50)；
微流控芯片离心系统(上海快灵)；荧光检测系统(上海快灵)；微流控芯片(含固化的捕获微球和荧光标记试剂)0.45um滤膜(已经处理后粘合在微流控盘片过滤池)；移液器及洗头(1ml、200ul、100ul、10ul、2.5ul eppendorf)；电子天平；pH计；离心机；超纯水系统；BSA；新生牛血清(杭州四季青)；
实验过程：
1)样本准备：
牛奶、酸奶：准确吸取500μl牛奶、酸奶等样本于15ml离心管中，加入9.5ml 35％甲醇水；振荡混匀，5000rpm室温离心5min；取上清10μl用于分析。
取出微流控盘片，放置至室温，分别加入标准品和待测样本。
放入微流控芯片离心系统中，900rpm离心30s，样本进入反应池。
将微孔控芯片放置37℃孵育15min。
放入微流控芯片离心系统中，2500rpm离心30s，样本经过检测区微孔膜过滤。
取出微流控芯片，将50ul洗液加入洗液孔。
放入微流控芯片离心系统中，3000rpm离心30s。
放入荧光检测系统中读取荧光值。
说明：如上述实验过程，实际使用的微流控芯片一般会有不止一个反应池，还应有样品池以及溶液流道和控制区。一个盘架上可以安装6个微流控芯片。
3、数据对比：
原始数据
Figure BDA0001835685180000101
将标准品OD值与平均OD做曲线得到如图3的曲线方程：y＝-0.3795x+2.3899，R2＝0.9997。
根据公司计算得到样本浓度为(ppb)
经计算，样本1的浓度为0.00458ppb，样本2的浓度为0.013862ppb。
结论：采用本发明的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片进行免疫检测试验具有良好的线性，该微流控芯片的一致性好，准确性好。

Claims (12)

1.一种微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的内部设有容积不超过100微升的第一溶液反应区，第一溶液反应区的某个端面设置了信号检测区，所述信号检测区偏中心位置设置了唯一的面积小于10平方毫米的溶液出口，所述溶液出口贴合覆盖有孔径基本均匀且孔径大于20nm的微孔膜，溶液只能穿越微孔膜流出；第一溶液反应区还设置有溶液入口。
2.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，微流控芯片内设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中具有互为直接或间接的配位体关系的物质。
3.如权利要求2所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，包被微球及标记试剂的物理尺寸匹配关系为：当包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在微孔膜表面形成堆积时，游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从微孔膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
4.如权利要求2所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，包被微球具备水溶液溶解悬浮特征，选自聚苯乙烯微球、磁微球、硅微球及其他纳米材料为核心而表面被亲水修饰的微球中的一种或几种。
5.如权利要求2所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，所述标记试剂包括可呈现光谱信号的荧光物质或颜色微粒，所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、以及其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、以及荧光蛋白中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，还包括对微孔膜表面截留的反应复合物中的标记试剂的至少一个波长的光谱信号进行光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在微球表面的标记试剂的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。
7.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，所述第一溶液反应区设有第一排气口，所述第一排气口设于所述第一溶液反应区流入的溶液最后充满该第一溶液反应区的位置，所述溶液出口设置于所述第一溶液反应区的中心底部，所述溶液入口设于所述第一溶液反应区的边缘区域；其中，所述第一溶液反应区内设有所述微孔膜，微孔膜紧贴于所述第一溶液反应区的中心底部且将所述溶液出口与所述第一溶液反应区分隔开。
8.如权利要求7所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，所述第一溶液反应区的溶液入口至少为两个，溶液从不同的溶液入口流入第一溶液反应区时，对第一溶液反应区底部或顶部的微孔膜表面达到了均匀冲刷的结果。
9.如权利要求1所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，微流控芯片还包括第二溶液反应区、第二出液口和第二进液口，溶液自所述第二进液口充满所述第二溶液反应区，并从所述第二出液口排出再流向第一溶液反应区，所述第二出液口处设置有控制区，能够调控第二溶液反应区的溶液流出后进入第一溶液反应区的时间；同时，当第二溶液反应区内进入溶液后，控制区打开，溶液才能从第二出液口流出。
10.如权利要求9所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，微流控芯片还设置了定容点和溢流区；所述定容点设置在第二溶液反应区内流入溶液最后充满的附近位置，当进入第二溶液反应区的溶液量超过第二溶液反应区的溶液量后，多余溶液将从定容点流向溢流区。
11.如权利要求9所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片，其特征在于，所述捕获试剂、标记试剂固化在所述第二溶液反应区内或者捕获试剂和标记试剂中的至少一种固化在第二溶液反应区的上游，所述记捕获试剂、标记试剂至少一个从第二溶液反应区的第二进液口流入。
12.一种如权利要求2-6任一项所述的微孔膜截留集聚微球的微流控芯片的检测方法，其特征在于，所述第一溶液反应区的溶液入口流入样品溶液并充满第一溶液反应区后，捕获试剂、标记试剂、待测样品在样品溶液中发生结合反应，在包被微球表面形成配位体反应复合物；当样品溶液受到驱动从溶液出口穿越微孔膜后，另有洗涤溶液从溶液入口流入第一溶液反应区，持续穿越微孔膜并对集聚在微孔膜表面的微球进行洗涤，游离的标记试剂流出，形成配位体反应复合物的标记试剂及包被微球被微孔膜截留在表面，避免游离标记试剂被阻截残留在微孔膜表面。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111537708A (zh) * 2020-06-11 2020-08-14 烟台芥子生物技术有限公司 微流控检测结构及其应用
CN113769806A (zh) * 2021-10-21 2021-12-10 暨南大学 一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在c-反应蛋白检测中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050164404A1 (en) * 2001-12-12 2005-07-28 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. Diagnostic testing process
CN103018224A (zh) * 2012-12-14 2013-04-03 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法
CN106807461A (zh) * 2017-01-10 2017-06-09 北京华科泰生物技术有限公司 一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法
CN107044972A (zh) * 2017-05-25 2017-08-15 沈阳优宁生物科技有限公司 一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒及其制备和检测方法
CN107328744A (zh) * 2017-05-17 2017-11-07 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法
CN207851078U (zh) * 2017-12-27 2018-09-11 江苏奥雅生物科技有限公司 一种免疫微流控检测卡
CN210159631U (zh) * 2018-10-19 2020-03-20 上海快灵生物工程有限公司 微孔膜截留集聚微球的微流控芯片

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050164404A1 (en) * 2001-12-12 2005-07-28 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. Diagnostic testing process
CN103018224A (zh) * 2012-12-14 2013-04-03 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法
CN106807461A (zh) * 2017-01-10 2017-06-09 北京华科泰生物技术有限公司 一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法
CN107328744A (zh) * 2017-05-17 2017-11-07 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法
CN107044972A (zh) * 2017-05-25 2017-08-15 沈阳优宁生物科技有限公司 一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒及其制备和检测方法
CN207851078U (zh) * 2017-12-27 2018-09-11 江苏奥雅生物科技有限公司 一种免疫微流控检测卡
CN210159631U (zh) * 2018-10-19 2020-03-20 上海快灵生物工程有限公司 微孔膜截留集聚微球的微流控芯片

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111537708A (zh) * 2020-06-11 2020-08-14 烟台芥子生物技术有限公司 微流控检测结构及其应用
CN113769806A (zh) * 2021-10-21 2021-12-10 暨南大学 一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在c-反应蛋白检测中的应用
CN113769806B (zh) * 2021-10-21 2022-09-27 暨南大学 一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在c-反应蛋白检测中的应用

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