CN111067906B - 美普他酚的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，特别涉及美普他酚的应用。本发明通过实验表明，美普他酚可以通过升高Ahi1的水平达到抗抑郁的效果。本实验利用慢性应激构建抑郁模型小鼠，观察Ahi1蛋白的变化，结果显示：给予小鼠21天连续空间行为限制后，利用悬尾实验和强迫游泳实验检测到小鼠的抑郁样行为学改变。造模成功后，按照10mg/kg的剂量腹腔注射小鼠，对照组给予生理盐水(NS)，同时每天继续进行空间行为限制，给药时间为中午12点钟，连续给予两周。在利用悬尾实验和强迫游泳实验检测到小鼠的抑郁样行为学改变。之后利用Western Blot方法检测发现，抑郁模型小鼠海马Ahi1蛋白水平较给药组均显著下降。

Description

美普他酚的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及美普他酚的应用。
背景技术
抑郁症是躁狂抑郁症的一种发作形式，以情感低落、思维迟缓、以及言语动作减少，迟缓为典型症状。抑郁症严重困扰患者的生活和工作，给家庭和社会带来沉重的负担，约15％的抑郁症患者死于自杀。世界卫生组织、世界银行和哈佛大学的一项联合研究表明，抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大病。
抑郁发作往往有复发倾向。因此，治疗目的有二：控制急性发作和预防复发。抑郁发作往往有复发倾向。因此，治疗目的有二：控制急性发作和预防复发。1、药物选择：目前仍把TCAS作为治疗抑郁的一线药，第二代非典型抗抑郁药为第二线药，其次可考虑MAOIS。2、双相抑郁的治疗基本和单相抑郁一样，但双相病人用抗抑郁药可能转为轻躁狂，故常将抗抑郁药和锂盐合并应用。精神病性抑郁单用抗抑郁药效果可能不理想，往往需合并抗精神病药，如奋乃静、舒必利等。3、疗程和剂量：治疗的成功除正确诊断，合理选择药物外，疗程和剂量至关紧要。常见的错误在于对抑郁症的复发和自杀危险性认识不够，因此常常剂量低、疗程短、效果差。
美普他酚(Meptazinol)是一种强效镇痛剂，别名甲氮卓酚，消痛定等，分子式为C15H23NO，分子量233.35，分子结构如式Ⅰ所示。目前美普他酚的在临床上应用普遍是作为镇痛药，其在抑郁症中的作用未见报道。
Figure BDA0002364344610000011
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种美普他酚的应用。本发明通过实验表明，美普他酚可以通过升高Ahi1的水平达到抗抑郁的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了美普他酚在制备Ahi1蛋白表达促进剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备Ahi1蛋白表达促进剂中的应用中所述美普他酚的作用浓度为5～20mg/kg动物体重。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备Ahi1蛋白表达促进剂中的应用中所述美普他酚的作用浓度为2～8g/kg人体重。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备Ahi1蛋白表达促进剂中的应用中所述美普他酚的给药次数为每日一次，给药周期为连续给予两周。
本发明还提供了美普他酚在制备预防和/或治疗抑郁的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备预防和/或治疗抑郁的药物中的应用中所述美普他酚的有效剂量为5～20mg/kg动物体重。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备预防和/或治疗抑郁的药物中的应用中所述美普他酚的有效剂量为2～8g/kg人体重。
在本发明的一些具体实施方案中，美普他酚在制备预防和/或治疗抑郁的药物中的应用中所述美普他酚的给药次数为每日一次，给药周期为连续给予两周。
本发明通过实验表明，美普他酚可以通过升高Ahi1的水平达到抗抑郁的效果。本实验利用慢性应激构建抑郁模型小鼠，观察Ahi1蛋白的变化，结果显示：给予小鼠21天连续空间行为限制后，利用悬尾实验和强迫游泳实验检测到小鼠的抑郁样行为学改变(图1-A/B)。造模成功后，按照10mg/kg的剂量腹腔注射小鼠，对照组给予生理盐水(NS)，同时每天继续进行空间行为限制，给药时间为中午12点钟，连续给予两周。在利用悬尾实验和强迫游泳实验检测到小鼠的抑郁样行为学改变(图1-C/D)。之后利用Western Blot方法检测发现，抑郁模型小鼠海马Ahi1蛋白水平较给药组均显著下降(图3A、B)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1图1示给予美普他酚治疗后造模的ICR小鼠的抑郁样表型出现改善行为；其中，图1A和图1B表明ICR小鼠经过应激处理后出现了抑郁样表型；图1C和图1D是经过美普他酚治疗应激ICR小鼠2周后，ICR小鼠身上的抑郁样表型得到缓解；
图2示给予美普他酚治疗后的Ahi1 KO小鼠未起到抗抑郁作用；其中，图2A和图2B表明Ahi1 KO小鼠存在着抑郁样表型；图2C和图2D表明经过美普他酚的治疗后Ahi1 KO小鼠的抑郁样表型未得到改善，说明美普他酚是通过Ahi1来改善抑郁样表型；
图3示给予美普他酚治疗后Ahi1水平升高明显；其中，图3(A)示Western blot蛋白定量结果；图3(B)示蛋白定量统计结果。
具体实施方式
本发明公开了一种美普他酚的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
仪器与材料：
研究对象：
健康雄性ICR小鼠，年龄6-8周，体重在23-25克之间，清洁级，由上海史莱克实验动物中心提供。研究过程经苏州大学动物伦理委员会审核批准。
主要仪器与试剂：
主要试验仪器：
超声波破碎仪(VCX130PB，SONICS公司，美国)
高速冷冻离心机(5417R，Eppendorf公司，德国)
酶标仪(Multiskan MK3，Thermo Fisher公司，美国)
超低温冰箱(MDF-U53V，SANYO公司，日本)
制冰机(SIM-F140AY65，SANYO公司，日本)
海尔冰箱(BCD-206TS，青岛海尔股份有限公司，中国)
垂直电泳仪(Bio-Rad公司，美国)
脱色摇床(TS-2，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，中国)
转移脱色摇床(TS-8S，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，中国)
X片自动洗片机(LD-14，苏州布鲁克冲洗设备有限公司，中国)
Mettler微量天平(型号：AL104，Mettler-Toledo公司，中国)
精密可调微量移液器(Eppemdrof公司，德国)
主要试剂与耗材：
BCA蛋白浓度测定试剂盒(西安晶彩生物有限公司，中国)
Western细胞及IP裂解液(批号：P0013C，碧云天试剂公司，中国)
丽春红染液(批号：P0022，碧云天试剂公司，中国)
Hap1豚鼠多克隆抗体(美国Emory大学李晓江实验室自制)
Ahi1兔多克隆抗体(美国Emory大学李晓江实验室自制)
GR兔多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)
β-actin鼠多克隆抗体(Sigma公司，美国)
山羊抗兔抗体(批号：93974，Jackson Laboratories公司，美国)
山羊抗鼠抗体(批号：93725，Jackson Laboratories公司，美国)
BSA(Sigma公司，美国)
脱脂牛奶(Usb公司，美国)
DNA Maker(Invitrogen公司，美国)
PMSF(Sigma公司，美国)
甲醇(批号：20121208，国药集团化学试剂有限公司，中国)
30％丙烯酰胺(批号：KB127666，Thermo公司，美国)
Tris-Hcl(Sigma公司，美国)
Tween20(Sigma公司，美国)
N，N’-亚甲双丙烯酰胺(Sigma公司，美国)
十二烷基硫酸钠(Sigma公司，美国)
TEMED(Sigma公司，美国)
巯基乙醇(Sigma公司，美国)
甘氨酸(Sigma公司，美国)
过硫酸铵(Sigma公司，美国)
SDS(New England Biolabs公司,美国)
异丙醇(批号：40064360，国药集团化学试剂有限公司，中国)
氯仿(批号：10006818，国药集团化学试剂有限公司，中国)
乙醇(批号：10009218，国药集团化学试剂有限公司，中国)
免疫印迹化学发光试剂AB液(批号：KL140446，Thermo公司，美国)
显影胶片(柯达公司，美国)
主要试剂的配制：
(1)5×上样缓冲液：250m MTris-HCl(p H6.8)1.2ml；10％(W/V)SDS 2ml；1％(W/V)溴酚蓝1ml；50％(V/V)甘油5ml；5％(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)0.5ml；去离子水0.3ml
(2)1×分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCl，PH 8.8)500ml：Tris 90.86g去离子水充分溶解，浓盐酸滴定至PH值为8.8，定容至500ml。
(3)1×浓缩胶缓冲液(0.5M Tris-HCl，PH 6.8)500ml：Tris 30.28g去离子水充分溶解，浓盐酸滴定至PH值为6.8，定容至500ml。
(4)10％十二烷基硫酸钠(SDS)20ml：SDS 2.0g去离子水充分溶解，浓盐酸滴定至PH值为7.2，定容至20ml。
(5)10％过硫酸胺(APS)1.0ml：APS 0.1g去离子水1.0ml
(6)10×电泳缓冲液1000ml：Tris 30g甘氨酸143g SDS 10g去离子水充分溶解后定容至1000ml。1×电泳缓冲液(现配现用)：10×电泳缓冲液100ml，去离子水定容至1000ml。
(7)10×转膜缓冲液1000ml：Tris30 g甘氨酸143g去离子水充分溶解后定容至1000ml，4℃保存。1×转膜缓冲液(现配现用)：10×转膜缓冲液100ml，甲醇200ml，去离子水定容至1000ml。
(8)10×PBS液1000ml:Na Cl 80g KCl，2.0g。Na2HPO4·12H2O 36.6g KH2PO42.4g去离子水充分溶解，浓盐酸滴定调p H值7.4，定容至1000ml。1×PBST(现配现用)：10×PBS液100ml，Tween 20 1ml，去离子水定容至1000ml。
(9)封闭液5％脱脂牛奶(封闭用)：脱脂奶粉5g 1×PBST 100ml 5％BSA(稀释抗体用)：BSA 5g 1×PBST 100ml。
(10)RIPA裂解液(组织蛋白提取液)100ml：Tris-HCl 50m M(PH7.2)Triton X-10010％脱氧胆酸钠5％SDS 0.1％Na Cl 150m M EDTA1m M去离子水定容至100ml，-20℃保存。使用前4℃溶解至完全，按如下比例加入蛋白酶抑制剂：RIPA裂解液10ml亮抑酶肽(1000mM)10μl抑肽酶(1000m M)10μl PMS100m M)100μl。
(11)分离胶5ml
试剂 8％ 10％ 12％
丙烯酰胺溶液(30％) 1.3ml 1.7ml 2ml
4×分离胶缓冲液(PH8.8) 1.9ml 1.9ml 1.9ml
去离子水 1.7ml 1.3ml 1ml
10％过硫酸胺(APS) 50μl 50μl 50μl
10％SDS 50μl 50μl 50μl
TEMED 3μl 2μl 2μl
(12)5％浓缩胶 2ml
试剂体积
丙烯酰胺溶液(30％) 0.33ml
4×分离胶缓冲液(PH6.8) 0.25ml
去离子水 1.4ml
10％过硫酸胺(APS) 20μl
10％SDS 20μl
TEMED 2μl。
本发明提供的美普他酚的应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1应激诱导抑郁小鼠模型的建立
(1)空间行为限制装置的制作：取一次性50ml离心管若干，分别在管底相同部位打上适量大小一致的小孔，以满足小鼠呼吸所用，在管头垫上棉花防止损伤小鼠尾巴。
(2)模型的建立：随机将雄性ICR小鼠分为Control组和Stress组两组。在每天同一时间(早上9:00-11:00)将Stress组小鼠放入空间行为限制装置内，行空间行为限制2小时，同时Control组禁食、禁水2小时，持续造模21天。
实施例2行为学评估
悬尾实验(TST)：
尾巴悬挂实验是一个广泛应用于评估小鼠抑郁行为的动物实验，悬挂小鼠尾巴后，小鼠企图挣扎和逃跑而不能逃脱后，放弃挣扎进而出现的不动状态，通过记录小鼠不动状态的时间，从而反应抑郁状态程度。实验设置：2－4月大的小鼠的尾巴(离尾巴尖约1cm)被粘在高度为40cm的木杆上。小鼠被迫悬挂持续6分钟，记录6分钟内小鼠静止不动的时间。测量和统计的人员为双盲。本实验中抑郁模型及对照小鼠尾尖到桌面的实际距离约为35厘米，每只小鼠被悬挂尾巴的时间为6分钟，利用秒表对小鼠在这6分钟内的不动时间进行记录。
强迫游泳实验(FST)：
强迫性游泳实验是检测动物抑郁行为的又一个经典实验。实验设置：2－4月大的小鼠逐个放置于盛水的圆形塑料烧杯内(高18cm，直径15cm)。烧杯内水温25℃，水深10cm。将小鼠放置于水中，没有游泳和挣扎逃跑等行为的时间，即不动时间。其中小鼠为了维持平衡和头的位置而出现的单个肢体或尾巴的轻微动作仍认为是不活动状态[56]。计时6分钟，用秒表测量小鼠不动时间。测量和统计的人员为双盲。本实验中的烧杯直径约25cm，水深约15cm，水温25℃，测量累计6分钟内抑郁模型及对照小鼠不动的时间。(每只小鼠测试完成后需清洗烧杯更换用水，以防止先前小鼠气味对后续小鼠测试造成影响)。
结果如表1～3、图1所示。
表1 图1A和B数据
Figure BDA0002364344610000081
表2图1C TST数据
Con(ns) Con(mep) Str(ns) Str(mep)
95. 124. 188. 144.
89. 131. 113. 108.
130. 103. 183. 114.
67. 124. 160. 93.
79 96 170. 102
表3图1D FST数据
Con(ns) Con(mep) Str(ns) Str(mep)
123. 150. 183. 81.
108. 102. 178. 132.
125. 123. 200. 94.
100. 121. 165. 103.
93 106 117. 143.
图1以及表1～3示给予美普他酚治疗后造模的ICR小鼠的抑郁样表型出现改善行为。其中，图1A和图1B表明ICR小鼠经过应激处理后出现了抑郁样表型；图1C和图1D是经过美普他酚治疗应激ICR小鼠2周后，ICR小鼠身上的抑郁样表型得到缓解。
本发明将ICR小鼠经过应激处理后使其出现抑郁样表型，之后给予美普他酚的治疗发现ICR小鼠的抑郁样表型得到改善。
实施例3腹腔注射法(i.p.)给予美普他酚(Mep)治疗
在造模完成后，按照10mg/kg的剂量腹腔注射小鼠，对照组给予生理盐水(NS)，同时每天继续进行空间行为限制，给药时间为中午12点钟，连续给予两周。
实施例4Western blot法检测小鼠脑组织Ahi1蛋白水平变化
小鼠脑组织蛋白样品制备及保存：
(1)小鼠脑组织蛋白抽提：准备冰桶冰盘和所需试剂，取抑郁模型及对照小鼠于专用工作台，颈椎脱臼法处死小鼠，断头，剥去头皮，用眼科剪沿枕骨中缝剪开一个小口，用血管钳撬开并去除颅骨，充分暴露脑组织，取出全脑组织，迅速置于冰盘上并立刻分离下丘脑，海马，杏仁核，脑干。存于液氮内备用或立刻提取蛋白：以1:15(即10mg重量加入150μl体积)的比例加入预冷的RIPA组织蛋白裂解液，匀浆器研磨20次，混合物置于0℃冰水混合物中充分裂解30分钟，冰上超声5s×3次，使组织标本成为蛋白匀浆，14000g，4℃离心20分钟，取上清转至预冷的新EP管，BCA试剂盒测蛋白浓度或-80℃冻存。
(2)BCA试剂盒测蛋白浓度：按样品个数(3个重复)计算好BCA检测试剂的用量后，配置BCA工作液：试剂盒A液和B液按50：1配好。10μl C液(蛋白标准)+90μl PBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。分别以0、2、4、8、16μl将蛋白标准液加入96孔板的第1～5标准孔中，在其他样品孔中加入1μl待测各样品。各孔分别用BCA工作液定容至200μl，混匀，置入37℃温箱，孵育30分钟，冷却到室温，用酶标仪测定蛋白浓度(A562)。
(3)样品配制：使用RIPA组织蛋白裂解液将所有样品配置至相同浓度(3μg/ul)，将样品与5×上样缓冲液按4：1比例混合，混匀后于95℃加热10分钟使蛋白质充分变性，进行蛋白电泳或-20℃冻存备用。
Western blot步骤：
(1)SDS-PAGE凝胶制备：用肥皂水洗刷玻璃板，自来水充分冲洗2-3遍，用去离子水冲洗1遍，最后用无水乙醇对玻璃板进行脱脂处理，置于玻璃板架上，烘箱烘干后，安装在制胶架上。按配方表配制下层分离胶，用移液器加入到制架上的前后玻璃板的间隙内，加至距离薄玻璃板上缘约3cm处。然后缓慢加入1ml去离子水或者无水乙醇，覆盖在分离胶上方，隔离空气中的氧气，防止其对凝胶的抑制作用。室温下静置30～45分钟，使分离胶充分聚合。将去离子水乙醇慢慢倒去，残留液体用滤纸吸净。按配方表配制上层浓缩胶，用移液器注入分离胶上端将玻璃间隙加满，迅速将洗净晾干的分齿梳插入玻璃间隙内，注意避免出现气泡。室温下静置30～45分钟，使浓缩胶充分聚合。
(2)SDS-PAGE凝胶电泳：将胶板固定，安装于电泳仪内，加入1×电泳缓冲液至完全浸没胶及梳孔，仔细检查周围是否有电泳液泄漏，缓慢拔出齿梳，缓冲液冲洗上样孔，以洗去未聚合的丙烯酰胺和碎胶。按顺序依次加样：第一孔加入蛋白Marker，中间各孔分别加入等体积制备好的样品，最后一孔加入等体积1×上样缓冲液，避免蛋白向边缘逃逸。打开电源，开始电泳，先使用80V电压使样品缓慢通过浓缩胶，等到溴酚蓝完全进入分离胶内压缩成细细的直线后，将电压提高到120V继续电泳，直到蛋白Marker显示的不同分子量蛋白完全分开溴酚蓝完全跑入电泳液中，停止电泳。电泳全程约2～3h。
(3)转膜：将硝酸纤维素膜和滤纸修剪至于凝胶同样大小，浸泡于1×转膜缓
冲液中平衡5分钟。电泳液中取出玻璃板，将玻璃板浸没于1×转膜缓冲液中轻轻撬开薄玻璃板，浓缩胶切去，小心剥离分离胶。在1×转膜缓冲液中按顺序铺：正极-海绵-双层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极(确保膜完全覆盖于胶，用玻璃棒轻轻去除气泡)，将转膜夹夹紧。将转膜夹插入电转槽中，在转移槽中加满预冷1×转膜缓冲液，加入冰盒，低温下用330m A电转60～90分钟(转膜所用时间依照蛋白分子量大小调整)。转膜完成后，丽春红染液染膜，于摇床上摇染1分钟，去离子水冲洗后观察膜上蛋白质的转移情况。然后用PBST洗3遍×3分钟，冲洗去膜上全部的丽春红染料。
(4)封闭：将膜完全浸没于5％脱脂牛奶内，置于摇床上，室温慢摇1～2小时，使膜上的非特异性免疫球蛋白结合位点得到充分封闭。封闭结束后，用PBST洗3×5分钟。
(5)一抗孵育：将膜取出，置于一塑封袋中，放入用5％BSA-PBST稀释的一抗，去除气泡，封膜机封口，摇床慢摇，在4℃中过夜。
(6)二抗孵育：取出膜，回收抗体，-20度保存。PBST漂洗，3×10分钟，室温。将膜放在另一塑封袋中，加入5％脱脂牛奶封闭液稀释的二抗(与一抗对应，稀释度为1：5000)，去除气泡，封膜机封口，摇床慢摇，室温下1小时。
(7)显影：取出膜，PBST漂洗，3×10分钟，室温。从PBST液中取出膜，正面向上，用滤纸吸干膜表面多余液体。ECL底物显色A、B液按1:1混匀(按膜面积0.1ml/cm2配)，用移液器滴加均匀，室温下反应1～2分钟，将表面残留多余的显色液用滤纸轻轻吸干，用透明薄塑料膜包裹膜，放入X光片夹中，固定位置。进入暗室内，取出X光片，打开X光片夹，降X光片盖放在膜上，过程中避免光片移动，关上X光片夹，反应适当时间后打开，X光片放入自动洗片机洗片。
(8)凝胶图象分析：标定Marker，将胶片进行扫描，图象扫描后采用凝胶图象处理系统(Image J软件，National Institutes of Health，美国)分析目标带的净光密度值。
表4 图2A和B数据
Figure BDA0002364344610000111
表5图2C TST数据
WT-NS WT-Mep KO-NS KO-Mep
107. 99. 135. 183.
74. 73. 150. 106.
117. 70. 145 107.
90. 67. 180. 210.
93. 81 176. 150.
表6图2D FST数据
WT-NS WT-Mep KO-NS KO-Mep
123. 127. 197. 114.
90. 100. 166. 228.
74. 125. 169. 158.
90. 90. 221. 235.
118. 108 136. 157.
表4～6、图2示给予美普他酚治疗后的Ahi1 KO小鼠未起到抗抑郁作用；其中，图2A和图2B表明Ahi1 KO小鼠存在着抑郁样表型；图2C和图2D表明经过美普他酚的治疗后Ahi1KO小鼠的抑郁样表型未得到改善，说明美普他酚是通过Ahi1来改善抑郁样表型。
实验结果表明，转基因Ahi1小鼠存在抑郁样行为(图2A和B所示)与此同时给予美普他酚的治疗，在Ahi1 KO小鼠身上无抗抑郁的作用(图2C和D所示)。
表7图3(B)统计数据
Str+NS Sts+Mep
0.512 0.647
0.368 0.862
0.402 0.831
表7、图3示给予美普他酚治疗后Ahi1水平升高明显；其中，图3A示Western blot蛋白定量结果；图3B示蛋白定量统计结果。通过Western Blot方法检测Stress对照组与Stress给药组的Ahi1的蛋白水平变化，经灰度统计及t检验(p<0.05)后得出给予美普他酚治疗后会使Ahi1水平升高，同时其抑郁样行为也得到改善。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.美普他酚在制备预防和/或治疗抑郁的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述美普他酚的有效剂量为5～20mg/kg动物体重。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述美普他酚的有效剂量为2～8g/kg人体重。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述美普他酚的给药次数为每日一次，给药周期为连续给予两周。
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