CN111066736A - 一种白蚁胚胎发育研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白蚁胚胎发育的研究方法，包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究，包括以下步骤：（1）收集白蚁卵；（2）白蚁卵前期处理；进行离巢饲养，即将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置；（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究包括卵壳的软化、卵的固定、白蚁卵的染色，制片与保存；（4）白蚁卵人工孵化研究，本方法通过DAPI染细胞核完整观察白蚁胚胎发育过程，建立人工离巢饲养白蚁卵的方法，探索白蚁卵离巢孵化的条件，为白蚁生物防治提供坚实的理论基础和实践指导。
Description
技术领域
本发明涉及昆虫学研究领域，具体是涉及一种白蚁胚胎发育研究方法，即一种社会性昆虫-白蚁产生的后代的胚胎发育的研究方法。
背景技术
白蚁是系统发育最古老的社会昆虫，属蜚蠊目(Blattodea)中的等翅下目(Infraorder Isoptera)，是半变态的真社会性昆虫。系统发育研究表明大约在1.5 亿年前，侏罗纪或三叠纪时期，白蚁是从蟑螂的近亲进化而来的，因此，白蚁从曾独的白蚁目(Order Isoptera) 系统发育分析最终将白蚁归类到蜚蠊目中。
作为世界范围内的破坏性害虫，白蚁每年对农作物和木造结构造成的损害超过300亿美元，给人类经济带来了全球性的挑战。白蚁能蛀食多种农林经济作物，对江河堤坝、房屋、仓储物资、埋地塑料电缆等的蛀蚀可造成巨大损失。近几年来，白蚁的为害已从南方向北方迁移，在辽宁具有逐年扩增的趋势。目前白蚁防治方法包括天敌、病毒、真菌、抗生素、化学药剂等。白蚁是自然环境中存在的能够高效降解木质纤维素的昆虫之一。白蚁品级包括蚁王蚁后、繁殖蚁、兵蚁、工蚁，若蚁和卵，繁殖蚁又有原始型繁殖蚁和补充型繁殖蚁之分。白蚁卵的发育具有多态性，可以发育成繁殖蚁，工蚁及兵蚁。
白蚁的生长发育特征是进行防治方法研究的重要理论依据。由于白蚁是真社会性昆虫，卵的发育依赖于工蚁的梳理清洁行为，离开巢穴且缺失工蚁照顾的白蚁卵无法进行正常孵化。从白蚁行为生物学角度而言，白蚁卵的储藏地为巢穴底部，由工蚁藏匿于腐木底端，导致蚁卵很难被收集和观察，严重阻碍了研究者对白蚁卵胚胎发育的观察的研究，目前，还没有系统的白蚁胚胎发育研究方法。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足和克服白蚁生物学特性引起的技术障碍，本发明的目的是提出一种白蚁胚胎发育研究方法，通过DAPI染细胞核完整观察白蚁胚胎发育过程，建立人工离巢饲养白蚁卵的方法，探索白蚁卵离巢孵化的条件，为白蚁生物防治提供坚实的理论基础和实践指导。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种白蚁胚胎发育的研究方法，其技术要点是：包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究，包括以下步骤：
（1）收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
（2）白蚁卵前期处理
将步骤1获得的白蚁卵加入双蒸馏水，放至漩涡震荡仪低速震荡，将水吸出，重复三次以清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，不同天数的白蚁卵单独放置于培养基上以获得不同发育天数的白蚁卵；用于不同发育天数的白蚁卵胚胎进行染色，对白蚁胚胎发育和卵孵化进行研究；
（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
a.卵壳的软化
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，进行软化处理，依据不同的发育时期对其处理时间和方法不同，具体如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配制方法为：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L，氯化钠(NaCl)：8g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，用DD水定容到1L，采用浓盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用；
b.卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵加入10%多聚甲醛（Paraformaldehyde）溶液，每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
c.白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（体积比DAPI：PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
d.制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（体积比甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，避光保存，在Olympus激光共聚焦扫描显微镜FV3000下观察胚胎发育情况；
（4）白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，5天观察孵化情况。
本发明的有益效果：
（1）明确了离巢饲养条件下白蚁卵破壳孵化的条件，为白蚁人工繁殖方法提供依据，同时建立了离巢饲养条件，即将卵从巢穴中移出后，将其至于最适宜的抗生素的琼脂糖培养基上，达到了有效抑制卵壳表面真菌的生长，有效阻碍了真菌对卵侵染带来的影响，同时为工蚁的梳理行为以及胚胎发育研究提供坚实的理论基础和实践指导。
（2）本实验将白蚁卵离巢饲养，将以工蚁照顾卵的传统模式转化为卵独立发育，可极大减少白蚁卵发育过程中工蚁使用的数量，降低实验成本和人工消耗。
（2）本发明确定了不同时期处理卵次氯酸钠处理卵的浓度，有效地消化卵壳绒膜的成分，且不破坏卵的整体结构，有效提高了软化率，为白蚁卵胚胎研究提供可行方法。
（3）本发明采用的DAPI染色成像技术的优点：
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的细胞核的染色。
附图说明
图1 为不同饲养条件对白蚁卵发育的影响，其中A：本研究探索的离巢饲养条件下白蚁卵发育图；B：只采用1.5%琼脂糖平板白蚁卵因真菌感染的发育状态图；
图2表示次氯酸钠溶液的不同处理时间对白蚁卵染色效果的影响，其中A：对发育13天的白蚁卵采用50%次氯酸钠NaClO处理8min后染色效果图；B：对发育13天的白蚁卵采用50%次氯酸钠NaClO处理10min后染色效果图；
图3为不同发育时期白蚁卵胚胎DAPI染色图，其中A：发育天数为胚胎发育早期（5天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图，B：发育天数为胚胎发育中期（13天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图，C：发育天数为胚胎发育晚期（28天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图；
图4.破壳孵化时不同处理对白蚁能否成功孵化的对比试验，其中A：正常生长的白蚁卵，B：死亡的白蚁卵。
具体实施方式
实施例1一种白蚁胚胎发育的研究方法
包括以下步骤：
1.收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
2.白蚁卵前期处理
将步骤1获得的白蚁卵加入双蒸馏水，放至漩涡震荡仪低速震荡，将水吸出，重复三次以清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵；用于不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁孵化研究；
3. 不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
（1）卵壳的软化
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别进行软化处理，处理时间和方法如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配制方法为：
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（2）卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵均加入10%多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde），每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
（3）白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（体积比为DAPI：PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
（4）制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（体积比为甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，避光保存，在Olympus激光共聚焦扫描显微镜FV3000下观察胚胎发育情况；
4. 白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，5天观察孵化情况。
实施例2尖唇散白蚁卵胚胎发育的研究方法
供试白蚁种群为尖唇散白蚁Reticulitermesaculabialis；
1.收集白蚁卵
取12个45mm*9mm的培养皿，每个培养皿中铺上8层灭过菌的湿润原浆纸，配上一块润湿的松木条，将10只工蚁、1只兵蚁、10只无翅繁殖蚁放入培养皿中，用封口膜封好，置于27℃，湿度70%-80%养虫室避光饲养，大约30天开始收集无翅繁殖蚁产出的卵。
2.白蚁卵前期处理
从收集卵的第1-30天，每日收集上述白蚁卵，每日采集的白蚁卵转移至1.5ml离心管内，加入1ml双蒸馏水，放至漩涡震荡仪低速震荡30s，将水吸出，重复三次以清除白蚁卵表面的杂质和病原菌，每日卵量在25-35颗，处理剂每日量恒定；清除表面的杂质和病原菌后，将每日采集的卵放至于单独培养皿中进行离巢培养，离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，小心扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基（40mm*9mm）上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵，供不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵孵化研究用；
离巢饲养的试验结果：
图1为上述离巢饲养条件下，发育天数为20天的白蚁卵的发育状况，其中采用1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基饲养的白蚁卵发育良好，而对比只采用1.5%琼脂糖平板的白蚁卵已经被真菌感染死亡，因此可见，200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养条件可以有效的抑制白蚁卵周围的真菌和细菌，同时对白蚁卵没有有害的影响，白蚁卵可以正常生长，即本方法提高了白蚁卵在离巢的条件下生长发育的存活时间，节约了白蚁的人工饲养条件。
3.不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色方法
（1）卵壳的软化
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别扫进5ml离心管进行软化处理，处理时间和方法如下：
1-7d白蚁卵——30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min用量为2ml，静止；
8-15d白蚁卵——50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min用量为2ml，静止；
16-22d白蚁卵——70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min用量为2ml，静止；
23-30d白蚁卵——80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min用量为2ml，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液为用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配方为：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L，氯化钠(NaCl)：8g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，用DD水定容到1L，采用浓盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用；
（2）卵的固定
将步骤4每日收集的卵软化处理后，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
每个处理每日卵均加入2ml 10%多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde），室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
（3）白蚁卵的染色
上述白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（DAPI：PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次。
（4）制片与保存
用移液枪将白蚁卵与溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，避光保存，在Olympus激光共聚焦扫描显微镜FV3000下观察胚胎发育情况。
（5）染色结果
图2可见次氯酸钠溶液不同处理时间对白蚁卵胚胎染色效果的影响，对发育13天的白蚁卵在卵壳软化过程中采用50%次氯酸钠NaClO溶液处理8min后染色效果从清晰度和立体效果明显低于处理10min的染色效果；可见白蚁卵在卵壳软化过程中次氯酸钠的处理时间对观察胚胎发育具有重要的作用。
图3为白蚁卵胚胎不同发育时期的扫描显微镜成像图，由图可见，本方法可以清楚明了的看出白蚁卵不同胚胎发育的进程，为白蚁卵胚胎发育的观察的研究提供了系统的技术方法。
4. 白蚁卵的人工孵化方法试验
分别取步骤2中发育27-29天的25颗白蚁卵进行如下处理：
处理1：放入在45mm*9mm的培养皿中铺上8层灭过菌的湿润原浆纸上，配上一块润湿的松木条，并放入10头同一种群工蚁，其中18颗卵依然正常存活，5d后全部孵化。
处理2：将25颗卵全部放到1.5%琼脂糖平板+200PPM四环素+200PPM多菌灵培养基上让其自然生长，3d后白蚁卵全部自然破裂，胚胎化水死亡。
处理3：将25颗卵全部人工手动破壳，交还给工蚁，1d后白蚁卵全部被工蚁吃掉。
试验结果表明，白蚁卵必须借助工蚁才能孵化，如无工蚁参与，孵化均失败，卵死亡，见图4。
Claims (1)
1.一种白蚁胚胎发育的研究方法，其特征是：包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究，包括以下步骤：
（1）收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
（2）白蚁卵前期处理
将白蚁卵清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，所述离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵，以用于不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究；
（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
a.卵壳的软化
将发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别进行软化处理，处理时间和方法如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，加入30%次氯酸钠溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，加入50%次氯酸钠溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，加入70%次氯酸钠溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，加入80%次氯酸钠溶液处理10min，静止；
所述次氯酸钠溶液加样量为每25-35个白蚁卵样品，加入2ml上述次氯酸钠溶液；上述处理后均将次氯酸钠溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4；
b.卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵均加入10%多聚甲醛（Paraformaldehyde）溶液，每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛溶液；
c.白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（DAPI：PBS =1:1000），每25-35个白蚁卵加入1ml染色液，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
d.制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，观察胚胎发育情况；
（4）白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，进行人工孵化。
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