CN111034669A

CN111034669A - 一种从养殖水中直接提取生物活性肽的方法和装置

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Publication number: CN111034669A
Application number: CN201911292127.4A
Authority: CN
Inventors: 曹伯良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN111034669B

Abstract

一种从养殖水中直接提取生物活性肽的方法和装置，通过一种水产品高密度养殖系统获得富集生物活性肽的水，从该水中可直接获取生物活性肽。所述“水产品高密度养殖系统”主要由水产品的养殖装置、水过滤装置、生物硝化器组成。水体在上述系统中循环，得到富集生物活性肽的水。

Description

一种从养殖水中直接提取生物活性肽的方法和装置

技术领域

本发明涉及一种从养殖水中直接提取生物活性肽的方法，特别是提供了得到用于提取生物活性肽的水产品养殖水的方法。本发明还提供了所涉及的装置。

背景技术

目前制备生物活性肽方法主要有两种：

一是利用酶解或发酵的方法将蛋白质原料水解为活性肽。

方法的缺点是：由于原材料是富含蛋白质的动植物、微生物等，原料中除含蛋白质，还存在其他多糖脂肪等万分，后续的分离和纯化工序复杂成本高昂；最重要的弊端是具有各种生物学活性的生物活性肽占比极低。

二是人工合成生物活性肽，如化学合成或DNA重组。其缺点是成本高，技术条件要求较高，产品功能单一。

总体来说，生物活性肽的制备仍存在生物活性肽有效成分低、功效不突出且提取成本高的问题，寻求一种绿色高效的方法迫在眉睫。

已发现，鱼类在生长过程中为了适应外界自然环境，其机体会不断产生并向外界释放各种生物活性肽。如，具有抵抗外部细菌、病毒、寄生虫感染的抗菌肽、抗病毒肽、提高和增强免疫力的免疫活性肽，以及具有促进细胞增殖和创伤修复功能的活性肽等。

但是，由于这些活性肽是被鱼类直接分泌到养殖水体中，在鱼类天然生长或常规养鱼环境中，所分泌出的活性肽被迅速稀释，因此通常水体中含量极低，没有实际应用价值。

目前，直接从含活性肽的鱼类养殖水中分离提取生物活性肽，由于经济和技术方面的各种限制，很难实际应用。

因此，提高鱼类养殖水中活性肽浓度，是亟须解决的技术关键。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种具有高浓度生物活性肽的水产品养殖水，从该养殖水中能够直接分离提取生物活性肽。

本发明提供了一种鱼类等水产品高密度养殖系统，该系统可以获得富集生物活性肽的水，从该水中可直接获取生物活性肽；

所述“水产品高密度养殖系统”由以下几部分组成：

1、鱼类等水产品的养殖装置；

2、与1连接的水过滤装置，用于物理过滤从1中流出的水；

3、与2连接的生物硝化器，用于硝化处理2所述物理过滤分离出的水；

硝化处理后，将水中氨氮等有害物质转化为植物生长所需的硝酸盐；

从3中流出的水，即为从所述“水产品高密度养殖系统”中得到的富集生物活性肽的水，用于提取生物活性肽。

4、水体回流再返回水产品养殖池的管道

净化后的水体重新输入养殖池内。这样多次反复循环，不仅节约水资源，还能得到富集生物活性肽的水。

所述硝化处理是在生物硝化罐中添加硝化细菌并培养菌群，在好氧条件下，将养殖水体中产生的氨氮氧化成亚硝酸盐，且进一步将亚硝酸盐转化为植物所吸收利用的主要营养成分硝酸盐的过程。

其目的是将养殖水体中产生的氨氮、亚硝酸盐等物质转化为植物所吸收利用的主要营养成分硝酸盐。

所述硝化细菌为市售品，主要包括两个细菌群：亚硝酸菌和硝酸菌。

转化氨氮的过程也分两步：亚硝酸菌先将氨氮转化为亚硝酸盐，然后硝酸菌将亚硝酸盐进一步转化为硝酸盐。

所述生物硝化罐是一个容器，里面放有培养硝化菌的生物填料，硝化菌在填料表面附着后繁殖生长。生物填料选用市售流化床填料即可。

硝化细菌的添加量根据养殖系统的大小(水体量，后期饲料投喂量)确定。

优选的情况下，上述“水产品高密度养殖系统”还可以具有以下任意一个或两个装置：

A与3连接的植物种植床

可以将上述硝化处理后的水再流经植物种植床，用于植物无土栽培。从种植床流出的水用于提取生物活性肽。

养殖水体中残饵粪便、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、悬浮物等物质对鱼类有害，但对植物生长是有益的营养，回流养鱼池之前可以去除，又利于植物生长。

B物理灭菌装置，用于将经种植床流出的水在提取生物活性肽之前先进行灭菌消毒。

所述灭菌，可采用本领域所使用的任何方式，比如紫外，臭氧等物理灭菌方式。

本发明的上述水产品高密度养殖系统是密闭式循环操作，只需补水，不需要换水

上述系统是工厂化循环水养殖系统，是全人工控制条件下的工业化养殖生产，利用物理过滤、生物硝化、消毒杀菌、控温、增氧等方法，去除养殖水体中对鱼类有害的残饵粪便、氨氮、亚硝酸盐、悬浮物等有害物质。因此，净化后的水体可以重新输入养殖池内，并多次反复循环，才能实现鱼类等水产品的高密度养殖，从而得到了富集生物活性肽的水。

从上述所得到的富集生物活性肽的水中提取生物活性肽的方法，可以采用本领域技术人员所使用的任何方法和手段。

因此，本发明又提供了一种“从水产品养殖体系中获取生物活性肽的系统”，该系统包括前述“水产品高密度养殖系统”和“生物活性肽提取分离装置”。

所述“生物活性肽提取分离装置”，可选用本领域技术人员所使用的任何生物活性肽提取分离装置。

在本发明的一种实施方式中，采用膜分离方法将从4(即种植床)流出的水进行生物活性肽的分离、提取和浓缩。所述“生物活性肽提取分离装置”是膜分离装置。

在本发明的一种实施方式中，所述膜分离方法，是通过超滤膜先去除分子量大于5000Da的蛋白质分子，分子量小于5000Da的截余液进入纳滤膜继续进行纳滤，然后经过化学清洗、清水反洗的手段不断地将截余液进行浓缩。

所述浓缩，是先浓缩到10-20％的体积后进行收集，然后进行重复浓缩，浓缩截余液即富含200-5000Da生物活性肽的产品。

本发明可将“循环水养殖”、“植物无土栽培”和“高效活性肽浓缩”三个发明目的完美地结合，操作流程为：

水从鱼池流出→经过物理过滤→通过生物反应器把氨氮等有害的物质转化为硝酸盐(氮肥)→流经蔬菜种植床，蔬菜将(氮肥和其它小分子无机化合物养料)养分吸收→水质净化→再经过活性肽分离系统→经过多级过滤浓缩→直接获得安全高品质的生物活性肽产品。

多级过滤浓缩后小于200Da的水最终再回到鱼池，循环使用。从而实现养鱼种菜及提取生物活性肽三种目的。

本发明和已有技术相比，其主要优势有如下几点:

1、得到富含生物活性肽的水

本发明提供的“水产品高密度养殖系统”可以使生物活性肽在水中不断富集，通过膜分离技术多级过滤浓缩能直接分离提取生物活性肽。

2、水体中杂质含量小，使生物活性肽的纯化效率高，且成本低

养殖水体中分子量小于200Da的大量无机盐成分(最主要是生物硝化产物硝酸盐)作为植物生长的养料直接被蔬菜根系吸收，避免了物理过滤的最后一步反渗透程序，极大提高了分离纯化效率和降低成本。

3、密闭式循环保证了生物活性肽的安全性

工厂化标准化鱼菜共生系统是一个相互制约的互锁机制，系统正常运行杜绝使用任何抗菌素和化学农药，而且系统是密闭式循环，只需补水而不换水，水源通过过滤去除重金属，因此，系统从根本上保证了生物活性肽的安全性，没有任何抗菌素、化学农药及重金属污染。

4、同时进行养鱼、种菜，是工厂化的鱼菜共生系统

模拟自然界动物、植物、微生物系统的完美平衡，真正实现了养鱼不换水。不仅得到富含鱼类分泌的高效生物活性肽的水，而且可同时收获无污染的有机鱼和菜。

附图说明：

图1是水产品高密度养殖系统的生产循环方式示意图；

图2是水产品高密度养殖系统的生产工艺流程的一个实例

水和鱼饲料加入养鱼池→水从鱼池流出→经过物理过滤→将滤出液进行生物硝化，得到有机肥(把氨氮等有害的物质转化为硝酸盐，即氮肥)→流经蔬菜种植床，蔬菜将吸收养分(氮肥和其它小分子无机化合物养料)同时净化水质→净化后的水进行物理灭菌(紫外，臭氧等方式)再经过活性肽分离系统，提取生物活性肽后，流入鱼池。

图3是养殖水体生物活性肽分离提取的工艺流程；

图4左右图分别是生物活性肽和纯水对照的紫外吸收光谱图。

图5、图6是生物活性肽的质谱结果，其中：

图5是质谱图，左侧为肽段液相分离，右侧为分离后肽段的质谱检测，右侧横坐标为质荷比，纵坐标为单独肽段信号强度；

图6是质谱所得结果的数据；

图7是生物活性肽和阳性对照奎诺二甲基丙烯酸酯的抗氧化性能测定结果。

具体实施方式:

实施例1“水产品高密度养殖系统”操作流程(一)

1、鱼池养殖

要求：

采用工厂化循环水养殖的技术手段，确保系统源头水源和饵料的安全可靠以及整个水产养殖生产环境可调控，使得系统养殖密度高于100斤/m³，保证所产出水产品的优质、高效、生态和安全；

2、养鱼水物理过滤

水从鱼池流出首先进入与鱼池连接的微滤机，进行养鱼水的物理过滤，去除水体中的直径大于60μm的固体悬浮物；

3、生物硝化

所用材料如下：

森森牌水族箱鱼药硝化菌，市售；

流化床填料(悬浮生物球)，河南洁康环保生产

将经过步骤2物理过滤后的水引入生物硝化器进行生物硝化，将水体中对鱼类有害的氨氮、亚硝酸盐等有害物质转化为植物生长所需的硝酸盐。

上述生物硝化器为加入了硝化菌的容器。40m³的水体，约是4000斤的养鱼容量，添加5000ml液体的硝化菌

4、水体重新输回养鱼池

步骤2中所述纳滤后的水体作为水源，重新返回系统鱼池中用于养鱼。

实施例2“水产品高密度养殖系统”操作流程(二)

方法同实施例1中步骤1～4，但增加以下步骤：

5、滤渣消化

用于处理步骤2所述物理过滤分离出的半固体；

6、引入蔬菜种植床

经过物理及生物过滤的水源流入无土栽培的蔬菜种植床，植物生长吸收水体中的无机盐离子及养分，同时又净化了水源，为后续的分离提供保障。

7、灭菌消毒

将经5流出的水进行紫外或臭氧消毒灭菌(方法为水体流经接通紫外灯光的管道快速杀菌，或在此接入臭氧气体杀菌)，得到富集生物活性肽的水。

整个流程见图1、图2。

实施例3生物活性肽的提取分离

1、消毒灭菌

将实施例1中流出蔬菜种植床的水经过消毒灭菌后，引入膜分离体系进行分离。

所述消毒灭菌的操作方法为：水体流经接通紫外灯光的管道快速杀菌，或在此接入臭氧气体杀菌。

2、生物活性肽的膜分离

将上述消毒灭菌后的水进行膜分离，步骤为：

1)超滤

弃去不能通过超滤膜(过滤孔径0.02-0.1μm)的部分(主要含分子量大于5000Da的蛋白质和其它杂质)；

收集通过超滤膜的滤液(滤液中含分子量小于5000Da的生物活性肽)；

2)纳滤

使用纳滤膜(过滤孔径0.05-1nm)将步骤1)所得到的滤液进行纳滤，弃去通过纳滤膜的滤液(滤液中含分子量小于200Da的小肽和其它杂质)；

收集不能通过纳滤的截余液(其中含200-5000Da生物活性肽)；

3)对纳滤所得的截余液进行浓缩

所述浓缩，是将截余液浓缩到10-20％的体积后进行收集，得到含分子量为200-5000Da生物活性肽的浓缩液(以下实验中亦称为“百源康水样”)。

实施例4生物活性肽的鉴定——紫外分析和液相层析-质谱分析

将实施例3得到的含生物活性肽的浓缩液(即“百源康水样”)进行以下分析。

1)紫外吸收光谱

光谱的分析条件：取200微升实施例3得到的生物活性肽的浓缩液(即，百源康水样)和阴性对照纯水，分别放入光析管，用紫外分光光度(BioTekInstrument)在波长200-300纳米(nm)区间扫描鉴定。

结果：见附图4，横坐标为波长，纵坐标为紫外光吸收值。百源康水样在波长200-300纳米(nm)之间有强吸收，纯水对照没有吸收。

光谱解析：根据有机化合物的紫外吸收光谱可以推测化合物所含的官能团：

在210～250nm区间有强吸收，有K带吸收，表示百源康水样含有两个双键的共轭体系；在260～300nm区间有中强吸收，有B带吸收，表示百源康水样中含有苯环存在；芳香族氨基酸中的酪氨酸、色氨酸含有共轭双键；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸含有苯环，具有吸收紫外光的性质。由此推断百源康水样中含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。

2)液相层析-质谱分析对所得产品进行生物活性肽的鉴定

将实施例3得到的含生物活性肽的浓缩液(即，百源康水样)进行了液相色谱法-质谱联用(Liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MSMS)分析。

实验样品：生物活性肽浓缩液(百源康水样)，浓度5.35mg/ml(Nano-drop BCA法)

实验方法：

A.肽段除盐(C18反相色谱除盐)

a.1ml活化柱料，1滴/秒

b.5％乙腈平衡，1滴/秒

c.样品用1ml双蒸水溶解过柱

d.5％乙腈洗柱除盐，1滴/秒

e.2x500μl纯乙腈洗脱，1滴/秒

f.低温离心抽干乙腈

g.0.1％甲酸复溶肽段

B.质谱检测

a.用0.1％甲酸溶液调整肽段终浓度至100ng/μl，上样量300ng。

b.用Thermo-fisher Q-Exactive-Orbitrap高精度液质联用型质谱仪检测肽段信号并分析。

实验结果：见附图5、附图6。附图5左侧为肽段液相分离，右侧为分离后肽段的质谱检测，右侧横坐标为质荷比，纵坐标为单独肽段信号强度。图6为excel数据表格截图，经软件分析，百源康水样所含肽段大部分集中在5-20个氨基酸的多肽片段。

实验结论：通过高精度液质联用型质谱仪检测，结果证明百源康水样含多种不同氨基酸序列的短肽片段。

实施例5生物活性肽的抗氧化性能鉴定

一、实验样品：实施例3得到的含生物活性肽的浓缩液(即，百源康水样)

阳性对照：奎诺二甲基丙烯酸酯，别名Trolox

化学名(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylica cid)。

来源Sigma-Aldrich#238813

是一种维生素E的细胞渗透性、水溶性衍生物，公认的抗氧化测定中的标准品或阳性对照品。

二、实验原理：

铁离子还原/抗氧化能力法(Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)，是一种在低pH酸性条件下，利用抗氧化物还原亚铁离子与TPTZ(tripyridyltriazine，三吡啶基三嗪)的混合物Fe³⁺-TPTZ产生蓝紫色的Fe²⁺-TPTZ，随后在593nm测定其吸光度，来测量样品抗氧化能力的测定方法。

三、溶液配制：

FRAP工作液配制(现用现配)：由25ml 300mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、2.5ml10mmol/L TPTZ溶液、2.5ml 20mmol/L FeCl₃溶液混合而成。

标准曲线的绘制：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的FeSO₄标准液各150微升，分别加入4.5ml FRAP工作液，混匀后在37度水浴条件下反应10分钟，于593nm处测定其吸光度值,绘制标准曲线。样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO₄的微摩尔数(μmol/L)表示。

四、样品的测定方法：

百源康水样做5个稀释浓度，奎诺二甲基丙烯酸酯做两个浓度。取150微升的样品溶液，加入4.5ml FRAP工作液,用纯水代替样品作为空白对照。混匀后37度水浴条件下反应10分钟，于593nm处测定其吸光度值。由标准曲线查得相同吸光度值处对应的FeSO₄浓度(μmol/L)作为FRAP值。

五、实验结果：

见附图7。横坐标为样品浓度(mg/mL)，纵坐标为抗氧化活性FRAP值(由标准曲线查得相同吸光度值处对应的FeSO₄浓度μmol/L)。

六、实验结论：

百源康水样具有抗氧化性能，且抗氧化性能与活性肽含量的浓度成正比。

Claims

1.一种从养殖水中直接提取生物活性肽的方法，其特征是：使用一种水产品高密度养殖系统，从中获得富集生物活性肽的水，从该水中直接获取生物活性肽；

所述“水产品高密度养殖系统”由以下几部分组成：

1)水产品的养殖装置；

2)与1)连接的水过滤装置，用于物理过滤从1)中流出的水；

3)与2)连接的生物硝化器，用于硝化处理2)所述物理过滤分离出的水；

4)水体回流再返回水产品养殖装置的管道；

水体在上述系统中循环，从3)中得到富集生物活性肽的水，从中提取生物活性肽。

2.权利要求1所述的方法，所述“水产品高密度养殖系统”还具有以下任意一个或两个装置：

A与3)连接的植物种植床

将上述硝化处理后的水再流入植物种植床后流出，用于植物无土栽培；

B灭菌装置，用于将从种植床流出的水在提取生物活性肽之前进行灭菌消毒。

3.权利要求1所述的方法，所述“水产品高密度养殖系统”是密闭式循环操作，仅补水，不换水或少量换水。

4.权利要求1所述的方法，所述硝化是水引入生物硝化器后进行曝气；所述生物硝化器是加入了硝化菌的容器。

5.权利要求1所述的方法，所述提取生物活性肽采用膜分离方法。

6.权利要求5所述的方法，所述膜分离方法，是通过超滤膜先去除分子量大于5000Da的蛋白质和其它杂质；含分子量小于5000Da生物活性肽的截余液进入纳滤膜继续进行纳滤，滤除分子量小于200Da的肽和其它杂质，然后将截余液浓缩后进行收集；得到富含分子量范围在200-5000Da的生物活性肽的浓缩液。

7.权利要求6所述的方法，所述浓缩，是浓缩到截余液体积的10-20％。

8.权利要求2所述的方法，所述灭菌装置，是包括紫外或臭氧方法的物理灭菌装置。

9.一种从水产品养殖体系中获取生物活性肽的系统，该系统包括一种“水产品高密度养殖系统”和生物活性肽提取分离装置；所述“水产品高密度养殖系统”如权利要求1或2所述的“水产品高密度养殖系统”所述。

10.权利要求9所述的系统，所述生物活性肽提取分离装置是膜分离装置。