CN111033237A - 使用剂量响应曲线的递减信号部分来测量包括高浓度分析物在内的分析物的夹心式测定 - Google Patents
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Abstract
本文所述的夹心式侧向流测定装置、系统和方法测量样品中感兴趣的分析物的浓度，并且当其以高浓度存在时，可以确定分析物的精确浓度。当样品中感兴趣的分析物的浓度为零时，将产生最大强度信号。对于低浓度的分析物，本文所述的侧向流测定产生与最大强度信号相同或基本上等同的信号。高浓度的感兴趣的分析物产生小于最大强度信号的信号。本公开的侧向流测定通过消除信号增大的剂量响应曲线的阶段而解决了与夹心式侧向流测定的钩状效应相关的缺点。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月28日提交的美国临时申请号62/526,051的权益，其因而通过引用以其全部并入。
技术领域
本公开通常涉及侧向流测定装置、测试系统和方法。更具体地，本公开涉及侧向流测定装置以确定样品中分析物——包括当所关注的分析物以高浓度存在时——的浓度。
背景技术
包括本文所述的侧向流测定的免疫测定系统提供了可靠、便宜、便携式、快速且简单的诊断测试。侧向流测定可以快速且准确地检测出样品中存在或不存在感兴趣的分析物，并且在一些情况下定量感兴趣的分析物。有利地，侧向流测定可以是微创的，并且可以用作即时测试系统。已经开发出侧向流测定以检测多种医学或环境分析物。在夹心形式的侧向流测定中，针对感兴趣的分析物的标记抗体沉积在样品接收区中或其附近的试条上。标记的抗体可以包括，例如，与抗体结合的检测分子或“标记”。当将样品施加至试条上时，样品中存在的分析物被标记的抗体结合，该标记的抗体沿着试条流动至捕获区，在捕获区，针对该分析物的固定抗体与标记的抗体-分析物复合物结合。固定在捕获线上的抗体可能与沉积在样品接收区中或其附近的标记的抗体不同。检测捕获的复合物，并确定分析物的存在。在不存在分析物的情况下，标记的抗体沿着试条流动，但会经过捕获区。捕获区处的信号缺乏表明不存在分析物。然而，当感兴趣的分析物以高浓度存在于样品中时，夹心式侧向流测定具有许多缺点，包括假阴性、结果不准确以及缺乏分辨率。
发明内容
因此，本公开的一方面是提供改进的侧向流测定，其精确地测量样品中感兴趣的分析物——包括当分析物以高浓度存在于样品中时——的浓度。
本文公开的一些实施方式涉及测定试条，其包括配置为接收流体样品的流动路径；与流动路径偶联的样品接收区；捕获区；和复合物。捕获区与样品接收区下游的流动路径偶联，并包括对感兴趣的分析物具有特异性的固定化捕获剂。该复合物在第一阶段偶联至流动路径，并且配置为在第二阶段在流体样品的存在下在该流动路径中流动至捕获区。该复合物包括标记、与感兴趣的分析物特异性结合的抗体或抗体片段、以及感兴趣的分析物。在一些情况下，流动路径配置为接收包括未标记的感兴趣的分析物的流体样品，并且复合物在第一阶段或第二阶段不特异性地结合至未标记的感兴趣的分析物。在一些实例中，该复合物被配置为在第二阶段与未标记的感兴趣的分析物一起在流动路径中流动至捕获区。在一些实例中，复合物配置为在第三阶段与未标记的感兴趣的分析物竞争以与捕获区中的固定化捕获剂结合。在一些情况下，随着流体样品中未标记的感兴趣的分析物的浓度增加，由与捕获区中固定化捕获剂结合的复合物发出的光信号减小。
在一些实例中，流动路径配置为接收包括或不包括感兴趣的分析物的流体样品。当流体样品不包括感兴趣的分析物时，在第二阶段在捕获区中复合物特异性地结合至所有或基本上所有固定化捕获剂。在一些实例中，当流体样品不包括感兴趣的分析物时，由在捕获区中结合的复合物发出的光信号是可以由测定试条发出的最大光信号。当流体样品确实包括感兴趣的分析物时，由在捕获区中结合的复合物发出的光信号小于最大光信号。
在一些情况下，固定化捕获剂包括与感兴趣的分析物特异性地结合的抗体或抗体片段。在一些实例中，复合物在第一阶段被整合到试条的表面上。在一些实例中，通过将包括复合物的溶液喷雾到试条的表面上并干燥溶液，将复合物整合到试条的表面上。流体样品可以包括血液、血浆、尿液、汗液或唾液样品。在一个非限制性实例中，感兴趣的分析物包括C反应蛋白(CRP)，并且复合物包括与CRP结合的抗CRP抗体或其片段。
本文公开的其他实施方式涉及诊断测试系统，其包括上述测定试条；包括光源和检测器的读取器，以及数据分析器。在一些情况下，当读取器检测到来自测定试条的光信号是试条的剂量响应曲线的最大光信号时，数据分析器输出流体样品中不存在感兴趣的分析物的指示。在一个实例中，当读取器检测到来自测定试条的光信号在最大光信号的1％以内时，数据分析器输出流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。在另一个实例中，当读取器检测到来自测定试条的光信号在最大光信号的5％以内时，数据分析器输出流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。在仍另一个实例中，当读取器检测到来自测定试条的光信号在最大光信号的10％以内时，数据分析器输出流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。在进一步的实例中，当读取器检测到来自测定试条的光信号为最大光信号的90％或小于90％时，数据分析器输出流体样品中存在高浓度的感兴趣的分析物的指示。在又另一个实例中，当读取器检测到来自测定试条的光信号低于最大光信号时，数据分析器输出样品中感兴趣的分析物的浓度的指示。
本文公开的进一步实施方式涉及确定流体样品中感兴趣的分析物的浓度的方法。该方法包括当复合物在第一阶段中偶联至流动路径时，将流体样品施加至上述测定试条；将复合物与流动路径解偶联；在第二阶段流体样品和复合物在流动路径中流动至捕获区；在捕获区将复合物结合到固定化捕获剂；并且检测来自捕获区中与固定化捕获剂结合的复合物的信号。该检测的信号可以是光信号、荧光信号或磁信号。在一些情况下，将复合物解偶联包括用流体样品溶解复合物。在一些情况下，流体样品包括未标记的感兴趣的分析物，并且复合物在第一阶段或第二阶段中未特异性地结合至未标记的感兴趣的分析物。在另一个实例中，流体样品包括未标记的感兴趣的分析物，并且该复合物配置为在第三阶段中与未标记的感兴趣的分析物竞争，以与捕获区中的固定化捕获剂结合。在一个实例中，流体样品不包括感兴趣的分析物，并且检测包括检测试条的剂量响应曲线的最大光信号。
在一些情况下，该方法包括确定流体样品中分析物的浓度为零。在一些实例中，该方法进一步包括显示流体样品中不存在感兴趣的分析物的指示。
在一个实例中，流体样品包括感兴趣的分析物，并且检测包括检测来自试条的信号，该信号小于试条的剂量响应曲线的最大信号。在一些情况下，该方法进一步包括确定流体样品中分析物的浓度大于零。在一些情况下，该方法进一步包括显示流体样品中存在感兴趣的分析物的指示。在一个实例中，该方法进一步包括确定检测到的信号在最大光信号的10％以内；并显示感兴趣的分析物以低浓度存在于流体样品中的指示。在另一个实例中，该方法进一步包括确定检测到的信号为最大信号的90％或小于最大信号的90％；并显示感兴趣的分析物以高浓度存在于流体样品中的指示。
本文公开的另外的实施方式涉及制造测定试条的方法，该方法包括将样品接收区偶联至配置为接收流体样品的流动路径；将捕获区偶联至样品接收区下游的流动路径；并且将复合物偶联至流动路径。复合物包括标记；特异性地结合感兴趣的分析物的抗体或抗体片段；和感兴趣的分析物。在一些情况下，感兴趣的分析物包括C反应蛋白(CRP)，并且抗体包括抗CRP抗体或抗CRP抗体片段。在一个实例中，感兴趣的分析物包括约50ng的CRP。在另一个实例中，感兴趣的分析物包括约100ng的CRP。在一些情况下，该方法进一步包括将对感兴趣的分析物具有特异性的捕获剂固定在捕获区上。在一些实例中，将复合物偶联至流动路径包括在复合物和流动路径之间形成结合，该结合在流动路径中存在流体样品的情况下断裂。在一个实例中，偶联复合物包括将包括复合物的溶液喷雾到样品接收区的表面上。在另一个实例中，偶联复合物包括将包括复合物的溶液喷雾到样品接收区和捕获区之间的测定试条的表面上。在进一步的实例中，偶联复合物包括将包括复合物的流体溶液施加到测定试条的表面上；并干燥液体溶液。在仍另一个实例中，偶联复合物包括将复合物整合到测定试条的表面上。
在一些实例中，该方法进一步包括提供包括复合物的溶液。在一些情况下，提供溶液包括将包括标记和抗体或抗体片段的第一液体与包括感兴趣的分析物的第二液体混合。在一些实例中，提供溶液进一步包括将第一液体和第二液体的混合物温育约30分钟。在一些实例中，将复合物偶联至流动路径包括将溶液喷雾到测定试条的表面上。本文公开的仍进一步的实施方式涉及通过上述方法制备的测定试条。
附图说明
图1A和1B示出了在将流体样品施加在样品接收区之前和之后的实例夹心式侧向流测定。
图2示出了图1A和1B的侧向流测定的实例剂量响应曲线。
图3A和3B示出了在将流体样品施加在样品接收区之前和之后的实例竞争型侧向流测定。
图4示出了图3A和3B的竞争侧向流测定的实例剂量响应曲线。
图5A和5B示出了在将流体样品施加在样品接收区之前和之后，根据本公开的实例侧向流测定。
图5C示出了图5A和5B的侧向流测定的实例剂量响应曲线。
图6A示出了夹心式侧向流测定的实例剂量响应曲线——比如图1A和图1B所示出和根据本公开的侧向流测定的实例剂量响应曲线，其中分析物的浓度沿x轴以对数标度测量。
图6B示出了根据本公开的侧向流测定的图6A的实例剂量响应曲线，其中分析物的浓度沿x轴以非对数标度测量。
图7A和7B分别示出了实验数据表和代表实验数据的图，其将通过根据本公开的一个实施方式的侧向流测定测量的CRP浓度与通过ELISA所确定的CRP浓度相关联。
具体实施方式
本文所述的装置、系统和方法精确地确定样品中感兴趣的分析物的量，例如已知体积的样品中分析物的浓度。有利地，根据本公开的侧向流装置、测试系统和方法在感兴趣的分析物以升高的或“高”浓度存在于样品中的情况下精确地确定感兴趣的分析物的量。当样品中感兴趣的分析物的浓度为零时，本文所述的侧向流测定可产生最大强度的信号。本文在反射型标记(例如但不限于金纳米颗粒标记)产生的光信号的背景下描述了由根据本公开的测定产生的信号。虽然本文通过参考“光学”信号描述了本公开的实施方式，但应理解，本文所述的测定可将任何合适的材料用于标记，以便产生可检测的信号，其包括但不限于产生荧光信号的荧光型乳胶珠标记和产生指示与测定相关的磁场变化的信号的磁性纳米颗粒标记。对于低浓度的分析物，本文所述的侧向流测定产生与最大强度信号相同或基本等同于最大强度信号(在有限的偏差范围内)的光信号。根据本公开的侧向流测定产生小于针对升高的或“高”浓度的感兴趣的分析物的最大强度信号的信号。
根据本公开，包括标记-抗体-分析物复合物的标记的试剂最初被整合到侧向流测定试条的表面上，例如整合到其缀合垫上。在将流体样品施加至试条之后，标记-抗体-分析物复合物变成与标记区未结合，并且与流体样品和该样品中的任何感兴趣的分析物(如果存在)一起行进至试条的捕获区。样品中的标记-抗体-分析物复合物和感兴趣的分析物(当存在时)与捕获区中的捕获剂结合。当样品中没有感兴趣的分析物与标记-抗体-分析物复合物竞争时，捕获剂完全结合至标记-抗体-分析物复合物，这产生最大强度的信号。当感兴趣的分析物以低浓度存在于样品中时，标记-抗体-分析物复合物与相对少量的未标记的分析物竞争以与捕获剂结合，这产生与最大强度信号相同或基本等同于最大强度信号(在有限的偏差范围内)的信号。当感兴趣的分析物以高浓度存在于样品中时，标记-抗体-分析物复合物与相对大量的未标记分析物竞争以与捕获剂结合，这产生小于最大强度信号的信号。
不受任何特定理论的束缚，以整合在标记区中的标记-抗体-分析物复合物形式的标记的分析物的添加掩盖了信号不断增加的夹心式侧向流测定剂量响应曲线的部分(当分析物浓度较低时)，从而产生改进的剂量响应曲线，该曲线从零浓度下的最大强度信号开始，然后或者保持相对恒定(低浓度下的分析物)或降低(高浓度下的分析物)。本公开的侧向流测定通过消除信号增加的剂量响应曲线的阶段(phase)解决了与夹心式侧向流测定的钩状效应(hook effect)相关的缺点。
当分析物处于高浓度时，由本文所述的侧向流测定产生的信号包括许多有利特征。在产生光信号的实例实施方式中，当分析物处于高浓度时产生的信号是容易可检测到的(例如，它们具有在常规读取器通常可以辨别并且被良好地间隔开的光信号范围内的强度)，它们在剂量响应曲线上不与零或低浓度下产生的信号重叠，并且它们可以用于计算高浓度和甚至很高浓度下的高精度浓度读数。本文所述的侧向流测定的实施方式避免了将特定检测信号与一定数量的分析物量(特别是高浓度的分析物)相关联相关的不确定性，比如在读取夹心式侧向流测定中产生的不确定性，由于钩状效应该夹心式侧向流测定产生对应于低浓度和高浓度的分析物二者的单个光信号。相反，根据本发明的侧向流测定产生清楚且明确地对应于零或低浓度的分析物(等于或基本等于最大强度信号的光信号)或高浓度的分析物(光信号小于最大强度信号的光信号)的光信号。在一些情况下，零或低浓度可以与受试者中分析物的正常或“健康”水平直接相关联，而高浓度的分析物可以与受试者中分析物的非正常或“不健康”水平直接相关联。
此外，根据本公开的侧向流测定的实施方式与用于确定样品中分析物的量的当前的金标测定——比如酶联免疫吸附测定(ELISA)——强烈相关联。有利地，已经发现，通过本文所述的侧向流测定的实施方式确定的CRP浓度与通过ELISA确定的CRP浓度强烈相关联。在以下所述的一个工作实例中，获得了使用根据本公开的测定的实施方式测量的CRP浓度与通过ELISA确定的CRP浓度之间的93％的相关性。
本文所述的侧向流测定的实施方式在针对感兴趣的分析物的诊断测试中特别有利，该感兴趣的分析物在健康个体中以低浓度自然存在但在患有疾病病况或病症的个体中升高至高浓度。在零到低浓度范围内产生与最大强度信号有相对小偏差的光信号，在这种情况下操作人员仅试图确认分析物以低浓度存在(健康水平的指标)，并且不需要光信号的特异性或分辨率；而在操作人员试图确认分析物以高浓度存在(非正常或疾病病况的指示)，特别地每当其处于高浓度时试图对感兴趣的分析物进行定量的情况下，产生与最大强度信号有高偏差的易于检测的高分辨率光信号。在感兴趣的分析物处于高浓度范围内时，能够准确查明感兴趣的分析物的精确浓度的能力还可以使得操作人员能够确定受试者的疾病或其他病况的阶段或进展，比如轻度阶段或重度阶段。
侧向流测定的各个方面提供了优于现有侧向流测定的优点。例如，在一些实施方式中，本文所述的侧向流测定不需要多条测试线，而是具有通过仅使用一条捕获线能够准确地确定分析物的浓度并且还确定测试是否正常起作用的能力。此外，在一些实施方式中，本文所述的侧向流测定可以准确地确定样品中升高的分析物的浓度，而无需首先稀释样品。另外，在一些实施方式中，可以改变放置在侧向流测定上的预先形成的标记-抗体-分析物复合物的量，以适应不同浓度范围的分析物的要求。
在下文中，将参考附图更全面地描述装置、测试系统和方法的各个方面。然而，本公开可以以许多不同的形式体现。基于本文的教导，本领域技术人员应领会，本公开的范围旨在覆盖本文公开的装置、测试系统和方法的任何方面，无论其是独立地还是与本公开的任何其他方面组合实施。例如，使用本文阐述的任何许多方面，可以实施装置或者可以实践方法。
虽然本文描述了特定方面，但是这些方面的许多变化和排列都落在本公开的范围内。虽然提及了一些益处和优点，但是本公开的范围并不旨在限于特定的益处、用途或目的。相反，本公开的方面旨在广泛地适用于不同的检测技术和装置配置，其中一些通过实例在附图和以下描述中示出。详细描述和附图仅是对本公开的说明而不是限制性的，本公开的范围由所附权利要求及其等同物限定。
本文所述的侧向流装置是在侧向流层析中使用的分析装置。侧向流测定是可以在本文所述的侧向流装置上进行的测定。侧向流装置可以在试条上实施，但是其他形式可以是合适的。在试条格式中，怀疑含有分析物的测试样品流体流动通过(例如通过毛细作用)试条。该试条可由吸水材料比如纸、硝化纤维素和纤维素制成。样品流体被接收在样品储器中。样品流体可以沿着试条流动至捕获区，在该捕获区中分析物(如果存在)与捕获剂相互作用，以指示分析物的存在、不存在和/或数量。捕获剂可以包括固定在捕获区中的抗体。
夹心式和竞争型侧向流测定
可以以夹心或竞争形式进行侧向流测定。本文所述的夹心和竞争形式测定将在产生光信号的反射型标记(例如金纳米粒子标记)的背景下进行描述，但应理解，测定可以包括配置为产生荧光信号的乳胶珠标记、配置为产生磁信号的磁性纳米颗粒标记、或配置为产生可检测信号的任何其他标记。夹心式侧向流测定包括标记的抗体，其沉积在固体基质上的样品储器处。在将样品施加至样品储器后，标记的抗体溶解在样品中，然后抗体识别并结合样品中分析物上的第一表位，形成标记-抗体-分析物复合物。该复合物沿着液体前沿从样品储器通过固体基质流动至捕获区(有时称为“测试线”)，其中固定化抗体(有时称为“捕获剂”)位于该捕获区。在其中分析物为多聚体或在相同单体上含有多个相同表位的一些情况下，沉积在样品储器的标记的抗体可以与固定在捕获区中的抗体相同。固定化抗体识别并结合分析物上的表位，从而在捕获区捕获标记-抗体-分析物复合物。在捕获区存在标记的抗体在捕获区提供了可检测的光信号。在一个非限制性实例中，金纳米颗粒被用于标记抗体，因为它们相对便宜、稳定且基于金纳米颗粒的表面等离子体共振性质提供易于观察的颜色指示。在一些情况下，该信号提供定性信息，比如样品中是否存在分析物。在一些情况下，该信号提供定量信息，比如对样品中分析物数量的测量。
图1A和1B示出了实例夹心式侧向流装置10。侧向流装置10包括样品储器12、标记区14、捕获区16和对照线18。图1A和1B示出了在将流体样品24施加至样品储器12之前和之后的侧向流装置10。在图1A和1B所示出的实例中，样品24包括感兴趣的分析物26。样品储器12中或其附近的标记区14包括标记的试剂28。在该实例夹心式侧向流装置中，标记的试剂28包括结合至标记32的抗体或抗体片段30。捕获剂34固定在捕获区16中。对照试剂35固定在对照线18上。
当将流体样品24施加至样品储器12时，样品24使标记的试剂28增溶，并且标记的试剂28结合至分析物26，形成标记-抗体-分析物复合物20。因此，在实例夹心式侧向流装置10中，直到将含有感兴趣的分析物26的流体样品24施加至侧向流装置之后，才形成标记-抗体-分析物复合物20。进一步地，在实例夹心式侧向流装置10中，标记-抗体-分析物复合物20中的分析物是来自流体样品24的分析物。如图1B所显示，该复合物20流动通过试条至捕获区16，在该捕获区16中，其被捕获剂34结合。现在结合的复合物20(具体地，现在结合的复合物20上的标记32)在捕获区16发出可检测的光信号。
未结合任何分析物26的标记的试剂28穿过捕获区16(没有分析物26结合至捕获区16中的捕获剂34)并沿着侧向流装置10继续向下流动。在包括对照线18的侧向流测定中——比如在此所示出的，沉积的对照试剂35捕获未结合至分析物26并穿过捕获区16至对照线18的标记的试剂28。在一些实施方式中，对照试剂35在抗体的Fc区捕获标记的试剂28。在一些实施方式中，对照试剂35在抗体的Fab区捕获标记的试剂28。结合在对照线18上处的该标记的试剂28发出可检测的光信号，该光信号可被测量并用于指示测定按预期运行(例如，在侧向流测定的正常运行期间，样品24如预期从样品储器12流出并通过捕获区16)。实例夹心式侧向流装置10的一个缺点是，在对照线18处产生的信号的强度取决于在捕获区16处产生的信号的强度(因为在对照线18处的对照试剂1835捕获在捕获区16中未结合分析物26并且然后穿过至对照线18的标记的试剂28)。例如，如果相对大量的分析物26在捕获区16中，那么相对少量的分析物26将穿过捕获区16并且可用于在对照线18处结合至对照试剂35，从而这导致对照线18处相对较弱的强度信号。
侧向流测定可以提供定性信息，比如关于样品中不存在或存在感兴趣的分析物的信息。例如，在捕获区16处检测到任何可测量的光信号可以指示感兴趣的分析物(以一些未知的量)存在于样品中。在捕获区不存在任何可测量的光信号可以指示感兴趣的分析物不存在于样品中或低于检测限。例如，如果样品24不含有任何感兴趣的分析物26(未示出)，那么样品24仍将使标记的试剂28增溶，并且标记的试剂28仍将流动至捕获区16。然而，标记的试剂28在捕获区16将不结合至捕获剂34。相反地，它将流动通过捕获区16，流动通过对照线18，并在一些情况下流动至任选的吸收区。一些标记的试剂28将结合至沉积在对照线18上的对照试剂35并发出可检测的光信号。在这些情况下，没有从捕获区16发出的可测量的光信号是在样品24中不存在感兴趣的分析物的指示，而存在从对照线18发出的可测量的光信号是在侧向流测定的正常运行期间，如所预期，样品24从样品接收区12行进通过捕获区16并至捕获线18的指示。
一些侧向流装置可以提供定量信息，比如样品中感兴趣的分析物的量的测量。从侧向流装置获得的定量测量可以是在给定体积的样品中存在的分析物的浓度。图2示出了从图1A和1B中示出的夹心式侧向流测定获得的实例定量测量。图2是剂量响应曲线，其以图形方式示出了在捕获区检测到的信号强度(沿y轴测量的)和样品中分析物浓度(沿x轴测量的)之间的关系。实例信号包括光信号、荧光信号和磁信号。
如图2中在零浓度处的第一数据点所显示，如果样品不含有任何感兴趣的分析物，那么样品中分析物的浓度为零，并且没有分析物结合至标记的试剂以形成标记-抗体-分析物复合物。在这种情况下，没有复合物流动至捕获区并结合至捕获抗体。因此，在捕获区处没有观察到可检测的光信号，并且信号幅度为零。
当样品中分析物的浓度从零浓度增加时，检测到信号。如阶段A中的数据点所证明的，信号随着样品中分析物浓度的增加而增大。发生这种情况是因为，随着分析物浓度增加，标记-抗体-分析物复合物的形成增加。固定在捕获区处的捕获剂结合越来越多的流动至捕获区的复合物，这导致在捕获区处检测到的信号增大。在阶段A中，信号随着样品中分析物浓度的增加而继续增大。
在一些实例中，如果样品具有的分析物浓度超过可用于结合至分析物的标记的试剂的量，那么存在过量的分析物。在这些情况下，未被标记的试剂结合的过量分析物与标记-抗体-分析物复合物竞争，以与捕获区中的捕获剂结合。捕获区中的捕获剂将结合至未标记的分析物(换句话说，未与标记的试剂结合的分析物)并且结合至标记-抗体-分析物复合物。然而，结合至捕获剂的未标记的分析物不发出可检测的信号。随着阶段B中样品中分析物浓度增加，结合至捕获剂的未标记的分析物(代替发出可检测信号的标记-抗体-分析物复合物)的量也增加。随着越来越多的未标记的分析物代替标记-抗体-分析物复合物结合至捕获剂，在捕获区处检测到的信号减小，如阶段B中数据点所显示。
这种在阶段A期间检测到的信号增大且在阶段B期间检测到的信号减小的现象称为“钩状效应”。随着在阶段A中分析物的浓度增加，更多的分析物结合至标记的试剂，这导致增大的信号强度。在点“Concsat”处，标记的试剂被来自样品的分析物饱和(例如，可用量的标记的试剂已全部或几乎全部结合至来自样品的分析物)，并且检测到的信号达到最大值Signalmax。随着在阶段B中样品中分析物的浓度继续增加，检测到的信号减小，因为在标记的试剂饱和点以上的过量分析物与标记的试剂-分析物竞争，以结合至捕获剂。
钩状效应，也称为“前带效应(prozone effect)”，对侧向流测定产生不利影响，特别是在感兴趣的分析物以阶段B中的浓度存在于样品中的情况下。钩状效应可以导致不准确的测试结果。例如，钩状效应可能导致假阴性或不准确地低的结果。具体地，当样品含有超过沉积在试条上的标记的试剂的浓度的升高水平的分析物时，会出现不准确的结果。在这种情况下，当将样品放置在试条上时，标记的试剂变得饱和，并且并非所有分析物都被标记。未标记的分析物流动通过测定并在捕获区结合，胜过标记的复合物，从而减小了可检测的信号。因而，装置(或装置的操作人员)无法区分光信号是对应于低浓度还是高浓度，因为单个检测到的信号对应于低浓度和高浓度二者。如果分析物水平足够高，那么分析物将完全胜过标记的复合物，并且在捕获区未观察到信号，这导致假阴性测试结果。
不准确的测试结果也可能由竞争型侧向流测定引起。与夹心式侧向流测定相反，在竞争型侧向流测定中，来自样品的未标记的感兴趣的分析物与标记的感兴趣的分析物竞争，以在捕获区结合至捕获剂。图3A和3B示出了实例竞争型侧向流测定22。侧向流装置22包括样品储器12、标记区14和捕获区16。图3A和3B示出了将流体样品24施加至样品储器12之前和之后的侧向流装置22。在图3A和3B所示出的实例中，流体样品24包括感兴趣的分析物26。在样品储器12中或其附近的标记区14包括标记的试剂29。在该实例竞争型侧向流装置中，标记的试剂29包括结合至标记32的感兴趣的分析物26。捕获剂34固定在捕获区16中。
将包括未标记的分析物26的样品24施加至样品储器12。样品24使标记的试剂29增溶。样品24中的未标记的分析物26和标记的试剂29一起流动至捕获区16，在该区域来自样品24的未标记分析物26和标记的试剂29二者都结合至固定在捕获区16中的捕获剂34。如图3B所显示，标记的试剂和未标记的分析物26彼此竞争以结合至固定量的捕获剂34。结合至捕获剂34的标记的试剂29(具体地，标记的试剂29中的标记32)发出可检测的光信号，而源自样品24且结合至捕获剂34的未标记的分析物26不发出可检测的光信号。
来自捕获区16的光信号的检测可以提供关于感兴趣的分析物26的定性或定量信息。在其中流体样品24不包括任何分析物26(未示出)的情况下，样品24仍将使标记的试剂29增溶并且标记的试剂29仍将流动至捕获区16。捕获区16中的捕获剂34将结合至标记的试剂29(其不与来自样品的任何未标记的分析物竞争)，导致检测到最大强度或接近最大强度的光信号。在样品24包括非常低或较低浓度的分析物26的情况下，也可以检测最大强度或接近最大强度的光信号。这是因为结合至捕获剂34的未标记的分析物26与结合至捕获剂34的标记的试剂29的比例低。因而，可能难以确定处于最大强度的检测到的光信号是否应与样品24中零浓度或低浓度的分析物26相关联。
随着样品24中未标记的分析物26的浓度增加，从捕获区16发出的检测到的光信号减小。这是因为随着样品中分析物浓度的增加，对捕获剂34的竞争增加，并且结合至捕获剂34的未标记的分析物26与结合至捕获剂34的标记的试剂29的比例将逐渐增大。然而，如果分析物以高或非常高的浓度存在于样品中，则在捕获区16处检测到的光信号迅速减小至低幅度信号。这种随着样品中分析物浓度增加至高和非常高的浓度光信号强度的快速下降使得难以(如果可能的话)精确地确定分析物的浓度，并且在一些情况下使装置根本无法确定分析物的浓度。当感兴趣的分析物以高浓度存在时(例如，当未标记的分析物与标记的试剂的比例较高时)，如图3A和3B所示的竞争型侧向流装置实际上无法准确地确定感兴趣的分析物的精确浓度。图4示出了在以上参考图3A和3B所描述的实例竞争型侧向流装置中产生的剂量响应曲线。如图4所显示，竞争型侧向流测定的剂量响应曲线在分析物浓度在大约1至20μg/mL范围内时表现为急剧下降。由于曲线的急剧下降，因此分辨率很差，降低了确定高浓度分析物的量的准确性，并且在一些情况下，使得以任何精确度确定以高浓度存在于样品中的分析物的量都是不切实际的或几乎不可能的。
精确定量以高浓度存在于样品中的分析物的实例侧向流装置
本文所述的侧向流测定、测试系统和方法解决了比如图2A、2B、3A和3B所示出的那些夹心式和竞争型侧向流测定的这些和其他缺点。图5A和5B示出了实例侧向流测定100，其可以精确地测量以高浓度存在于样品中的感兴趣的分析物的量。图5C是实例剂量响应曲线，其以图形方式示出了由侧向流测定100测量的光信号，并且具体地示出了在捕获区处检测到的光信号的幅度(沿y轴测量的)和施加至该测定的样品中分析物的浓度(沿x轴测量的)之间的关系。应当理解，虽然在产生光信号的反射型标记的背景下描述了根据本公开的测定，但是根据本发明的测定可以包括配置为产生荧光信号、磁信号或任何其他可检测信号的任何合适材料的标记。
侧向流测定100包括具有样品接收区112、标记区114和捕获区116的试条110。图5A和5B示出了在将流体样品124施加至样品储器112之前和之后的侧向流装置100。在示出的实例中，标记区114沿着试条110内的样品流118的方向在样品接收区112的下游。在一些情况下，样品接收区112位于标记区114内和/或与标记区114共同延伸。捕获剂134被固定在捕获区116中。
标记的试剂128被整合在标记区114上。在根据本公开的侧向流装置中，比如参考图5A和5B所讨论的非限制性实例，标记的试剂128包括结合在一起以形成复合物的至少三种组分：标记(检测分子)132、感兴趣的分析物126和对感兴趣的分析物126具有特异性的抗体或抗体片段130。标记的试剂128是标记-抗体-分析物复合物128。在一些情况下，在操作人员使用试条110之前，形成标记的试剂128并且将其施加至试条110。例如，可以在试条110的制造期间将标记的试剂128整合在标记区114中。在另一个实例中，在制造之后但在将流体样品施加至试条110之前，可以将标记的试剂128整合在标记区114中。标记的试剂128可以以下面更详细讨论的多种方式整合到试条110中。
因此，在本公开的侧向流装置的实施方式中，在将任何流体样品124施加至侧向流装置之前，形成标记-抗体-分析物复合物128并将其整合在试条110上。在一个非限制性实例中，在将任何流体样品124施加至侧向流装置之前，形成标记-抗体-分析物复合物128并将其整合至试条110的缀合垫上。进一步地，在本公开的侧向流装置的实施方式中，标记-抗体-分析物复合物128中的分析物不是来自流体样品124的分析物。
为了使用试条110进行测试，在样品接收区112上沉积可能包括或可能不包括感兴趣的分析物126的样品124。在其中标记区114在样品接收区112下游的所示出的实施方式中，样品124中未标记的感兴趣的分析物126接着流动至标记区114并与整合的标记的试剂128接触。样品124使标记的试剂128增溶。在一个非限制性实例中，样品124溶解标记的试剂128。释放(release)将标记的试剂128保持在标记区114中的试条110的表面上的键，使得标记的试剂128不再整合到试条110的表面上。接着，标记的试剂128与样品124中的未标记的分析物126一起沿着流体前沿迁移至捕获区116。捕获区116处的捕获剂134结合至来自样品124的标记的试剂128和分析物126(如果存在的话)。取决于样品124中未标记的分析物126的量，标记的试剂128和未标记的分析物126彼此竞争以结合至捕获区中的捕获剂134。
因此，根据本公开的侧向流装置具有包括标记-抗体-分析物复合物的标记的试剂，该标记的试剂在第一阶段(例如，在将流体样品施用至侧向流装置之前)结合至侧向流装置的标记区，并且然后在第二、后续阶段(例如，在将流体样品施加至样品接收区之后)迁移通过试条。根据本公开的标记的试剂在第三阶段(例如，在流体样品已经流动至捕获区之后)可以结合至捕获区中的捕获剂。因而，本文所述的标记的试剂可最初定位在侧向流装置的第一区域(例如标记区)中，然后(在与流体接触之后)与流体一起迁移至第一区域下游的侧向流装置的其他区域，并且然后结合至捕获区中的捕获剂。
如上所述，流体样品124使标记的试剂128增溶。在一种实施中，样品124中感兴趣的分析物126在该过程中不与标记的试剂128相互作用或者基本上不与标记的试剂128相互作用。不受任何特定理论的束缚，在本文所述的侧向流装置的这种实施中，当样品124流动通过标记区114时，未标记的感兴趣的分析物126不与标记的试剂128缀合、结合或缔合。这与以上参照图1A和1B讨论的夹心式侧向流装置相反，在图1A和1B中，当样品24流动通过标记区14时，标记的试剂28结合至未标记的感兴趣的分析物26上。在本文描述的侧向流装置的另一个实施中，当流体样品124使标记的试剂128增溶时，样品124中的感兴趣的分析物126与标记的试剂128相互作用。不受任何特定理论的束缚，在该实施中，捕获区116中的捕获剂134可以结合至至少一些标记-抗体-分析物复合物，其中复合物中的分析物是经由样品124引入到装置上的感兴趣的分析物126。
当样品124中不存在感兴趣的分析物126时(未示出)，标记的试剂128在捕获区116处使捕获剂134饱和(例如，捕获区135中的每个捕获剂134分子结合至从标记区114流出的一个标记的试剂128)。在捕获区116中捕获的标记的试剂128发出可检测的光信号，该光信号是可以从侧向流装置100获得的最大强度信号。在样品124中不存在感兴趣的分析物126的情况下在捕获区116处检测到的光信号在本文中被称为“最大强度信号”，因为在捕获区116处的每个可用捕获剂134已结合至标记的试剂128。在图5C所示出的非限制性实例中，当感兴趣的分析物的浓度为零时获得的最大强度信号为或约为76AU(任意信号强度单位)。
存在许多方法以确定侧向流装置100的最大强度信号。在一个非限制性实例中，可以凭经验确定可以从特定侧向流装置100获得的最大强度信号并将其存储在查询表中。在一些情况下，通过测试已知特征和构造的侧向流装置100例如，通过对将感兴趣的分析物的浓度为零或几乎为零的样品施加至已知规格和构造的侧向流装置100时获得的最大强度信号取平均值，凭经验确定最大强度信号。在另一个非限制性实例中，考虑到侧向流装置100的已知规格和构造(例如，标记区114上整合的标记的试剂128的量和特定特性)，可以使用理论计算确定可以从特定侧向流装置100获得的最大强度信号。
进一步地，将理解的是，虽然在本文中参考“最大强度信号”，但是在预期最大强度的特定范围内的信号可以被认为基本上等同于“最大强度信号”。另外，将理解的是，“最大强度信号”可以指最大强度光信号、最大强度荧光信号、最大强度磁信号或以最大强度出现的任何其他类型的信号。作为一个非限制性实例，在预期最大强度信号的1％以内的检测到的信号被认为基本上等同于预期最大强度信号。如果最大强度信号为或约为76AU，那么在约75.24AU至约76.76AU范围内的检测到的信号将被认为基本上等同于76AU的最大强度信号。作为另一个实例，在参考图5C、6A和6B描述的非限制性实施方式中，在预期最大强度信号的10％以内的检测到的信号被认为基本上等同于预期最大强度信号。因而，在其中最大强度信号为或约为76AU的图5C所示出的实例中，在约68.4AU至约83.6AU的范围内的检测到的信号被认为基本上等同于76AU的最大强度信号。提供这些实例仅出于说明目的，因为其他变化是可以接受的。例如，在根据本公开的侧向流测定装置中，与预期的最大强度信号在任何合适的偏差范围内(比如，但不限于在预期最大强度信号的1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％以内)的检测到的信号可以被认为基本上等同于预期最大强度信号。
在比如其中样品124中存在感兴趣的分析物126的图5A和5B所示的情况下，来自标记区114的标记的试剂128和来自样品的分析物126流动至捕获区116，在该捕获区116中它们竞争以与捕获剂134结合。在一个实例中，感兴趣的分析物126以低浓度存在于样品124中。当在捕获区116处检测到的光信号与最大强度信号相同、与最大强度信号基本上相同和/或在与最大强度信号的特定偏差范围内时，可以认为感兴趣的分析物126以低浓度存在于样品124中。在一个非限制性实例中，当检测到的光信号在76AU的5％以内(或在约72.2AU至约79.8AU内)时，认为感兴趣的分析物126以低浓度存在于样品中。在76AU的5％以内的光信号与在0至约1μg/mL之间的感兴趣的分析物的浓度相关联，因此在此实例中，在0至约1μg/mL之间的浓度将被视为感兴趣的分析物的低浓度。在图5C所示出的非限制性实例中，当检测到的光信号在76AU的10％以内(或在约68.4AU至约83.6AU以内)时，认为感兴趣的分析物126以低浓度存在于样品中。在76AU的10％以内的光信号与在0和约10μg/mL之间的感兴趣的分析物的浓度相关联，因此在此实例中，在0和约10μg/mL之间的浓度将被视为感兴趣的分析物的低浓度。在样品124中存在相对较少的感兴趣的分析物126的这种低浓度情况下，结合至捕获剂的来自样品124的感兴趣的分析物126相对于结合至捕获剂的标记的试剂128的比例较低。在低浓度的这种情况下，在捕获区116处检测到的光信号将等于或略小于样品124中不存在感兴趣的分析物126将检测到的最大强度信号。
随着样品124中分析物126的浓度从约1μg/mL增加至10μg/mL，然后至20μg/mL，以及更高的浓度，更多的分析物126存在于捕获区116以与标记的试剂128竞争以结合至捕获剂134。随着分析物126的浓度增加，这导致更少的标记的试剂128在捕获区134结合，并且在捕获区116检测到的光信号减小。
如图5C所示出，在根据本公开的侧向流装置的实施方式中，随着感兴趣的分析物浓度增加，有利地是，信号逐渐减小。作为检测到的信号的这种逐渐减小的结果，本文描述的侧向流装置的实施方式有利地允许检测器以高分辨率精确地测量信号并且允许数据分析器以高精度确定当浓度较高时感兴趣的分析物的浓度。这与以上参考图3A、3B和4描述的竞争型侧向流装置相反。
此外，根据本公开的侧向流装置的剂量响应曲线有利地从最大强度信号开始，然后从该最大强度信号减小。这意味着，有利地，在剂量响应曲线中信号减小的部分中，没有信号具有与最大强度信号相同的幅度。进一步地，因为当样品中分析物的浓度较低时的信号与最大强度信号相同或有效地相同(例如，如上所述，它们被认为基本上等同于最大强度信号)，因此存在对于零至低浓度的分析物光信号处于相对恒定值(“最大强度信号”)的平台(如以下将参考非限制性实例详细讨论)。这意味着，有利地，在剂量响应曲线中信号减小的部分中，没有信号具有与最大强度信号大约相同的幅度。因而，在本文所述的侧向流装置的实施方式中，避免了假阴性和不正确的低读数。这与以上参照图1A、1B和2讨论的夹心式侧向流装置相反，在该装置中，样品中高浓度的分析物将产生与分析物浓度较低时产生的信号相同或大约相同的信号。
有利地，在本文所述的侧向流装置的实施方式中，在沉积到缀合垫上之前，可以预先配制标记的试剂128以包括已知量的感兴趣的分析物。在一些实施方式中，将已知浓度的感兴趣的分析物与抗体或抗体片段和标记分子在与试条分开的反应容器中温育。在温育期间，感兴趣的分析物与抗体和标记分子缀合、结合或缔合，以形成如上所述的标记的试剂128。在温育之后，将标记的试剂128以精确的已知浓度直接添加到溶液中，或者分离以除去过量的游离CRP，然后喷雾至缀合垫上。将包括标记的试剂128的溶液施加至试条上，比如上述的标记区域114上。在沉积期间，标记的试剂128变得整合在试条的表面上。在一个非限制性实例中，标记的试剂被整合到试条的缀合垫上。有利地，标记的试剂128可以保持物理结合至试条的表面上和在试条的表面上化学稳定，直到操作人员将流体样品施加至试条，然后标记的试剂128从试条上解除结合并且与如以上所述的流体样品一起流动。
在一些实施方式中，标记的试剂128以范围约0.1-20μL/试条的量沉积。在一些实施方式中，标记的试剂128以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μL/试条的量沉积在标记区。
可以以许多不同方式将包括标记的试剂128的溶液施加至试条上。在一个实例中，通过用喷气(airjet)技术将溶液喷雾而将溶液施加至标记区114。在另一个实例中，通过倾倒溶液、喷雾溶液、将溶液配制成置于或摩擦在试条上的粉末或凝胶，或任何其他合适的方法以施加分离的标记的试剂128来沉积包括标记的试剂128的溶液。在一些实施方式中，在沉积之后，通过在缀合垫上加热或吹气，将标记的试剂128在沉积后的试条的表面上干燥。干燥在试条的表面上的标记的试剂128的其他机制是合适的。例如，真空或冻干也可以用于干燥在缀合垫上的标记的试剂128。在一些情况下，在沉积之前不将分离的标记的试剂128添加至溶液中，而是将其直接施加至试条上。标记的试剂128可以使用任何合适的方法直接施加，所述方法包括但不限于对试条的表面上的标记的试剂128施加压缩或真空压力和/或将冻干颗粒形式的标记的试剂128施加至试条的表面。
图5A和5B所示出的侧向流测定的实施方式不需要包括对照线或对照区，该对照线或对照区配置为确认施加在样品接收区112中的样品已按预期流动至捕获区116。在正常运行情况下，如果样品已经流动至捕获区116，那么总是从捕获区116发出一些可检测的信号。即使感兴趣的分析物以极低的浓度存在于样品中，情况也是如此，因为本公开的侧向流装置具有对于低浓度保持在最大强度信号处或其附近的剂量响应曲线。因此，在已经将样品施加至样品接收区112之后在捕获区116处没有任何可检测到的信号可以用于指示侧向流测定没有按预期运行(例如，样品没有如预期流动至捕获区116，或者作为另一个实例，捕获区处的固定化捕获剂134是有缺陷的或不完善的)。因此，根据本公开的侧向流装置的实施方式的进一步优势是捕获区起对照线作用的能力，从而允许从试条上完全省去单独的对照线。然而，将理解的是，出于多种目的，本文所述的侧向流装置的实施方式可以包括对照线，其包括但不限于观察线，用于归一化噪声或用于检测来自血清中分析物的干扰。
在一些情况下，根据本公开的侧向流测定包括对照线，比如类似于以上参考图1A和1B描述的对照线18的对照线。在一个实施方式(未示出)中，侧向流测定包括包含捕获试剂的对照线，该捕获试剂发出的信号的信号强度独立于由捕获区116中的标记的试剂128产生的信号强度的强度。在一种实施中，侧向流测定包括多个捕获区(包括至少一个捕获区116，其配置为捕获根据本公开的标记的试剂128)，每个捕获区配置为指示不同的感兴趣的分析物的存在、不存在和/或浓度，并且单个对照线配置为指示样品按预期流动通过多个捕获区。与以上参考图1A和1B描述的对照线18相反，在该实施中，从对照线发出的信号的强度可能与从任何捕获区发出的信号的强度不相关或不取决于它们。在其中当感兴趣的分析物以极高的浓度存在于样品中时捕获区116发出相对较弱强度信号的情况下，包括对照线的实施方式也可能是有利的。在这种情况下，从捕获区116发出的信号强度可能不足以确认测定按预期运行(例如，样品按预期流动通过捕获区116)。
进一步地，测试多种不同感兴趣的分析物的存在、不存在和/或数量的多重测定可以在如以上参考图1A和1B所述的一种或多种夹心式侧向流测定相同的试条上包括根据本公开的侧向流测定(如以上参考图5A和5B所述的)。在这种多重测定中，即使根据本公开的侧向流测定不需要对照线，对照线仍可以有利地包括在试条上以确认样品已经流动通过与夹心式侧向流测定相关的对照区。包括用于一种测定的对照线和省略用于根据本公开的测定的对照线的这种选择在多重测定中特别有益，在多重测定中，可以在试条上放置有限数量的线或区。
以下非限制性实例示出了本文所述的侧向流装置、测试系统和方法的特征，并且绝不旨在限制本公开的范围。
实施例1
制备侧向流测定以定量升高的蛋白浓度
以下实施例描述了如本文所述的制备侧向流测定以定量感兴趣的分析物。在该非限制性实施例中，感兴趣的分析物是以升高或高浓度存在于血清样品中的蛋白质、C反应蛋白(CRP)。
CRP是血浆中发现的蛋白质。CRP水平响应于炎症升高。因而，CRP是炎症的标志物，其可用于筛查炎症。受试者血清中升高水平的CRP可与受试者的炎症、病毒感染和/或细菌感染相关联。健康人类受试者的CRP正常水平在约1μg/mL至约10μg/mL的范围内。在轻度炎症和病毒感染期间CRP的浓度范围为10-40μg/mL；在活动性炎症和细菌感染期间其为40-200μg/mL；并且在严重的细菌感染和烧伤病例中其为大于200μg/mL。测量和绘制CRP水平可用于确定疾病进展或治疗效果。
根据该非限制性实施例制备的测定可用于确定血清样品中CRP(感兴趣的分析物)的精确浓度，即使该浓度高于健康人类受试者中CRP的正常水平(约1μg/mL至约10μg/mL)。该测定包括包含抗体-标记-CRP复合物的标记的试剂，其避免了夹心式侧向流测定的几个缺点，包括与钩状效应相关的缺点。
为了制备测定，将抗C-反应蛋白(抗CRP)抗体与金纳米颗粒一起温育以形成标记的抗CRP抗体。将该标记的抗体与CRP一起温育，以形成结合至CRP的标记的抗体的复合物。通过用喷气机喷雾包含复合物的溶液，以1.8μL/试条的量将复合物沉积到缀合垫(标记区)上。加热缀合垫以将复合物干燥至缀合垫。
仔细考虑了沉积在缀合垫上的抗体-标记-CRP复合物的量以确保必需量的复合物以在捕获区提供最佳范围的光信号，这将使测试系统能够定量升高水平的CRP。在缀合垫上沉积过量的复合物会改变剂量响应曲线，使得CRP的可定量浓度过度高(对于非常高浓度的CRP(如果存在)可能产生光信号，但对于轻度至高浓度不产生光信号)。在缀合垫上沉积不足量的复合物会使剂量响应曲线向另一个方向偏移，导致产生如此信号，其可能无法定量非常高的CRP浓度。表1展示了实验结果以确定最佳量的抗体-标记-CRP复合物沉积在缀合垫上。沉积在缀合垫上的预先形成的标记-抗体-分析物复合物的量可以变化，以适应不同浓度范围的分析物的要求。
表1：缀合垫上各种量的抗体-标记-CRP复合物的光信号强度
在该实施例中，添加至缀合垫的抗体-标记-CRP复合物的最佳量导致50ng CRP沉积在缀合垫上，这对应于70.06AU的信号。在此量下，因为它们竞争以结合至捕获区中的捕获剂，样品中未标记的CRP与抗体-标记-CRP复合物的比例在未标记的CRP浓度的最佳范围内会产生强的光信号，从而允许足够分辨率的信号，并且样品中升高的CRP浓度都可以准确地定量。有利地，在缀合垫上沉积50ng CRP(通过在缀合垫上沉积适量的抗体-标记-CRP复合物)导致未标记的CRP与标记的试剂(抗体-标记-CRP复合物)的比率为具有减小的光信号的夹心式测定剂量响应曲线的部分(例如，在图2的阶段B中)。未标记的CRP与标记的试剂(抗体-标记-CRP络合物)的这种比率也允许该实施例中的侧向流测定掩盖具有增大的光信号的夹心式剂量响应曲线的部分(例如，在图2的阶段A中)。不受任何特定理论的束缚，据信，在该实施例中的侧向流测定的实施方式通过添加优化量的CRP(在该实施例中为50ng)至缀合垫上有效地掩盖了夹心式侧向流测定的增大的光信号部分——仅使用剂量响应曲线中表现出减小的信号强度的部分(曲线中表现出“钩状效应”的部分)，并且从而避免了以上参考图1A、1B和2所述的缺点。
在该实施例中，抗CRP抗体以2mg/mL的量沉积在捕获区。山羊抗小鼠抗体以2mg/mL的量沉积在对照区。
实施例2
使用侧向流测定定量高浓度C反应蛋白
由于钩状效应，比如以上参考图1A和1B所述的夹心式侧向流测定通常不适合于当CRP以升高的水平存在于样品中时对其浓度进行定量。为了确定升高的浓度，以前需要对样品进行系列稀释，这导致效率低且费力的过程。然而，使用本文所述的侧向流装置、测试系统和方法，可以准确、可靠且快速地定量高于健康水平的CRP浓度。
如以下表2的最后一栏中所显示，将如实施例1中制备的侧向流测定与包括各种浓度的CRP的样品接触。在该实施例中，添加至缀合垫的抗体-标记-CRP复合物的量导致100ng的CRP沉积在缀合垫上。如表2的中间栏所显示，将夹心式侧向流测定比如以上参考图1A和1B所述的那些与相同的样品接触。如以上所述，中间栏所引用的夹心式侧向流测定仅包括沉积在缀合垫上的标记的抗体(没有经由抗体-标记-CRP复合物在缀合垫上沉积的CRP)。通过在30μL人血清中添加表2第一栏中显示的量的CRP来制备流体样品。样品被接收在侧向流测定上，并且在15秒之后，用45μL的HEPES缓冲液追踪(chase)。十分钟后，测量光信号。所有样品均一式六份运行，平均值在表2中报道。图6A示出了在缀合垫上沉积的具有标记的抗体的侧向流测定(带菱形的实线)和缀合垫上沉积的具有抗体-标记-CRP复合物的侧向流测定(带正方形的虚线)的所得剂量响应曲线，其中分析物的浓度沿x轴以对数标度进行测量。图6B示出了具有抗体-标记-CRP复合物的侧向流测定的图6A的实例剂量响应曲线，其中分析物的浓度沿x轴以非对数标度测量。
表2：传统夹心式侧向流测定与本公开的侧向流测定的比较
图6A突出显示了包括钩状效应的夹心式侧向流测定与根据本公开的侧向流测定之间的显著差异。在包括钩状效应的夹心式侧向流测定中，大于10μg/mL(以对数标度1.00)的CRP浓度产生与小于10μg/mL的CRP浓度相同强度的光信号。相反，根据本公开的侧向流测定使得能够准确地确定CRP的浓度为大于10μg/mL的浓度。在感兴趣的分析物为CRP的本实施例中，这特别有利，当存在炎症或疾病病况时，CRP升高至大于10μg/mL的浓度。本文所述的侧向流测定的实施方式允许使用者置信地确定被测受试者中的CRP浓度高于正常水平。当进行根据本公开的测试并且其指示CRP的浓度大于健康水平(例如，大于10μg/mL)时，该信息可以与炎症、病毒感染和/或细菌感染病况相关联。
进一步地，在被测受试者中准确查明CRP精确浓度的能力可以使得测试结果与特定类型的疾病病况相关联。例如，在10μg/mL和20μg/mL之间的浓度可能与轻度炎症相关联，而在40μg/mL和200μg/mL之间的浓度可能与细菌感染相关联。此外，在被测受试者中准确查明CRP精确浓度的能力可以使得测试结果与疾病阶段相关联。例如，在40μg/mL和200μg/mL之间的浓度可能与轻度细菌感染相关联，而大于200μg/mL的浓度可能与严重细菌感染相关联。这些实例是说明性的，并且不旨在限制本公开的范围。
本文公开的侧向流测定装置、系统和方法提供了另外的优点。例如，根据本公开的侧向流测定能够通过使用剂量反应曲线中展现出钩状效应的部分来可靠地定量样品中的分析物。如图6A所示出，在健康水平或低于健康水平(约10μg/mL或更低)的CRP浓度产生为76AU(76.20AU至70.29AU)的最大强度或其10％以内的信号。因而，低浓度的样品产生为相对恒定的值的信号平台(在这种情况下，信号为76AU的最大强度信号的10％以内)。在根据本公开的侧向流测定的实施方式中，对于低浓度的CRP浓度，光信号中的这种重叠不是缺点，这是因为在健康受试者中始终存在低浓度的CRP，并且测试不需要对低水平的CRP浓度敏感。
相反，有利地，本公开的侧向流测定对以高浓度存在的感兴趣的分析物特别敏感。高浓度的分析物产生不在平台上或其附近的信号，在这种情况下，产生小于约70AU的信号。当CRP的浓度高于健康水平(大于10μg/mL)时，侧向流测定产生逐渐减小的信号，其中信号可很容易检测到(可辨别的信号强度且充分间隔开)，并且在剂量响应曲线上与其他信号不重叠。这消除了在特定检测到的信号下确定分析物数量的不确定性，比如在夹心式侧向流测定中，由于钩状效应，其产生可能对应于超过一个分析物数量的信号值。在这种情况下，使用者无法确定分析物的浓度是低还是高，这导致诊断目的的不确定性。相反，根据本公开的侧向流测定产生清楚且明确地对应于零或低浓度的分析物的信号(为最大强度信号或基本上等同于最大强度信号的信号)或高浓度的分析物的信号(小于最大强度信号的信号)，其然后可以直接与正常水平的分析物(零或低浓度的分析物)或非正常水平的分析物(高浓度的分析物)相关联。
此外，本文描述的侧向流装置在一次单独测定中定量了样品中升高浓度的分析物，而无需稀释样品。相反，比如参考图1A、1B、3A和3B描述的那些测定需要稀释包括高浓度分析物的样品；否则，剂量响应曲线的高浓度部分的信号难以区分。本公开的侧向流测定能够基于在一次测试之后在捕获区获得的单个信号确定升高的分析物浓度的甚至微小的差异。
实施例3
使用根据本公开的侧向流测定测量的CRP浓度与ELISA测定高度相关联
此外，根据本公开的侧向流测定的实施方式与用于确定样品中分析物的量的当前金标测定——比如酶联免疫吸附测定(ELISA)——强烈相关联。有利地，已经发现，通过本文所述的侧向流测定的实施方式确定的CRP浓度与通过ELISA确定的CRP浓度强烈相关联。图7A是总结使用根据本公开的侧向流测定测量的各种血清样品中的CRP浓度和使用ELISA测量的相同血清样品中的CRP浓度的表。图7B是将根据本公开获得的CRP浓度与通过ELISA测量的CRP浓度相关联的图。如图7B所示出，获得了使用根据本公开的测定的实施方式测量的CRP浓度与通过ELISA确定的CRP浓度之间的93％的相关性。
使用根据本公开的侧向流测定诊断病况的方法
本文提供的一些实施方式涉及使用侧向流测定诊断医学病况的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供如本文所述的侧向流测定。在一些实施方式中，该方法包括在侧向流测定的样品储器处接收样品。
在一些实施方式中，样品获得自包括环境或生物来源在内的来源。在一些实施方式中，样品被怀疑具有感兴趣的分析物。在一些实施方式中，样品不被怀疑具有感兴趣的分析物。在一些实施方式中，获得并分析样品以验证不存在或存在分析物。在一些实施方式中，获得并分析样品以定量样品中的分析物。在一些实施方式中，样品中的分析物的量小于健康受试者中存在的正常值，处于健康受试者中存在的正常值或其附近，或者高于健康受试者中存在的正常值。
在一些实施方式中，在侧向流测定的样品储器处接收样品包括使样品与侧向流测定接触。通过外部施加如使用滴管或其他施加器，将样品引入至样品储器中，样品可以接触侧向流测定。在一些实施方式中，比如当将试条浸没到容纳样品的容器中时，样品储器可以直接浸入样品中。在一些实施例中，样品可以被倾倒、滴下、喷雾、放置或以其他方式与样品储器接触。
在本公开的实施方式中的标记的试剂包括抗体、标记和感兴趣的分析物，并且可以沉积在样品储器内或下游的缀合垫(或标记区)上。标记的试剂可以通过物理或化学结合整合在缀合垫上。在将样品添加至样品储器后，样品使标记的试剂增溶，这释放了将标记的试剂固定在缀合垫上的结合。包括分析物(如果存在)和标记的试剂的样品沿着流体前沿流动通过侧向流测定至捕获区。固定在捕获区的捕获剂结合分析物(如果存在)和标记的试剂。当标记的试剂在捕获区结合至捕获剂时，检测来自标记的信号。该信号可以包括如本文所述的光信号。当低浓度的分析物存在于样品中时(比如处于或低于健康水平的水平)，在捕获区检测到最大强度信号。在分析物的升高的浓度(比如高于健康值的水平)下，检测到的信号的强度以与样品中分析物的量成比例的量降低。将检测到的信号与感兴趣的分析物的剂量响应曲线上的值进行比较，并且确定样品中分析物的浓度。
在一些实施方式中，分析物以升高的浓度存在。升高的分析物的浓度可以指高于健康水平的分析物浓度。因而，升高的分析物浓度可以包括以下分析物浓度：5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或高于健康水平。在一些实施方式中，感兴趣的分析物包括C反应蛋白(CRP)，其以约1至约10μg/mL的量存在于健康个体的血清中。因而，样品中升高的CRP浓度包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110，120、130、140、150、160、170、180、190或200μg/mL或更高的量。感兴趣的分析物被认为是升高的水平可能根据特定的感兴趣的分析物而变化。
在一些实施方式中，在确定分析物以升高的浓度存在于样品中之后，诊断出该受试者患有某种疾病。在一些实施方式中，当CRP的浓度确定为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μg/mL或更高时，做出感染的诊断。在一些实施方式中，确定浓度大于200μg/mL，例如400-500μg/mL，产生严重细菌感染的诊断。
包括根据本公开的侧向流测定的实例测试系统
本文所述的侧向流测定测试系统可以包括侧向流测定测试装置(比如但不限于试条)、外壳——其包括配置为接收全部或部分测试装置的端口，包括光源和光检测器的读取器，数据分析器及其组合。外壳可以由多种材料中的任何一种制成，所述材料包括塑料、金属或复合材料。外壳形成用于诊断测试系统的组件的保护性壳体。该外壳还限定了插孔，该插孔相对于读取器机械地对准(register)试条。插孔可以被设计成接收多种不同类型的试条中的任何一种。在一些实施方式中，外壳是便携式装置，其允许在各种环境中进行侧向流测定的能力，所述环境包括在工作台上、在野外、在家里或在用于家庭、商业或环境应用的设施中。
读取器可以包括一个或多个光电组件，用于光学检查试条的捕获区的暴露区域。在一些实施中，读取器包括至少一个光源和至少一个光检测器。在一些实施方式中，光源可以包括半导体发光二极管，并且光检测器可以包括半导体光电二极管。取决于试条所使用的标记的性质，可以将光源设计为发出特定波长范围内的光或具有特定偏振的光。例如，如果标记是荧光标记，比如量子点，则光源将被设计为用诱导从标记发出荧光的波长范围内的光照射试条捕获区的暴露区域。类似地，光检测器可以被设计成选择性地从捕获区的暴露区域捕获光。例如，如果标记是荧光标记，那么光检测器将被设计为选择性地捕获在由标记发出的荧光的波长范围内的光或具有特定偏振的光。另一方面，如果标记是反射型标记，那么光检测器将被设计为选择性地捕获在由光源发出的光的波长范围内的光。为此，光检测器可以包括一个或多个滤光器，其限定捕获的光的波长范围或偏振轴。可以使用视觉观察或分光光度计以检测发色底物的颜色；辐射计数器——比如用于检测125I的伽玛计数器——以检测辐射；或荧光计以检测某一波长的光存在下的荧光，来分析来自标记的信号。在使用酶联测定的情况下，可以使用分光光度计对感兴趣的分析物的数量进行定量分析。如果需要，本文所述的侧向流测定可以是自动化的或自动进行的，并且可以同时检测来自多个样品的信号。此外，可以在多重型测定中检测多个信号，其中检测、鉴定或定量多于一种的感兴趣的分析物。
多重测定可以包括例如病毒差异测定(viral differential assay)。例如，如本文所述的多重侧向流测定可以检测来自患有病毒感染或怀疑患有病毒感染(例如，表现出流感样症状)的受试者的样品中是否存在一种或几种病毒蛋白。在一些实施方式中，用于该目的的多重侧向流测定将能够检测升高浓度的CRP和低浓度的TRAIL和IP-10。
数据分析器处理由读取器获得的信号测量。通常，数据分析器可以在任何计算或处理环境中实施，包括在数字电子电路或计算机硬件、固件或软件中。在一些实施方式中，数据分析器包括处理器(例如，微控制器、微处理器或ASIC)和模数转换器。数据分析器可以并入在诊断测试系统的外壳内。在其他实施方式中，数据分析器定位在单独的装置比如计算机中，该装置可以通过有线或无线连接与诊断测试系统通信。数据分析器还可包括用于经由无线连接将结果传输至外部源以进行数据分析或检查结果的电路。
通常，结果指示器可以包括多种不同的机制中的任何一种，以指示测定测试的一个或多个结果。在一些实施中，结果指示器包括一个或多个灯(例如，发光二极管)，其被激活以指示，例如测定测试的完成。在其他实施中，结果指示器包括字母数字显示器(例如，两个或三个字符的发光二极管阵列)，用于呈现分析测试结果。
本文所述的测试系统可以包括电力供应，其向诊断测试系统的有源组件供电，该有源组件包括读取器、数据分析器和结果指示器。电力供应可以由例如可更换电池或可再充电电池来实施。在其他实施方式中，诊断测试系统可以由外部主机装置(例如，通过USB电缆连接的计算机)供电。
实例侧向流装置的特征
本文所述的侧向流装置可包括样品储器(也被称为样品接收区)，在该样品储器中将流体样品引入试条，比如但不限于侧向流装置中存在的免疫层析试条。在一个实例中，可通过外部施加如使用滴管或其他施加器将样品引入至样品储器。可以将样品倾倒或表达在样品储器上。在另一个实例中，比如当将试条浸没到容纳样品的容器中时，样品储器可以直接浸入样品中。
本文所述的侧向流装置可包括固体载体或基板。合适的固体载体包括但不限于硝酸纤维素、反应托盘的孔的壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁性珠、膜和微粒(例如胶乳颗粒)。具有足够的孔隙度以允许标记的试剂进入并具有合适的表面亲和力以固定捕获剂的任何合适的多孔材料可以用于本文所述的侧向流装置中。例如，硝化纤维素的多孔结构对多种试剂例如捕获剂具有出色的吸收和吸附质量。尼龙具有类似的特性，并且也是适合的。微孔结构是可用的，在水合状态下具有凝胶结构的材料也是可用的。
可用的固体载体的进一步的实例包括：天然聚合碳水化合物及其合成修饰的、交联的或取代的衍生物，比如琼脂、琼脂糖、交联的藻酸、取代的和交联的瓜尔豆胶、纤维素酯——特别是用硝酸和羧酸、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，比如蛋白质和衍生物，包括交联或修饰的明胶；天然烃聚合物，比如乳胶和橡胶；可以用合适的多孔结构制备的合成聚合物，比如乙烯基聚合物，其包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、以上缩聚物的共聚物和三元共聚物，比如聚酯、聚酰胺，以及其他聚合物，比如聚氨酯或聚环氧化物；多孔无机材料，比如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，其包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；以及铝或硅的氧化物或水合物，例如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可用作上述聚合材料的过滤器)；以及以上种类的混合物或共聚物，比如通过在现有天然聚合物上引发合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。
本文所述的侧向流装置可包括片或条形式的多孔固体载体，比如硝化纤维素。这种片或条的厚度可以在宽限度内变化，例如，约0.01至0.5mm、约0.02至0.45mm、约0.05至0.3mm、约0.075至0.25mm、约0.1至0.2mm或约0.11至0.15mm。这种片或条的孔径可类似地在宽限度内变化，例如约0.025至15微米，或更具体地约0.1至3微米；然而，孔径不旨在是选择固体载体的限制因素。固体载体的流速——如果适用——也可以在宽限度内变化，例如约12.5至90sec/cm(即50至300sec/4cm)、约22.5至62.5sec/cm(即，90至250sec/4cm)、约25至62.5sec/cm(即100至250sec/4cm)、约37.5至62.5sec/cm(即150至250sec/4cm)或约50至62.5sec/cm(即200至250sec/4cm)。在本文所述的装置的具体实施方式中，流速为约35sec/cm(即140sec/4cm)。在本文所述装置的其他具体实施方式中，流速为约37.5sec/cm(即150sec/4cm)。
固体载体的表面可以通过引起试剂(例如捕获剂)与载体的共价键的化学过程活化。如下所述，固体载体可包括缀合垫。可以使用许多其他合适的方法将试剂(例如捕获剂)固定在固体载体上，其包括但不限于离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。
除非受到物理限制，否则固体载体可以以任何合适的形状使用，例如膜、片、条或板，或者可以将其涂布或粘合或层压至合适的惰性载体，比如纸、玻璃、塑料膜或织物。
本文所述的侧向流装置可包括缀合垫，比如膜或其他类型的材料，其包含捕获剂。缀合垫可以是乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺、聚碳酸酯、玻璃纤维、膜、聚醚砜、再生纤维素(RC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二酯)、聚碳酸酯(例如，4,4-羟基-二苯基-2,2'-丙烷)、氧化铝、混合纤维素酯(例如，醋酸纤维素和硝酸纤维素的混合物)、尼龙(例如，聚酰胺、六亚甲基二胺和尼龙66)、聚丙烯、PVDF、高密度聚乙烯(HDPE)+成核剂“二苯甲酸铝”(DBS)(例如80u 0.024HDPE DBS(Porex))和HDPE。
本文所述的侧向流装置对以高浓度存在于样品中的感兴趣的分析物高度敏感。如上所述，当样品中未标记的感兴趣的分析物以足以与标记的化合物竞争以结合至捕获区中的捕获剂的量存在时，就会出现高浓度，这在剂量响应曲线的负斜率部分上产生检测到的信号(例如，在常规夹心式侧向流测定的剂量响应曲线的“钩状效应”部分上或根据本公开的侧向流测定的剂量响应曲线的负斜率部分上)。“敏感性”是指这样正确识别出的实际阳性的比例(例如，被正确识别为患有病况的感染、潜伏或有症状受试者的百分比)。可以将敏感性计算为真阳性的数量除以真阳性的数量和假阴性的数量之和。
本文所述的侧向流装置可以准确地测量许多不同种类的样品中的感兴趣的分析物。样品可以包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人类)获得，并且包括液体(fluid)、固体、组织和气体。生物样品包括尿液、唾液和血液制品，比如血浆、血清等。然而，这种实例不应被解释为限制适用于本公开的样品类型。
在一些实施方式中，样品是用于检测环境中的分析物的环境样品。在一些实施方式中，样品是来自受试者的生物样品。在一些实施方式中，生物样品可以包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑膜液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、库珀液或射精前液、女性射精、汗液、粪便、头发、眼泪、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺吸出物或其他灌洗液。
如本文所用，“分析物”通常是指要检测的物质。例如，分析物可包括抗原性物质、半抗原、抗体及其组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括用于治疗目的施用的药物以及用于非法目的施用的药物)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒和任何上述物质的代谢产物或抗体。一些分析物的具体实例包括铁蛋白；肌酸激酶MB(CK-MB)；人绒毛膜促性腺激素(hCG)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼丁；黄体生成素(LH)；卵泡刺激素(FSH)；雌二醇、孕酮；C反应蛋白(CRP)；脂蛋白；IgE抗体；细胞因子；TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；维生素B2微球蛋白；干扰素γ-诱导蛋白10(IP-10)；糖化血红蛋白(Gly Hb)；皮质醇；洋地黄毒；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因酰胺；风疹抗体，比如风疹IgG和风疹IgM；弓形虫病抗体，比如弓形虫病IgG(Toxo-IgG)和弓形虫病IgM(Toxo-IgM)；睾酮；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝核心抗原抗体，比如抗乙肝核心抗原IgG和IgM(抗HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV 1和2)；人T细胞白血病病毒1和2(HTLV)；乙型肝炎e抗原(HBeAg)；乙型肝炎e抗原抗体(抗HBe)；流感病毒；甲状腺刺激激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲状腺原氨酸(总T3)；游离三碘甲状腺原氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；脂蛋白、胆固醇和甘油三酸酯；和甲胎蛋白(AFP)。滥用药物和管制物质包括但不限于苯丙胺；甲基苯丙胺；巴比妥类，比如阿莫巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮
类，比如甲氨二氮
(Librium)和苯甲二氮
(valium)；大麻素，比如印度大麻和大麻(marijuana)；可卡因；芬太尼；LSD；甲喹酮；阿片剂，比如海洛因、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、羟考酮、羟吗啡酮和鸦片；苯环利定；和丙氧基苯。为了感兴趣的生物或环境物质的目的，可以包括其他分析物。
本文所述的侧向流装置可包括标记。标记可以采取许多不同形式，包括结合或能够结合至分析物、分析物类似物、检测试剂的分子或组合物，或通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的结合配偶体。标记的实例包括酶、胶体金颗粒(也称为金纳米颗粒)、有色乳胶颗粒、放射性同位素、辅因子、配体、化学发光剂或荧光剂、蛋白吸附的银颗粒、蛋白吸附的铁颗粒、蛋白吸附的铜颗粒、蛋白偶联的硒颗粒、蛋白吸附的硫颗粒、蛋白吸附的碲颗粒、蛋白吸附的碳颗粒和蛋白质偶联的染料囊。化合物(例如检测试剂)与标记的附连可以通过共价键、吸附过程、疏水键和/或静电键——比如在螯合物等中或这些键和相互作用的组合，和/或可能涉及连接基团。
术语“特异性结合配偶体(或结合配偶体)”是指通过取决于所涉及分子的三维结构的特异性、非共价相互作用的方式而相互作用的分子对的成员。典型的特异性结合配偶体对包括抗原/抗体、半抗原/抗体、激素/受体、核酸链/互补核酸链、底物/酶、抑制剂/酶、碳水化合物/凝集素、生物素/(链霉)亲和素、受体/配体和病毒/细胞受体，或其各种组合。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指结合特异性抗原的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体、Fab片段、F(ab')2片段，并且包括以下类别的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgD、IbE和分泌的免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白通常包含两条相同的重链和两条轻链。然而，术语“抗体”和“免疫球蛋白”也涵盖单链抗体和两链抗体。
本文所述的侧向流装置包括标记的试剂。在一些情况下，标记的试剂包括能够结合至分析物的检测试剂。标记的试剂可以对分析物具有特异性。在一些实施方式中，标记的试剂可以是已经与检测试剂缀合、结合或缔合的抗体或其片段。在根据本公开的侧向流测定的实施方式中，标记的试剂可以是已经与检测试剂和感兴趣的分析物缀合、结合或缔合的抗体或其片段，这形成标记-抗体-分析物复合物。
根据本公开的侧向流装置包括捕获剂。捕获剂包括能够结合至分析物——其包括游离的(未标记的)分析物和/或标记的分析物——的固定化试剂。捕获剂包括未标记的特异性结合配偶体，其对以下物质具有特异性：(i)标记的感兴趣的分析物，(ii)标记的分析物或未标记的分析物，如在竞争性测定中，或(iii)辅助特异性结合配偶体——其本身对分析物具有特异性，如在间接测定中。如本文所用，“辅助特异性结合配偶体”是结合至分析物的特异性结合配偶体的特异性结合配偶体。例如，辅助特异性结合配偶体可以包括对另一种抗体具有特异性的抗体，例如，山羊抗人抗体。本文所述的侧向流装置可以包括“捕获区域”，其是侧向流装置的固定捕获剂的区域。本文所述的侧向流装置可以包括一个以上的捕获区域，例如，“主要捕获区域”，“次要捕获区域”等等。在一些情况下，将不同的捕获剂固定在主要、次要和/或其他捕获区域中。在侧向流基板上，多个捕获区域可以相对于彼此具有任何取向；例如，主要捕获区域可以沿着流体流动路径在次要(或其他)捕获区域的远端或近端，反之亦然。可选地，主要捕获区域和次要(或其他)捕获区域可以沿着垂直于流体流动路径的轴线对准，使得流体同时或大约同时接触捕获区域。
根据本公开的侧向流装置包括被固定的捕获剂，使得在侧向流装置的正常运行期间捕获剂的运动受到限制。例如，在将流体样品施加至侧向流装置之前和之后，固定化捕获剂的运动受到限制。捕获剂的固定化可以通过物理手段来完成，比如屏障、静电相互作用、氢键、生物亲和力、共价相互作用或其组合。
根据本公开的侧向流装置可以包括多重测定。多重测定包括可以检测、鉴定和在一些情况下定量多种不同的感兴趣的分析物的测定。例如，在多重测定装置中，可以存在主要、次要或更多的捕获区域，每个捕获区域对多种感兴趣的分析物中的一种感兴趣的分析物具有特异性。
根据本公开的侧向流装置可以检测、识别并且在一些情况下定量生物制品。生物制品包括由活生物体产生的化学或生化化合物，该活生物体可以包括原核细胞系、真核细胞系、哺乳动物细胞系、微生物细胞系、昆虫细胞系、植物细胞系、混合细胞系、天然发生的细胞系或合成工程化细胞系。生物制品可以包括较大的大分子，比如蛋白质、多糖、脂质和核酸，以及小分子，比如主要代谢产物、次要代谢产物和天然产物。
应当理解的是，虽然指示为示例性实施方式，但是描述、具体实例和数据以说明的方式给出，并且不旨在限制本公开的各种实施方式。根据本文所包含的描述和数据，本公开的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且因而被认为是本公开的各种实施方式的一部分。
Claims (48)
1.一种测定试条，其包括：
配置为接收流体样品的流动路径；
偶联至所述流动路径的样品接收区；
捕获区，其偶联至所述样品接收区下游的流动路径并且包括对感兴趣的分析物具有特异性的固定化捕获剂；和
复合物，其在第一阶段偶联至所述流动路径并且被配置为在第二阶段在存在所述流体样品的情况下在所述流动路径中流动至所述捕获区，所述复合物包括
标记，
特异性地结合所述感兴趣的分析物的抗体或抗体片段，和
所述感兴趣的分析物。
2.根据权利要求1所述的测定试条，其中所述流动路径配置为接收包括未标记的感兴趣的分析物的流体样品，并且其中所述复合物在所述第一阶段或所述第二阶段未特异性结合至所述未标记的感兴趣的分析物。
3.根据权利要求2所述的测定试条，其中所述复合物配置为在所述第二阶段在所述流动路径中与所述未标记的感兴趣的分析物一起流动至所述捕获区。
4.根据权利要求3所述的测定试条，其中所述复合物配置为在第三阶段与所述未标记的感兴趣的分析物竞争以结合至所述捕获区中的所述固定化捕获剂。
5.根据权利要求4所述的测定试条，其中随着所述流体样品中未标记的感兴趣的分析物的浓度增加，由结合至所述捕获区中的所述固定化捕获剂的复合物发出的光信号减小。
6.根据权利要求1所述的测定试条，其中所述流动路径配置为接收包括或不包括感兴趣的分析物的流体样品，并且其中当所述流体样品不包括感兴趣的分析物时，在所述第二阶段中所述复合物特异性地结合至所述捕获区中的所有或基本上所有的固定化捕获剂。
7.根据权利要求6所述的测定试条，其中当所述流体样品不包括感兴趣的分析物时，由在所述捕获区中结合的所述复合物发出的光信号是可以由所述测定试条发出的最大光信号。
8.根据权利要求7所述的测定试条，其中当所述流体样品确实包括所感兴趣的分析物时，由在所述捕获区中结合的所述复合物发出的光信号小于所述最大光信号。
9.根据权利要求1所述的测定试条，其中所述固定化捕获剂包含特异性结合所述感兴趣的分析物的抗体或抗体片段。
10.根据权利要求1所述的测定试条，其中在第一阶段所述复合物整合到所述试条的表面上。
11.根据权利要求1所述的测定试条，其中通过将包括所述复合物的溶液喷雾到所述试条的表面上并干燥所述溶液，将所述复合物整合到所述试条的表面上。
12.根据权利要求1所述的测定试条，其中所述流体样品选自血液、血浆、尿液、汗液或唾液样品。
13.根据权利要求1所述的测定试条，其中所述感兴趣的分析物包括C反应蛋白(CRP)，并且所述复合物包括结合至所述CRP的抗CRP抗体或其片段。
14.一种诊断测试系统，其包括：
根据权利要求1所述的测定试条；
包括光源和检测器的读取器；和
数据分析器。
15.根据权利要求1所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号是所述试条的剂量响应曲线的最大光信号时，所述数据分析器输出所述流体样品中不存在感兴趣的分析物的指示。
16.根据权利要求15所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号在所述最大光信号的1％以内时，所述数据分析器输出所述流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。
17.根据权利要求15所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号在所述最大光信号的5％以内时，所述数据分析器输出所述流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。
18.根据权利要求15所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号在所述最大光信号的10％以内时，所述数据分析器输出所述流体样品中存在低浓度的感兴趣的分析物的指示。
19.根据权利要求15所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号为所述最大光信号的90％或小于所述最大光信号的90％时，所述数据分析器输出所述流体样品中存在高浓度的感兴趣的分析物的指示。
20.根据权利要求15所述的诊断测试系统，其中当所述读取器检测到来自所述测定试条的光信号低于所述最大光信号时，所述数据分析器输出所述样品中所述感兴趣的分析物的浓度的指示。
21.一种使用测定试条确定流体样品中感兴趣的分析物的浓度的方法，所述测定试条包括配置为接收流体样品的流动路径；偶联至所述流动路径的样品接收区；捕获区，其偶联至所述样品接收区下游的所述流动路径并且包括对感兴趣的分析物具有特异性的固定化捕获剂；和配合物，其在第一阶段偶联至所述流动路径并且配置为在第二阶段在所述流体样品的存在下在所述流动路径中流动至所述捕获区，所述复合物包括标记、与所述感兴趣的分析物特异性结合的抗体或抗体片段以及所述感兴趣的分析物，所述方法包括：
当在所述第一阶段所述复合物偶联至所述流动路径时，将所述流体样品施加至所述测定试条；
将所述复合物与所述流动路径解偶联；
在所述第二阶段使所述流体样品和所述复合物在所述流动路径中流动至所述捕获区；
将所述复合物结合至所述捕获区中的所述固定化捕获剂；
检测来自结合至所述捕获区中的所述固定化捕获剂的所述复合物的信号。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所检测的信号是光信号、荧光信号或磁信号。
23.根据权利要求21所述的方法，其中使所述复合物解偶联包括用所述流体样品使所述复合物增溶。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述流体样品包括未标记的感兴趣的分析物，并且其中所述复合物在所述第一阶段或所述第二阶段未特异性地结合至所述未标记的感兴趣的分析物。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述流体样品包括未标记的感兴趣的分析物，并且其中所述复合物配置为在所述第三阶段与所述未标记的感兴趣的分析物竞争以结合至所述捕获区中的所述固定化捕获剂。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述流体样品不包括感兴趣的分析物，并且其中检测包括检测所述试条的剂量响应曲线的最大信号。
27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括确定所述流体样品中所述分析物的浓度为零。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括显示所述流体样品中不存在所述感兴趣的分析物的指示。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述流体样品包括感兴趣的分析物，并且其中检测包括检测到来自所述试条的信号小于所述试条的剂量响应曲线的最大信号。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括确定所述流体样品中所述分析物的浓度大于零。
31.根据权利要求30所述的方法，进一步包括显示所述流体样品中存在所述感兴趣的分析物的指示。
32.根据权利要求29所述的方法，进一步包括：
确定检测到的信号在所述最大光信号的10％以内；和
显示所述流体样品中所述感兴趣的分析物以低浓度存在的指示。
33.根据权利要求29所述的方法，进一步包括：
确定检测到的信号为所述最大信号的90％或小于所述最大信号的90％；和
显示所述流体样品中所述感兴趣的分析物以高浓度存在的指示。
34.一种制造测定试条的方法，其包括：
将样品接收区偶联至配置为接收流体样品的流动路径；
将捕获区偶联至所述样品接收区下游的所述流动路径；和
将复合物偶联至所述流动路径，所述复合物包括
标记，
特异性结合感兴趣的分析物的抗体或抗体片段，和
所述感兴趣的分析物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述感兴趣的分析物包括C反应蛋白(CRP)，并且所述抗体包括抗CRP抗体或抗CRP抗体的片段。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述感兴趣的分析物包含约50ng的CRP。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述感兴趣的分析物包括约100ng的CRP。
38.根据权利要求34所述的方法，进一步包括将对感兴趣的分析物具有特异性的捕获剂固定在所述捕获区。
39.根据权利要求34所述的方法，其中将所述复合物偶联至所述流动路径包括在所述复合物与所述流动路径之间形成结合，所述结合在所述流动路径中存在流体样品的情况下断裂。
40.根据权利要求34所述的方法，其中偶联所述复合物包括将包括所述复合物的溶液喷雾到所述样品接收区的表面上。
41.根据权利要求34所述的方法，其中偶联所述复合物包括将包括所述复合物的溶液喷雾到所述样品接收区和所述捕获区之间的所述测定试条的表面上。
42.根据权利要求34所述的方法，其中偶联所述复合物包括：
将包括所述复合物的流体溶液施加至所述测定试条的表面上；和
干燥所述液体溶液。
43.根据权利要求34所述的方法，其中偶联所述复合物包括将所述复合物整合到所述测定试条的表面上。
44.根据权利要求34所述的方法，进一步包括提供包括所述复合物的溶液。
45.根据权利要求44所述的方法，其中提供所述溶液包括将包括所述标记和所述抗体或所述抗体片段的第一液体与包括所述感兴趣的分析物的第二液体混合。
46.根据权利要求45所述的方法，其中提供所述溶液进一步包括将所述第一液体和所述第二液体的混合物温育约30分钟。
47.根据权利要求44所述的方法，其中将所述复合物偶联至所述流动路径包括将所述溶液喷雾到所述测定试条的表面上。
48.一种通过权利要求34-47中任一项所述的方法制成的测定试条。
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