CN111019977A - 一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：将Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌一起接种在互营培养基中，并加入无机电子供体和CO2，在光照条件下培养。该方法能够以自然界中普遍存在的光能和无机化合物作为驱动力激发不产氧光合菌氧化产电子，然后Methanosarcina菌利用电子实现选择性CO2还原产甲烷，显著降低了工艺成本。

Description

一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法
技术领域
本发明涉及一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
人类日常的频繁活动以及工业的大量发展使得化石能源逐渐被消耗殆尽，而且释放大量的CO2。CO2的大量积累会导致全球气候变暖、海平面上升、生态平衡遭到破坏等一系列问题，严重威胁人类的生存及发展。寻找有效的方式将CO2固定成有价值的能源燃料甲烷是保护生态环境并缓解能源短缺的重要策略。
固定CO2产甲烷的传统方式是化学催化。但是CO2化学性质稳定，还原路径复杂，将其催化成甲烷需要寻找高效的催化剂。但是目前发现的催化剂的转化效率低且产物的选择性差，不具经济效益，不便大规模推广。
产甲烷菌是一种能够固定CO2产甲烷的特异性菌株，尤其是Methanosarcina菌，在厌氧环境中大量存在，能够实现高效产甲烷。产甲烷菌在固定CO2产甲烷的过程中需要有额外的电子输入，也即需要电子供体。但是产甲烷菌能利用的电子供体种类有限，如乙酸和氢气等。由于乙酸造价高、氢气溶解度低，限制了该方法的推广利用。不产氧光合菌能够捕获太阳能，且能够利用多种无机化合物产电、固氮、固碳，具有重要的工业应用及生态保护价值。经查阅大量文献及专利，尚未发现有研究利用不产氧光合菌的无机光合作用促进产甲烷菌固定CO2产甲烷的方法。
发明内容
本发明提供了一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，将Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌一起接种在互营培养基中，并加入无机电子供体和CO2，在光照条件下培养。
作为进一步改进的，取所述Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌的生长对数后期的OD600值为0.2～0.4菌液接种，接种量为1～3％(v/v)。
作为进一步改进的，所述Methanosarcina菌为Methanosarcina barkeri，Rhodopseudomonas菌为Rhodopseudomonas palustris。
作为进一步改进的，在Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌接种之前还进行离心洗菌。
作为进一步改进的，所述离心的转速为6000～8000r/min，离心时间为5～15min。
作为进一步改进的，所述光照的光源选自太阳光、白炽灯或者LED灯中的至少一种。
作为进一步改进的，所述光照的光强为5～20mW/cm2，光照时的温度为30～40℃。
作为进一步改进的，所述无机电子供体为硫代硫酸钠。
作为进一步改进的，所述硫代硫酸钠的终浓度为1～4mM。
作为进一步改进的，所述互营培养基的配方为Na2S2O3·5H2O 0.1～0.3g/L，MgCl2·6H2O 0.3～0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.08～0.12g/L，NH4Cl 0.08～0.12g/L，KH2PO40.18～0.22g/L，KCl 0.48～0.52g/L，HEPES 7.1～7.2g/L，NaHCO3 2.5～2.6g/L，Na2S·9H2O 0.2～0.4g/L，微量元素溶液SL-10 0.8～1.2mL/l，亚硒酸盐溶液0.8～1.2mL/L，维生素溶液2.5～3.5mL/L，其余为水。
本发明的有益效果是：
本发明的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，能够以自然界中普遍存在的光能和无机化合物作为驱动力激发不产氧光合菌氧化产电子，然后甲烷八叠球菌Methanosarcina菌利用电子实现选择性CO2还原产甲烷，显著降低了工艺成本。
本发明克服了传统CO2还原产甲烷过程中存在的甲烷转化效率低、产物选择性差、经济效益低下等缺点，具有操作简单、产物选择性强、经济效益高的优点，系统的易操作、可重复使用的特性使得它们更易于进行优化，可进行大规模的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系产甲烷性能图。
图2是对本发明实施例中的Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系的表征。图2-A为Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系的光学显微图；图2-B为利用激光共聚焦显微镜观察所得Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系的荧光原位杂交图。图2-A的标尺刻度为20μm、图2-B的标尺刻度为100μm。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)将Methanosarcina barkeri和Rhodopseudomonas palustris分别以20％(v/v)和2％(v/v)接种至pH为7.0的乙酸培养基中，37℃恒温培养；Rhodopseudomonaspalustris购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center)，保藏编号为CGMCC-1.2180，Methanosarcina barkeri购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen)，保藏编号为DSM-800。
(2)当步骤1中Methanosarcina barkeri和Rhodopseudomonas palustris生长至对数后期时，以7500r/min离心分离10min收集菌液，并用生理盐水洗菌3次，最终用生理盐水稀释菌液OD600值至0.3。
(3)取2％(v/v)步骤2中Methanosarcina barkeri和Rhodopseudomonaspalustris菌液接种至互营培养基，加入硫代硫酸钠，使其终浓度为2mM，获得Rhodopseudomonas-Methanosarcina互营体系。
(4)在37℃恒温条件下，利用15W白炽灯对步骤3的互营体系进行光照，促使互营体系进行无机光合固定CO2产甲烷。
采用气相色谱(Agilent 7890A)测量产生的甲烷，结果如图1所示，并利用NikonEclipse E100生物显微镜观察所得Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系，用激光共聚焦显微镜(LSM880 NLO，ZEISS)观察所得Rhodopseudomonas-Methanosarcina无机光合互营体系的荧光原位杂交情况，结果如图2所示。
由图1可知，互营体系中能产生大量的甲烷，9天甲烷积累量达到了7.93μmol，说明本发明Methanosarcina barkeri-Rhodopseudomonas palustris无机光合互营体系在光照的条件下有优越的CO2还原产甲烷性能。
由图2可知，在无机光合互营体系中，Methanosarcina barkeri与Rhodopseudomonas palustris相互团聚在一起(图2-A、图2-B)，表明Methanosarcinabarkeri与Rhodopseudomonas palustris之间以直接和(或)间接种方式传递电子实现CO2固定产甲烷。
表1培养基的组成
Figure BDA0002344318410000051
Figure BDA0002344318410000061
*每升微量元素溶液SL-10中含有HCl(2M)50mL，2g FeCl2·4H2O，0.2g ZnCl2，0.1gMnCl2·4H2O，0.18g H3BO3，0.05g CoCl2·6H2O，6mg CuCl2·2H2O，72mg NiCl2·6H2O，108mgNa2MoO4·2H2O，余量为水。
**每升亚硒酸盐溶液中含有0.5g NaOH，3mg Na2SeO3·5H2O，4mg Na2WO4·2H2O，余量为水。
***每升维生素溶液中含有0.04g对氨基苯甲酸，0.01g D-生物素，0.01g a-硫辛酸，0.1g D-泛酸钙，0.1g维生素B6，0.03g叶酸，0.05g烟酸，0.05g核黄素，0.01g维生素B1，0.05g维生素B12，余量为水。
实施例2
为了分析Rhodopseudomonas palustris菌的无机光合作用在Methanosarcinabarkeri菌固定CO2还原产甲烷中的作用，还进行了对照组实验，包括：Methanosarcinabarkeri光照组，即不加入Rhodopseudomonas palustris菌，其他操作均同实施例1；Rhodopseudomonas palustris光照组，即不加入Methanosarcina barkeri菌，其他操作均同实施例1；Methanosarcinabarkeri-Rhodopseudomonas palustris黑暗组，即在无光照条件下培养，其他操作均同实施例1。经检测结果显示，上述3组对照组实验未有明显的甲烷产生。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：将Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌一起接种在互营培养基中，并加入无机电子供体和CO2，在光照条件下培养。
2.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：取所述Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌的生长对数后期的OD600值为0.2～0.4菌液接种，接种量为1～3％(v/v)。
3.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述Methanosarcina菌为Methanosarcina barkeri，Rhodopseudomonas菌为Rhodopseudomonaspalustris。
4.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：在Rhodopseudomonas菌和Methanosarcina菌接种之前还进行离心洗菌。
5.根据权利要求4所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述离心的转速为6000～8000r/min，离心时间为5～15min。
6.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述光照的光源选自太阳光、白炽灯或者LED灯中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述光照的光强为5～20mW/cm2，光照时的温度为30～40℃。
8.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述无机电子供体为硫代硫酸钠。
9.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述硫代硫酸钠的终浓度为1～4mM。
10.根据权利要求1所述的驱动甲烷八叠球菌产甲烷的方法，其特征在于：所述互营培养基的配方为Na2S2O3·5H2O 0.1～0.3g/L，MgCl2·6H2O 0.3～0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.08～0.12g/L，NH4Cl 0.08～0.12g/L，KH2PO40.18～0.22g/L，KCl 0.48～0.52g/L，HEPES 7.1～7.2g/L，NaHCO3 2.5～2.6g/L，Na2S·9H2O 0.2～0.4g/L，微量元素溶液SL-10 0.8～1.2mL/l，亚硒酸盐溶液0.8～1.2mL/L，维生素溶液2.5～3.5mL/L，其余为水。
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