CN110997930A - 用于综合鉴定抗生素敏感性的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开多个用于同时确定在来自于疑似具有一感染症的一受试者的一样本中的细菌对多种抗生素的敏感性的方法，其中所述样本是在不用先从所述样本中分离出所述细菌的情况下进行测试。

Description

用于综合鉴定抗生素敏感性的测定方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2017年4月19号提交的美国临时申请62/487,395号的权益，其通过引用整体并入本文中。
背景技术
感染性疾病影响多个器官系统，并造成显着的发病率、死亡率及经济冲击。多种感染源通常大多数表现为复杂的多微生物感染，而不是一单一种的病原体。在体内，所述多微生物感染通过互利共生来相互合作，从而不仅改变了所述多种生物体易敏感的抗生素类型，也改变了治疗所述感染所需的抗生素的水平以及个别的所述病原体的毒性。目前的黄金标准为培养及敏感性：一种将一样本放置在含有一洋菜胶培养基的一盘子上进行过夜培育的过程，以使单独的生物体被分离出并进行鉴定。通常需要额外的一天来通过抗生素敏感性测试鉴定所述单独的生物体对哪种抗生素具敏感性。所述过程的有效性受到所述方法本身固有的不佳的敏感性及专一性的限制。例如，多个近期的研究已经发现高达25％的尿液培养结果会产生一伪阴性结果，且多达三分之二的尿道致病菌由于进行培养而被遗漏。通常需花费48至72小时的此过程对临床上的实施具有一重大的影响，在所述临床实施中，多个临床医生被迫在没有一准确的诊断及没有关于有效治疗所述感染症的所述抗生素类型的适当引导的情况下凭经验治疗所述患者。
目前的抗生素敏感性测试的一固有的缺陷为其仅依赖于一单独的生物体，而不是同时对整个生物体池(pool)进行测试。由于需要分离，因此最少增加额外的一天以进行所述测试过程。如此需要一种在不需要分离的情况下允许同时进行抗生素抗性评估的测试，从而允许更快速地确定抗生素的抗性。本文所描述的方法为一简单且节省成本的方法，所述方法在不需要先分离的情况下用于同时评估在所有组成中抗生素抗性。
发明内容
本文公开多个用于同时确定存在于多个患者样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，而不用先从所述样本中分离出所述细菌。
在一些实施例中，本文公开多个用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，所述方法包含：将一定量的所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；将所述样本在所述培养基上培养一段时间；以一溶液悬浮出现在所述培养基中的所述细菌，并回收所述悬浮液；量测所述悬浮液的一OD600值，其中一悬浮液的一调整过的OD600值指示出在所述样本中的细菌对一单独的抗生素的所述敏感性或抗性；及提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。所述样本疑似具有多个菌种在其中。
在一些实施例中，所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在多个孔中的一含有抗生素的细菌生长培养基。在一些实施例中，所述多孔测定盘具有96个孔。在一些实施例中，所述细菌生长培养基为一含有洋菜胶的培养基。
在一些实施例中，所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、头孢吡肟、头孢唑林、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。在一些实施例中，所述多个孔的每一个含有一单一种的抗生素或含有多种抗生素的一组合。在一些实施例中，所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。在一些实施例中，所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。在一些实施例中，每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。在一些实施例中，每一种抗生素或多种抗生素的一组合以三种或多种浓度存在于所述多个孔中。
在一些实施例中，所述悬浮液的所述OD600值被多次进行量测。在一些实施例中，所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。在一些实施例中，所述调整过的OD600值包含扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。在一些实施例中，假如所述调整过的OD600值低于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。在一些实施例中，假如所述调整过的OD600值高于或等于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
在一些实施例中，所述样本为一生物流体或一活检样本。在一些实施例中，所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
本文也公开了多个用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，所述方法包含：将一定量的所述样本与生长培养基混合，并培育一段时间；将所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；将所述样本在所述培养基中培养一段时间；通过OD600量测法来量测在所述培养基中的细菌的生长，其中所述样本的一调整过的OD600量测值指示出在所述样本中的所述细菌对一单独的抗生素的所述敏感性或抗性；及提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。所述样本疑似具有多个菌种在其中。
在一些实施例中，所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在多个孔中的一含有抗生素的细菌生长培养基。在一些实施例中，所述多孔测定盘具有96个孔。在一些实施例中，所述培养基为一液态肉汤培养基。在一些实施例中，所述培养基为穆勒-欣顿(Mueller-Hinton)培养基。
在一些实施例中，所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。在一些实施例中，所述多个孔的每一个含有一单一种的抗生素或多种抗生素的一组合。在一些实施例中，所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。在一些实施例中，所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。在一些实施例中，每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。在一些实施例中，每一种抗生素或多种抗生素的一组合包括有三种或多种浓度。
在一些实施例中，所述样本的所述OD600值被量测一次。在一些实施例中，所述样本的所述OD600值被多次进行量测。在一些实施例中，所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。在一些实施例中，所述调整过的OD600值包含一单一OD600量测值或扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。在一些实施例中，假如所述调整过的OD600值低于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。在一些实施例中，假如所述调整过的OD600值高于或等于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
在一些实施例中，所述样本为一生物流体或一活检样本。在一些实施例中，所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
附图说明
图1描绘了具有多个孔内容物及抗生素浓度(微克/毫升)的一示例性抗生素来源盘(Antibiotic Source Plate)。Nitro＝呋喃妥因、Cipro＝环丙沙星、Mero＝美罗培南、Ceftiaxone＝头孢曲松、TMP/SMX＝甲氧苄啶+磺胺甲恶唑、Pip/Tazo＝哌拉西林+三唑巴坦、Levo＝左氧氟沙星、Cefoxitin＝头孢西丁、Tetra＝四环霉素、Amp/Sulb＝氨必西林+舒巴坦、Amp＝氨必西林，及Vanco＝万古霉素。
图2描绘了具有多个孔内容物及抗生素浓度(微克/毫升)的一示例性抗生素来源盘。Cefazolin＝头孢唑林、Cefepime＝头孢吡肟、Ceftazidime＝头孢他啶、Gentamicin＝庆大霉素、Amox/Clav＝阿莫西林+克拉维酸、Cefaclor＝头孢克洛。
具体实施方式
多微生物感染的诊断及管理从未如此重要，特别是随着人口高龄化的发生，影响多个部位及器官系统的多微生物的感染对临床上及经济上皆有重大的影响。这些感染性疾病的诊断及管理受到能够与可用于对抗这些感染性疾病的多种功效下降的抗生素结合的多个不良的诊断工具的显着影响。用于评估这些挑战的一个良好模型系统为尿道感染症(UTI’s)的诊断及管理。
过去，尿液已经被认为是“无菌的”液体，且正常来说不会有细菌存在。没有细菌生长的培养物被假定为不含有细菌，且目前已知这可能是由于所述尿液培养物中没有细菌生长，而不一定是由于细菌不存在。人类的膀胱目前被公认为具有一微生物群系，所述微生物群系包括正常存在的一系列的细菌菌群，由于我们培养微生物的能力有限，因此所述一系列的细菌菌群已被忽略。此问题的结果为对于细菌感染的频率及范围的保守陈述。
一近期的研究(Wolfe等人J Clin Microbiol 50:1376-1383,2012)比较了从排泄的(voided)、经尿道的及/或耻骨上的收集方法所获得的多个尿液样本，并确定了利用16SrRNA的PCR扩增的标准培养方法。此研究说明了细菌至少存在于培养呈阴性的经尿道收集的尿液的一个亚群族中，所述样本最不可能受到其他来源的细菌污染(阴道或直肠污染)。估计仅有大约一半的UTI症状的患者会造成培养呈阳性。
再者，UTIs被认为通常是由一单一种的菌株所引起，且在培养之后，假如有多种菌株存在于一尿液检体中，则推测所述检体在采集期间受到污染。这些具有多种菌株的培养物经常被丢弃且不再进一步处理。目前已公认许多UTI为含多微生物的，且所述多种菌株可彼此间相互合作或支持以定殖(colonizing)在膀胱中。
从培养基的组成到pH值、气体比率及培育时间，目前存在的多个尿液培养条件偏向于一子系列的病原菌的侦测，主要为大肠杆菌。然而，这些偏倚的测定方法与临床上的多个症状不一致。因此，尿液样本的常规测试遗漏了许多尿道病原菌。
由于具抗生素抗性的细菌普及率的提高，UTIs的治疗由于未诊断出的抗性生物体的存在而时常不足。此外，相较于单一微生物感染，多微生物感染增加了抗生素抗性及毒性的发生频率。
例如，带有腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)及奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)两者的感染导致上行性肾盂肾炎风险的增加；带有尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli,UPEC)及奇异变形杆菌两者的感染造成两种微生物计算出的菌落形成单位(CFU)的增加；带有奇异变形杆菌及一种普罗威登斯菌株(Providenciastrain)两者的感染导致尿道结石风险的增加；带有绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)两者的感染导致肾盂肾炎风险的增加；以及带有B型链球菌及UPEC两者的感染造成UPEC滴度(titer)的增加。
鉴定微生物体及管理相关的多微生物感染所涉及的多个挑战不限于尿液。事实上，这是正常而不是例外的，并且包括了耳朵、鼻子与喉咙、肠胃道、肾结石、指甲及皮肤、前列腺、呼吸系统的感染、外科手术前与外科手术的感染以及伤口的照护。这些多微生物感染时常与所涉及的大量生物体复合。例如，细菌性前列腺炎是由一至八种不同的病原体同时引起的，因为所述多种病原体可在任何特定的精液样本中被发现，并且微生物的完全浓度在2.0至7.5log10 CFU/毫升之间变化。在囊肿性纤维化中，所述感染被公认为在遗传上及表型上是多样化的，甚至在同一患者内及肺的不同区域中。感染的多样性可能影响管理，且存在于相同空间中的两个或多个菌种的出现似乎改变了各个菌种的行为方式。它们的通信，包括遗传数据的分布，影响了对抗生素的敏感性。一特定细菌的出现可能与较佳或较差的结果相关。
在外科手术部位的感染中，医疗照顾相关感染(HAI)的子组成构成所有的HAI的20％，而外科手术部位感染的发生为所有的外科手术程序的约5％。外科手术部位感染已经被证明是由多微生物感染所引起的。
最常见的多微生物感染的其中之一在于伤口照护。压疮在行动不便的老年人中最常见，并且很难治愈。在住院期间，约有26％的老年人患有压迫性溃疡，并且这种情况由于年纪将显着地加剧。所述溃疡的发生可能与一些感染性并发症相关。慢性与急性伤口体现了一广泛的健康议题。真皮的伤口受到厌氧细菌及好氧细菌及真菌株的定殖，且它们大部分属于周围皮肤、口腔及肠道的常驻微生物群，或者来自于外部环境，并形成多个多微生物群落。
肾结石已经被证明涉及多微生物的细菌性来源。肾结石为在尿道中形成的一块坚硬的石头或晶体。结石可能导致尿液中的血尿、呕吐或排尿疼痛。患有慢性UTIs的个体，例如，在其肾脏或膀胱中具有长期导管的个体，或者由于神经系统疾病(瘫痪、多发性硬化症及脊柱裂)而具有较弱的膀胱排空的人有最高的风险。
因此，多微生物感染的盛行需要发展出新的方法。通过使用目前的培养指南，多微生物感染通常会被归类为混合菌群-可能受污染-而不会被进行处理。有许多研究显示出对应于UTIs研究结果的血液中的多微生物感染支持样本的适当特征的重要性。在与目前的培养指南结合的传统培养上所观察到的敏感性缺乏造成出现多个感染症状且无法诊断的患者发病率的上升-导致无效的治疗。
在一些实施例中，本文描述了用于与出现在一患者样本中的微生物菌群(多微生物)结合的抗生素敏感性测定法。因此，以目前的方法来测定的所述样本包含在测试前的可选择性被储存及可选择性被稀释的样本。在抗生素敏感性训练之前，没有细菌从样本中被分离出。所述公开的方法鉴定了在生物学背景下必须用以治疗在所述样本中发现的生物体的多种抗生素，并确定了针对所需抗生素的最小抑制浓度(MIC)。
如本文所使用，术语“样本”指的是从疑似具有一感染症的一受试者所采集到的任何生物流体或组织。示例性“样本”包括但不限于，尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、粪便、阴道分泌物、活检组织、脑脊髓液或任何需要用于抗生素敏感性测定的体液或组织。
如本文所使用，术语“受试者”指的是需要进行抗生素敏感性测试的任何哺乳类受试者，包括但不限于，人类、伴侣动物(例如，狗、猫、天竺鼠、仓鼠、雪貂、兔子、大鼠、小鼠等)、牲畜(例如，牛、猪、绵羊、山羊、马等)或任何疑似具有一感染症且需要进行抗生素敏感性测定的其他哺乳类。
如本文所使用，术语“细菌”可以指的是一单一种菌种或多种菌种。
如本文所使用，术语“多微生物”指的是具有存在其中的多个细菌菌种的一样本。多微生物样本也被称为具有一混合的细菌种群。
如本文所使用，术语“敏感的”指的是在使用建议用以治疗感染部位的剂量时，受到通常可达到的抗微生物制剂浓度所抑制的细菌。
如本文所使用，术语“抗性的”指的是在正常的剂量方案下不受到通常可达到的抗生素浓度所抑制的细菌及/或显示出落在一范围内的最小抑制浓度的细菌，在所述范围中，可能有特定的微生物抗性机制(例如，β-内酰胺酶)，且针对所述分离株的所述制剂的临床效用尚未可靠地显示在多个治疗研究中。
所述最小抑制浓度(MIC)为在一洋菜胶或肉汤(broth)的稀释敏感性测试中防止一种微生物的可见生长的一抗微生物制剂的最低浓度。
多个目前的抗生素敏感性测试法是在单独的个体上进行，并在敏感性测试之前从一样本中培养出。临床及实验室标准协会已经建立了对被测试的及用于指示出所述生物体对欲测试的抗生素是否具有“敏感性”、“中等程度”或“抗性”的所述菌种专一的多种抗生素浓度。多个测试方法包括洋菜胶稀释的所述“黄金标准”法、液体培养稀释及纸片扩散法。
目前，多个肉汤(液体)或洋菜胶稀释方法可被使用于定量地测定针对一特定的细菌分离株的一抗微生物制剂在试管内的活性。为了执行所述多个测试，准备具有一肉汤培养基或洋菜胶培养基的一系列的管子或盘子来添加各种浓度的抗微生物制剂。接着，将所述多个管子或盘子接种所述待测试生物体的一标准的悬浮液。在35±4℃下进行培育后，执行所述多个测试并确定所述MIC。最终的结果受方法的影响很大，假如要实现可再现的结果(实验室内及实验室间)，则所述方法必须被小心地控制。
目前，可能致病的生物体的每种类型所分离出的多个菌落从原先的洋菜胶盘被筛选出，且个别进行敏感性测试。多个鉴定流程时常被同时进行。目前建议不要在同一个敏感性测试盘或平板上测试不同类型微生物的多个混合体。
先前不建议直接与临床材料(例如，正常的无菌体液及组织)一起进行敏感性测试，除非在直接的革兰氏染色呈现出一单一种病原菌时的临床紧急状况下。进行测试的实验室被告诫在直接以所述临床材料实行测试时，应将多个结果报告为初步结果，并通过使用标准化方法对分离出的微生物重复进行所述敏感性测试。
虽然所述洋菜胶稀释方法被认为是所述黄金标准，但由于高劳动、材料及空间的要求，其很少被使用。此方法需要准备含有固体洋菜胶的培养皿，所述固体洋菜胶含有生长培养基及抗生素。对于测试每一个菌种的每一种抗生素，准备了由不同抗生素浓度组成的多个单独的培养皿。对于首批的12组抗生素而言，此情况转化为每一个菌种有45个单独的培养皿。在获得分离出的多个单一种的生物体(从隔夜培育的一菌种鉴定盘上来获得)后，所述多个生物体被接种在每个所述洋菜胶盘上，并进行隔夜培育。接者，一微生物专家目视检查并记录所述细菌是否在每个含有抗生素的洋菜胶盘上生长。
更普遍地，目前是使用所述纸片扩散法，其中将分离出的单一种生物体接种在含有生长培养基的培养皿上，并将浸渍了抗生素的滤纸圆盘放置在所述洋菜胶盘上。假如扩散到所述洋菜胶中的所述抗生素停止所述细菌的生长，或杀伤所述细菌，则所述细菌存在的所述圆盘的周围为不生长的一区域。此称为一抑制圈。通过量测所述抑制圈的尺寸来确定MIC、敏感性及抗性。然而，此方法需要将所述细菌均匀地沉积在所述培养盘上。越大的抑制圈与越低的MIC相关。
所述肉汤微稀释方法也经常被使用，其中将分离出的单一种生物体接种至液体培养基及不同浓度下的抗生素溶液中。假如所述抗生素停止所述细菌的生长，或杀伤所述细菌，则相较于接种至不含抗生素的培养基中的细菌的浊度，所述悬浮液的浊度将非常低或不存在。通过在液体培养基中产生一抗生素的不同浓度，可确定MIC、敏感性及抗性。
本文所描述的多个方法测试了所述样本中的结合的微生物菌群的所述抗生素敏感性，从而排除了要先从所述样本分离出单独菌种的需求。通过将具有所有的不同抗生素浓度的所述洋菜胶生长培养基或所述液体生长培养基放置于一多孔盘(例如，6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔盘，或任何适合用于此目的的多孔盘)的不同的孔中来排除掉对于每一种抗生素或浓度的多个单独的培养皿的需求。通过使用分光光度计分析来排除掉视觉评估生长相关的劳动。对于利用洋菜胶培养基的所述方法，在进行隔夜培育后，将一水溶液放置于所述多孔盘的所述多个孔的每一个中，并进行培育以允许在所述洋菜胶表面上生长的细菌菌落进入一悬浮液中。手动搅拌可用来辅助此过程，并且将含有可能生长在所述洋菜胶盘上的任何细菌的所述水溶液转移至一全新的多孔盘中，以进行分光光度分析。对于利用液态培养基的所述方法，将排列在所述多孔盘中的所述悬浮液用于分光光度分析，而不需要转移至一全新的多孔盘中。多个OD600量测值被取得以测定细菌生长。一简单的阈值被利用以指示出在一特定的抗生素浓度下是否存在细菌。
通过使用选自于大量可用于治疗患者的多种抗生素来进行本方法。多种抗生素(也被称为抗微生物制剂或抗菌制剂)包括，但不限于，青霉素类、四环霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、林可霉素类、大环内酯类、磺胺类、醣肽类抗生素类、胺基糖苷类、碳青霉烯类、安沙霉素类、脂肽类、单环内酰胺类、硝基呋喃类、恶唑烷酮类及多胜肽类。
青霉素类抗生素包括，但不限于，青霉素、甲氧苯青霉素、阿莫西林、氨必西林、氟氯西林、青霉素G、青霉素V、羧苄青霉素、哌拉西林、替卡西林、苯唑西林、双氯西林、阿洛西林、氯唑西林、美洛西林、替莫西林及萘夫西林。此外，青霉素类抗生素时常与多种β-内酰胺酶抑制剂结合使用，以提供更大范围的活性；这些抗生素的组合包括阿莫西林/克拉维酸、氨必西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦，及克拉维酸/替卡西林。
四环霉素类抗生素包括，但不限于，四环霉素、强力霉素、地美环素、米诺环素及土霉素。
头孢菌素类抗生素包括，但不限于，头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢西丁、头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢唑肟、头孢哌酮、头孢噻吩、头孢孟多、头孢洛林酯、头孢比普及头孢他啶。头孢菌素类抗生素时常与多种β-内酰胺酶抑制剂结合使用，以提供更大范围的活性；这些抗生素的组合包括，但不限于，阿维巴坦/头孢他啶，及头孢洛扎/三唑巴坦。
喹诺酮类抗生素包括，但不限于，洛美沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星、环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、西诺沙星、萘啶酸、曲伐沙星、依诺沙星、格帕沙星、替马沙星及司氟沙星。
林可霉素类抗生素包括，但不限于，克林霉素及林可霉素。
大环内酯类抗生素包括，但不限于，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、泰利霉素、地红霉素、罗红霉素、竹桃霉素、螺旋霉素及非达霉素。
磺胺类抗生素包括，但不限于，磺胺甲恶唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺、磺胺异恶唑、磺酰氨基柯衣定(sulfonamidochrysoidine)及磺胺异恶唑。磺胺类抗生素时常与甲氧苄啶结合使用，以提升杀菌活性。
醣肽类抗生素类抗生素包括，但不限于，达巴万星、奥利万星、特拉万星、替考拉宁及万古霉素。
胺基糖苷类抗生素包括，但不限于，巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素及奇霉素。
碳青霉烯类抗生素包括，但不限于，亚胺培南、美罗培南、多尼培南、厄他培南及亚胺培南/西司他丁。
安沙霉素类抗生素包括，但不限于，格尔德霉素、除莠霉素及利福昔明。
脂肽类抗生素包括，但不限于，达托霉素。
单环内酰胺类抗生素包括，但不限于，氨曲南。
硝基呋喃类抗生素包括，但不限于，呋喃唑酮及呋喃妥因。
恶唑烷酮类抗生素包括，但不限于，利奈唑胺、泼斯挫来(posizolid)、雷得唑来及特地唑胺。
多胜肽类抗生素包括，但不限于，杆菌肽、粘菌素及多粘菌素B。
不属于上述任何群组的一部分的其他抗生素包括，但不限于，氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布丁、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁/达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑及甲氧苄啶。
在一些实施例中，所述疑似感染为一尿道感染症，且所述抗生素为环丙沙星、左氧氟沙星、TMP/SMX、头孢曲松、氟喹诺酮、环丙沙星、胺基糖苷类(例如，庆大霉素5毫克/千克/天)、阿莫西林、利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因、磷霉素、匹美西林、阿莫西林-克拉维酸、氨必西林-舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-三唑巴坦、头孢氨苄、头孢唑林、头孢克洛、头孢呋辛、头孢替坦、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟、氨曲南、亚胺培南B(imipenemb)、多尼培南、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、加替沙星、莫西沙星、氧氟沙星、普卢利沙星、克林霉素、阿奇霉素及头孢氨苄中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为一前列腺感染症，且所述抗生素为阿莫西林-克拉维酸、氨必西林-舒巴坦、氨必西林、哌拉西林、哌拉西林-三唑巴坦、头孢氨苄、头孢唑林、头孢克洛、头孢呋辛、头孢替坦、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟、氨曲南、亚胺培南B(imipenemb)、多尼培南、万古霉素B(vancomycinb)、TMP/SMX、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、呋喃妥因、环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、普卢利沙星、克林霉素、阿奇霉素及克拉霉素中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为一肠胃道感染症，且所述抗生素为甲硝唑、万古霉素、非达霉素、硝唑尼特、甲硝唑、硝唑尼特、阿奇霉素、环丙沙星、强力霉素、TMP/SMX、非达霉素及替硝唑中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为一肺部感染症，且所述抗生素为阿奇霉素、克拉霉素、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼、氨必西林/克拉维酸、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、吉米沙星、TMP/SMX、四环霉素类(例如，强力霉素)、阿莫西林、氨必西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢地尼、头孢泊肟酯、头孢地尼、头孢呋辛、左氧氟沙星、莫西沙星、氨曲南赖氨酸、黏菌素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林-三唑巴坦及万古霉素中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为一中枢神经系统感染症，且所述抗生素为青霉素、氨必西林、庆大霉素、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、万古霉素、莫西沙星、吉米沙星、加替沙星、加雷沙星、曲伐沙星、TMP/SMX、氨曲南、美罗培南、氯霉素、利奈唑胺、利福平、甲硝唑、青霉素G、头孢唑肟、头孢他啶、氨必西林-舒巴坦、亚胺培南、米诺环素及阿米卡星中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为伤口感染，且所述抗生素为TMP/SMX、头孢氨苄、阿莫西林/克拉维酸、强力霉素、克林霉素、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦、尔他培南、万古霉素、头孢唑林、氨必西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢曲松、甲硝唑及亚胺培南中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为一鸟粪石(Struvite)感染症/肾结石感染症，且所述抗生素为环丙沙星、左氧氟沙星、TMP-SMX、头孢曲松、氟喹诺酮、环丙沙星、胺基糖苷类(例如，庆大霉素5毫克/千克/天)、阿莫西林、利奈唑胺、万古霉素(cancomycin)、呋喃妥因、磷霉素、匹美西林、阿莫西林-克拉维酸、氨必西林-舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-三唑巴坦、头孢氨苄、头孢唑林、头孢克洛、头孢呋辛、头孢替坦、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟、氨曲南、亚胺培南B(imipenemb)、多尼培南、TMP/SMX、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、加替沙星、莫西沙星、氧氟沙星、普卢利沙星、克林霉素、阿奇霉素及头孢氨苄中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为指甲、皮肤、甲沟炎感染，且所述抗生素为氨必西林、TMP/SMX、头孢氨苄、克林霉素、阿莫西林/克拉维酸、强力霉素、克林霉素、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦、尔他培南、万古霉素、头孢唑林、氨必西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢曲松、甲硝唑及亚胺培南中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为耳朵、鼻子及喉咙感染，且所述抗生素为阿奇霉素、克拉霉素、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼、氨必西林/克拉维酸、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、吉米沙星、TMP/SMX、四环霉素类(例如，强力霉素)、阿莫西林、氨必西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢地尼、头孢泊肟酯、头孢地尼、头孢呋辛、左氧氟沙星、莫西沙星、氨曲南赖氨酸、粘菌素、妥布霉素、阿米卡星、妥布霉素、氧氟沙星、强力霉素、青霉素V、哌拉西林-三唑巴坦及万古霉素中的一种或多种。
在一些实施例中，所述疑似感染为外科手术前/外科手术的部位感染，且所述抗生素为头孢唑林、头孢呋辛、头孢唑林、头孢呋辛、头孢唑林、头孢西丁、头孢替坦、头孢曲松、氨必西林-舒巴坦、头孢替坦、甲硝唑、硫酸新霉素、红霉素、尔他培南、氟喹诺酮、TMP/SMX、氨必西林、氨曲南、环丙沙星、克林霉素、尔他培南、氟康唑、庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、哌拉西林-三唑巴坦、万古霉素、红霉素、甲硝唑及新霉素中的一种或多种。
此外，本公开的多个方法的范围包含多种未知的或未得到监管机构批准的抗生素。目前主张的测定法可以任何抗菌制剂来进行，且并非受限于本文所公开的所述多种抗生素。
现在，转移至所公开的多个方法，根据标准收集实验步骤从多个受试者采集多个样本至多个无菌容器中，并且将所述多个样本运送至一测试设备。
所述抗生素抗性(ABR)测试盘的准备涉及两个步骤。第一步骤为准备多种抗生素溶液，且第二步骤为准备细菌生长培养基盘。针对一特定样本的欲测试的所述多种抗生素包括已知对于治疗疑似受感染的所述组织很有用的多种抗生素，或是任何由具有所述特定患者样本的资讯的一医学专家或实验室专家所请求的抗生素。可以预期的是，基于由一医学专家所臆测的所述感染的类型及位置，大部分的测定将使用一标准的抗生素组来进行。在一些实施例中，所述标准的抗生素组包含呋喃妥因、环丙沙星、美罗培南、头孢曲松、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、哌拉西林/三唑巴坦、左氧氟沙星、头孢西丁、四环霉素、氨必西林/舒巴坦、氨必西林及万古霉素。然而，已知对抗生素过敏或敏感，或者具有一抗生素抗性病史的多个患者可能需要客制化的抗生素组。所述测定法可以无限数量的抗生素来同时进行。
通过使用多种适合用于各个抗生素的稀释液来制备多种抗生素原液，接着制备成10X溶液，并将所述10X溶液储存在多个多孔盘中，以允许有效率的传递至多个测试盘中。每一种抗生素以至少两种浓度进行测试。在一些实施例中，所述测定法包括一种抗生素或一种抗生素组合物的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种浓度。通常会制备所述多种抗生素的连续稀释，其中每种稀释相当于较高浓度的一半浓度。根据建立用于针对所述测定所选择的所述抗生素组的一盘计画(plate plan)来将所述多种10X抗生素溶液储存在所述多孔盘中。图1及图2中的抗生素来源盘(Antibiotic Source Plate)描绘了多个示例性盘计画。在2至8℃下储存多种抗生素原液及10X溶液，直到有需求为止。
所述多个ABR测试盘为能够含有细菌生长培养基并培养细菌的多个多孔盘(例如，6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔盘，或任何适合用于此目的的多孔盘)。在一些实施例中，所述多个盘子为96孔盘。在一些实施例中，无菌的洋菜胶-细菌生长培养基被分配至所述盘子的每一个孔中。示例性的洋菜胶-细菌生长培养基包括，但不限于，穆勒-欣顿(Mueller-Hinton)洋菜胶、血液洋菜胶、胰蛋白酶大豆洋菜胶等。在所述洋菜胶于室温凝固后，根据所述预定的盘计画来将10X抗生素溶液体积的十分之一加入所述测试盘的每一个孔中。在所述多种抗生素被引入至所述细菌生长培养基后，将所述多个盘子静置至少一小时。对长期的储存而言，所述多个含有抗生素的ABR盘被储存在2至8℃。在一些实施例中，与样本混合的无菌的液体肉汤细菌生长培养基被分配至含有根据一预定的盘计画所排列的10X抗生素溶液体积的十分之一的所述盘子的每一个孔中。含有(细菌生长培养基及抗生素溶液)十分之一体积的多个多孔盘被储存在2至8℃，以便随后的使用或长期的储存。
用于所公开的抗生素抗性测试的多个样本可选择地以无菌的水溶液或与细菌生长培养基混合来进行稀释。在一些实施例中，首先将用于所公开的抗生素抗性测试的一定体积的样本与一生长培养基混合，并且在35±4℃的一培育温度下培育0至24小时。接着，以食盐水稀释所述多个样本，然后与生长培养基混合，并且以所述多孔盘中的每一个孔的十分之九的体积加入至常温的多个ABR测试盘中。在一些实施例中，多个样本是以存在于所述孔中的细菌生长培养基体积的二十分之一加入至常温的多个ABR测试盘中。每个ABR盘用于一单一患者的检体。假如有多个患者检体欲被测试，则每个检体在其自己的盘子中进行测定。一旦被接种，将所述多个盘子覆盖并进行培育以促进细菌生长。使用一个以上的盘子来测定一单一样本的多个实施例也在本方法的范围内。
所述多个盘子可用于厌氧细菌或好氧细菌。对于厌氧细菌的培养，所述多个盘在一温度及一低氧环境下进行培育，以促进厌氧细菌的生长。对于好氧细菌的培养，所述多个盘子在一温度及一含氧环境下进行培育，以促进好氧细菌的生长。
所述培育温度可取决于多种所预期的细菌类型来变化，但最可能在35至40℃的一范围内。将含有多个样本的所述多个盘子进行培育12至48小时、12至24小时、24至28小时、12至36小时、14至30小时、16至24小时、16至20小时或16至18小时，或者这些数字所限制的任何范围。
在一些实施例中，所述测定法是以一含有洋菜胶的培养基来进行，在培育之后，通过在一水溶液中进行再悬浮来回收存在于每一个孔中的细菌。合适的多种液体包括，但不限于，水、食盐水、培养基等。所述水溶液应该为无菌的，或者至少没有细菌生长。等同于细菌生长培养基的100％体积的一定体积的液体被小心地加入至所述ABR盘的所述多个孔中，并且静置至少30分钟。在一些实施例中，所述多个盘被允许静置35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟。接着，根据所述预定的盘计画将得到的悬浮液小心地从每一个孔中移出，并放入一干净多孔盘的多个个别的孔中。所述多个盘子可选择地被搅拌，以使得在所述悬浮液被移出之前将所述细菌与所述液体进行混合。在使用液体生长培养基来进行所述测定法的一些实施例中，所述多孔盘将在培育之后立即用于OD600值的量测。
接着，在一分光光度计中读取容纳了所述含有细菌的悬浮液的所述多孔盘。所述被回收液体的所述光学密度在OD600的条件下多次进行量测，以校正在所述悬浮液中的多个细菌粒子的不均匀分布。在一些实施例中，所述多个盘子被读取一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。所述多孔盘的多次读取连续地发生，而不允许所述悬浮液在所述多个孔中沉淀。
每一个孔的所述多个OD600值被平均以提供在特定条件下存在于每一个孔中的细菌的一准确定量。接着，通过减去没有细菌可生长以产生一空白值的一孔的多个OD600值的平均值来调整每一个孔的OD600平均值的背景值。在一些实施例中，这种没有生长的孔含有多种抗生素的混合物(AB-混合物)。在一些实施例中，这种没有生长的孔含有迭氮化钠(钠-迭氮化物)。所述空白值代表细菌在存在有特定抗生素的所述孔中的生长能力。
接着，多个所述空白结果基于一阈值来被转换成一“抗性”(R)分数或一“敏感性”(S)分数。大于或等于所述阈值的多个OD600量测值被解释为具抗性的，而低于所述阈值的多个量测值被解释为具敏感性的。
在一些实施例中，所述阈值是针对含有洋菜胶的一培养基。在一些实施例中，基于与一标准参考方法的关联性来将一阈值确定为0.010至1.000、0.010至0.090、0.015至0.035，或0.020至0.030。在一些实施例中，基于与一标准参考方法的关联性来将一阈值确定为约0.010、约0.015、约0.020、约0.025、约0.030、约0.035、约0.040、约0.045、约0.050、约0.055、约0.060、约0.065、约0.070、约0.075、约0.080、约0.085，或约0.090。在一些实施例中，基于与一标准参考方法的关联性来将一阈值确定为0.025。
在一些实施例中，所述阈值是针对一液态培养基。在一些实施例中，基于与在两个标准参考方法之间的一共识分数(consensus score)的关联性来将一阈值确定为0.010至1.000、0.020至0.090、0.050至0.080、0.055至0.075，或0.060至0.070。基于与在两个标准参考方法之间的一共识分数的关联性来将一阈值确定为约0.010、约0.015、约0.020、约0.025、约0.030、约0.035、约0.040、约0.045、约0.050、约0.055、约0.060、约0.065、约0.070、约0.075、约0.080、约0.085、约0.090，或约0.095。在一些实施例中，基于与在两个标准参考方法之间的一共识分数的关联性来将一阈值确定为0.065。
在其他实施例中，任何大于空白OD600量测值的调整过的OD600量测值可被确定作为细菌生长的指示，并通过与一标准参考方法或多个标准参考方法的一组合的关联性来被应用作为一阈值。
接着，基于在所述多种抗生素浓度下的所述培养物的所述敏感性或抗性来计算针对每一种有效的抗生素的最小抑制浓度。
本文所公开的所述抗生素抗性测定的多个结果可被传递给一合适的医学专家，所述医学专家接着可选择开出被证明对所述患者的感染具有活性的一种抗生素或多种抗生素的处方，或将所述抗生素改变为一更有效的抗生素，或安排进行额外的测试。
示例
示例一、利用含有洋菜胶的培养基进行的抗生素抗性(ABR)测定法
通过使用多个BD真空采集管(BD Vacutainer)(灰盖)或其他合适的防漏无菌容器来采集、运送及储存适合用以与此测定法一起进行的多个尿液样本。在多个测试结果综合平衡之前，多个尿液样本可在室温下放置48小时。
将未被容纳于现成溶液中的多种抗生素溶解在适当的稀释液中，并根据它们各自的溶解度溶解成所述测定法所需的10X浓度，以作为多种抗生素原液。将多种抗生素原液储存在2至8℃，并且免于阳光的直接照射。多种制备好的抗生素原液被分装至一96深孔盘(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))中，以形成如图1所示的一抗生素来源盘，并且通过抗生素的名字及浓度来进行辨识(微克/毫升；10X最终浓度)。包括在此测定中的多种抗生素为单独的或组合的呋喃妥因、环丙沙星、美罗培南、头孢曲松、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、哌拉西林、三唑巴坦、左氧氟沙星、头孢西丁、四环霉素、氨必西林、舒巴坦及万古霉素。将一个孔设计成AB-混合物，所述AB-混合物含有多种抗生素的一组合，以确保没有细菌生长。
将100微升的穆勒-欣顿洋菜胶培养基分装至一96孔微量盘(VIS96/F-PS，艾本德(Eppendorf))的每个适当的孔位置中。所述培养基在室温下于至少10分钟内进行固化。
接着，将各种浓度的所述多种抗生素(10微升)从所述抗生素来源盘分装至所需的多个孔中。在所述多种抗生素被引入至所述洋菜胶培养基后，所述多个ABR盘在使用之前被静置至少一小时。假如需要长期储存，则将含有注入有抗生素的洋菜胶的多个ABR盘储存在2至8℃的黑暗环境中。
在测试时，将多个尿液样本以无菌食盐水中进行1:20的稀释并进行旋涡振荡。每个患者样本使用一单一个ABR微量盘。将5微升的稀释过的患者样本加入至室温的所述微量盘的每一个孔中，所述盘子被密封并且在37℃培育16至18小时。
在培育之后，将所述盘子从恒温箱移出，并小心地开盖。将200微升的去离子水加入至每一个孔中，以悬浮出现在所述洋菜胶上的多个细胞，并且在室温下培育所述多个盘子30分钟。在30分钟后，将每一个孔中的100微升移至一新的盘子中，并以一分光光度计确定所述OD600值。对每个盘子进行五次个别的读取，并计算出一OD600量测值的平均值。
表1描述了多个控制组。
表1、多个控制组
Figure BDA0002319077570000211
表2描述了从所述盘子采集到的原始数据。试算表形式的数据依照“孔位置”来进行排列，所述“孔位置”邻近于与其相对应的OD的“平均值”。
表2、原始数据
Figure BDA0002319077570000221
根据所述盘计画，每一个孔位置对应于在一特定浓度下的一特定的抗生素。表3描述了添加所述抗生素的说明。
表3、
Figure BDA0002319077570000222
Figure BDA0002319077570000231
一旦抗生素说明被放置成邻近于合适的孔，则所述数据通过将相同的抗生素分类在一起来被重新排列(表4)。
表4、
Figure BDA0002319077570000232
Figure BDA0002319077570000241
接着，通过使用从所述AB-混合物孔获得的所述量测值来将所述原始数据进行“去背景化(blanked)”，如表5所描述。
表5、
Figure DA00023190775758636
Figure BDA0002319077570000242
Figure BDA0002319077570000251
为了确定存在于所述多个患者样本中的多种细菌生物对于一特定浓度下的一特定的抗生素是否具有抗性或敏感性，将多个去背景化过的OD读取值与0.025的一OD600阈值进行比较(表6)。任何大于或等于此阈值的OD量测值被指定为具抗性(R)的，所述抗性(R)代表存在于患者样本中的多种细菌生物对于在所述特定浓度下的所述特定的抗生素为具抗性的。任何低于此阈值的OD量测值被指定为具敏感性(S)的，所述敏感性(S)代表存在于患者样本中的多种细菌生物对于在所述特定浓度下的所述特定的抗生素为敏感的。
表6、
Figure BDA0002319077570000252
Figure BDA0002319077570000261
Figure DA00023190775758700
在此示例中，所述样本包含对呋喃妥因、环丙沙星、美罗培南、头孢曲松、哌拉西林/三唑巴坦及头孢西丁敏感的细菌。对于左氧氟沙星的多个结果为模棱两可的。
接着，可提供对于每一种药物的所述MIC。所述最小抑制浓度(MIC)为所述样本对所测试的抗生素具敏感性的最小浓度。表7描述了基于上述多个结果的针对美罗培南所确定的一示例性MIC。
表7、
Mero[1] Mero[2] Mero[4] Mero[8] MIC 判读
S S S S <＝1 S
R S S S <＝2 I
R R S S <＝4 I
R R R S <＝8 I
R R R R >＝8 R
示例二、利用含有生长培养基的洋菜胶进行的ABR测定法的验证
准确性
通过将所述测试方法的所述多个抗生素抗性结果与由所述抗生素-洋菜胶方法评估多个混合培养物及分离出的培养物所获得的多个结果进行比较来评估准确性。测试总共19个细菌池(所述细菌池由2至4种生物体组成)、17种分离出的生物体及9种常规处理的尿液样本对12种抗生素的抗性。准确性是关于专一性(真阴性)、灵敏度(真阳性)及整体准确性(所有样本)来进行评估。所述测定法在全部的三个类别中显示出优异的准确性(表8)。
表8、
Figure BDA0002319077570000271
精确性
通过在三天内测试来自于所述“准确性”样本组的三个样本来评估测定间的精确性。通过对一批次中的这些样本的每一个测试三次来评估测定内的精确性。通过确定所有的五个重复的共识结果，且接着计算与所述共识结果匹配的所述多个重复的数量来评估对于每一个样本的精确性。接着，将此数量除以所述量测值的总数(对于所有药物的量测值的总数)，以确定精确性百分比。通过将所述正确匹配的总数除以所有样本的量测值的总数量来计算整体精确性。所述测定法证明了非常优异的精确性(表9)。
表9、
Figure BDA0002319077570000281
分析灵敏度
通过确定产生多个正确结果的最低的细菌浓度来评估分析灵敏度或侦测的限制(LOD)。低于10,000细胞/毫升的多种细菌浓度不会被视为对于UTI为阳性的，因此，所测试的所述最低浓度为10,000细胞/毫升。在所测试的所述最低的细菌浓度下获得与所述多个共识结果相关联的多个一致性结果(>98％)。此测定法的所述LOD为10,000细胞/毫升。
分析专一性
通过在100,000,000细胞/毫升的细菌浓度下测试多个样本来评估此测定法的所述分析专一性。这种浓度通常不会在常规的UTI患者身上观察到，而是在饱和的隔夜细菌培养物上实现。接着，通过测试来自于所述“准确性”样本组的三个样本来进行分析量测范围(AMR)的评估，所述三个样本的每一个被稀释如下：100,000,000细胞/毫升、1,000,000细胞/毫升、100,000细胞/毫升及10,000细胞/毫升。在所测试的所有细菌浓度下获得与所述多个共识结果相关联的多个一致性结果(>94％)。
示例三、利用液体生长培养基进行的抗生素抗性(ABR)测定法
通过使用多个BD真空采集管或其他合适的防漏无菌容器来采集、运送及储存适合用以与此测定法一起进行的多个尿液样本。在多个测试结果综合平衡之前，多个尿液样本可在室温下放置48小时。
将未被容纳于现成溶液中的多种抗生素溶解在适当的溶剂中，以及根据它们各自的溶解度溶解成所述测定法所需的50X浓度，并储存作为多种抗生素原液。将多种抗生素原液储存在2至8℃，并且免于阳光的直接照射。多种制备好的抗生素原液被分装至一96深孔盘(赛默飞世尔科技)中，以形成一50X抗生素来源盘，接着以1:5进行稀释以形成如图2所示的一10X抗生素来源盘，在图2中每个孔通过抗生素的名字及浓度来被辨识(微克/毫升；10X最终浓度)。包括在此测定中的多种抗生素为单独的或组合的阿莫西林、克拉维酸、氨必西林、舒巴坦、头孢克洛、头孢唑林、头孢吡肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、美罗培南、呋喃妥因、哌拉西林、三唑巴坦、四环霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑及万古霉素。将一个孔设计成迭氮化钠，以确保在此孔中不会观察到细菌生长。
将20微升的每一种抗生素溶液从所述10X抗生素来源盘分装至一96孔微量盘(VIS96/F-PS，艾本德)的所述多个预定的孔中，以创造出用于接种的多个ABR测试盘。在使用之前，将这些ABR测试盘在黑暗环境中静置长达24小时。
在测试时，将多个尿液样本离心以浓缩任何细菌细胞，接着与穆勒-欣顿培养基混合，并在37℃下培育6至16小时。在这次的初始培育后，所述样本在食盐水中被稀释成0.5至0.6McF，接着将500微升的悬浮液加入至29.5微升的穆勒-欣顿培养基中。接着，将180微升的所述稀释过的样本分装至已经含有10X抗生素溶液的所述ABR盘的每一个孔中，从而将所有的所述抗生素调整至所需的最终浓度。接着，所述盘子被密封并且在37℃下培育12至16小时。
在培育之后，将所述盘子从恒温箱移出，并小心地开盖，以及通过一分光光度计确定对于每个适当的孔的所述OD600值。对一盘子上的每一个孔进行五次个别的读取，并对于每一个孔计算出一OD600量测值的平均值。
表10描述了多个控制组。
表10、多个控制组
Figure BDA0002319077570000301
表11描述了从所述盘子采集到的原始数据。试算表形式的数据依照“孔位置”来进行排列，所述“孔位置”邻近于与其相对应的OD的“平均值”。
表11、原始数据
Figure BDA0002319077570000302
Figure BDA0002319077570000311
根据所述盘计画，每一个孔位置对应于在一特定浓度下的一特定的抗生素。表12描述了添加所述抗生素的说明。
表12、
Figure BDA0002319077570000312
Figure BDA0002319077570000321
在抗生素说明被放置成邻近于合适的孔的情况下，所述数据通过将相同的抗生素分类在一起来被重新排列(表13)。
表13、
Figure BDA0002319077570000322
Figure BDA0002319077570000331
接着，通过使用从所述迭氮化钠孔获得的所述量测值来将所述原始数据进行“去背景化(blanked)”，如表14所描述。
表14、
Figure BDA0002319077570000332
Figure BDA0002319077570000341
Figure BDA0002319077570000342
Figure BDA0002319077570000351
为了确定存在于所述多个患者样本中的多种细菌生物对于一特定浓度下的一特定的抗生素是否具有抗性或敏感性，将多个去背景化过的OD读取值与0.065的一OD600阈值进行比较(表15)。大于或等于此阈值的一OD量测值被指定为具抗性(R)的，所述抗性(R)代表存在于患者样本中的多种细菌生物对于在所述特定浓度下的所述特定的抗生素为具抗性的。任何低于此阈值的OD量测值被指定为具敏感性(S)的，所述敏感性(S)代表存在于患者样本中的多种细菌生物对于在所述特定浓度下的所述特定的抗生素为敏感的。
表15、
Figure BDA0002319077570000352
Figure BDA0002319077570000361
Figure BDA0002319077570000362
Figure BDA0002319077570000371
在此示例中，所述样本包含对阿莫西林/克拉维酸、氨必西林、氨必西林/舒巴坦、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/三唑巴坦及万古霉素敏感的细菌。
接着，可提供对于每一种药物的所述MIC。所述最小抑制浓度(MIC)为所述样本对所测试的抗生素具敏感性的最小浓度。表16描述了基于上述多个结果的针对美罗培南所确定的一示例性MIC。
表16、
Mero[1] Mero[2] Mero[4] Mero[8] MIC 判读
S S S S <＝1 S
R S S S <＝2 I
R R S S <＝4 I
R R R S <＝8 I
R R R R >＝8 R
示例四、利用液体生长培养基进行的ABR测定法的验证
准确性
通过将所述测试方法的所述多个抗生素抗性结果与由多个标准参考方法所获得的多个结果的一共识进行比较来评估准确性。测试总共15种分离出的生物体及20种常规处理的尿液样本对18种抗生素的抗性，每一种都以多种浓度进行测试，总共有57种抗生素浓度。准确性是关于专一性(真阴性)、灵敏度(真阳性)及整体准确性(所有样本)来进行评估。所述测定法在全部的三个类别中显示出优异的准确性(表17)。
表17、
Figure BDA0002319077570000381
精确性
通过在不同的三天内测试五个样本来评估测定间的精确性。通过在单一天内对相同的五个样本测试三次来评估测定内的精确性。计算一致性的百分比来量测通过此测定法所获得的所述多个精确性结果。所述测定法证明了非常优异的精确性(表18)。
表18、
Figure BDA0002319077570000382
分析灵敏度
通过创造具有对于每一种生物体有低于100个细胞/毫升的最低细菌浓度的大肠杆菌及粪肠球菌的一连续稀释来评估分析灵敏度。测试对于每一种分离株的每一个稀释程度，以显示出低至所述最低浓度的多个结果的再现性。在对于两种分离株的所有稀释程度上均观察到98％的关联性，从而指示出此测定法的测定限制(LOD)低于100细胞/毫升。
分析专一性
在以过多的细菌细胞进行的超载测定的抑制效果的背景来下评估分析专一性。对于在高细菌浓度下进行接种的多个样本观察到较低的准确性(由于假性的抗性结果)。这指示出在预培养后及ABR接种之前，所有的样本必须被稀释至特定的细胞密度。
决定预培养的持续时间
在将多个样本引入至多种抗生素中之前，此测定法采用一预培养步骤。对于两种分离株(大肠杆菌及粪肠球菌)是在6小时及16小时的时间点测试此预培养培育的持续时间。在6小时及16小时两者的预培养培育后，观察到对于每一种分离株的优异的准确性，从而指示出针对此测定法的6至16小时的一预培养窗口。下面的表19呈现出多个结果。
表19、
Figure BDA0002319077570000391
决定培育的持续时间
一旦多个样本被引入至多种抗生素中，所述多个样本则被培育12至16小时。此培育的长度是通过获得在进行12小时及16小时的培育后的多个精确性样本的多个OD量测值来决定。对于在12至16小时的一培育窗口内的所有样本均观察到优异的一致性百分比(表20)。
表20、
Figure BDA0002319077570000392
细菌生长的确认
为了确认由于细菌生长所造成的混浊度(高OD量测值)，从对应于多个敏感性及抗性结果的多个孔来粹取DNA，并且通过PCR来测试所述DNA以进行病原体的鉴定。多个鉴定结果证实相较于多个敏感性(清澈)孔，多个抗性(混浊)孔含有相当高的细菌浓度(表21)。
表21、
Figure BDA0002319077570000401
除非另有说明，否则在说明书及权利要求中所使用的所有用以表示多种成分的量值、例如分子量、反应条件等的多个特性的数字在所有的例子中均应被理解为通过术语“大约”来进行修饰。如本文所使用，术语“大约”及“大概”意旨为在10至15％内，优选为5至10％内。因此，除非有相反的指示，否则在说明书及所附权利要求中所阐述的多个数字参数为多个近似值，所述多个近似值可取决于本发明试图获得的多个所需特性来进行变化。至少且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个所述数字参数至少应根据所报导的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来被解释。尽管本发明的广泛范围所阐述的多个数字范围及参数为多个近似值，但在多个具体实例中所阐述的数值尽可能精确地被报导。然而，任何数值皆固有地包含某些误差，所述误差必定是由它们各自的测试量测值的标准差所引起的。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)所使用的术语“一”(“a”、“an”)、“所述”及多个类似的指代物应被解释为涵盖单数及复数，除非本文另外指示或与上下文明显相抵触。本文中的多个数值范围的列举仅旨在作为分别指出落在所述范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的数值均被并入说明书中，就好像其在本文中被单独引用一样。本文所描述的所有方法可以任何合适的顺序来被执行，除非本文另外指示或与上下文明显相抵触。本文所提供的任何或全部的示例或示例性语言文字(例如，“例如”)的用途仅旨在更好地说明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言文字都不应被解释为指示出必须用以实施本发明的任何未被要求保护的元素。
本文所公开的本发明的多个替代元件或多个实施例的分组不应被解释为限制。每个群组的成员可被单独引用或要求保护，或者与所述群组的其他成员或在本文找到的其他元件组合使用。可以预期的是，出于方便及/或可专利性的原因，一群组中的一个或多个成员可被包括在一群组中或从所述群组中被删除。当任何的这种包括或删除发生时，说明书被认为包含有如同被修改过的所述群组，因此满足了在所附权利要求中所使用的所有马库西群组的书面描述。
本文所描述的本发明的某些实施例包括了发明人已知的用于实现本发明的最佳模式。当然，在阅读前述的说明时，这些所描述的实施例的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这种变型，且本发明人意图以不同于本文所具体描述的方式来实施本发明。因此，此发明包括如同可应用的法律所允许的在所附权利要求中列举出的主题标的物的所有修改及等同物。并且，除非本文另外指示或与上下文明显相抵触，否则本发明涵盖了上述的多个元件在其所有可能的变化中的任何组合。
本文所公开的多个具体实施例可能进一步通过使用由语言文字组成或基本上由语言文字组成来被限制在权利要求中。在被使用于权利要求中时，无论是按修正案提交或增加，过渡术语“由…组成”不包括在权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分。过渡术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为多个特定的材料或步骤，以及那些不会实质上影响(多个)基础及新颖特征的材料或步骤。如此要求保护的本发明的多个实施例在本文中被固有地或明确地描述及启用。
再者，在整个说明书中，已经对多个专利及多个印刷出版物进行多次引用。上面所引用的多个参考文献及印刷出版物的每一个均通过引用将其全文个别地并入本文中。
最后，应当理解的是，本文所公开的本发明的多个实施例为本发明的多个原理的说明。其他可能被采用的实施例亦在本发明的范围内。因此，通过示例的方式，但不限于，本发明的多个可替代的配置可根据本文的多个教学来被使用。因此，本发明不限于被精确地显示及描述出。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，其特征在于：所述方法包含︰
将一定量的所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；
将所述样本在所述培养基上培养一段时间；
以一溶液悬浮出现在每个培养基中的所述细菌，并回收所述悬浮液；
量测每个悬浮液的一OD600值，其中一悬浮液的所述调整过的OD600值指示出在所述样本中的细菌对一单独的抗生素的所述敏感性或抗性；及
提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本含有多个菌种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在所述多孔测定盘中的多个含有抗生素的细菌生长培养基，其中所述多孔测定盘的每一个孔中含有不同的抗生素或不同浓度的抗生素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多孔测定盘具有96个孔。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述细菌生长培养基为一含有洋菜胶的培养基。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、头孢吡肟、头孢唑林、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：每一个所述孔含有一单一种的抗生素或含有多种抗生素的一组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以三种或多种浓度存在于所述多个孔中。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述悬浮液的所述OD600值被多次进行量测。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述调整过的OD600值包含扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值低于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值高于或等于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本为一生物流体或一活检样本。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
19.一种用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，其特征在于：所述方法包含：
将一定量的所述样本与一生长培养基混合，并培育一段时间；
将所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；
将所述样本在所述含有抗生素的培养基中培养一段时间；
通过OD600量测法来量测在每个所述培养基中的细菌的生长，其中所述培养基的一调整过的OD600量测值指示出在所述样本中的所述细菌对一抗生素的所述敏感性或抗性；及
提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本含有多个菌种。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在所述多孔测定盘中的多个含有抗生素的细菌生长培养基，其中所述多孔测定盘的每一个孔中含有不同的抗生素或不同浓度的抗生素。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述多孔测定盘具有96个孔。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述培养基为一液态肉汤培养基。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述培养基为穆勒-欣顿培养基。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于：每一个所述孔含有一单一种的抗生素或多种抗生素的一组合。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。
29.如权利要求21所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合包括有三种或多种浓度。
31.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本的所述OD600值被量测一次。
32.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本的所述OD600值被多次进行量测。
33.如权利要求34所述的方法，其特征在于：所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。
34.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述调整过的OD600值包含一单一OD600量测值或扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。
35.如权利要求19所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值低于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。
36.如权利要求19所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值高于或等于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
37.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本为一生物流体或一活检样本。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于：所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
39.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在使用所述方法之前，不用从所述样本分离出多个单独的菌种。
40.如权利要求19所述的方法，其特征在于：在使用所述方法之前或期间，不用从所述样本分离出多个单独的菌种。

Claims (38)

1.一种用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，其特征在于：所述方法包含︰
将一定量的所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；
将所述样本在所述培养基上培养一段时间；
以一溶液悬浮出现在所述培养基中的所述细菌，并回收所述悬浮液；
量测所述悬浮液的一OD600值，其中一悬浮液的一调整过的OD600值指示出在所述样本中的细菌对一单独的抗生素的所述敏感性或抗性；及
提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本含有多个菌种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在多个孔中的一含有抗生素的细菌生长培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多孔测定盘具有96个孔。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述细菌生长培养基为一含有洋菜胶的培养基。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、头孢吡肟、头孢唑林、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多个孔的每一个含有一单一种的抗生素或含有多种抗生素的一组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以三种或多种浓度存在于所述多个孔中。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述悬浮液的所述OD600值被多次进行量测。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述调整过的OD600值包含扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值低于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值高于或等于0.025，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本为一生物流体或一活检样本。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
19.一种用于同时确定在一样本中的一混合的细菌种群对多种抗生素的敏感性的方法，其特征在于：所述方法包含：
将一定量的所述样本与一生长培养基混合，并培育一段时间；
将所述样本同时施加于多个含有抗生素的培养基，其中所述样本来自于疑似具有一感染症的一受试者；
将所述样本在所述含有抗生素的培养基中培养一段时间；
通过OD600量测法来量测在所述培养基中的细菌的生长，其中所述样本的一调整过的OD600量测值指示出在所述样本中的所述细菌对一单独的抗生素的所述敏感性或抗性；及
提供所述敏感性的信息给一医药专家，以决定用于所述受试者的一抗生素治疗。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本含有多个菌种。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述多个含有抗生素的培养基包含一多孔测定盘，所述多孔测定盘具有配置在多个孔中的一含有抗生素的细菌生长培养基。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述多孔测定盘具有96个孔。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述培养基为一液态肉汤培养基。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述培养基为穆勒-欣顿培养基。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃妥因、磷霉素、阿莫西林、克拉维酸、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克洛、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、阿维巴坦、头孢他啶、头孢洛扎、三唑巴坦、诺氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢西丁、四环霉素、舒巴坦、头孢呋辛及万古霉素中的两种或多种。
26.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述多个孔的每一个含有一单一种的抗生素或多种抗生素的一组合。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素的组合包含两种抗生素。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述多种抗生素包含至少三种抗生素、至少四种抗生素、至少五种抗生素、至少六种抗生素、至少七种抗生素、至少八种抗生素、至少九种抗生素或至少十种抗生素。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合以两种或多种浓度存在于所述多个孔中。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于：每一种抗生素或多种抗生素的一组合包括有三种或多种浓度。
31.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本的所述OD600值被量测一次。
32.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本的所述OD600值被多次进行量测。
33.如权利要求34所述的方法，其特征在于：所述OD600值被量测两次、三次、四次或五次。
34.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述调整过的OD600值包含一单一OD600量测值或扣除一背景对照值的多次量测的一OD600平均值。
35.如权利要求19所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值低于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为敏感的。
36.如权利要求19所述的方法，其特征在于：假如所述调整过的OD600值高于或等于0.065，则在所述样本中的所述细菌对一种抗生素或多种抗生素的一组合为具抗性的。
37.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述样本为一生物流体或一活检样本。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于：所述样本包含尿液、血液、唾液、痰、肺灌洗液、阴道分泌物、活检组织或脑脊髓液。
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