CN110997022B - 涂覆的植入装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用生物活性化合物，特别是用葡萄酒酿造残渣的植物提取物涂覆的植入装置。植入装置尤其是骨植入物，并且更优选地为牙科植入物。特别地，本发明涉及一种用于植入装置的表面官能化的方法，该方法按该顺序包括以下步骤：a)任选地，用空气、氧气、氩气、氮气等离子体和通常能够去除烃污染的表面层的等离子体处理植入装置的表面；b)用胺底物处理植入物的表面；c)处理步骤b)产生的所述植入物的表面，或者：‑用果渣提取物，并且干燥所述官能化表面，或‑通过共吸附果渣提取物和透明质酸，并干燥所述官能化表面，或‑通过吸附透明质酸并后吸附果渣提取物，并干燥所述官能化表面。本发明还涉及通过该方法实现的植入装置。

Description

涂覆的植入装置

技术领域

本发明涉及用生物活性化合物，特别是用葡萄酒酿造残渣的植物提取物涂覆的植入装置。植入装置尤其是骨植入物，并且更优选地为牙科植入物。

背景技术

将植入装置插入人体必然涉及伤口和随后的组织修复过程。本质上，组织修复是通过伤口发炎和愈合的自然机制进行的。在植入装置的存在下，由于长期存在被认为是异物的原因，自然发炎过程可能会发生变化，从而导致不利于装置自身功能和健康的结果。炎症和愈合过程由炎症细胞(主要是嗜中性粒细胞和巨噬细胞)介导。这些细胞到达伤口部位并释放称为细胞因子和趋化因子的分子，这些分子召回其他炎症细胞并刺激其活性。在正常的组织修复中，炎症细胞产生的细胞因子和趋化因子会以精确的时间顺序和浓度出现，从而指导愈合过程。这些分子中的一些具有促炎作用，其他具有抗炎作用。通过适当地平衡所需的促炎刺激，例如用于去除受损的组织、微粒物质、细菌和保持过程受控并避免过度损害所需的抗炎刺激，生物体的防御机制通常设法诱导组织修复。

在病理情况下，或在存在植入装置的情况下，受累细胞正常产生促炎和抗炎刺激可能会失衡：例如，不能被负责消除它们的炎症细胞吞噬的微米大小的固体材料的颗粒(例如，植入材料的碎片)会刺激炎症细胞本身(巨噬细胞)。在无法吞噬的异物(颗粒)的影响下，巨噬细胞会释放出另外的促炎趋化因子和细胞因子，以召回该部位的其他炎症细胞，从而消除异物刺激。如果刺激仍然存在(非吞噬性异物)，则该过程会继续重复进行，从而引起慢性炎症的情况，这可能是造成问题的主要根源，例如矫形装置。

在其他情况下，趋化因子和细胞因子的不平衡产生会诱导细胞的转化和改变，其不允许完全治愈和导致异常组织的形成。典型的情况是继冠状动脉支架或外周支架的引入之后再狭窄组织的形成。

在这种情况下，应该强调的是，即使在通用语言中，词语“炎症”通常具有负面含义，但以肿胀、疼痛，发红和发热为特征的继发于伤口的“急性”炎症实际上是伤口自身愈合所需的自然过程。炎症活动负责从受损组织中清除任何细菌，并启动修复机制。炎症不能也不应被抑制，否则就不会愈合，但必须加以控制才能获得所需的植入物骨整合。

通常用于骨植入物的材料是钛，其特征在于有利于自然组织保护的有利生物惰性。然而，期望并且已经部分实现的是用生物活性材料涂覆植入物表面，该生物活性材料可以有效地作用于骨整合过程。用于此目的的典型材料是透明质酸。

还已知使用抗炎分子，特别是属于类黄酮类的分子来涂覆骨植入物，以便引起更好的骨整合。Cordoba等人，(Flavonoid-Modified Surfaces:Multifunctional BioactiveBiomaterials with Osteopromotive,Anti-Inflammatory,and Anti-FibroticPotential，Adv.Healthcare Mater.2015,4,540-549)描述了通过共价键将二氢槲皮素(taxifolin)或槲皮苷(quercitrin)固定在钛表面上，并建议将其应用于骨植入物或冠状动脉支架，并且WO 2014/169959描述了骨植入物，通过与氨基硅烷结合其上固定选自槲皮苷、二氢槲皮素、高良姜黄素、香叶木素(diosmethine)和白杨素的类黄酮分子。

我们发现，在钛植入物上涂覆抗氧化剂分子(例如上文所述的抗氧化剂分子)时，存在的一个问题是，即要实现植入物表面的完全覆盖并不容易。我们还发现，植入物表面的涂覆程度会影响装置的骨诱导作用，因此是理想的目标。

发明内容

根据本发明，通过用源自果渣(marcs)的植物提取物(vegetable extract，蔬菜提取物)涂覆植入物表面来解决上述问题。

因此，本发明涉及一种植入装置，包括从果渣的植物提取物中获得的表面涂层。

其次，本发明涉及用于提取果渣并用这样获得的提取物使植入装置的表面官能化的方法。

这些和其他目的形成所附权利要求的主题，所附权利要求的定义是本说明书的组成部分。

术语“果渣”是指葡萄酒酿造过程中的废料，特别是葡萄籽和葡萄皮。作为加工废料，原材料不会带来大量成本。在本领域中众所周知，可以从这种性质的废物中容易且成本有效地提取复杂混合物中的多酚，例如通过使用水醇溶液(John Shi,Jianmei Yu,JosephPohorly,J.Christopher Young,Mike Bryan,Ying Wu,Optimization of the extractionof polyphenols from grape seed meal by aqueous ethanol solution,Food,Agriculture&Environment Vol.1(2):42-47.2003年)，但这些提取物由于它们溶于水，并且非常不稳定，因此不能直接用于局部使用。

附图说明

图1示出了θ电位作为钛样品的pH和XPS光谱的函数的图。

图2显示了用聚乙烯亚胺(PEI)官能化的钛样品的θ电位作为pH值的函数的图表；

图3显示了θ电位作为官能化钛样品的pH的函数的图表：Ti+PEI+EPGCG，Ti+PEI+单宁酸和Ti+PEI+果渣提取物；

图4显示了官能化钛样品的XPS光谱：Ti+PEI+EPGCG，Ti+PEI+单宁酸和Ti+PEI+果渣提取物；

图5显示了样品Ti+PEI+果渣提取物的XPS光谱的一部分；

图6显示了图5中频谱的反褶积；

图7显示了θ电位作为Ti+PEI样品+果渣提取物，Ti+PEI+HA以及通过不同浓度的果渣和HA提取物的共吸附而获得的样品的pH的函数的图表；

图8显示了θ电位作为Ti+PEI样品+果渣提取物，Ti+PEI+HA以及通过果渣和HA提取物的共吸附或后吸附而获得的样品的pH的函数的图表；

图9显示了重新生成的多酚混合物的色谱图；

图10显示了图9中θ电位作为Ti+PEI样品+果渣提取物和Ti+PEI+多酚混合物的pH的函数的图表；

图11显示了在各种提取物浓度下，θ电位作为Ti+PEI样品+果渣提取物的pH的函数的图表；

图12显示了Ti+PEI+TA样品和Ti+PEI+TA+PEI样品(TA＝单宁酸)的XPS光谱；

图13显示了Ti+PEI样品+果渣提取物和Ti+PEI样品+果渣提取物+PEI的XPS光谱；

图14显示了Ti+PEI样品+果渣提取物+PEI+果渣提取物的XPS光谱；

图15显示了图14中的样品的XPS光谱的放大部分；

图16显示了θ电位作为Ti+PEI样品+内比奥罗、巴贝拉、科罗帝纳和阿内斯的果渣提取物的pH的函数的图表；

图17-20显示了按指定顺序的图16中的样品的XPS光谱的一部分的反褶积；

图21显示了在用氰基硼氢化物处理之前和之后的Ti+PEI样品+内比奥罗果渣提取物的XPS光谱的一部分；

图22显示了在图16的样品中编码两种蛋白质、骨桥蛋白(OPN)和SPARC(分泌蛋白、酸性和富含半胱氨酸)的基因的基因表达；

图23显示了图16中的样品在DPPH测试中的抗氧化能力(表示为吸光度降低)；

图24显示了与Ti+PEI样品+科罗帝纳果渣提取物相比，Ti+PEI样品+科罗帝纳果渣提取物+HA在DPPH测试中的抗氧化能力(以吸光度降低表示)；

图25显示了在样品灭菌后，与Ti+PEI样品+科罗帝纳果渣提取物相比，Ti+PEI样品+科罗帝纳果渣提取物+HA在DPPH测试中的抗氧化能力。

具体实施方式

本发明受到我们的观察启发，来自葡萄酒酿造残渣的提取物是用于表面修饰过程的极好材料，该表面修饰过程旨在将植物来源的生物分子，特别是多酚固定在植入装置的表面上。特别地，就大小、电荷和溶液性质而言，分子复杂的多酚混合物与具有高密度碱性位点(胺基)的表面之间的相互作用允许实现均匀官能化的和完整的表面层。如现有技术中所建议的，该结果不是从类黄酮或其他纯多酚开始获得的。

不受任何理论的束缚，我们相信被氨基官能化的器件表面的高电荷密度与提取物中存在的物质的分子复杂性协同作用，使得同一表面从多酚溶液中选择亲和力更高的物质并且优化空间限制，以创建功能上均匀的表面层。该表面层的特征对于某些应用显示出优势，特别是它们对细胞生长产生有利影响。因此，该方法由于其与细胞的有效相互作用而在材料的表面改性中发现了有利的应用，特别地为植入装置，更特别地为骨植入物，甚至更特别地为钛牙科植入物螺钉。

因此，本发明首先涉及一种用于植入装置的表面官能化的方法，该方法按顺序包括以下步骤：

a)任选地，用空气、氧气、氩气、氮气等离子体或通常能够去除烃污染的表面层的等离子体处理植入装置的表面；

b)用胺底物处理植入物的表面；

c)用果渣提取物处理由步骤b)得到的植入物的表面并干燥所述官能化的表面。

在不同的实施方案中，用于植入装置的表面官能化的方法按顺序包括以下步骤：

a)任选地，用空气、氧气、氩气、氮气等离子体或通常能够去除烃污染的表面层的等离子体处理植入装置的表面；

b)用胺底物处理植入物的表面；

c)通过果渣提取物和透明质酸的共吸附或透明质酸的吸附和果渣提取物的后吸附来处理从步骤b)得到的植入物的表面并干燥所述官能化的表面。

植入装置是旨在与人体或动物体长时间接触的任何装置，并且例如可以选自心血管支架或各种类型的骨植入物。特别地，根据本发明的装置是钛骨植入物，更优选地为钛牙科植入物螺钉(titanium dental implant screw)。

步骤a)的优点是促进胺底物在装置表面上的粘附。

在步骤b)中，胺底物优选是聚乙烯亚胺。优选地，将优选使用浓度为0.03至0.15体积％，优选为0.05至0.1体积％的胺底物的水溶液，更优选为聚乙烯亚胺的水溶液。处理植入装置，优选地将其浸入所述胺底物溶液中超过1小时，优选为约2小时，并且优选在室温下。相对于现有技术的已知官能化，胺底物的使用已被证明是非常有利的，其提供了来自甲苯等中的溶液以及在无水条件下的硅烷的使用。

步骤c)可以例如通过简单地将植入物浸入下文所述获得的果渣提取物的溶液或悬浮溶液中来进行。该处理优选在15℃至30℃的温度下或在室温下进行大于4小时，更优选大于6小时，甚至更优选10至14小时。

当在步骤c)中使用透明质酸时，其以浓度优选在0.01至0.15重量/体积％或0.01至0.1重量/体积％的水溶液使用。

在某些实施方案中，本发明的方法包括按顺序重复步骤b)和c)2至8次，优选为3至6次，以产生源自所述果渣提取物的多酚分子的多层涂层。如果在如上所定义的透明质酸的吸附后，该方法包括果渣提取物的共吸附或后吸附：

-根据第一种变型，将使用浓度为0.05至0.15重量/体积％的透明质酸的水溶液，并且涂层的最外层将通过仅吸附果渣提取物而获得；

-根据第二种变型，将使用浓度低于0.02重量/体积％的透明质酸水溶液，并且涂层的所有层将包含透明质酸。

在某些实施方案中，本发明的方法包括通过根据步骤c)处理的植入物在25kGy的γ射线的灭菌步骤。

果渣提取物可以源自各种来源的葡萄的果渣或其混合物。例如，可以使用白葡萄或红葡萄的葡萄果渣或其混合物。

在某些实施方案中，果渣将衍生自具有高花青素含量的葡萄。

在某些实施方案中，果渣选自“内比奥罗”葡萄果渣、“巴贝拉”葡萄果渣、“科罗帝纳”葡萄果渣、“阿内斯”葡萄果渣及其混合物。更优选地，将使用“科罗帝纳”葡萄果渣。

也可以使用衍生自单一葡萄果渣的提取的提取物混合物，而不是在提取步骤之前混合各种单一葡萄品种的果渣。该实施方案允许在各种葡萄酒的生产场所附近进行提取，从而将随后的到植入装置的生产场所的运输操作仅限制在提取物上，而不是全部果渣。

由果渣制备植物提取物的方法构成本发明的第二个目的。这种方法包括以下步骤：

i)干燥果渣，

ii)研磨干燥的果渣，

iii)在酸性pH下用水洗涤干燥和研磨的果渣，

iv)用水溶液和可以与水混合的有机溶剂萃取从步骤iii)获得的果渣，

v)离心步骤iv)的混合物，分离液相并除去有机溶剂，从而获得果渣提取液/悬浮液，

vi)优选地，分离悬浮相，从而以溶液获得提取物。

干燥果渣的步骤i)优选在30℃至50℃，更优选在37℃至43℃的温度下进行，优选大于24小时，更优选高于48小时。在该步骤中，例如，可以使用通风炉。

洗涤步骤iii)用pH优选为2-6.5，更优选3-5.5的水进行。

萃取步骤iv)优选用水和丙酮的混合物进行，优选在水/有机溶剂比为40/60至60/40，更优选为45/55至55/45中，并且优选使用水+有机溶剂/果渣(衍生自步骤iii)的混合比例为5:1至7:1mL/g，更优选为6:1mL/g。步骤iv)优选在20℃至40℃的温度和5至约7的pH范围内进行，这取决于所使用的果渣的类型。特别地，观察到红酒(Ovello、巴贝拉、科罗帝纳)的葡萄的pH值在5至6.5之间，白葡萄(阿内斯)的pH值为约7。

步骤v)优选通过在5000至7000rpm范围内的离心进行。在低沸点溶剂(例如，丙酮)的情况下，可以例如通过旋转蒸发仪除去有机溶剂。

步骤vi)是任选的，但优选的，并且可以通过倾析悬浮液，然后通过离心分离溶液的相而进行，优选在5000至7000rpm之间进行。可备选地，可以进行过滤，可能地将絮凝剂添加到悬浮液中。将悬浮相与溶液中的悬浮相分离的优势在于，只有溶液中存在的分子才能够结合到覆盖植入装置的胺底物上，而悬浮颗粒可能堆积在外表面上，从而使这种表面不均匀。溶液相仅包含水溶性多酚或其他水溶性分子。溶液相不包含例如槲皮苷，因为该分子不溶于水相。

通过上述方法获得的提取物，特别是所述提取物的溶液相，包含没食子酸、槲皮素(quercetin)、芦丁和锦葵色素-3-葡糖苷(malvidin-3-glucoside)。

本发明的第三目的涉及一种如上所定义的植入装置，优选为钛骨植入物，更优选为钛牙科植入物螺钉，包括用一层或多层胺底物与一层或多层从果渣提取的多酚交替的胺底物的表面官能化，其中粘附到植入物表面的层由胺底物组成，并且其中一层或多层所述多酚产生大于90％，优选大于95％，更优选大于98％，甚至更优选大于99％的表面涂覆度。

植入装置的涂覆度可计算如下：

1)计算通过XPS分析测得的至少两个涂有聚乙烯亚胺的标准植入物样品的钛的平均百分比值(Ti％平均)；

2)测量被检查的植入装置的钛的百分比值(Ti％样品)；

3)根据公式计算涂覆度：

涂覆％＝100-(Ti％样品x 100)/Ti％平均值

在以下描述中定义XPS分析方法。

在优选的实施方案中，如上定义的植入装置的一层或多层所述多酚具有均匀的酸性官能度，其特征在于单一定义的pKa值。

在某些实施方案中，从所述一层或多层多酚的果渣中提取的多酚包括没食子酸、槲皮素、芦丁和锦葵色素-3-葡糖苷。

在某些实施方案中，从所述一层或多层多酚的果渣中提取的多酚包含花青素。

本发明的植入装置可以通过上述的果渣官能化和提取方法获得。应当指出，鉴于如上所述植物提取物中所含化合物组成的复杂性，除通过其制备方法所采用的方法外，不可能精确地确定所有可以吸附在植入物表面上的分子。

优选地，本发明的植入装置包含2至8层，更优选3至6层的胺底物和2至8层，更优选3至6层的来自所述果渣提取物的多酚，其如上所定义交替布置。

在某些实施方案中，植入装置包括用一层或多层胺底物与一层或多层包含从果渣提取的多酚和透明质酸的层交替的表面官能化，其中粘附至植入物表面的层由胺底物组成。优选地，最外层由仅来自果渣提取物的多酚组成。

果渣提取物是上述的那些。优选地，本发明的植入装置包含从选自“内比奥罗”葡萄果渣、“巴贝拉”葡萄果渣、“科罗帝纳”葡萄果渣、“阿内斯”葡萄果渣或其混合物的果渣提取物获得的多酚，或更优选地来自“科罗帝纳”葡萄的果渣。

在一个优选的实施方案中，胺底物是聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺可以是直链或支链的，优选是支链的，并且分子量大于10,000Da。

实验部分

提取物的定义和鉴定

最初的实验是从Nebbiolo da Barbaresco葡萄，cru Ovello的果渣开始进行的。提取过程首先涉及在通风炉中将果渣豆在约40℃的温度下干燥48小时。将由于脱水的果皮和种子研磨成粉末以增加表面积，因此增加多酚的提取产率。然后，“粉状物”经历三个处理步骤：

-用酸化水洗涤以除去皮肤上的大量杂质、细菌和任何真菌；

-相对于每6ml溶液1g果渣的植物质量，用水:丙酮50:50溶液萃取；

-提取物的离心，对富含多酚的溶液取样，并在旋转蒸发仪中浓缩以除去溶剂的有机部分(丙酮)。

在该过程结束时，富含多酚的提取物然后处于水溶液/悬浮液的形式。随着时间的流逝并在很大程度上作为特定葡萄的函数，存在一部分悬浮材料的沉淀过程。

提取物的表征通过分光光度法和色谱技术进行。

特别地，用于定义提取物的主要参数是多酚的总量，以mg/mL表示为没食子酸当量(GAE)。该参数通过Folin-Ciocalteau测试(FC测试)进行评估，该测试产生的吸光度值参考由没食子酸制成的校准线，而没食子酸是按照惯例作为参考的化合物。在与纯化合物的对比测试中，后者的浓度应使提取物具有相同的GAE值。除FC测试外，提取物的表征还在于其通过DPPH测试的抗氧化能力和花青素的含量(使用锦葵色素-3-葡糖苷作为参考)。最后，使用液相色谱法对主要多酚分子进行定性和定量分析。

总多酚含量(FC测试)

Folin-Ciocalteau测试允许通过使用试剂(Folin-Ciocalteau试剂)对分析溶液中总多酚含量进行定量，因为总多酚在碱性环境下会减少光钨酸和磷钼酸的混合物，在蓝色的钨和钼氧化物的混合物中构成Folin-Ciocalteau试剂。然后，通过紫外/可见分光光度计在765nm的波长下分析吸光度(即，蓝色的强度)，在该溶液中插入适量的试剂，我们可以定量溶液的多酚含量，以mg/mL的没食子酸当量表示。

抗氧化能力(DPPH测试)

DPPH测试可通过使待分析样品与DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼)溶液反应来确定抗氧化能力。抗氧化剂化合物能够将氢原子转移至自由基，从而引起溶液的变色。然后在预定的温育时间后，通过UV-Vis光谱法分析DPPH自由基在525nm处的峰的减少。这种变色与样品中存在的抗氧化剂负载(antioxidant charge)成正比。

花青素的定量(Ribereau-Goyon和Stonestreet方法)

该方法基于通过亚硫酸氢盐发生的花青素变色的过程。

通过液相色谱法(HPLC)的多酚光谱分析

为了比较通过文献中出现的内容获得的结果，实施了Wittenaur等人已经使用的分析方法。

用于分析的方法涉及两个流动相的使用：

-流动相A(MP A)：2％的乙酸的水溶液；

-流动相B(MP B)：0.5％乙酸的50:50的水:乙腈溶液

所开发的方法预见了下表1中报告的梯度：

使用的参数如下：

-Luna C8色谱柱

-流量0.8ml/min

-进样量20μl

-温度25℃。

通过使用与“二极管阵列”耦合的HPLC仪器，可以获得组成提取物的多酚分子的光谱。基于用标准品制成的校准线，对以下分子进行定量：没食子酸、槲皮素、芦丁和锦葵色素-3-葡糖苷。

根据我们的起始提取物的所示方法进行的表征给出的结果示于下表2中。

用于植入装置官能化的程序

对于表面官能化测试，将提取物的溶液相稀释至约2的FC值(根据FC测试的值)。所有具有纯化合物的比较实验都是从具有相同FC值的溶液开始进行的。

该方法涉及在室温下并在2小时的时间内通过从水溶液中吸附浓度为0.05-0.1％(体积)的聚乙烯亚胺(PEI)来官能化待覆盖的材料。必须在其上进行吸附过程的材料优先用空气、氧气或氩气等离子进行预处理，以促进PEI的表面与聚阳离子链之间的相互作用。在进行官能化之后，进行洗涤，并使该材料与提取物的水溶液在室温下接触过夜。然后洗涤材料。分析证据是通过以下方式获得的：

-测量

电位(θ电位)。该参数是表面电荷的间接度量，因此是表面上可能存在的化学基团的间接度量，并且可以通过在待评估材料的两个相同表面组成的毛细管通道中流动已知和恒定离子强度的水溶液来获得，放置在适当的电池中，并测量由于电荷转移而产生的电流(流动电流)。作为pH的函数进行测量。

因此，实验方法如下：对于每个实验，制作两个尺寸为2x 1cm的钛板，并从0.25mm厚的钛板(Titanium,Sigma Aldrich,代码267503-25.2G)将其切出。片材经过各种官能化处理(聚乙烯亚胺、提取物、纯化合物的吸附)，然后放入Surpass 3(Anton Paar公司生产的θ电位计)的测量室中。通过在1mM的KCl溶液中测量pH范围8-2中的流动电流进行测试。所有参数均由仪器软件控制。

-XPS(X射线光电子能谱)分析。使用这种技术，我们获得了材料表面第一纳米厚度的定性和定量化学组成。

实验方法如下：通过XPS Perkin Elmer PHI 5600ESCA系统分光光度计分析按上述情况获得的但尺寸为1x 1cm的样品。它配备有带有Al阳极的单色X射线源，保持在10kV且功率为200W。分析的深度为约5nm。分析室内的压力保持在约10^-9托。使用仪器软件和制造商提供的灵敏度因子，分析结果以“原子％”表示。

所得结果讨论如下。

从对通过本工艺在表面进行改性的钛材料进行评估开始，图1在顶部显示作为pH的函数测得的

电位并在底部显示XPS光谱。

电位在测量的基本端极负(-54mV)，并且随着pH值的降低而一致地趋向于较低绝对值。该性能表明，电位值基本上由大多数存在于溶液中的离子物质(尤其是碱性pH值的羟基)的界面处的吸附决定，逐渐被氢离子平衡。这种趋势针对材料是预期的，这些材料在表面上没有特定的酸碱官能，并且其中电位由溶液中的离子控制。XPS光谱相反显示在表面上构成元素Ti、O(在表面上，钛通过与大气接触而被氧化)，不可避免地吸附的碳以及少量存在的常见污染物N和Si的存在。

吸附PEI后，观察到对测得的表面化学参数的相当大的影响，如图2所示。

电位保持负值(并且绝对值比以前低得多)，仅高达约6.5的等电点。然后，朝着酸性场移动，表面呈现出正电势，这显然是在这些pH值下质子化的氨基存在的结果。XPS光谱显示出明显的N信号，其根据电位数据证实了PEI的成功吸附。

如此官能化的钛准备用于随后的步骤，所述步骤用植物来源的生物分子，特别是多酚进行涂覆。根据

电位和表面化学组成对钛样品进行评估，用PEI对其进行官能化，然后与以下物质接触：

-小分子的类黄酮：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；

-大分子的多酚：单宁酸(TA)；

-如上所述获得的来自葡萄酒酿造残渣的提取物，含有多酚和其他植物来源的生物分子的混合物。

为了比较相同浓度下的结果，制得的所有溶液的多酚含量为2.1mg/mL的GAE。获得了图3所示的结果。

在所有三种情况下，由于表面上多酚分子引入以及PEI基团的掩蔽，在碱性pH值下均会恢复到强烈的负电位。然而，所检查的样品之间存在两个实质性差异，即：

i)从纯化合物Ti+PEI+EGCG和Ti+PEI+TA开始获得的表面在酸性pH值下具有正电位值，这表明胺基团仍未被覆盖，因此涂覆不完全，这与从提取物开始获得的样品不同。XPS分析获得的表面化学组成值证实了这一数据，该数据提供了以下图4中光谱报告的数据。如表3所示。

表3-被检查样品的表面组成(％at)

Ti+PEI样品+提取物上几乎没有Ti信号，这证实了

电位图所建议的最完整涂覆。使用上述公式，基于作为各种样品的平均值获得的Ti％平均值＝6的值，计算涂覆程度(涂覆％)。

使用以下样品重复相同的实验：

-Ti+PEI+桑色素，

-Ti+PEI+槲皮苷。

桑色素是一种水溶性黄酮醇(0.25mg/mL)，而槲皮苷不溶，因此它在水中形成悬浮液。XPS分析的结果如下：

表3b-被检查样品的两个表面组成(％at)

ii)从提取物开始获得的样品的电位曲线具有平台，即它从约pH 5.5向上达到几乎恒定的值。该行为表明，在表面上具有均匀的化学功能，具有酸性性能，这决定了电荷，因此决定了表面电位。实际上，平台的存在是由于表面官能团的定义的pKa值的存在引起的，而连续的倾斜趋势表明存在多个pKa或行为，其部分取决于表面官能团的酸碱解离，部分取决于OH^-离子的吸附。

基本上，这些数据以一致的方式表明，仅在涉及使用植物来源的生物分子，特别是多酚的复杂混合物的过程中，才获得具有均匀酸性官能度的完整涂覆，其特征在于确定的pKa值和不是多个pKa的范围或现象。考虑到起始分子的性质，可以假设该官能度是酚羟基。与使用类黄酮化合物(EGCG)或更大且结构更复杂的分子(单宁酸)从纯多酚化合物开始进行的方法相比，从非均相提取物开始进行的方法产生的结果出人意料地更好。

表面层的化学性质

由

电位测量值推导出的单官能酸性表面的起始混合物的组成和观察结果，让我们假设本方法的表面结果富含多酚。XPS测量，特别是对峰C1s形状的详细研究证实了这一假设，该峰提供了有关存在的碳官能度化学邻域的信息。特别地，Ti+PEI样品+提取物的峰C1s如图5所示。峰显然不是对称的，而是由不同的成分组成。由于碳原子与其他碳原子或氢原子相连，具有最大285eV的主要的一个是众所周知的。单个碳-氧键涉及约1.5eV的“位移”，因此最大为约286.5eV的强度的第二分量是由于C-O官能团所致。每个额外的氧键都涉及约1.5eV的位移，其中羰基位于约288eV，且羧基位于约289.5eV。然后可以对实验曲线进行反褶积，如图6所示，其中分量1、2、3和4分别由于键C-C、C-H、C-O、C＝O和OC＝O所致。从该评价得出结论，存在于表面上的化学物质包含高百分比的CO键。约291至294eV之间的曲线部分很难解释。该数据非常重要，因为XPS分析通常显示该区域的所谓振激峰，由于芳香环的典型电子跃迁，该峰较弱且边界不清(即，与常规组分相比较宽)。反褶积曲线的分量5则归因于芳环的存在。

本质上，通过用以下方法(该方法包括将来自葡萄酒酿造残渣的提取物中所含分子吸附到PEI层上)进行表面官能化的钛样品的XPS技术获得的C1s峰的详细分析得出以下结论：表面上存在的化学物质包含芳环和大量的C-O键。因此，有理由认为，即使考虑到其中羧基将减少的成分(图6中图表中的成分4)的百分比也不是很丰富，通过

电位测量可以证明同一表面上的单官能酸性性能是由于酚基的酸性，并且表面本身主要由多酚组成。与从纯化合物开始获得的结果相比，从多酚和其他分子的非均相混合物开始进行的本发明方法情况下的涂覆密度和pKa均匀性出人意料地更好。

在共吸附或后吸附过程中，单独提取物的吸附所引起的效果持久性

进行以下实验.

如上所述，通过在PEI的Ti上吸附2小时，然后从如上定义的葡萄提取物溶液中吸附过夜，来进行该过程。此外，制备样品，其中以下物质溶于相同提取液：

-0.01％(w/v)的透明质酸(HA)

-0.05％(w/v)HA

-0.3％(w/v)HA。

使用平均分子量为700-800kDa的HA。

还制备样品，其涉及无萃取物的0.1％的HA溶液在Ti+PEI上的吸附过夜。

通过XPS分析和

电位分析样品。表4显示了与XPS分析有关的结果(所检查样品的表面组成(％at))

所检查样品的表面组成(％at)

数据表明，从纯HA吸附过渡到纯提取物，C/O比逐渐增加。表面组成数据以及对峰C1s的分析以及对振激峰的存在的评估表明，对于三个中间样品，我们存在共吸附现象，每个分析样品不同的表面组成。

电位的测量提供如图7所示的结果。

以完全出乎意料且不可预测的方式，每当从果渣提取物中的多酚非均相混合物开始进行加工时，即使在大量HA分子共吸附存在的情况下，测量表明平台，该平台表明单功能酸性表面。仅在HA的存在下不会出现这种类型的表面，可能是因为涂覆不够完整，而且还因为存在于由两个单糖组成的重复单元中的单个羧基，参与与PEI的氨基相互作用并且因此不适用于酸碱界面行为。在多酚的情况下，存在于分子单元的每个子组分上的不同酚基成功地产生了均匀的酸性层。平台期电位的绝对值与pKa值相关，随溶液中HA浓度的增加或HA分子对电位的直接贡献而增加，或者因为吸附的HA的存在影响pKa的值，从而形成了环境，其或多或少有利于解离。

在后吸附实验中观察到相同的令人惊讶的现象。特别地，如先前的实验中那样，将第一PEI层吸附在钛样品上，然后如先前的实施例中那样，以0.01％的浓度吸附一层HA。此时，将样品洗涤并用果渣提取物进一步吸附过夜。结果如图8和表5所示。

所检查样品的表面组成(％at)

数据表明，在已经涂覆有透明质酸分子的表面上，存在于提取物非均相混合物中的多酚也被吸附在表面上，并组织赋予表面本身单官能酸性性能的结构。在共吸附和后吸附的情况下，表面组成和

电位值不同，但是令人惊讶的是，在两种情况下，表面均具有确定的pKa值。该观察结果支持以下假设：无论吸附剂表面的性质如何(纯PEI或已吸附HA并因此具有部分饱和表面位点的PEI)，由多酚的非均相混合物提供的分子种类的供给都是例如始终允许通过其表面选择具有更大亲和力的物种，优化空间限制和相互作用能，以便从最不同的条件(溶液或表面中存在其他分子)开始始终到达以产生功能上均匀的表面层。从现有技术中报道的结果不能预期该结果。

为了证明这一点，进行了进一步的测试，其中使用相同的方法，并从含有纯多酚化合物的MIX的溶液中吸附。特别地，具有不同分子量和结构的分子被用来模拟从果渣提取物的非均相混合物中的吸附。MIX的组成(对于2.05mg/mL GAE的值)和相对色谱图如图9和表6所示：

1.没食子酸	150ug/cc
		2.咖啡酸	200ug/cc
3.香豆酸	200ug/cc
		4.儿茶素	200ug/cc
5.EPGCG	150ug/cc
		6.芦丁	200ug/cc
7.单宁酸	250ug/cc
		8.反式白藜芦醇	150ug/cc
9.檞皮素	200ug/cc
		10.反式肉桂酸	250ug/cc

电位的测量提供如图10所示的结果。

Ti+PEI样品+纯化合物的MIX的

电位值的几乎完全呈负电场跃迁(除了pH<3.5)证实了MIX化合物的成功吸附，其在Ti+PEI上相反几乎为正，如预期的那样。然而，在Ti+PEI+MIX上，没有观察到平台：吸附到表面上的酚基具有Ka范围，并且表面结构与通过本发明的方法获得的基本上不同。

尽管在纯化合物的情况下，未观察到平台的形成，但在从提取物中进行吸附的情况下，令人惊奇地观察到，在相当大的稀释度的吸附溶液中，

电位曲线的值和形状仍具有显著影响。图11中的图表显示，通过稀释提取物溶液1:2、1:10和1:50，只有在最强稀释的情况下，才有明显偏离平台的趋势，然而其保留了大量表面负电荷的证据。

基本上，考虑到所用的高稀释度，该数据证实了提取物对用PEI官能化的钛表面具有惊人的亲和力，明显且出乎意料地高于纯化合物的情况。这由在相同样品上获得的XPS分析数据所证实，其即使在高稀释度的情况下也显示出表面钛的大量涂覆，如表7所示：

所检查样品的表面组成(％at)

不存在吸附分子的释放

由于上述原因，根据本发明方法固定在钛表面上的多酚具有显著的稳定性，并且即使不存在现有技术中所述的共价键也不会在水溶液中解吸。通过进行WO 2014169959 A1中报道的实验，即将多酚分子固定在钛圆盘上，将圆盘放置在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中，并通过紫外可见吸收光谱法读取给定波长下的吸光度，证明了该特征。特别地，使用直径为6mm的钛圆盘，按以下方式制备三个副本：

i-钛本身，

ii-从0.5％的水溶液中吸附PEI 2小时的钛，

iii-作为样品ii，进一步从果渣提取物溶液中吸附过夜，

iv-作为样品ii，进一步从含有0.1％(wt/vol)平均分子量为700-800kDa的透明质酸的果渣提取物溶液中吸附过夜。

干燥后，将圆盘分别置于具有48微孔的聚苯乙烯平板的孔中进行细胞培养，将其浸入500μL的PBS中。72小时后，取400μL的PBS并将其置于微孔(48孔)中。用Tecan Spark10M酶标仪(Tecan)读取溶液的吸光度，光谱范围为276至380nm。为了进行评估，使用了280nm的波长，其中它们吸收了大多数多酚，370nm，其中提取物中广泛存在的槲皮素具有最大值和355nm，其中存在芦丁的最大峰。获得以下结果，报告表8中每种样品类型使用的三个重复样品的每个的释放溶液中测得的吸光度值：

以单向方式比较每个波长下的测量数据进行的方差分析表明，在任何情况下，对四个被检查样品的测量平均值均无显著差异。本质上，根据本发明方法在PBS中存在多酚涂覆的圆盘并不需要在多酚典型的吸收波长处测得的吸光度的显著变化。因此，该数据表明多酚没有从涂覆的圆盘上释放。

多层的创建

本方法的第二重要的技术优势是可以生产聚阳离子-聚阴离子多层。如现有技术中已知和描述的(例如Picart,C.；Lavalle,P.；Hubert,P.；Cuisinier,F.J.G.；Decher,D.；Schaaf,P.；Voegel,J.-C.Buildup mechanism for poly(L-lysine)/hyaluronic acidfilms onto a solid surface,Langmuir 2001,17,7414-7421)，材料的表面特征可以通过聚阳离子(通常为PEI)，随后是聚阴离子(透明质酸、肝素、多糖、聚丙烯酸等)的顺序吸附过程。此时，可以重复该顺序，将新的PEI吸附到聚阴离子表面上，然后再进行新的聚阴离子吸附，直到定义的层数为止。该顺序过程的主要优点是因此获得了甚至更完整和均匀的表面涂覆。

我们已经证实，令人惊讶地，聚阳离子-聚阴离子多层的构造仅通过从本发明的果渣提取物而不是从可从本文所述的实验中得到的纯多酚开始，才有效地可行。

使用上述方法，将生成Ti+PEI+TA(单宁酸)样品，因此使用大的多酚分子，其与小分子相比，应赋予构建体更大的稳定性并提供更完整的涂覆。XPS分析显示出类似于图4的光谱，这确认了TA成功吸附到表面上。此时，通过从0.5％的水溶液中吸附2小时，再涂覆另外一层PEI，干燥样品并进行XPS分析，得到的结果如图12所示。

Ti+PEI+TA+PEI的光谱显示出明显的钛信号和强氮信号。与Ti+PEI+TA的相比，唯一的解释是溶液中的PEI分子已经取代了表面上的TA的分子，因此PEI-TA的相互作用不够强到构成用于进一步的PEI层的稳定底物。

在用果渣提取物制成的样品上重复相同的实验，给出如图13所示的结果。证据与先前的情况完全不同。我们观察到C/O比的预期增加，存在N信号的预期增加以及仅非常低的Ti信号。这些数据表明，PEI的另一层已吸附在从提取物中获得的阴离子表面上，并且与使用单分子获得的结果不同，该集合是稳定的，尽管与先前情况的TA一样大。此时，可以再涂覆一层阴离子层，重复从果渣提取物中的吸附。获得图14所示的结果。

再次观察到O/C比的增加，PEI信号的绝对值的减少和Ti信号的消失。然后，我们返回吸附提取物的典型组成，这也由峰C1s证实，该峰显示出显著的CO分量和振激峰，如上所讨论的(图15)。

从先前的结构数据得出的第一阴离子层的稳定性特征和没有释放的情况，在这种情况下允许构造连续的聚阳离子-聚阴离子层。如上所述，它们允许甚至更完整和均匀的涂层，如由Ti信号的消失和总光谱的形状所证明的那样。由于与金属层相比，分子层的电子密度较小，因此与以前的情况一样，其在高的b.e.下看起来是平坦的而不是弯曲的。即使在这种情况下，

电位的测量也提供了平稳趋势。图14中的表面是均相的多酚和单官能酸，其程度大于现有技术中所描述的范围，并且处于未预料的方式。

生物效应

进行细胞培养物生长测试以评估用本方法实现的表面结构的生物学效果。特别地，采用该方法来官能化用于细胞培养的聚苯乙烯微板的表面。根据以下方案进行L929成纤维细胞生长实验。

使用的细胞是小鼠结缔组织L-929(BS CL 56)的成纤维细胞，购自Lombardy和Emilia Romagna的Istituto Zooprofilattico Sperimentale的细胞基质中心。

将成纤维细胞(其密度使用TC10自动化细胞计数器仪器BIO-RAD计算)在补充有10％胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素(GIBCO细胞生长培养基的所有成分均来自LIFETECHNOLOGIES Srl,San Giuliano Milanese(MI)公司)的3.0mL的最低基本培养基+glutaMAX培养基(MEM-glutaMAX)中的悬浮液引入到无菌聚苯乙烯容器中用于带有24个隔室的细胞培养(24孔板，Sarstedt)。如下所述，每个孔都经过了表面改性处理。所描述的所有操作均在层流净化罩(Faster BIO 48,DASIT)下进行。

然后，将12孔的容器放置在37℃，5％CO₂和98％相对湿度的HERA CELL培养箱(HERAEUS)中规定的时间。

在预期的实验时间，在倒置光学显微镜DMI4000 B(LEICA)上下观察细胞，以在测试过程中获得定性指示。然后，通过MTT测试对它们的生存力进行定量评估，以评估线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)的效率。MTT测试提供，在显微镜下观察后，将细胞用5mg/mL的可溶性四唑盐3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4.5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)，Sigma Aldrich Srl,Milan溶液温育。琥珀酸脱氢酶在37℃的随后的三个温育小时中，诱导四唑盐开始以可溶和黄色的形式转化为不溶于水的蓝色产物甲瓒：沉淀量越大，酶活性越高，因此新陈代谢的活细胞数量越高。将沉淀物用二甲基亚砜(Sigma Aldrich Srl,Milan)溶解，并使用SPARK 10M分光光度计(TECAN ITALIAsrl)在560nm波长处分光光度法测量。

结果

在第一个实验中，制备以下样品：

-用吸附在PEI上的单层多酚官能化的聚苯乙烯微孔(4次重复，称为提取物1)；

-用吸附在PEI上的单层单宁酸官能化的聚苯乙烯微孔(4次重复，称为TA)。

未官能化的微孔用作对照，即用于细胞培养的特定表面(4次重复，称为TCPS)。

初始接种体为3x 10⁵细胞/mL。

在48小时时评估细胞生长，获得表9中所示的结果，随后进行单向方差分析和事后Tukey HSD测试以验证显著性。

表9

样品	Ads.1	Ads.2	Ads.3	Ads.4	平均	Std
							TCPS	0.985	0.857	1.105	1.120	1.017	0.122
提取物1	1.271	1.098	1.210	1.460	1.260	0.151
							TA	0.941	0.965	0.874	1.015	0.949	0.059

方差分析：F＝7.75；p＝0.0011037

HSD[.05]＝0.23；HSD[.01]＝0.32

M1 vs M2 P<.05

M1 vs M3 非显著的M2 vs M3 P<.05

结果表明，相对于TCPS对照和使用纯多酚分子(单宁酸)获得的结构，根据本发明方法实现的表面结构允许更好的细胞生长。

在第二个实验中，根据上述方法制备以下样品：

-用吸附在PEI上的单层多酚官能化的聚苯乙烯微孔(4次重复，称为提取物1)；

-用吸附在PEI上的双层多酚官能化的聚苯乙烯微孔(4次重复)(PEI提取物-PEI提取物，称为提取物2)。

未官能化的微孔用作对照，即用于细胞培养的特定表面(4次重复，称为TCPS)。

初始接种体为2x 10⁴细胞/mL。

在48小时时评估细胞生长，获得表10中所示的结果，随后进行单向方差分析和事后Tukey HSD测试以验证显著性。

表10

样品	Ads.1	Ads.2	Ads.3	Ads.4	平均	Std
							TCPS	0,413	0,527	0,471	0,418	0,457	0,053
提取物1	0,640	0,517	0,619	0,687	0,616	0,072
							提取物2	0,698	0,748	0,761	0,746	0,738	0,028

方差分析：F＝27.2；p＝0.000153

HSD[.05]＝0.11；HSD[.01]＝0.15

M1 vs M2 P<.01

M1 vs M3 P<.01

M2 vs M3 P<.05

该实验证明了提取物1和提取物2样品均能刺激细胞生长，但表明提取物2样品(即，多层)对细胞生长的刺激最大。

通过共吸附调节表面性能

如上所示进行实验，以验证果渣提取物和透明质酸在钛基质上的共吸附对细胞增殖的影响。初始接种体为8x 10⁴细胞/mL。温育48小时后的实验结果列于表11中：

方差分析：F＝21.38；p＝0.000355

HSD[.05]＝0.1；HSD[.01]＝0.13

M1 vs M2 P<.01

M1 vs M3 P<.01

M1 vs M4 非显著的

M2 vs M3 非显著的

M2 vs M4 P<.01

M3 vs M4 P<.01

数据表明，细胞粘附和生长受所用层的特性调节，而始终保留在单功能酸性多酚层的存在下。根据HA的抗粘附性，其逐步引入会导致测量值降低。仅用提取物获得的层与通过添加0.01％HA获得的层没有显著差异，两者都与通过添加0.05％HA获得的层显著不同，其具有较低的粘附和增殖。强调表面层组成对细胞形态的显著影响也很重要。提取物1+0.05％HA上存在的细胞不呈现粘附良好的细胞的扁平化和扩大形态，但保留类似于HA层上呈现的球形外观。

不同葡萄提取物上的实验测试

如上所述，使用来自四种不同葡萄的果渣重复提取过程。除了参与实验的第一部分的来自Barbaresco的内比奥罗之外，还进行了以下评估：

-Portacomaro(AT)产区的巴贝拉的果渣；

-科罗帝纳果渣，非常富含花青素的红葡萄，科罗帝纳(AT)产区；

-阿内斯果渣，白葡萄，科罗帝纳(AT)产区。

通过上述方法获得的提取物的特性如表12所示。

数据证实了科罗帝纳中丰富的花青素含量，并且在阿内斯的白色果渣中含量较低。

关于方法的一般信息

使用上述不同葡萄的提取物，重复了多酚对钛的吸附实验。如第一部分所述，该方法涉及通过在室温下从水溶液中吸附聚乙烯亚胺(PEI)2小时来使钛官能化。在进行官能化之后，进行洗涤，并使该材料与提取物的水溶液在室温下接触过夜；必要时将提取物稀释，以使CF的起始值接近2。然后清洗材料，并通过XPS分析和

电位测量进行表征。XPS分析数据如表13所示：

所检查样品的表面组成(％at)

图16显示了电位值，这显示了以下平稳电位(表14)：

数据表明：

-吸附过程，其包括钛信号几乎消失，有机表面的定义(即，由C和O信号为主)和在基本场中形成负电位平台是普遍现象，其与所有评估的组合物一起发生；

-表面的化学组成和平台电位的绝对值随葡萄的变化而变化，表明存在于表面上的分子的组成不同。

这些数据符合该方法的一般性观点，其将被PEI官能化的表面识别为提取物的溶液/悬浮液中存在的多酚分子的“吸引子”或“螯合剂”，作为其丰度和亲和力的函数。从具有不同化学组成的提取物开始，无论如何都可能发生这种现象，尽管很可能选择至少部分不同的分子。从表面化学组成表中可以明显看出，按照提取物的组成数据以及甚至在视觉体验之前的建议，两个家族的分析表面分解：这三个红葡萄形成了第一个家族(以O/C比例或O或C的绝对值作为指标)，白葡萄形成了不同的家族。

为了更好地理解获得的表面的分子差异，如上所述，我们使用了通过XPS获得的峰C1s的反褶积。对于所描述的每个样品，然后获取高分辨率峰C1s，并使用分析方法在280-300eV范围内运行，该分析方法提供200次采集以优化信噪比，0.1eV的采集步骤持续时间为每步50mS。

使用仪器软件和从化学证据和文献中得出的以下数据，对获得的峰进行最佳拟合程序：

表15

组分	结合能(eV)	官能度
			1	285.0	C-C,C-H
2	286.5	C-O
			3	288.0	C＝O
4	289.5	O-C＝O
			5	291.5	芳环的振激

假定各个峰的形状为高斯型，并且最佳拟合过程将谱带强度和FWHM(半峰全宽)作为主要变量考虑在内，优化这些值以重现实验峰。

获得的结果如图17-20所示。特别地，这些图显示了四个通过实验获得的峰C1s和从最佳拟合过程中获得的相应峰，以及最佳分量和这些分量的总和曲线。对于每个样品，下面显示了各个分量在总峰中所占面积的百分比，即给定官能团的相对丰度(表16)：

数据显示了所分析的四个样品表面上存在的碳的化学邻域差异。特别地，考虑到芳香族成分的发生率(由振激峰占据的面积百分比来突出显示)，很明显，从“科罗帝纳”葡萄果渣中提取的提取物最大，而从“阿内斯”葡萄果渣中提取的提取物最小。该数据与“科罗帝纳”葡萄中的花青素的高含量和“阿内斯”葡萄中的苯甲酸(咖啡酸衍生物)的高含量有关。

在从红葡萄获得的表面结构(可能以类黄酮为主)的上下文中，“巴贝拉”和“内比奥罗”葡萄表现出与科罗帝纳相比的C＝O基团的更高发生率，其中C-O键更多地存在，如图17-20和表16所示。

我们进行了进一步的实验，包括在pH为5.5下在室温下将用“内比奥罗”葡萄提取物官能化的钛样品浸入氰基硼氢化钠溶液中2小时。氰基硼氢化钠是用于还原胺化的试剂，即用于将不稳定的席夫碱(C＝O+HN-→C＝N)转化为胺键(C＝N→-C-N-)的试剂，也已在WO2014169959 A1中进行了描述。图21显示了在浸入氰基硼氢化钠后，Ti+PEI+内比奥罗的峰C1s(浸入前的虚线，浸入后的连续线)如何变化。显然，由于经过还原胺化过程的C＝O键(或C＝N键，这两个分量实际上是重叠的)，约288eV处的“肩”明显减少，即上述组分3，其引起共价键-C-N-。

该结果表明：

-在用“内比奥罗”果渣提取物(还有“巴贝拉”，其产生类似的结果)涂覆的情况下，其中主要存在花青素以外的类黄酮，其与表面的相互作用在很大程度上通过席夫碱的形成发生；

-为了做到这一点，存在的类黄酮必须优选地是那些含有羰基的类黄酮，因此是黄烷酮、黄酮醇、黄酮和二氢黄酮；

-与使用单一黄酮醇的报道不同，例如在WO 2014169959 A1中引用的槲皮苷中，即使没有共价键形成的特定作用，该表面在释放时也是稳定的，并且允许形成多层(参见以上所示数据)；

-然而，通过席夫碱形成的相互作用并不是存在的唯一相互作用。即使在表面被“阿内斯”和“科罗帝纳”果渣的提取物官能化的情况下，也可能形成多层，并具有不同表面分子种群的证据，这归因于提取物和葡萄的组成。

用来自各种葡萄果渣的提取物官能化的钛基质的生物效应

进行了以下实验：

-使用上述评估的四种葡萄(“内比奥罗”，“巴贝拉”，“科罗帝纳”和“阿内斯”)的果渣提取物对直径约1cm的钛圆盘进行表面官能化处理；

-使用上述常规细胞培养方法，在其上接种SaOS2成骨细胞。特别地，用于粘附力测试的细胞是来自人骨肉瘤SaOS-2(BS TCL 90)的成骨细胞，购自Lombardy and EmiliaRomagna的Istituto Zooprofilattico Sperimentale的细胞基质中心。将1.05±0.13x10⁵SaOS-2/mL在补充有15％牛胎血清、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和两性霉素B(GIBCO细胞生长培养基的所有成分均来自LIFE TECHNOLOGY Srl,San Giuliano Milanese(MI))的3mL McCoy's 5a培养基中的悬浮液(通过在T75烧瓶内的单层中加入2mL胰蛋白酶/EDTA溶液获得，使用TC10自动化细胞计数器仪器，BIO-RAD计算细胞悬浮液的密度)引入具有6个无菌孔(6孔多孔板，SARSTEDT)的容器中，每个孔包含4个相同类型的圆盘。该操作在层流净化罩FASTER BIO 48DASIT内进行。然后，将6孔容器倒入37℃，5％CO₂和98％相对湿度的培养箱(HERAEUS)中。在采用的3个实验时间的每一个结束时，将圆盘从孔中取出，用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤，然后进行预期的测试；

-在确定的实验时间，按类型取出四张光盘，其中两张用于细胞活力测量(如上所述的MTT测试)，两张用于测量编码两种蛋白质(骨桥蛋白(OPN)和SPARC(分泌蛋白质，酸性和富含半胱氨酸))的基因的表达，都是成骨细胞活性的标志物。用于评估的方法是实时PCR定量分析技术(qPCR)与反转录(RT-qPCR)相结合。培养72小时、5天和7天后，使用MaxwellRSCsimplyRNA细胞试剂盒(Promega)，用Maxwell RSC仪器自动提取核酸，来提取总RNA。然后，通过Quantus^TM荧光计(Promega)和与之关联的试剂盒QuantiFluor^TMRNASystem(Promega)对提取的RNA进行定量。然后，使用Applied Biosystems High Capacity cDNA反转录试剂盒将提取的RNA逆转录以获得cDNA。

使用对每个评估基因具有特异性的Taq Man探针和GAPDH作为参考基因，获得了基因的相对定量。对于每种提取物类型和未改性的钛用作参考，每个实验时间使用两个圆盘。根据制造商的说明，使用StepOne Plus热循环仪(Applied Biosystems)进行扩增。根据标准ΔCt方法，对从StepOne Plus软件分析获得的数据进行归一化，获得基因表达图。然后，将从每种类型和每种实验时间使用的两个光盘获得的平均值记录在基因表达图上。

关于MTT测试，数据表明细胞表面粘附和定殖阶段的进展，没有毒性作用，并且所分析的样品之间存在显著差异。关于基因表达评估，结果总结在图22中。

可以观察到，从72h实质等同的情况开始，细胞响应于使用过表达成骨活性的基因指示剂的提取物的表面修饰。实际上，在5天时，官能化表面会以更大量表达编码OPN的基因。在第7天，用“科罗帝纳”果渣提取物官能化的钛表面具有两种标记物的明显过表达，并且用“内比奥罗”果渣提取物修饰的钛表面也显示出标记物的过表达。

从该实验可以得出结论，使用提取物官能化的表面的所有类型相对于编码OPN的基因的表达进入细胞-材料对话，与仅在钛的情况下观察到的相比，导致其过表达。在该上下文中，通过用“科罗帝纳”果渣提取物官能化而获得的表面组合物特征在于由于花青素的普遍存在而导致的芳族部分的较高发生率，显示优先行为。

用果渣提取物官能化的钛基材的抗氧化活性

通过将已经描述的DPPH方法应用于表面改性的钛圆盘进行抗氧化活性测试。DPPH测试通过使待分析样品与DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼)溶液反应来确定抗氧化能力。抗氧化剂化合物能够将氢原子转移至自由基，从而引起溶液的变色。然后在预定的温育时间后，通过UV-Vis光谱法分析DPPH自由基在525nm处的峰的减少。这种变色与样品中存在的抗氧化剂负载成正比。对于圆盘测试，与用于提取物的评估的那些相比，DPPH的初始浓度降低，与提取物中存在的那些相比，由于表面上分子数量的减少，可能的反应可能很弱，并且基本上是一种分析耗竭方法。为了测试，用PEI单层+提取物，3层(PEI+提取物+PEI+提取物+PEI+提取物)和类似的6层制备圆盘。

多层厚度的形成和逐渐增长从视觉外观上可以立即看出：随着表面层的增长，通常在单层的情况下，几纳米朝着与可见光波长相当的厚度，产生清晰可见的光学干涉现象。特别地，定性地观察以下颜色，这是与厚度有关的干涉现象与由于层的特定组成而引起的吸收现象之间复杂的相互作用的结果：

提取物：	1层颜色	3层颜色	6层颜色
				阿内斯	金属	青铜	青铜
巴贝拉	金属	青铜	淡蓝色-紫色
				内比奥罗	金属	青铜	淡蓝色
科罗帝纳	金属	青铜	淡蓝色-橙色

通过XPS分析，通过上述方法确认了表面层中多酚的存在。

通过将圆盘在黑暗中浸入含有2mL DPPH 0.05mg/ml溶液的试管中15分钟来进行DPPH测试。最后，测量溶液的吸光度并计算表面的抗氧化能力，得到的结果如图23所示。

数据证实了表面的抗氧化能力及其随制成的层数即可用的多酚分子数的增加而增加。数据还表明，在定性共同行为的框架内，不同提取物之间存在定量差异。

应该注意的是，上述颜色在DPPH测试结束时保持不变，这证实了以下事实：表面层不会因浸入水溶液而改变，换句话说，不会发生吸附分子的明显释放。通过经受测试的圆盘的XPS分析进一步证实了这种行为，其没有显示任何钛信号，证明表面层没有崩解，因此表面上没有钛暴露。

通过果渣提取物和透明质酸共吸附官能化的钛基材的抗氧化活性

如上所述，通过从“科罗帝纳”葡萄提取物和0.1％HA中共吸附制备3层和6层圆盘。观察到干涉斑(interference stain)的形成，而且在这种情况下，溶液中的测试结束时也没有改变。评价抗氧化能力，获得图24所示的结果(与图23中“科罗帝纳”所示的结果相比)。

结果是令人惊讶和违反直觉的。通过HA的共吸附，显然，由于HA本身占据了表面的一部分，因此表面上存在的多酚分子数量减少，如上所述。然而，抗氧化剂作用大大增强。不希望受到任何理论的束缚，我们认为HA的存在会导致水性环境中水合度更高和扩展度更高的多酚层结构，使表面层更具渗透性，因此增加了多酚与DPPH分子之间相互作用的可能性。

无论如何，实验数据表明可以提供具有显著的抗氧化性能的钛圆盘，因此可以提供用其制成的装置。如图22中的基因表达数据所示，相同装置还将具有在促成骨方向上影响细胞定植过程的能力增强。如上所示，由于其已知的抗细胞粘附特征，HA在多酚层中以一定浓度(0.5％)的存在减少了表面上存在的细胞数量。然而，显示出通过使用较低浓度的HA，不会损害由于吸附的多酚引起的成骨作用。利用这一证据，采用以下表面官能化工艺制成钛牙科植入物：

-4层聚阳离子-聚阴离子PEI+“科罗帝纳”果渣的提取物层+0.1％HA，以增强自由基中和性能，

-第五层，最外层，由PEI+“科罗帝纳”中果渣的提取物组成，以利用成骨特性。

采用以下表面官能化工艺制成不同钛牙科植入物：

-4层聚阳离子-聚阴离子PEI+“科罗帝纳”果渣的提取物层+0.05％HA，以增强自由基中和性能，

-第五层，最外层，由PEI+“科罗帝纳”中果渣的提取物组成，以利用成骨特性。

采用以下表面官能化工艺制成不同钛牙科植入物：

-4层聚阳离子-聚阴离子PEI+“科罗帝纳”果渣的提取物层+0.01％HA，以获得自由基中和性能和成骨性能。

用果渣提取物官能化的钛基材灭菌后的抗氧化活性

根据以下步骤，将上述表面改性过程应用于某些牙科植入物：

1)牙科植入物用来自科罗帝纳的聚乙烯亚胺提取物(“提取物”样品)的三个交替层制成；

2)用来自科罗帝纳的聚乙烯亚胺提取物+0.1％透明质酸的两个交替层和来自科罗帝纳的聚乙烯亚胺提取物+0.01％的透明质酸(“HA提取物”样品)的最后一个交替层制成牙科植入物。

如此获得的样品的一半存储在实验室中，另一半送到使用25kGy的γ射线的灭菌过程。

从灭菌返回后，如上所述，根据DPPH方法评估植入物的抗氧化能力。

得到图25所示的结果，其中示出了抗氧化剂能力的百分比变化，将未经过灭菌处理的样品的值设定为100。对于仅用提取物制成的样品，平均下降约16％。在用共吸附HA制成的样品的情况下，观察到平均增加约44％。结果是令人惊讶的，因为几乎可以预见到由于辐照对分子结构的破坏以及随之而来的抗氧化剂能力的损失，但是抗氧化剂活性却没有增加。不希望受任何理论的束缚，可以假设辐照对共吸附层的影响会增加其渗透性和抗氧化剂位点的利用率，从而以某种方式放大透明质酸的存在所引起的影响。

Claims (21)

1.一种用于植入装置表面官能化的方法，按顺序包括以下步骤：

a)任选地，用空气、氧气、氩气、氮气等离子体或通常能够去除烃污染的表面层的等离子体处理植入装置的表面；

b)用聚乙烯亚胺处理植入物的表面；

c)用以下选择处理由步骤b)产生的所述植入物的表面：

-用葡萄果渣提取物，并且干燥官能化表面，或

-通过共吸附葡萄果渣提取物和透明质酸，并干燥官能化表面，或

-通过吸附透明质酸并后吸附葡萄果渣提取物，并干燥官能化表面，

其中所述植入装置是钛骨植入物或钛牙科植入物螺钉。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙烯亚胺是浓度范围以体积计为0.03-0.15％的水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤c)在室温下进行并且持续大于4小时的时间段。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中当在步骤c)中使用透明质酸时，以浓度范围以重量/体积计在0.01％至0.15％的水溶液使用。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中顺序重复2至8次步骤b)和c)，并且其中当所述方法包括透明质酸的共吸附或吸附透明质酸后的葡萄果渣提取物的后吸附时：1)使用浓度范围以重量/体积计为0.05％到0.15％的透明质酸水溶液，并且外层不包含透明质酸，或者2)使用浓度以重量/体积计小于0.02％的透明质酸的水溶液，并且所有涂覆层包含透明质酸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述葡萄果渣选自白葡萄果渣、红葡萄果渣、具有高花青素比例的葡萄果渣或它们的混合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述葡萄果渣选自“内比奥罗”葡萄果渣、“巴贝拉”葡萄果渣、“科罗帝纳”葡萄果渣、“阿内斯”葡萄果渣或它们的混合物。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述提取物是单一葡萄果渣提取物的混合物。

9.根据权利要求1或2所述的方法，包括根据步骤c)处理的所述植入物使用25kGy的γ射线的灭菌步骤。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述葡萄果渣为“科罗帝纳”葡萄果渣。

11.一种植入装置，包括用与一层或多层从葡萄果渣提取的多酚交替的一层或多层聚乙烯亚胺官能化的表面，其中附着于植入物表面的层由聚乙烯亚胺制成，并且其中一层或多层所述多酚构成大于90％的表面涂覆水平，其中所述植入装置是钛骨植入物或钛牙科植入物螺钉。

12.根据权利要求11所述的植入装置，其中涂覆程度大于95％。

13.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中所述植入装置的一层或多层所述多酚显示均匀的酸官能度，其特征在于预定的单个pKa值。

14.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中从一层或多层所述多酚的葡萄果渣中提取的多酚包括没食子酸、槲皮素、芦丁、锦葵色素-3-葡糖苷和/或花青素。

15.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中所述装置包括交替排列的2至8层所述聚乙烯亚胺和2至8层来自所述葡萄果渣提取物的多酚。

16.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中，所述装置包括使用与包含从葡萄果渣中提取的多酚和透明质酸的一层或多层交替的一层或多层聚乙烯亚胺官能化的表面，其中附着于植入物表面的层由聚乙烯亚胺组成。

17.根据权利要11或12所述的植入装置，其中所述装置包括从选自以下果渣的果渣提取物获得的多酚：“内比奥罗”葡萄果渣、“巴贝拉”葡萄果渣、“科罗帝纳”葡萄果渣、“阿内斯”葡萄果渣或它们的混合物。

18.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中外层由仅来自葡萄果渣提取物的多酚组成。

19.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中所述装置包括从仅来自“科罗帝纳”葡萄的果渣的果渣提取物获得的多酚。

20.根据权利要求11所述的植入装置，其中涂覆程度大于99％。

21.根据权利要求11或12所述的植入装置，其中所述装置包括交替排列的3至6层所述聚乙烯亚胺和3至6层来自所述葡萄果渣提取物的多酚。

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