CN110996997A - 采用登革病毒和树突细胞进行癌症治疗的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了采用登革病毒和可选的经引发的识别肿瘤抗原的树突细胞治疗疾病，特别是黑素瘤的组合物和方法。描述了裂解方案，其中所述裂解不会导致细胞的完全或不完全裂解，以提供维持细胞表面分子在细胞表面嵌入的状态。还提供了用于治疗目的的非致死性登革病毒株。

Description

采用登革病毒和树突细胞进行癌症治疗的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2017年6月15日提交的第62/520,345号美国临时申请的权益，该美国临时申请通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2018年6月14日的所述ASCII副本被命名为48253-707_601_SL.txt，大小为45,748个字节。

背景技术

与细胞毒性药物、辐射和手术不同，免疫疗法刺激免疫系统识别并杀死肿瘤细胞。已经在刺激免疫系统识别并破坏肿瘤细胞方面进行了许多尝试。由于选择作为免疫疗法之靶标的肽的自身性(self-identity)、免疫活化的缺乏、不良事件和/或肿瘤免疫逃避机制，因此这些尝试已经取得的成功较为有限。

目前的细胞疗法例如树突细胞疗法在晚期癌症患者中诱导持久的完全应答的能力很低(在大多数免疫原性癌症类型中为5-10％，在其它癌症类型中更低)。通常，树突细胞疗法由于低激活(例如，没有足够的免疫细胞来完全杀死全部癌细胞)、低靶向(例如，健康细胞被杀死并且/或者肿瘤细胞未被杀死)或免疫抑制的肿瘤微环境限制了药效而产生不太理想的结果。因此，需要改进的免疫疗法来治疗癌症。

肿瘤由于其高有丝分裂率和细胞代谢率而常常缺氧。这种缺氧导致较高的厌氧途径利用来产生三磷酸腺苷(ATP)，结果是乳酸水平较高，而细胞质和细胞核内的pH较低。因此，需要以高遗传可塑性靶向并消除这些低灌注肿瘤部位。

发明内容

提供了治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：向有需要的受试者施用登革病毒，其中该受试者患有黑素瘤；以及将经引发的树突细胞施用于该受试者，其中所述经引发的树突细胞通过使树突细胞与肿瘤抗原接触而产生。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其包括在施用一定剂量的登革病毒之前至少一周从所述受试者获得所述树突细胞。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒以约30,000PFU/mL的浓度施用。本文进一步提供了方法，其包括在施用一定剂量的登革病毒后4天至10天施用经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，其中皮下施用所述登革病毒。本文进一步提供了方法，其中经由肿瘤内注射施用所述登革病毒。本文进一步提供了方法，其包括在所述受试者表现出发热症状时施用经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，其包括在所述受试者已达到101°F的体温时施用经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，其包括在第一时间向所述受试者施用第一份经引发的树突细胞，并且在第二时间施用第二份经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，其中第一时间和第二时间相隔至多30天。本文进一步提供了方法，其中第一时间和第二时间相隔约3天。本文进一步提供了方法，其中所述第一份经引发的树突细胞中经引发的树突细胞的数目为10⁴个细胞至10⁸个细胞。本文进一步提供了方法，其中所述第一份经引发的树突细胞和第二份经引发的树突细胞之每一个中经引发的树突细胞的总数为10⁶个细胞至10⁹个细胞。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是同种异体的。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是自体的。本文进一步提供了方法，其包括从所述受试者获得树突细胞。本文进一步提供了方法，其包括使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤裂解物接触。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约16ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约29ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是血清型1、2、3、4或5。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是DENV2#1710。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是DENV1#45AZ5。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒是S16803、HON1991C、HON 1991D、HON1991B、HON 1991A、SAL 1987、TRI 1981、PR 1969、IND 1957、TRI1953、TSV01、DS09-280106、DS31-291005、1349、GD01/03、44、43、China 04、FJ11/99、FJ-10、QHD13CAIQ、CO/BID-V3358、FJ/UH21/1971、GU/BID-V2950、American Asian、GWL18、IN/BID-V2961、Od2112、RR44、1392、1016DN、1017DN、1070DN、98900663DHF、BA05i、1022DN、NGC、Pak-L-2011、Pak-K-2009、Pak-M-2011、PakL-2013、Pak—L-2011、Pak-L-2010、Pak-L-2008、PE/NFI1159、PE/IQA2080、SG/D2Y98P-PP1、SG/05K3295DK1、LK/BID/V2421、LK/BID-V2422、LK/BID-V2416、1222-DF-06、TW/BID-V5056、TH/BID-V3357、US/BID-V5412、US/BID-V5055、IQT1797、VN/BID-V735、US/Hawaii/1944、CH53489或341750。

本文提供了治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：向有需要的受试者施用DENV1#45AZ5，其中所述受试者患有黑素瘤；从所述受试者获得树突细胞；使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤抗原接触，以产生经引发的树突细胞；以及将所述经引发的树突细胞施用于所述受试者。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其中所述DENV1#45AZ5以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV1#45AZ5以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV1#45AZ5以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV1#45AZ5以约30,000PFU/mL的浓度施用。

本文提供了治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：向有需要的受试者施用DENV2#1710，其中所述受试者患有黑素瘤；从所述受试者获得树突细胞；使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤抗原接触，以产生经引发的树突细胞；以及将所述经引发的树突细胞施用于所述受试者。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。本文进一步提供了方法，其中所述DENV2#1710以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV2#1710以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV2#1710以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。本文进一步提供了方法，其中所述DENV2#1710以约30,000PFU/mL的浓度施用。

附图说明

图1描绘了采用登革病毒和树突细胞的示例性治疗方法。

图2是对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条表示每种情况下肺转移的平均数。

图3是对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条表示每种情况下肺转移的平均数。

图4是流式细胞术数据的图，其证实了CD14+单核细胞的分离。

图5是相对于通过比较物方法产生的DC，通过本文公开的方法产生的DC所表达的IL-12p70的蛋白质表达数据图。

图6是在细胞毒性T淋巴细胞的存在下，登革病毒诱导的上清液对黑素瘤细胞系(FEMX细胞)的细胞毒性的图。Y轴是相对于总细胞的细胞死亡百分比。

图7是在细胞毒性T淋巴细胞的存在下，登革病毒诱导的上清液对黑素瘤细胞系(624.28细胞)的细胞毒性的图。Y轴是相对于总细胞的细胞死亡百分比。

图8是登革病毒诱导的上清液和自然杀伤细胞对黑素瘤细胞系(FEMX细胞)的细胞毒性的图。Y轴是相对于总细胞的细胞死亡百分比。

图9是登革病毒诱导的上清液和自然杀伤细胞对黑素瘤细胞系(FEMX细胞)的细胞毒性的图。Y轴是相对于总细胞的细胞死亡百分比。

图10是在不存在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤(NK)细胞的情况下，DV诱导的上清液对黑素瘤细胞系624.28细胞具有细胞毒性的图。Y轴是相对于总细胞的细胞死亡百分比。

具体实施方式

定义

贯穿本公开内容，各个实施方案以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本发明之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。除非上下文另有明确规定，否则当所声称的范围包括限值之一或全部两者时，排除了这些包括的限值之一或全部两者的范围也被包括在本发明中。

本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制任何实施方案。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。进一步应当理解，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指定所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元件、组分和/或其群体。如本文所用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何及所有组合。

除非特别说明或从上下文中可以明显看出，否则如本文所用的，关于数字或数字范围的术语“约”应被理解为表示所述数字及其+/-10％的数字，或者对于范围列出的值，表示低于所列下限的10％至高于所列上限的10％。

如本文所用的术语“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括大鼠、小鼠、非人灵长类动物和灵长类动物，包括人。

癌症疗法

本文提供了组合物及其用途，其中该组合物具有以对于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症有效的量存在的登革病毒。如本文所述的登革病毒的用途包括治疗性施用登革病毒以治疗受试者中的各种病况，如癌症。本文进一步提供了通过向受试者施用有效量的登革病毒来治疗癌症的方法，其中与未接受治疗的受试者相比，该登革病毒能够在接受治疗的受试者中治疗、稳定或减轻癌症。进一步提供了包含登革病毒的组合物，该登革病毒也可用作癌症治疗的佐剂。在一些情况下，该登革病毒是用于治疗癌症的联合疗法的一部分。登革病毒疗法与各种抗癌疗法(例如组合生理学(高热降低肿瘤灌注)、免疫学(激活适应性和先天性免疫系统的效应细胞)和凋亡诱导途径(sTRAIL)的疗法)联合施用，以破坏或稳定肿瘤细胞的生长。

登革病毒

登革病毒可用于本文所述的组合物和方法，因为原发感染的死亡率低于普通感冒，同时还允许增加毛细血管通透性和细胞因子产生，以及其它特征。本文提供了用于治疗癌症的组合物，其中该组合物以对于消除或减少有需要的受试者中的癌症有效的量包含登革病毒。(图1)本文还提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用对于消除或减少癌症有效量的登革病毒。本文还提供了用于稳定癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用对于稳定或控制癌症生长有效量的登革病毒。登革病毒是虫媒病毒(Arboviruses)，并且仅由埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)种的蚊子传播。该病毒具有复杂的生命周期，涉及未确定的森林哺乳动物群(可能是灵长类动物)和人类宿主。雌蚊从受感染的人身上吸食血液，病毒在肠道上皮细胞中复制达高感染滴度(10⁵/ml)，然后蚊子在另一次吸食血液之后利用背压在抽出其口针时将病毒传递给另一人。登革热流行每年感染5000万人，导致数千人死亡，通常是继发性感染相关休克治疗不足的儿童。

登革病毒基因组编码结构蛋白质、衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E和非结构蛋白质：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的活株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的减毒株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的弱毒株。在一些情况下，该登革病毒选自以下登革病毒血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4和DENV-5，及其组合。本文提供了用于联合疗法的方法和组合物，其包括向有需要的受试者施用：登革病毒(DV)和经引发以靶向肿瘤细胞的树突细胞(DC)。

登革病毒是披膜病毒科、黄病毒亚科(B组)的正链RNA病毒。该病毒具有二十面体(icoashederal)几何形状，且直径约为40-45纳米。11,000个碱基的基因组编码核壳(NC)蛋白、prM膜融合蛋白、包膜糖蛋白(E)和5个非结构蛋白质NS1-NS5。NC蛋白形成病毒核心，具有通过prM复合体附接的包膜刺突。E糖蛋白是中和抗体的重要靶标，而NS-3和NS-4蛋白构成CD4+和CD8+CTL的重要靶标。

登革病毒构成五种不同的血清型：DENV-1至DENV-5。血清型2和4对IgG是交叉中和的，而1型和3型也是交叉中和的。然而，免疫并不完全，并且登革热在病毒感染中是独特的，原因在于由非交叉中和血清型引起的后续感染由于免疫过度激活引起的休克综合征而导致增加的死亡风险。在一些情况下，可以采用非致死形式的登革病毒。示例性的非致死性登革病毒可以是血清型1、2、3、4或5的登革病毒。例如，非致死性登革病毒可以选自表1。例如，在序列同源性或结构同源性上，登革病毒可以与表1的任何株约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高达约100％相同。

表1：非致死性登革病毒株

本文提供了使用一种或多种登革病毒株的组合物和方法，其中该组合物包含血清型1、2、3、4或5的登革病毒株。在一些情况下，该登革病毒是血清型1的登革病毒。在一些情况下，该DV是45AZ5株。表2提供了对应于45AZ5基因组的DNA和蛋白质序列。

表2.DV株45AZ5的DNA和氨基酸序列

在一些情况下，所述DV是血清型2。在一些情况下，该DV血清型2是DENV-2株#1710。DENV-2株#1710来自于1985年从波多黎各(Puerto Rico)采集的样品，并且使用包膜基因区特异性的4种引物(见表3)在限制性位点特异性RT-PCR分析中表征为A型。参见Harris等人,Virology 253,86-95(1999)。用这些引物进行的限制性位点特异性RT-PCR产生582个碱基对、754个碱基对和可能676个碱基对的扩增产物。DENV-2株#1710被记录在CDC数据库中，条目号为555。参见Harris(1999)。DENV-2株#1710在波多黎各流行期间被分离。这次暴发有9,540例疑似DV病例，其中有一例疑似、但未经确认的、由于该病毒而导致的死亡，这表明DENV-2株#1710的毒性非常低，因此适用于本文所公开的方法。

表3.扩增DENV-2病毒的引物的序列和位置

本文描述了在癌症免疫疗法中用作有效免疫刺激物的有利的DV特性。DV对未成熟B-淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞和树突细胞(DC)谱系的抗原呈递细胞(APC)具有亲和力。DV的独特特征在于原发性感染导致CD4+和CD8+辅助细胞诱导物和细胞毒性效应CTL的T_H1型应答的激活。通过感染但不杀死APC，DV上调其CD80和CD83表达，从而导致促炎性T_H1细胞因子谱。原发性DV感染诱导活化的CD4⁺和CD8⁺效应T细胞以及LAK细胞的T_H1型应答。在对癌症免疫疗法完全反应的患者中可见这种类型的应答(见表4)。

表4.肿瘤免疫逃避机制和DV感染

在原发性感染中，DV引起的死亡率非常低(Manson热带病为1/61,000)。该病毒感染但不杀死单核细胞-巨噬细胞和树突细胞谱系的APC。这些被感染的APC随后开始促炎性(TNF-α和IL-1β)和T_H1(IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21)类型的细胞因子级联。这些细胞因子导致适应性(CTL)和先天性(NK)免疫系统的强烈激活。在3-5天孵育时间段之后，发热升至39.5-40.5℃，并持续升高4-5天。患者经历剧烈头痛、关节痛、不适和对光敏感。到发热的第3天会发生皮疹覆盖胸部、背部，并且有时覆盖腿和手臂。临床上，登革感染导致血小板计数降低，从而导致出血，其范围从轻微到休克综合征情况下的危及生命。在基于合理的液体处置进行适当支持性医护的情况下，99％的病例完全恢复。

本文提供了用于减少有需要的受试者中的癌细胞的组合物和方法，其包括施用登革病毒，其中该方法导致该受试者中的癌细胞减少至少约40％。在一些情况下，本文公开的方法和组合物导致受试者中的癌细胞减少至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

药物组合物

本文提供了包含对于减少有需要的受试者中的癌细胞有效量的登革病毒(DV)的组合物。在一些情况下，该有效量是约10⁵噬斑形成单位(PFU)。在一些情况下，DV的有效量是约10,000至约90,000PFU；约20,000至约60,000PFU；约50,000至约80,000PFU。在一些情况下，DV的有效量大于约40,000PFU或大于约30,000PFU。在一些情况下，DV的有效量小于约90,000PFU；小于约30,000PFU；或小于约20,000PFU。该DV可以是表1中描述的毒株。

本文提供了组合物，其包含足以提高受试者中至少一种细胞因子的水平的有效量的登革病毒。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者血液中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者血清样品中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以显著提高所述至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约2％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约15,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约14,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约15,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约14,000％的量。

本文提供了组合物，其包含足以提高受试者中至少一种细胞因子的水平的量的登革病毒。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是白介素(IL)。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是干扰素(IFN)。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是白介素。在一些情况下，所述至少一种细胞因子选自肿瘤坏死因子(TNF)α、IFNα、IFNβ、IFNγ、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、IL-12、IL-2R、IL-7、IL-15、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及其组合。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约300％。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约240％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约800％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约420％。在一些情况下，IFNβ的水平增加约50％至约20,000％。在一些情况下，IFNβ的水平增加约50％至约14,000％。在一些情况下，IFNγ的水平增加约50％至约200％。在一些情况下，IFNγ的水平增加约50％至约100％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约8000％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约5000％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约4000％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约100％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约80％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约100％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％至约400％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％至约350％。在一些情况下，IL-12R的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-12R的水平增加约20％至约150％。

本文提供了包含有效量的登革病毒(DV)的组合物，其中该有效量是足以增加肿瘤细胞中蛋白质表达的量。在一些情况下，该有效量是足以增加肿瘤细胞上表达的蛋白质的表达的量。在一些情况下，该蛋白质是检查点蛋白质。在一些情况下，这使肿瘤细胞成为检查点抑制剂的更好靶标。在一些情况下，该检查点蛋白质是编程死亡-配体1(PD-L1)。在一些情况下，该有效量使PD-L1的表达增加约10％至约100％。在一些情况下，该有效量使PD-L1的表达增加约10％至约20％。在一些情况下，该有效量是足以增加肿瘤细胞上表达的蛋白质复合物的表达的量。在一些情况下，该复合物是主要组织相容性复合物(MHC)。在一些情况下，该MHC是I类MHC。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％至约60％。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％至约100％。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％至约150％。

本文提供了包含对于减少有需要的受试者中的癌细胞有效量的登革病毒(DV)的组合物，其中该有效量是足以增加该受试者的免疫细胞上蛋白质表达的量。在一些情况下，该有效量是足以增加该免疫细胞中的蛋白质表达的量。在一些情况下，该免疫细胞是T细胞。在一些情况下，该蛋白质是细胞间粘附分子(例如，将两个细胞连接在一起)。在一些情况下，该细胞间粘附分子是细胞间粘附分子1(ICAM-1)。在一些情况下，该有效量使ICAM-1的表达增加约10％至约500％。在一些情况下，该有效量使ICAM-1的表达增加约10％至约300％。本文提供了包含有效量的登革病毒的组合物。在一些情况下，本文公开的组合物包含糖。在一些情况下，本文公开的组合物包含表面活性剂。在一些情况下，本文公开的组合物包含蛋白质。在一些情况下，本文公开的组合物包含盐。在一些情况下，本文公开的组合物包含非离子型表面活性剂、非还原糖、盐、载体蛋白质或其组合。

本文提供了包含对于减少有需要的受试者中的癌细胞有效量的登革病毒的组合物。在一些情况下，该组合物包含非离子型表面活性剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是非离子型去污剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含疏水链的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧乙烯的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧丙烯的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是充当细胞膜稳定剂的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是防止细胞膜剪切的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是充当消泡剂的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂包含普朗尼克(pluronic)F-68。在一些情况下，该非离子型表面活性剂基本上由普朗尼克F-68组成。预期用于本文公开的组合物的非离子型表面活性剂的其它非限制性实例包括烷基聚糖苷、cetomacrogol 1000、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、癸基葡糖苷、癸基聚葡萄糖、单硬脂酸甘油酯、IGEPAL CA-630、异鲸蜡醇聚醚-20、月桂基葡糖苷、麦芽糖苷、单月桂酸甘油酯、抗霉枯草菌素、窄范围乙氧基化物、nonidet P-40、壬苯醇醚-9、壬苯醇醚、NP-40、八甘醇单十二烷基醚、N-辛基β-d-硫代吡喃葡糖苷、辛基葡糖苷、油醇、PEG-10葵花甘油酯、五甘醇单十二烷基醚、聚多卡醇、泊洛沙姆、泊洛沙姆407、聚乙氧基牛脂胺、聚蓖麻油酸聚甘油酯、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨聚糖、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、硬脂醇、表面活性素(surfactin)、Triton X-100和吐温80，及其组合。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约0.01％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约0.1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约2％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包含足以减少有需要的受试者中的癌细胞的量的登革病毒和非还原糖的组合物。在一些情况下，该非还原糖是能够捕获水分子的糖。在一些情况下，该非还原糖充当冷冻保护剂，在冷冻和解冻过程中保护登革病毒的活力。在一些情况下，该非还原糖包含二糖。在一些情况下，该非还原糖在两个α葡萄糖单元之间包含α,α-1,1-葡糖苷键。在一些情况下，该非还原糖基本上由二糖组成。在一些情况下，该非还原糖包含海藻糖。海藻糖也被称为α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-α-D-吡喃葡糖苷、mycose和tremalose。在一些实施方案中，该非还原糖基本上由海藻糖组成。在一些情况下，该海藻糖是α-海藻糖。在一些情况下，该海藻糖是D-(+)-海藻糖脱水物。在一些情况下，该海藻糖具有化学式C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O。在一些情况下，该非还原糖以约5％w/v至约25％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约1％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约10％w/v至约20％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约15％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包含对于减少有需要的受试者中的癌细胞有效量的登革病毒和载体蛋白质的组合物。载体蛋白质可以充当类固醇、脂肪酸或激素的载体或稳定剂。在一些情况下，该载体蛋白质是在储存条件(例如，低于室温)下能够稳定病毒包膜的蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是可溶性单体蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是白蛋白。在一些情况下，该载体蛋白质是确保本文公开的组合物符合优质生产规范(GMP)标准的人蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是人白蛋白。在一些情况下，该载体蛋白质以约0.1％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该载体蛋白质以约1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该载体蛋白质以约2％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包含对于减少有需要的受试者中的癌细胞有效量的登革病毒的组合物。在一些情况下，该组合物包含盐。在一些情况下，该盐包含钙、镁、钾、钠、硼盐。在一些情况下，该盐是磷酸盐、氯化物盐、硫酸盐或重铬酸盐。在一些情况下，该盐是氯化钙。在一些情况下，该盐是氯化镁。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约10mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约5mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约2mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约1mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁，其中氯化钙以约0.1mM至约10mM存在于该组合物中，并且氯化镁以约0.1mM至约10mM存在于该组合物中。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁，其中氯化钙以约1mM存在于该组合物中，并且氯化镁以约1mM存在于该组合物中。

在一些情况下，本文公开的组合物和方法改变了受试者细胞中的基因表达。基因表达的示例性改变可以是增加或降低的表达。DV感染可以增加受试者细胞中的基因表达，包括但不限于IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、CD8抗原、ICOSLG、CCL3、CCL5、TRAIL、IP10、GNLY、GZMA、HLA-DRA、HLA-DPα1、HLA-DPβ1和ZAP70。在受试者的循环体液中可以观察到与这些基因相对应的蛋白质的水平升高。水平可以升高至少2倍。水平可以升高2倍至1000倍。水平可以升高2倍至100倍。水平可以升高2倍至10倍。DV感染可以增加施用DV的受试者的细胞类型，包括但不限于CD8+CD44+62L-细胞、CD4+CD44+CD62L^lo细胞、HLA-DR+CD8+细胞、Tia-1CD8+细胞、VLA-4CD8+细胞、ICAM-1CD8+细胞和LFA-1CD8+细胞。在一些情况下，在DV感染过程中由免疫系统释放TNF-α。TNFα是一种炎性细胞因子，其具有多效性，包括经由TRAIL(TNF凋亡诱导配体)直接杀伤肿瘤细胞。

在一些情况下，DV诱导来自多种细胞(包括γδCTL、活化的M1巨噬细胞和浆细胞样DC(pDC))的高水平的可溶性TRAIL(sTRAIL)。在一些情况下，DV激活IFNβ——一种对于与IFNα相同的受体具有10倍亲和力的多功能细胞因子。IFNβ在抑制病毒RNA转录方面具有相似的抗病毒性质，但在诱导肿瘤细胞凋亡方面则比IFNα有效得多。一氧化氮和IFNβ在登革感染期间可以协同作用。这些分子可以接连工作以克服对由M₁巨噬细胞、pDC和δγCTL诱导的高水平sTRAIL介导的凋亡的抗性。

本文提供了可以任选地包含一种登革病毒株的药物组合物。在一些情况下，可以使用约1、2、3、4、5种或更多种登革病毒株作为本文所述的方法或组合物的一部分。在一些情况下，该药物组合物包含登革病毒的至少一部分。登革病毒的部分可以是足以在接受该药物组合物的受试者中产生免疫应答的部分。该组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物。用于本发明药物组合物中的药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递送媒介物、张度剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。

在一些情况下，本文公开的载体包含中性缓冲盐水。所述药物组合物可以包含抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。另外举例来说，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可以用作防腐剂。合适的共溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括失水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等。缓冲液可以是常规缓冲液，如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液可以是大约pH 4-5.5，而Tris缓冲液可以是大约pH 7-8.5。

本文提供了包含登革病毒的组合物，其中该组合物为液体形式、冻干形式或冷冻干燥形式，并且可以包含一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂。在一些情况下，包含冻干保护剂，其为非还原糖，如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得经重建后，所得制剂将是等渗的，尽管高渗或略微低渗的制剂也可能是合适的。另外，冻干保护剂的量应足以防止病毒在冻干时不可接受的程度的降解和/或聚集。预冻干制剂中的糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为大约10mM至大约400mM。

本文提供了包含本文公开的登革病毒的组合物，其中该组合物适合于注射或输注。示例性组合物适合于通过技术人员可用的任何途径注射或输注到动物中，该途径例如是关节内、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外制剂通常是无菌的、无热原的、等渗的水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。

用于注射本文所述的登革病毒的装置可以被配置用于皮下注射。在一些情况下，该装置并非配置用于皮内注射。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是30至19G。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是27至19G。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是24至19G。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是23至19G。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是22至19G。该装置在ISO尺度上的针规大小可以是21至19G。该装置的针长度可以是3/8英寸至3/4英寸。该装置的针长度可以是1/2英寸至5/8英寸。对于皮下注射，该针可以以45度至90度的角度注射。注射部位可以在手臂的三角肌或大腿的股外侧肌中。

本文公开了制备及储存DV的方法。在一些情况下，该DV被储存在0.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在1.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在1.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在2.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在2.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在3.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在3.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在4.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在4.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在5.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在5.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在6.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在6.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在7.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在7.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在8.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在8.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在9.0ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在9.5ml容器中。在一些情况下，该DV被储存在10ml容器中。示例性容器包括但不限于瓶子、小瓶、罐或注射器。

本文提供了包含本文公开的登革病毒和非水性溶剂的药物组合物。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏(Ringers’)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

本文提供了包含本文公开的登革病毒的药物组合物，其中该药物组合物被配制用于吸入，例如作为干粉。基于本公开内容和配制技术的常识，取决于拟定的施用途径、递送形式和所需剂量，可以确定合适的和/或优选的药物制剂。无论施用方式如何，可以根据患者体重、体表面积或器官大小来计算有效剂量。对于涉及本文描述的各种制剂的治疗，用于确定其适当剂量的计算的进一步细化在本领域中常规进行，并且处于本领域中常规实施的任务的范围内。适当的剂量可以通过使用合适的剂量-响应数据来确定。

施用方法

本文提供了包括向有需要的受试者施用登革病毒的方法。在一些情况下，该病毒以水性形式提供。在一些情况下，将病毒冻干并在水溶液(例如，盐水溶液)中重建。在一些情况下，该病毒通过选自皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、经皮给药、静脉内(“i.v.”)给药、鼻内给药、淋巴管内注射和口服给药的途径施用。在一些情况下，通过淋巴管内微导管向受试者输注该病毒。

在一些情况下，本文公开的方法包括以约0.5ml 10⁶pfu/ml的剂量施用登革病毒。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁸pfu/ml之间。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁶pfu/ml之间。在一些情况下，该剂量为约10³pfu/ml至约10⁴pfu/ml、约10⁴pfu/ml至约10⁶pfu/ml、约10⁶pfu/ml至约10⁸pfu/ml或约10⁸pfu/ml至约10¹⁰pfu/ml。在一些情况下，该剂量为约10¹pfu/ml、10²pfu/ml、10³pfu/ml、10⁴pfu/ml、10⁵pfu/ml、10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml、10⁸pfu/ml或至多约10⁹pfu/ml。在一些情况下，本文所述的剂量在约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2ml或0.3ml的体积中。在一些情况下，剂量在约0.01ml至约0.03ml、约0.01ml至约0.1ml、0.03ml至约0.05ml、0.05ml至约0.07ml、0.07ml至约0.09ml、0.1ml至约0.2ml、0.2ml至约0.4ml、0.4ml至约0.6ml的体积中。

在一些情况下，本文公开的方法包括以约0.5ml 10⁶pfu/ml/天的剂量施用登革病毒。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁸pfu/ml/天之间。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁶pfu/ml/天之间。在一些情况下，本文公开的方法包括以超过一个约0.5ml 10⁶pfu/ml/天的剂量施用登革病毒。在一些情况下，方法包括每天超过一次施用约10³pfu/ml至约10⁸pfu/ml的剂量。在一些情况下，方法包括每天超过一次施用约10³pfu/ml至约10⁶pfu/ml的剂量。在一些情况下，方法包括每天1-5次施用约10³pfu/ml至约10⁸pfu/ml的剂量。在一些情况下，方法包括每天1-5次施用约10³pfu/ml至约10⁶pfu/ml的剂量。在一些情况下，方法包括每天1-3次施用约10³pfu/ml至约10⁸pfu/ml的剂量。在一些情况下，方法包括每天1-3次施用约10³pfu/ml至约10⁶pfu/ml的剂量。

本文提供了包括向有需要的受试者施用包含登革病毒的组合物的方法。在一些情况下，该组合物包含糖。在一些情况下，该组合物包含表面活性剂。在一些情况下，该组合物包含蛋白质。在一些情况下，该组合物包含盐。在一些情况下，该组合物包含非离子型表面活性剂、非还原糖、盐、载体蛋白质或其组合。在一些情况下，该组合物包含非离子型表面活性剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是非离子型去污剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含疏水链的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧乙烯的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧丙烯的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是充当细胞膜稳定剂的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是防止细胞膜剪切的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂是充当消泡剂的试剂。在一些情况下，该非离子型表面活性剂包含普朗尼克F-68。在一些情况下，该非离子型表面活性剂基本上由普朗尼克F-68组成。预期用于本文公开的组合物的非离子型表面活性剂的其它非限制性实例包括烷基聚糖苷、cetomacrogol1000、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、癸基葡糖苷、癸基聚葡萄糖、单硬脂酸甘油酯、IGEPAL CA-630、异鲸蜡醇聚醚-20、月桂基葡糖苷、麦芽糖苷、单月桂酸甘油酯、抗霉枯草菌素、窄范围乙氧基化物、nonidetP-40、壬苯醇醚-9、壬苯醇醚、NP-40、八甘醇单十二烷基醚、N-辛基β-d-硫代吡喃葡糖苷、辛基葡糖苷、油醇、PEG-10葵花甘油酯、五甘醇单十二烷基醚、聚多卡醇、泊洛沙姆、泊洛沙姆407、聚乙氧基牛脂胺、聚蓖麻油酸聚甘油酯、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨聚糖、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、硬脂醇、表面活性素、Triton X-100和吐温80，及其组合。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约0.01％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约0.1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非离子型表面活性剂以约2％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包括向有需要的受试者施用包含登革病毒的组合物的方法。在一些情况下，该组合物包含非还原糖。在一些情况下，该非还原糖是能够捕获水分子的糖。在一些情况下，该非还原糖充当冷冻保护剂，在冷冻和解冻过程中保护登革病毒的活力。在一些情况下，该非还原糖包含二糖。在一些情况下，该非还原糖在两个α葡萄糖单元之间包含α,α-1,1-葡糖苷键。在一些情况下，该非还原糖基本上由二糖组成。在一些情况下，该非还原糖包含海藻糖。海藻糖也被称为α-D-吡喃葡糖基-(1→1)-α-D-吡喃葡糖苷、mycose和tremalose。在一些实施方案中，该非还原糖基本上由海藻糖组成。在一些情况下，该海藻糖是α-海藻糖。在一些情况下，该海藻糖是D-(+)-海藻糖脱水物。在一些情况下，该海藻糖具有化学式C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O。在一些情况下，该非还原糖以约5％w/v至约25％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约1％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约10％w/v至约20％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该非还原糖以约15％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包括向有需要的受试者施用包含登革病毒的组合物的方法。在一些情况下，该组合物包含载体蛋白质。载体蛋白质可以充当类固醇、脂肪酸或激素的载体或稳定剂。在一些情况下，该载体蛋白质是在储存条件(例如，低于室温)下能够稳定病毒包膜的蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是可溶性单体蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是白蛋白。在一些情况下，该载体蛋白质是确保本文公开的组合物符合优质生产规范(GMP)标准的人蛋白质。在一些情况下，该载体蛋白质是人白蛋白。在一些情况下，该载体蛋白质以约0.1％w/v至约10％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该载体蛋白质以约1％w/v至约5％w/v的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该载体蛋白质以约2％w/v的浓度存在于组合物中。

本文提供了包括向有需要的受试者施用包含登革病毒的组合物的方法。在一些情况下，该盐包含钙、镁、钾、钠、硼盐。在一些情况下，该盐是磷酸盐、氯化物盐、硫酸盐或重铬酸盐。在一些情况下，该盐是氯化钙。在一些情况下，该盐是氯化镁。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约10mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约5mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约0.1mM至约2mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，该盐以约1mM的浓度存在于组合物中。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁，其中氯化钙以约0.1mM至约10mM存在于该组合物中，并且氯化镁以约0.1mM至约10mM存在于该组合物中。在一些情况下，组合物包含氯化钙和氯化镁，其中氯化钙以约1mM存在于该组合物中，并且氯化镁以约1mM存在于该组合物中。

本文提供了包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的登革病毒的方法。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者血液中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者血清样品中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以显著提高所述至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约2％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约20,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约15,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约100％至约14,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约15,000％的量。在一些情况下，该有效量是足以使所述至少一种细胞因子的水平提高约50％至约14,000％的量。

本文提供了包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的登革病毒的方法。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者中至少一种细胞因子的水平的量。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是白介素(IL)。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是干扰素(IFN)。在一些情况下，所述至少一种细胞因子是白介素。在一些情况下，所述至少一种细胞因子选自肿瘤坏死因子(TNF)α、IFNα、IFNβ、IFNγ、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、IL-12、IL-2R、IL-7、IL-15、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及其组合。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约300％。在一些情况下，TNFα的水平增加约50％至约240％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约800％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，IFNα的水平增加约50％至约420％。在一些情况下，IFNβ的水平增加约50％至约20,000％。在一些情况下，IFNβ的水平增加约50％至约14,000％。在一些情况下，IFNγ的水平增加约50％至约200％。在一些情况下，IFNγ的水平增加约50％至约100％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约8000％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约5000％。在一些情况下，IP-10的水平增加约50％至约4000％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约100％。在一些情况下，IL-12的水平增加约20％至约80％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约200％。在一些情况下，IL-15的水平增加约20％至约100％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，IL-7的水平增加约50％至约500％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％至约1000％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％至约400％。在一些情况下，GM-CSF的水平增加约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％至约350％。在一些情况下，IL-12R的水平增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％至约200％。在一些情况下，IL-12R的水平增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％直至约200％。本文提供了包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的登革病毒的方法。在一些情况下，该有效量是足以提高受试者中至少一种细胞因子的水平的量。

本文提供了包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的登革病毒的方法。在一些情况下，该有效量是足以增加肿瘤细胞中的蛋白质表达的量。在一些情况下，该有效量是足以增加肿瘤细胞上表达的蛋白质的表达的量。在一些情况下，该蛋白质是检查点蛋白质。在一些情况下，这使肿瘤细胞成为检查点抑制剂的更好靶标。在一些情况下，该检查点蛋白质是编程死亡-配体1(PD-L1)。在一些情况下，该有效量使PD-L1的表达增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，直到约100％。在一些情况下，该有效量使PD-L1的表达增加约10％至约20％。在一些情况下，该有效量是足以增加肿瘤细胞上表达的蛋白质复合物的表达的量。在一些情况下，该复合物是主要组织相容性复合物(MHC)。在一些情况下，该MHC是I类MHC。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％、20％、30％、40％、50％，直到约60％。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，直到约100％。在一些情况下，该有效量使MHC的表达增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％，直到约150％。

本文提供了包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的登革病毒的方法。在一些情况下，该有效量是足以增加受试者的血细胞如淋巴细胞中的蛋白质表达的量。在一些情况下，该有效量是足以增加受试者的循环细胞中的蛋白质表达的量。在一些情况下，该血细胞或循环细胞是T细胞。在一些情况下，该蛋白质是细胞间粘附分子(例如，将两个细胞连接在一起)。在一些情况下，该细胞间粘附分子是细胞间粘附分子1(ICAM-1)。在一些情况下，ICAM-1由内皮细胞和免疫系统细胞如淋巴细胞表达。可以通过施用登革病毒增加T细胞上的ICAM-1表达。在一些情况下，该有效量使免疫细胞中ICAM-1的表达增加约10％至约500％。在一些情况下，ICAM-1的表达是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％，或至多约500％。在一些情况下，该有效量使ICAM-1的表达增加约10％至约300％。在一些情况下，ICAM-1由肿瘤细胞表达。可以通过施用登革病毒增加肿瘤细胞上的ICAM-1表达。在一些情况下，该有效量使肿瘤细胞中ICAM-1的表达增加约10％至约500％。在一些情况下，ICAM-1的表达是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％，或至多约500％。在一些情况下，该有效量使ICAM-1的表达增加约10％至约300％。表达水平可以通过诸如流式细胞术等体外测定来测量。

本文提供了通过施用登革病毒以增加免疫细胞或肿瘤细胞中ICAM-1的表达来治疗癌症的方法。增加的或持续的ICAM-1表达可以允许改善细胞-细胞相互作用。细胞-细胞相互作用可以导致免疫细胞与癌细胞的结合增加。

联合递送

本文提供了组合物和方法，其中将树突细胞接种与登革病毒(DV)株的佐剂作用相结合，以克服肿瘤免疫逃避机制并消耗肿瘤细胞。本文所述的方法可以用来通过以下步骤治疗受试者的癌症：从受试者获得树突细胞和肿瘤细胞，使树突细胞暴露于肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物(也称为“脉冲处理”树突细胞)以得到经引发的(或“活化的”)树突细胞，在受试者的免疫系统已经用DV刺激后，将得到的经引发及肿瘤靶向的树突细胞递送至受试者(参见，例如，图1)。任选地，并非来自该受试者的肿瘤抗原可用于脉冲处理树突细胞。

本文提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括：获得树突细胞(DC)；将该DC与至少一种肿瘤细胞抗原一起孵育；向该受试者施用登革病毒2型血清型株；以及向该受试者施用所述DC。在一些情况下，该登革病毒2型血清型株为DENV-2#1710。在一些情况下，该树突细胞为自体的树突细胞。在一些情况下，该树突细胞为同种异体的树突细胞。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起孵育包括将DC与肿瘤细胞一起孵育。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起孵育包括将DC与肿瘤细胞裂解物一起孵育。

向有需要的受试者施用本文公开的登革病毒和树突细胞。在一些情况下，方法进一步包括施用本文公开的经引发的树突细胞。在一些情况下，在施用树突细胞之前至少24小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用树突细胞之前约12小时至约96小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用经引发的树突细胞之前约24小时至约72小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用经引发的树突细胞之前1天至4天先施用登革病毒。在一些情况下，登革病毒仅施用一次。在一些情况下，登革病毒施用超过一次。在一些情况下，登革病毒仅在接受树突细胞之前施用。在一些情况下，登革病毒在接受经引发的树突细胞之后施用。在一些情况下，登革病毒在接受经引发的树突细胞之前和之后施用。

在一些情况下，高热或发热的发生证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。在一些情况下，受试者血液/血浆中循环细胞因子的存在或增加证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。细胞因子可包括但不限于白介素-2、白介素-7、白介素-12、白介素-15、白介素-2R、TNFα、IP-10、GM-CSF、干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ。

本文提供了包括施用的方法，在一些情况下，本文所述的方法包括向有需要的受试者施用经引发的树突细胞仅一次。在一些情况下，经引发的树突细胞施用超过一次。在一些情况下，在第一时间和第二时间施用经引发的树突细胞，其中第一时间和第二时间相隔约1天、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天、约8天、约10天、约12天、约18天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天、约50天、约60天、约100天、约1年、约2年，及其任意组合。在一些情况下，第一时间和第二时间相隔约1周、约2周、约3周或约一个月。在一些情况下，第一时间和第二时间相隔超过一个月。在一些情况下，第一时间和第二时间相隔不到12个月。在一些情况下，第一时间和第二时间相隔超过12个月。

在一些情况下，在受试者突发发热后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到约37.5℃至约42℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到约38℃至约42℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到至少约38.5℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到38.5℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温达到38摄氏度或更高之后向该受试者施用经引发的树突细胞。在一些情况下，通过鼓室或口腔方法来测量受试者的体温。

黑素瘤治疗的施用和评估方法

本文提供了包括向患有黑素瘤的受试者施用登革病毒的方法。在一些情况下，该登革病毒是DV-2#1710株。本文进一步提供了包括向患有黑素瘤的受试者施用本文公开的经引发的树突细胞的方法。本文还提供了包括向患有黑素瘤的受试者施用本文公开的登革病毒和树突细胞的方法。在一些情况下，该黑素瘤是晚期黑素瘤。在一些情况下，该受试者具有不可切除的III期黑素瘤。在一些情况下，该受试者具有不可切除的IV期黑素瘤。在一些情况下，该受试者具有可测量的黑素瘤(例如，可以二维测量的肿瘤)。黑素瘤的类型和阶段在本文中进一步描述。

在一些情况下，方法包括从患有黑素瘤的受试者获得肿瘤样品。在一些情况下，方法包括从肿瘤样品制备肿瘤裂解物。在一些情况下，方法包括使树突细胞与肿瘤裂解物接触，以针对受试者的黑素瘤细胞引发所述树突细胞。在一些情况下，该树突细胞对受试者而言是同种异体的。在一些情况下，该树突细胞对受试者而言是自体的。在一些情况下，方法包括对来自受试者的血液进行白细胞提取法(leukapheresis)，以获得对受试者而言是自体的树突细胞。在所述方法包括施用树突细胞和登革病毒的一些情况下，可以在用登革病毒接种受试者之前进行白细胞提取法。在一些情况下，在接种登革病毒前至少一周进行白细胞提取法。在一些情况下，在用登革病毒接种受试者之前约1周至约4周进行白细胞提取法。

在一些方法中，方法包括在白细胞提取法之前让受试者进行运动。在一些方法中，方法包括在白细胞提取法之前让受试者运动约5小时至约15分钟。在一些方法中，方法包括在白细胞提取法之前让受试者运动约1小时至约15分钟。在一些情况下，方法包括在白细胞提取法之前让受试者运动30分钟。在一些情况下，运动包括使受试者的心率提高至少约50％的活动。在一些情况下，运动包括使受试者的心率提高至少约65％的活动。在一些情况下，运动包括使受试者的心率提高至少约80％的活动。在一些情况下，运动包括使受试者的心率提高至少约50％到至少约80％的活动。在一些情况下，运动使获得的树突细胞的数目增加。

在一些情况下，方法包括施用一定剂量的登革病毒，其中该剂量是每次注射约10³pfu登革病毒。在一些情况下，逐步增加剂量(例如，受试者未发生登革热)。在一些情况下，方法包括施用一定剂量的登革病毒，其中该剂量是每次注射约10⁴pfu登革病毒。在一些情况下，方法包括施用一定剂量的登革病毒，其中该剂量是每次注射约10⁵pfu登革病毒。在一些情况下，方法包括施用一定剂量的登革病毒，其中该剂量是每次注射约10⁶pfu登革病毒。在一些情况下，方法包括施用一定剂量的登革病毒，其中该剂量是每次注射约10⁷pfu登革病毒。在一些情况下，方法包括每剂量施用约10³pfu登革病毒至10⁷pfu登革病毒。

在一些情况下，方法包括以约500微升的体积施用所述剂量。在一些情况下，方法包括以约100微升至约1000微升的体积施用所述剂量。在一些情况下，方法包括每天大约一次施用所述剂量。在一些情况下，方法包括每天大约三次施用所述剂量。在一些情况下，方法包括每天大约三次至每天大约五次施用所述剂量。在一些情况下，方法包括每天三次至每天五次施用所述剂量。

在一些情况下，方法包括通过皮下注射施用登革病毒。在一些情况下，方法包括通过肿瘤内注射施用登革病毒。在一些情况下，方法包括通过肌肉内注射、腹膜内注射或静脉内注射施用登革病毒。

注射病毒后，指示患者每天3次测量口腔温度。当开始发热超过101°F(38.5℃)(注射后5-8天)时，患者入院接受首次DC输注。

所有患者还接受用自体肿瘤裂解物脉冲处理的自体树突细胞。

将大约3.0x 10⁷个肿瘤裂解物脉冲处理的DC(TL-DC)在水浴中温热至37℃，并在因发热症状入院后在0.9％注射级NaCl中静脉内输注30分钟。48小时后，在30分钟内与0.9％注射级NaCl同时静脉内输注第二份3.0x 10⁷个TL-DC。任选地，在出现发热症状后的第3天输注剩余份的裂解物脉冲处理的DC(6×10⁷)。静脉内途径为将大量DC输送至诸如肝脏和脾白髓等器官提供了一种简单的方式，但需要TH1细胞因子环境才能实现最佳的CTL应答。因此，在最初表现出发热症状时进行首次DC输注，以便利用增加的TH1细胞因子水平。第二剂量在大约48小时后给予，以在细胞因子应答转变为TH2之前提供第二波CTL，以防止中毒性休克程度的应答。任选地，在TL-DC输注前30分钟向受试者施用抗组胺药，以降低对DMSO的输液反应的风险。或者，在转移至II类输液袋之前，将细胞在现场洗涤以去除DMSO。

全面体格检查(包括生命体征、体重)、体力状态评价(即ECOG或Karnofsky)和安全性实验室评价在基线时及每周一次进行。从第4周开始，每2周进行一次免疫监视和随访，直到第12周。从第12-24周开始，每3周评价一次患者。在第24周之后，每12周进行一次治疗后随访，直到在病情稳定或有反应的患者中发生明确的疾病进展。

在一些情况下，以3到12周的间隔进行CT或PET扫描，以确定抗肿瘤活性。CT扫描包括胸部、腹部和骨盆区域的扫描。在一些情况下，以8周的间隔进行CT或PET扫描，以确定抗肿瘤活性。备选地或另外地，表征疾病或抗肿瘤活性的生物标志物。表征疾病或抗肿瘤活性的生物标志物包括：测定抗登革病毒中和抗体的效价；进行循环肿瘤细胞(CTC)分析；进行循环黑素瘤DNA测定；以及T细胞免疫表型分型/TCR测序；检测抗核抗体；以及测定类风湿因子的水平。根据肿瘤的大小和数量进行活检，包括针芯活检。常规HE组织学方法检测经历细胞死亡的肿瘤细胞以及被炎性嗜中性粒细胞或淋巴细胞浸润的肿瘤。

本文提供了用于制备本文公开的经引发的树突细胞(DC)的方法。本文进一步提供了用于将经引发的树突细胞暴露于与疾病状态相关的抗原例如肿瘤抗原的方法，从而产生能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对癌细胞的特异性且强烈应答的经引发的树突细胞。本文进一步提供了用于将这类DC施用于受试者中以治疗与所述疾病状态有关的病症的方法。在一些情况下，该病症是癌症。在一些情况下，该病症是自身免疫病症，例如，类风湿性关节炎和多发性硬化。在一些情况下，该病症是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或获得性免疫缺陷综合征。在一些情况下，在施用经引发的DC之前向受试者施用登革病毒。

分离和引发树突细胞(DC)的方法

本文提供了包括引发树突细胞的方法，其中引发树突细胞包括使树突细胞与目标癌细胞上存在的一种或多种肿瘤抗原接触。在一些情况下，单独采用肿瘤抗原引发树突细胞，该肿瘤抗原已合成、分离或纯化。备选地或另外地，采用肿瘤细胞裂解物引发树突细胞，其中该肿瘤细胞裂解物含有肿瘤抗原。在一些情况下，采用表达肿瘤抗原的完整癌细胞引发树突细胞。随后将该树突细胞施用于受试者，其中该树突细胞将把肿瘤抗原呈递给CTL，从而使CTL适应于识别并破坏目标癌细胞。

本文提供了限制树突细胞暴露于塑料容器材料中存在的聚合物的方法。例如，在软塑料袋的情况下，聚合物可渗入介质溶液中并影响DC活性。相反，可以在硬容器如聚苯乙烯组织培养板之中和之上培养、储存并运输树突细胞。这避免了可通过暴露于软塑料袋中含有的聚合物而引起的树突细胞免疫刺激活性的降低。例如，这些聚合物可减少由树突细胞产生的IL-12的量，从而降低其诱导稳定CTL应答的能力。本文提供的实例证明，由本文公开的方法生成的经引发的树突细胞能够分泌至少18pg/mL的IL-12p70，而由标准方法产生的树突细胞通常仅产生4-6pg/mL的IL-12p70。

在一些情况下，用肿瘤裂解物引发树突细胞是理想的或有利的。值得注意的是，本文公开的方法采用保持肿瘤抗原完整性的温和的细胞裂解方案。这种温和的裂解可通过将肿瘤细胞或癌细胞暴露于次氯酸钙或次氯酸钠溶液不超过约30-60分钟来实现。类似地，温和地分解用来引发树突细胞的任何肿瘤细胞，例如，通过Miltenyi GentleMACS系统等。

本文提供了通过本文公开的方法制备的经引发的树突细胞，其中该方法包括向受试者施用经引发的树突细胞以及会增强受试者的免疫系统的药剂。经引发的树突细胞与病毒感染的组合提供了采用最少给药(可能仅一次)的有效治疗，这避免了受试者在坚持治疗方面的挑战。所述经引发的树突细胞可以是自体的，意思是来源于受试者自身的细胞，或者是同种异体的，即来源于具有相似组织类型的另一受试者。

本文提供了方法，其包括引发DC并将经引发的DC施用于有需要的受试者，其中所述DC诱导来自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答，从而导致靶细胞的细胞毒性。所述DC可包含同种异体的树突细胞或自体的树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用同种异体的经引发的树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用自体的经引发的树突细胞。包括向受试者施用经引发的DC的本文公开的方法在本文中可被称为“树突细胞接种”。

在一些情况下，本文所述的方法包括从骨髓中的CD34+祖细胞获得树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括从外周血中的CD1+CD14+不成熟单核细胞获得树突细胞。在一些情况下，获得树突细胞包括白细胞提取法。在一些情况下，白细胞提取法包括从受试者或供体抽取一单位的血液，分离一系列的血液组分：红细胞、血小板和大部分血浆因子，将这些血液组分返回到受试者，而保留白细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括测试白细胞的无菌性，将其在冷藏(4℃)下运输或储存，和/或处理来自白细胞提取法产物的DC。

本文提供了产生DC的方法，其中该方法包括分离所述单位血液中的单核细胞与其它白细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。这可采用免疫磁性选择或通过粘附性质来实现。免疫磁性选择包括使来自所述单位血液的白细胞与具有塑料珠的无菌塑料柱接触，该塑料珠上包被有免疫细胞抗体，例如，作为非限制性实例，CD表面蛋白质(CD4、CD8、CD56等)抗体。不需要(非单核细胞)的细胞将粘附于珠子，使得单核细胞通过并得到收集。在阳性选择中，可用CD1和/或CD14的抗体包被磁珠以捕获单核细胞，将磁体抵靠柱子放置，并用缓冲盐水溶液或能使细胞存活的介质将不需要的细胞冲洗出柱子。随后从珠子上洗下单核细胞并在以下步骤中收集。在粘附选择中，利用单核细胞附着于特定表面的特性，通过使白细胞提取法产物由上而下地沿着倾斜的柱子流动来分离单核细胞。

本文提供了细胞收集方法，该方法可包括从所述单位血液中收集仅几千个单核细胞。当前采用的免疫治疗方法通常需要5000万范围内的DC剂量。因此，本文公开的方法可包括扩充单核细胞及其任何前体，以及由其分化的任何细胞(例如，DC)。扩充细胞可包括使细胞与因子如生长因子、集落刺激因子、细胞因子或其它任何增殖或生长诱导因子及其组合相接触。作为非限制性实例，重组人生长因子rhu白介素-4(IL-4)和rhu粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可用来实现DC数目的扩充。此外，IL-4和GM-CSF可能是由单核细胞发展为成熟DC所必需的，单核细胞与成熟DC相比具有较差的抗原摄取和CTL刺激能力。因此，IL-4和GM-CSF可扩充成熟DC标志物的数目和发展。DC标志物可包括但不限于CD11、CD80和CD83，以及I类(用于将短肽呈递给CD8+细胞)和II类(用于将更长的肽呈递给CD4+辅助诱导T淋巴细胞)MHC复合物的表达增加。扩充细胞可在约2天内产生数千万个成熟DC，扩充细胞可在约3天内产生数千万个成熟DC，扩充细胞可在约4天内产生数千万个成熟DC，扩充细胞可在约5天内产生数千万个成熟DC，或者扩充细胞可在约一周内产生数千万个成熟DC。

在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触或用它们对DC进行脉冲处理。如本文所用的术语“脉冲处理”通常是指以一个或多个间隔使DC接触超过一次，并且可与接触互换使用，除非另有说明。在一些情况下，所述方法包括使DC与能结合MHC I类分子的肽(“MHC I类肽”)接触或用该肽脉冲处理DC。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与能结合MHC II类分子的肽(“MHC II类肽”)接触或用该肽脉冲处理DC。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与MHC I类肽和MHC II类肽接触或用这些肽脉冲处理DC。在一些情况下，所述接触或脉冲处理使得DC有能力引发CTL并将CTL靶向肿瘤。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与制备/合成的I类和/或II类肽接触或用该肽脉冲处理DC。在一些情况下，制备I类和/或II类肽，随后将其任选地以微克量或更少的量添加至DC培养基中。在一些情况下，本文所述的方法包括用于持续的免疫应答的II类肽。在一些情况下，本文所述的方法包括对肽(即肿瘤抗原)进行DNA或RNA测序和/或使用电穿孔将DNA或RNA插入DC中以触发抗原加工。在一些情况下，本文所述的方法不需要对DC进行HLA匹配。在一些情况下，所述肽或其部分由选自EGSRNQDWL(SEQ ID NO:1)、(TAYRYHLL)(SEQ ID NO:2)或其组合的氨基酸序列来表示。

在一些情况下，本文公开的肽是I类肽。可以制备I类肽，随后将其以微克量添加至DC培养基中。然而，该技术是昂贵的，因为所述肽必须与受试者的HLA类型相匹配，并且如果肿瘤细胞不呈递所述抗原，则该肿瘤细胞可以逃避检测和裂解。缺乏激活CD4+辅助细胞的II类肽导致免疫应答能力的快速下降。其它方法可包括对常见肿瘤抗原的RNA测序，随后使用电穿孔将RNA插入DC中以触发抗原加工。该方法不需要HLA匹配，并且包括用于持续的免疫应答的II类肽。然而，RNA测序可能在技术上是复杂的，并且可能仅呈递数千个潜在基因产物的有限数目的抗原。由于这些原因，自体的完整肿瘤细胞或其裂解物具有低成本、易于通过活检获得(1-2g足够)的优点，并且含有用于广泛且深度免疫应答的全系列潜在抗原。

本文提供了引发树突细胞的方法，其包括获得完整肿瘤细胞和/或其裂解物。可通过放射或其它手段杀死肿瘤细胞，并通过多种方法制备裂解物。在一些情况下，裂解肿瘤细胞不包括胰蛋白酶消化和冻融循环，它们简单且迅速，但可能损伤其中纤细的肽。本文公开的方法可采用自动化细胞处理器(例如，Miltenyi GentleMACS系统)，其允许将样品手动切碎，悬浮于PBS溶液中，随后使用预先选择的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。可对单细胞悬浮液进行膜裂解，其对肿瘤肽的损伤最小。

在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与自体肿瘤细胞或其裂解物接触。在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与自体的完整肿瘤细胞(例如，肿瘤细胞和肿瘤支持细胞)或其裂解物相接触，后者含有用于广泛且深度免疫应答的全系列潜在抗原。本文所述的树突细胞引发方法可包括使树突细胞与包含凋亡体或坏死体的肿瘤细胞裂解物接触。在进一步的情况下，该肿瘤细胞裂解物包含来自肿瘤细胞周围微环境的肿瘤抗原，如细胞外基质蛋白质。

在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与将会增强DC的引发、增殖或活力的增强剂接触。作为非限制性实例，增强剂可选自淋巴因子、单核因子、细胞因子、生长因子、细胞、细胞碎片、(非蛋白质)小分子、抗体、抗体片段、核酸及其组合。

在一些情况下，本文所述的制备用于DC引发的细胞和抗原的方法包括使靶细胞(例如，癌细胞)不能发生细胞分裂。例如，所述方法可包括用丝裂霉素C或辐射处理细胞，以使细胞不能发生细胞分裂。这些方法可包括作为增强剂添加的细胞或用来脉冲处理DC的细胞(例如，肿瘤细胞)。

在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约1小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约12小时至约48小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约8小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约18小时。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少一次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少两次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少三次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触少于两次、少于三次、少于四次、少于五次或少于10次。脉冲处理可包括向DC中添加肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物超过一次，使得所述肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物在DC培养基中积累。脉冲处理可包括在一次或多次脉冲处理之间洗涤细胞或去除DC培养基。

在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与本文所述的熟化剂接触来增强、完成或结束DC的成熟化。在一些实施方案中，熟化剂还充当“危险信号”。在没有该危险信号的情况下，肿瘤抗原可诱导Treg产生或活性，这将最终降低CTL活性。在一些实施方案中，熟化剂/危险信号是炎性信号。炎性信号还可被称为炎性介质。炎性介质可包括细胞因子，以及可能不被本领域技术人员分类为细胞因子，但直接或间接地影响炎症的其它因子(例如，趋化因子、粘附分子等)。在一些实施方案中，该炎性介质选自趋化因子、细胞因子、病原体、非肽小分子、化合物、抗体、肽、其片段、其部分以及它们的组合。在一些实施方案中，该炎性信号是模式识别受体(PRR)或其途径的调节剂。

在一些情况下，本文所述的炎性信号选自干扰素、toll样受体信号传导调节剂及其组合。作为非限制性实例，该干扰素可以是干扰素-γ。在一些实施方案中，该炎性信号是toll样受体信号传导途径调节剂。

在一些情况下，本文所述的炎性信号是toll样受体(TLR)信号传导途径调节剂(regulator)。作为非限制性实例，该toll样受体信号传导途径调节剂可以是脂多糖(LPS)——来自细菌细胞壁的多糖。在一些情况下，该toll样受体信号传导途径调节剂可选自调节TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR 10的toll样受体信号传导途径调节剂。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR的配体、结合蛋白质、抗体、激动剂或拮抗剂。该toll样受体信号传导途径调节剂可选自肽、蛋白质、细胞碎片、细胞壁组分、脂蛋白、肽聚糖、多糖、单糖和小分子化合物。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是动物细胞、植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞及其组合的一部分。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR2信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR2信号传导途径调节剂可以是脂磷壁酸、MALP-2、MALP-4、OspA、孔蛋白、LcrV、脂甘露聚糖、GPI锚、溶血磷脂酰丝氨酸、脂磷聚糖、糖磷脂酰肌醇、酵母聚糖、hsp60和血凝素。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR4信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR4信号传导途径调节剂可以是丁丙诺啡、卡马西平、乙醇、芬太尼、左啡诺、LPS、美沙酮、吗啡、奥卡西平、羟考酮、哌替啶和葡糖醛木甘聚糖。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR7信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR7信号传导途径调节剂可以是单链RNA或咪唑并喹啉化合物。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR8信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR8信号传导途径调节剂可以是单链RNA、富含G的寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物。该咪唑并喹啉化合物可以是R848。在暴露于炎性信号之后，DC可上调其CD80/CD83+活化标志物，增加IL-12p70的产生以诱导1型CTL应答，以及抵抗进一步的抗原摄取和加工。

在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与本文所述的熟化剂接触来增强、完成或结束DC的成熟化。在一些情况下，用来结束DC成熟化的试剂包括LPS细菌细胞壁。在一些情况下，该熟化剂包括IFN-γ。在一些情况下，该熟化剂包括R848。在一些情况下，该熟化剂包括CD40L。在一些情况下，该熟化剂包括选自LPS细菌细胞壁、IFN-γ、R848和CD40L的至少任意两种试剂的组合。在一些情况下，该熟化剂包括选自LPS细菌细胞壁、IFN-γ、R848和CD40L的至少任意三种试剂的组合。在一些情况下，该熟化剂包括LPS细菌细胞壁、IFN-γ、R848、CD40L或其任意组合。在一些情况下，所述熟化剂同时施用。在一些情况下，所述熟化剂依次施用。在一些情况下，从首先施用LPS开始，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，从首先施用IFN-γ开始，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，从首先施用R848开始，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，从首先同时施用LPS和IFN-γ开始，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，通过首先同时施用LPS和IFN-γ，随后施用R848、CD40L或其任意组合，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，通过首先同时施用LPS和IFN-γ，随后施用R848，依次施用所述熟化剂。在一些情况下，通过首先同时施用LPS细菌细胞壁和IFN-γ，随后施用R848，再然后施用CD40L，依次施用所述熟化剂。

本文提供了产生本文所述的经引发的树突细胞的方法，其中该方法包括使经引发的树突细胞与干扰素γ接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约100U/mL至约10,000U/mL、约500U/mL至约5000U/mL和约500U/mL至约2,000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约500U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约1000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约2000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。

在一些情况下，本文所述的产生经引发的树突细胞的方法可包括使经引发的树突细胞与TLR8激动剂R848接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约0.1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL和约1μg/mL至约10μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约1μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约5μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约10μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。

在一些情况下，本文所述的产生经引发的树突细胞的方法包括使经引发的树突细胞与脂多糖接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL和约1ng/mL至约25ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约5ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约10ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约15ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。

本文提供了方法，其包括对通过本文公开的方法产生的经引发的DC进行无菌性、特异性和活力测试。该测试可在运输或储存DC之前进行。该测试可在运输或储存DC之后进行。所述方法可包括在RNA或蛋白质水平上测定IL-12p70在DC中的表达水平。IL-12p70是临床反应的独立预测指标，近二十年来在大量试验中进行了测试，其中一些具有大约40％的反应率。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是通过传统方法产生/储存/运输的经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约两倍。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是通过传统方法产生/储存/运输的经引发的DC(“传统经引发的DC”)中IL-12p70表达水平的至少约两倍。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以比传统经引发的DC中IL-12p70的表达水平高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约三倍。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约四倍。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的约两倍至约二十倍。

本文提供了产生超过166ng/mL IL-12p70的树突细胞的产生方法。本文还提供了产生超过2010ng/mL的IL-12p70的树突细胞。本申请的DC可以产生至少约1510ng/mL、至少约12ng/mL、至少约1914ng/mL、至少约16ng/mL、至少约18ng/mL、至少约20ng/mL、至少约22ng/mL、至少约24ng/mL、至少约26ng/mL、至少约28ng/mL、至少约29ng/mL或至少约30ng/mL。本申请的DC可以产生约20ng10ng/mL至约30ng/mL。本申请的DC可以产生约20ng10ng/mL至约29ng/mL。本申请的DC可以产生约15ng/mL至至少约29ng/mL。

CTL应答

本文提供了产生本文所述的DC的方法，其包括测试DC诱导CTL应答的能力。测量CTL应答的水平可包括测量来自受试者的血液、血清或血浆中的细胞因子或炎性介质。测量CTL应答的水平可包括测量来自受试者的血液、血清或血浆中的细胞因子或炎性介质的水平变化。测量CTL应答的水平可包括测量细胞因子或炎性介质在体外的产生量。细胞因子和炎性介质可包括白介素、迁移抑制蛋白质、单核细胞趋化蛋白质、单核细胞化学吸引蛋白质、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞炎性蛋白质、单核因子、趋化因子、趋化因子配体(CCL)和C-X-C基序趋化因子(CXCL)及其受体。细胞因子和炎性介质包括但当然不限于白介素1β(IL-1b)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-5)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、Rantes、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、巨噬细胞炎性蛋白质1α(MIP-1a)、巨噬细胞炎性蛋白质1β(MIP-1b)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞化学吸引蛋白质-1(MCP-1)、干扰素α(IFNa)、干扰素γ(IFNg)、白介素1受体α(IL-1Ra)、白介素2受体(IL-2R)、肿瘤坏死因子α(TNFa)、干扰素γ诱导的蛋白质(IP-10)和γ干扰素诱导的单核因子(MIG)。可通过肿瘤应答基因(MxA等)的表达来测量CTL应答，从而在非应答者或低应答者中实现高癌症杀伤(使“冷”肿瘤变“热”)以及产生进一步的肿瘤收缩。

硬表面

本文提供了制备本文所述的DC的方法，其包括在硬表面上培养该DC。如本文所用的术语“硬表面”通常是指标准塑料组织培养板或培养瓶(例如，聚苯乙烯培养板)。本文公开的方法包括在DC可以粘附的硬表面上培养DC。在一些实施方案中，用蛋白质、肽、细胞外基质分子、聚合物或其组合包被硬表面。在一些实施方案中，不包被硬表面(例如，DC直接粘附于硬塑料表面上)。硬表面与软组织培养袋(也称为细胞分化袋)形成对照。软组织培养袋可以是包含降低DC的1型应答能力的聚合物或化学物质(例如，邻苯二甲酸酯)的袋子。软组织培养袋可以是包含引起DC的中性0型应答从而使得DC在功能上钝化的聚合物或化学物质的袋子。软组织培养袋可以是包含选自聚乙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)、六氟丙烯、四氟乙烯、聚四氟乙烯及其共聚物以及它们的组合的聚合物的袋子。

本文提供了制备本文所述的DC的方法，其包括将该DC转移至储存单元。该储存单元还可以是运输单元。该储存单元可以选自柔性或软的容器或表面(例如，袋子)或硬的容器或表面(例如，培养瓶或培养板)。该储存单元可包括硬塑料表面。该储存单元可基本上由硬塑料表面组成。该储存单元可由硬塑料表面组成。该储存单元可包括非塑料表面(例如，玻璃)。该储存单元可基本上由非塑料表面组成。该储存单元可由非塑料表面组成。该储存单元可不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。该储存单元可不含或基本上不含在不成熟DC中诱导中性或0型应答的聚合物。中性应答的特征可在于IL-12p70的低表达。该储存单元可基本上不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。基本上不含可意指，储存单元至少90％、至少95％、至少98％或至少99％不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。基本上不含可意指，储存单元至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。

在一些情况下，所述储存单元包含内表面，其中该内表面是与其中所储存的细胞接触的该储存单元的表面。内表面可由硬塑料表面组成。内表面可以是玻璃。内表面可不存在将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可由不被储存单元内储存的不成熟DC或任何细胞摄取的聚合物构成。内表面可不含将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可基本上不含将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可至少90％、至少95％、至少98％或至少99％不含在添加细胞和储存介质之后将被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％不含在添加细胞和储存介质之后将被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可不含或基本上不含在不成熟DC中诱导中性或0型应答的聚合物。中性应答的特征可在于IL-12p70的低表达。

本文提供了用于储存通过本文所述方法产生的DC的方法，其中所述储存单元适合于在液氮中在-70℃下冷冻储存长达1年，并运输至诊所以供使用。所述方法可包括在储存单元中储存和/或运输成熟DC、不成熟DC、单核细胞或血液。所述方法可包括将细胞在冷却下运输过夜。所述方法可包括解冻或温热细胞至37℃(例如，在温水浴中)。

分离和裂解肿瘤细胞的方法

本文提供了治疗受试者的方法，其包括将通过本文公开的方法产生的DC施用至目标肿瘤细胞。在一些情况下，用来自受试者的肿瘤细胞引发DC。在一些情况下，该肿瘤细胞是从受试者的肿瘤微环境(在本文中称为肿瘤支持细胞)分离的细胞。在一些情况下，将树突细胞暴露于肿瘤细胞、肿瘤支持细胞和/或其肽/用它们进行脉冲处理，使得树突细胞将靶向肿瘤细胞和/或支持肿瘤生长和转移的肿瘤支持细胞(例如，内皮细胞、血管细胞、免疫细胞等)。在一些情况下，来自肿瘤细胞和肿瘤支持细胞的肽/抗原诱导具有针对肿瘤细胞和肿瘤支持细胞上的肽/抗原的受体的树突细胞或细胞毒性淋巴细胞，从而导致该树突细胞或细胞毒性淋巴细胞靶向肿瘤微环境，而不是只靶向肿瘤细胞。在一些情况下，从肿瘤组织的活检物获得肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，该活检物包含选自肿瘤细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、浸润性免疫细胞及其组合的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括扩充肿瘤细胞，以具有足够数目的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤细胞抗原来有效且最佳地引发/脉冲处理DC。扩充可包括肿瘤细胞的体外增殖。

本文提供了用于激活本文公开的DC以靶向肿瘤细胞的方法，其中用裂解的肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞和周围的细胞外基质激活所述DC。在一些情况下，裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与NH4Cl酶溶液接触以去除红细胞。在一些情况下，裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与次氯酸溶液接触以诱导免疫原性细胞死亡。在一些情况下，足够温和地裂解所述细胞而不破坏肽。在一些情况下，裂解所述细胞以产生凋亡体或坏死体。在一些情况下，所述方法包括用酶溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，所述方法包括用不含过氧化物的溶液或低过氧化物含量的溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。

本文提供了激活本文公开的DC的方法，其包括用次氯酸盐溶液(HOCL)裂解肿瘤细胞。在一些情况下，该次氯酸盐溶液包含亚氯酸钠。在一些情况下，该次氯酸盐溶液包含亚氯酸钙。在一些情况下，在悬浮肿瘤细胞的介质中次氯酸盐的浓度为约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM。

本文提供了激活通过本文所述方法产生的DC的方法，其中该方法包括在与DC接触前用去污剂溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，该去污剂选自但不限于Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温20、吐温80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、SDS、CHAPS和CHAPSO。在一些情况下，该去污剂溶液净化了过氧化物和其它杂质。在一些情况下，该去污剂是约0.1％至约10％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂是约0.1％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂是约0.5％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂是约1％至约10％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂是约1％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，所述方法包括在不进行摇动、涡流、冷冻、解冻、剪切压力、超声处理和/或加热细胞的情况下裂解细胞。

在一些情况下，本文所述的细胞裂解方法进一步包括停止或中和所述裂解。例如，可用缓冲盐水溶液(磷酸盐缓冲盐水溶液或Hank平衡盐溶液)洗涤细胞以中和所述裂解。

药盒

本文公开了包含组合物的药盒。本文还公开了用于治疗或预防癌症、病原体感染或免疫紊乱的药盒。在一些情况下，药盒可以包括治疗性或预防性组合物，该组合物包含有效量的单位剂型形式的登革病毒组合物。在一些情况下，药盒包括无菌容器，该容器可以容纳登革病毒的治疗性组合物；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、烧瓶、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合容纳药物的材料制成。在一些情况下，药盒可包含约1x 10⁴个细胞至约1x10¹²个细胞的细胞，如树突细胞。在一些情况下，药盒可包含至少约1x10⁵个细胞、至少约1x10⁶个细胞、至少约1x10⁷个细胞、至少约4x10⁷个细胞、至少约5x10⁷个细胞、至少约6x10⁷个细胞、至少约6x10⁷个细胞、至少约8x10⁷个细胞、至少约9x10⁷个细胞、至少约1x10⁸个细胞、至少约2x10⁸个细胞、至少约3x10⁸个细胞、至少约4x10⁸个细胞、至少约5x10⁸个细胞、至少约6x10⁸个细胞、至少约6x10⁸个细胞、至少约8x10⁸个细胞、至少约9x10⁸个细胞、至少约1x10⁹个细胞、至少约2x10⁹个细胞、至少约3x10⁹个细胞、至少约4x10⁹个细胞、至少约5x10⁹个细胞、至少约6x10⁹个细胞、至少约6x10⁹个细胞、至少约8x10⁹个细胞、至少约9x10⁹个细胞、至少约1x10¹⁰个细胞、至少约2x10¹⁰个细胞、至少约3x10¹⁰个细胞、至少约4x10¹⁰个细胞、至少约5x10¹⁰个细胞、至少约6x10¹⁰个细胞、至少约6x10¹⁰个细胞、至少约8x10¹⁰个细胞、至少约9x10¹⁰个细胞、至少约1x10¹¹个细胞、至少约2x10¹¹个细胞、至少约3x10¹¹个细胞、至少约4x10¹¹个细胞、至少约5x10¹¹个细胞、至少约6x10¹¹个细胞、至少约6x10¹¹个细胞、至少约8x10¹¹个细胞、至少约9x10¹¹个细胞或至少约1x10¹²个细胞。例如，药盒中可包含约5x10¹⁰个细胞。在另一个实例中，药盒可以包含3x10⁶个细胞；可以将细胞扩充至约5x10¹⁰个细胞并施用于受试者。这样的药盒可进一步包含其使用说明书。

药物组合物

本文提供了包含有效量的本文公开的登革病毒的药物组合物。在一些情况下，该药物组合物包含超过一种登革病毒株。在一些情况下，该药物组合物包含登革病毒的至少一部分。登革病毒的部分可以是足以在接受该药物组合物的受试者中产生免疫应答的部分。该组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物。用于本发明药物组合物中的药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递送媒介物、张度剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。

在一些情况下，本文公开的载体包含中性缓冲盐水。所述药物组合物可以包含抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。另外举例来说，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可以用作防腐剂。合适的共溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括失水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛等。缓冲液可以是常规缓冲液，如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液可以是大约pH 4-5.5，而Tris缓冲液可以是大约pH 7-8.5。

本文提供了包含登革病毒的组合物，其中该组合物为液体形式、冻干形式或冷冻干燥形式，并且可以包含一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂。在一些情况下，包含冻干保护剂，其为非还原糖，如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得经重建后，所得制剂将是等渗的，尽管高渗或略微低渗的制剂也可能是合适的。另外，冻干保护剂的量应足以防止病毒在冻干时不可接受的程度的降解和/或聚集。预冻干制剂中的糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为大约10mM至大约400mM。

本文提供了包含本文公开的登革病毒的组合物，其中该组合物适合于注射或输注。示例性组合物适合于通过技术人员可用的任何途径注射或输注到动物中，该途径例如是关节内、皮下、肿瘤内、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外制剂通常是无菌的、无热原的、等渗的水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。

本文提供了包含本文公开的登革病毒和非水性溶剂的药物组合物。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

本文提供了包含本文公开的登革病毒的药物组合物，其中该药物组合物被配制用于吸入，例如作为干粉。基于本公开内容和配制技术的常识，取决于拟定的施用途径、递送形式和所需剂量，可以确定合适的和/或优选的药物制剂。无论施用方式如何，可以根据患者体重、体表面积或器官大小来计算有效剂量。对于涉及本文描述的各种制剂的治疗，用于确定其适当剂量的计算的进一步细化在本领域中常规进行，并且处于本领域中常规实施的任务的范围内。适当的剂量可以通过使用合适的剂量-响应数据来确定。

实施例

实施例1.鼠树突细胞(DC)的产生和脉冲处理

使用如Lutz M.等人(J.Immunol.Methods 223:77-92,1999)描述的方法由小鼠骨髓产生成熟DC。将骨髓悬浮液在培养皿中于补充有重组鼠GM-CSF的培养基中孵育10天。收集非贴壁细胞，离心，并重悬于含有GM-CSF和脂多糖的培养基中。两天后，收获DC，并通过台盼蓝排除法测定其活力。通过流式细胞术分析测定DC的纯度。用10μg/ml的合成肽来脉冲处理DC 18小时。孵育18小时后，收获DC，在HBSS中洗涤两次，并重悬于HESS中以进行另外的分析(参见实施例2和3)。

实施例2.用于在第一个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞

使用登革病毒(DV)株和肿瘤抗原引发的树突细胞(DC)进行小鼠模型试验，以观察癌细胞联合靶向的结果。通过尾基部注射，向DV C57BL/6小鼠接种0.05ml的1x10⁶或1x10⁷pfu/m1的登革病毒(DEN-2株#1710)。在施用登革病毒(DEN-2株#1710，CDC数据库条目号555，由Duane Gubler博士提供)后第5天、第10天、第15天和第20天，通过静脉内输注以2,000(rIL-2)和500IU(rIFN-γ)施用重组鼠IL-2(Genzyme)和IFN-γ(SigmaPharmaceuticals)。登革病毒施用后7天，用分开与2种肽一起孵育的小鼠DC经静脉内注射免疫C57BL/6小鼠。合成肽。使用来自卵清蛋白的H-2b-限制性肽(OVA-8)——SIINFEKL(SEQID NO:7)作为对照。使用来源于抗原gp100/pme117的B16黑素瘤相关H-2b-限制性肽(EGSRNQDWL(SEQ ID NO:1))和来源于TRP-1/75的B16黑素瘤相关H-2b-限制性肽(TAYRYHLL(SEQ ID NO:2))脉冲处理鼠DC(详见实施例1)。以14天的间隔进行另外两次DC免疫。在最后一次DC输注后三天，用5×10⁴个活B16黑素瘤细胞在侧尾静脉中静脉内攻击小鼠，然后跟踪记录存活率，将其记录为在肿瘤注射后随时间推移(以天计)的存活动物百分比。记录来自每组五只或更多只小鼠的数据(参见表5和图2)。

表5.

在组2(登革病毒血清型2株#1710和肿瘤肽引发的DC)中施用的小鼠中观察到的肺转移数比组1中的对照小鼠低7.5％，组1施用肿瘤肽引发的DC但未施用登革病毒。

实施例3.用于在第二个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞

使用登革病毒(DV)株和肿瘤抗原引发的DC进行小鼠模型试验，以观察癌细胞联合靶向的结果。向小鼠施用细胞因子以模拟(parallel)在人类中所观察到的对DV的应答。

使用H-2b-限制性B16小鼠黑素瘤细胞系(ATCC#CRL-6322)在小鼠中建立肿瘤。合成用于脉冲处理树突细胞的肽(来源于抗原gp100/pme117和来源于TRP-1/gp75的B16黑素瘤相关H-2b限制性肽)。根据如Lutz等人(J.Immunol.Methods 223:77-92,1999)描述的方法从小鼠骨髓产生树突细胞。

在第0天，小鼠在侧尾静脉内通过静脉内注射接受5x10⁴个活B16黑素瘤细胞以建立肺转移。在第7天，通过尾基部注射，向小鼠接种0.05ml的1x10⁶或1x10⁷pfu/m1的登革病毒(DEN-2株#1710，CDC数据库条目号555)。在施用登革病毒(DEN-2株#1710)后，每隔5天，通过静脉内输注以2000IU(rIL-2)和500IU(rIFN-γ)来施用重组鼠IL-2(Genzyme)和IFN-γ(Sigma Pharmaceuticals)。在第21天、第35天和第49天，将小鼠DC分别与2种肽一起孵育，并在同一天以2次连续施用的方式静脉内注射，以匹配受试者的施用途径和时间表(其它细节参见实施例2)。对照组小鼠未接受登革病毒或接受用来自卵清蛋白的H-²b-限制性肽(OVA-8)——SIINFKEL(SEQ ID NO:7)脉冲处理的树突细胞。表6中示出了治疗组和对照组。

表6.测试登革病毒和DC对黑素瘤肺转移的效果的实验组

在第90天，处死动物并对肺肿瘤集落进行计数。吹入Fekette溶液并固定肺后，以盲法编码方式对肺转移进行计数。将数据报告为转移的平均数；每组四只小鼠(参见表7和图3)。进行以下主要器官系统的组织病理学分析：脑、心脏、肺、肝、肾、脾和性腺(数据未示出)。

表7.测试登革病毒和DC对黑素瘤肺转移的效果的结果

在组C小鼠(施用肿瘤抗原引发的DC并且未施用病毒)中观察到的肺转移数比对照组D(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低47％。在组A小鼠(施用DENV-2#1710和肿瘤抗原引发的DC)中观察到的肺转移数比对照组D(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低54％。在组B小鼠(施用DENV-2#1710和肿瘤抗原引发的DC)中观察到的肺转移数比对照组D(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低51％。组A和组B相比于组D的平均减少为52.8％。

实施例4.登革病毒的制备和筛选

生成具有来自Vero(非洲绿猴肾细胞)的经验证和认证的细胞系的主细胞库，并且测试其没有任何污染物和外来的生物体。世界卫生组织使用Vero细胞系来生产多种病毒疫苗。根据FDA生物制剂中心(CBER)制定的指导方针，将登革病毒在源自主细胞库并确立为工作细胞库的经验证的Vero细胞系中传代。将来自初始种子储备物的两个2型登革病毒株(DNV-2#1584和DENV-2#1710)以10^-5的MOI添加至WCB的Vero细胞中。

在200-ml病毒接种物在37℃下吸附1.5小时后添加第一份4-ml覆盖培养基——其含有在营养培养基(0.165％乳白蛋白水解物[Difco Laboratories,Detroit,Mich.])中的1％SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts,Rockland,Maine)、0.033％酵母提取物[Difco]、Earle平衡盐溶液、25mg硫酸庆大霉素[BioWhittaker,Walkersville,Md.]和1.0mg/L两性霉素B[Fungizone；E.R.Squibb&Sons,Princeton,N.J.]和2％FBS。在37℃孵育7天后，加入每毫升含有另外80mg的中性红活性染色剂(GIBCO-BRL,Gaithersburg,Md.)的第二份2-ml覆盖物。感染后8至11天对噬斑进行计数。

在最终的病毒培养物上进行噬斑测定。如由噬斑测定所估算的，DNV-2#1584的滴度大约为5E+06PFU/ml，而DENV-2#1710的滴度为3.5E+06pfu/mL。在感染后5天，来自ATCC的登革病毒2(DNV-2；#1584)显示Vero细胞中有明显的致细胞病变效应，而在盲传#2(#1710病毒)感染后11天，Vero细胞似乎具有形态学变化。(数据未示出)。显示DENV-2#1710病毒的致细胞病变性远低于DNV-2#1584株。

实施例5.在有和没有DV的情况下，用脉冲处理的DC进行的癌症杀伤试验

在对照组中，将正常的人肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)直接施加至人黑素瘤FEMX细胞。T细胞受体经由HLAA2.1+与FEMX黑素瘤细胞系相匹配。在治疗组中，将人TIL暴露于含有干扰素和白介素的DV上清液。将暴露的TIL+DV上清液置于具有FEMX肿瘤细胞的培养物中。在T细胞与肿瘤细胞之比为5:1(100,000个细胞比20,000个细胞)的情况下使两组杀伤癌细胞4小时。然后通过流式细胞术将存活的肿瘤细胞计数为起始细胞的百分比。表8中显示的结果表明，DV诱导35％的额外癌细胞杀伤，超出经脉冲处理的DC的抗癌应答。

表8.经脉冲处理的DC的抗癌活性的DV增强

	％FL2-A-	％FL2-A+(％凋亡细胞)
			CTL	86.1％	13.9％
CTL+DV上清液	81.2％	18.8％

实施例6.人树突细胞分离以及用黑素瘤裂解物抗原进行的脉冲处理

以下实施例表明了由分离的纯CD14+单核细胞生成表达高水平人IL-12p70的高纯度CD11a+成熟DC群体，以及用黑素瘤细胞裂解物引发DC，整个过程在短于一周的时间内完成。细胞在硬塑料板上培养并且不暴露于软塑料袋。

分离CD14+单核细胞，并分析其CD14、CD15、CD45和7AAD的表达。预运行后，90.25％的输入细胞为CD14+(参见图4)。在接种后24小时，用GM-CSF和IL-4处理CD14+细胞，以生成不成熟的树突细胞。来自Providence Cancer Institute的FEMX黑素瘤细胞在预运行当天到达，并进行重悬、计数和接种。随后用次氯酸钙溶液处理黑素瘤细胞。或者，用亚氯酸钠溶液处理细胞。将黑素瘤细胞裂解物添加至不成熟的DC，并添加熟化剂IFNγ(1000U/mL)、R848(5μg/mL)、LPS(10ng/mL)和CD40L(1μg/mL)。在时间上，LPS较早施用，而IFN-γ和R848随后施用。CD40L在成熟过程中最后施用。

在用黑素瘤细胞裂解物脉冲处理后22小时以及在添加熟化剂后18小时，收集来自成熟DC的上清液以进行支原体和内毒素测试。未观察到生物体或生长。另外，使用DC培养基上清液的13种稀释液，利用ELISA测定IL-12p70水平，IL-12p70水平是DC的效力的指标。IL-12p70的浓度为19+/-4ng/mL，与4-6ng/mL的行业标准形成对照。图5显示了相对于数种比较物的IL-12p70产量的DC IL-12p70产量。这些比较物方法包括将细胞暴露于软塑料袋，用除亚氯酸盐溶液以外的溶液裂解细胞，并且不使用LPS、IFNγ和R848的组合使细胞成熟。对于裂解步骤使用HOCL溶液代替HOCL粉末的重复实验提供了高达29ng/mL的IL-12p70浓度。

将细胞进一步冷冻，然后在4℃下解冻，以检测细胞在冷冻和解冻之后的计数和活力。在解冻开始后约16h、18h、20h和22h测量细胞计数和活力。在冷冻保存研究中测试非脉冲处理的DC的额外收获物，其显示出80％的活力，这高于70％活力的行业标准。冷冻保存前活力的范围为85-89％。

实施例7.用登革病毒在人白细胞中诱导细胞因子

人白细胞(WBC)，包括单核细胞、树突细胞和T淋巴细胞，在时间＝0时以0.1、0.5和2这三种不同的感染复数(MOI)用模拟病毒或登革病毒(DENV-2#1710)进行感染。在感染后48h、72h和96h测定多种细胞因子的水平(pg/mL)。一式三份地进行处理。每个时间点的结果示于表9-12中。(M＝模拟病毒。0.1、0.5和2为MOI)。计算在测试的MOI下模拟病毒与登革病毒之间的一式三份变化平均值，并以百分比的形式示于表9中。该实验和重复实验证明，与模拟病毒相比，DV诱导GM-CSF、IL-7和IP-10等细胞因子的70％-4000％增加。

表9.在登革病毒感染后48h，由人WBC产生的细胞因子水平，以皮克/毫升测量

表10.在登革病毒感染后72h，由人WBC产生的细胞因子水平，以皮克/毫升测量

表11.在登革病毒感染后96h，由人WBC产生的细胞因子水平，以皮克/毫升测量

表12.在模拟感染与登革热感染之间WBC细胞因子水平的相对变化

实施例8.额外的病毒制备方案

除了实施例4的方法以外，还分别使用来自盲传#2、DENV-2#1710、DNV-2#1584和45AZ5的上清液的稀释液感染Vero和FRhL细胞。为了提高检测灵敏度，开发免疫荧光染色来检测用来自盲传#2的上清液感染的细胞中的病毒。

必要时，使用超速离心法来浓缩病毒。在确认病毒滴度后，过滤终产物以去除任何细胞碎片，测试是否存在任何外来生物体，并且在得到最终批次后，将其装入5ml瓶子中，并在4℃下储存直到准备运输及施用。

实施例9.从供体收集PBMC

由受过训练的人员使用适当的设备在设施中对供体(自体的或HLA匹配的同种异体的)进行白细胞提取程序。在白细胞提取法结束后，将红细胞、血小板和血浆蛋白质返回至供体。针对是否存在细菌污染，对白细胞提取法产物进行现场测试(革兰染色测试和鲎变形细胞裂解[LAL])。通过后，用供体特定的信息对收集容器(附接小的测试样品容器)进行条形编码，并置于符合FDA和DOT关于储存和运输非感染性生物材料的规定的经批准的运输容器中。该运输容器中包装有冷却物(例如，固体CO₂、液氮)和温度监测器。该运输容器为硬塑料瓶。快递员在24小时内将该容器运送至GMP制造设施。

实施例10.用肿瘤抗原脉冲处理的树突细胞的制备和使用

将单核细胞与其它收集的白细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)分离。这通过免疫磁性选择或备选地通过粘附性质来实现。免疫磁性选择包括将白细胞倒入具有塑料珠的无菌塑料柱中，该塑料珠上包被有针对免疫细胞CD表面蛋白质(CD4/CD8/CD56等)的抗体。

免疫磁性选择的一个实例是可从Stem Cell Technologies(Vancouver,B.C,Canada,www.stemcell.com)获得的EasySep Monocyte Enrichment试剂盒。为了使用EasySep试剂盒，将白细胞提取法产物悬浮于无菌PBS中并倒入EasySep塑料柱中，该塑料柱含有与针对人CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123和血型糖蛋白A的鼠抗体的四聚体抗体复合物。在孵育10分钟之后，添加EasySep磁性颗粒。粘附于珠子上的细胞在电磁分选中被去除。倒置磁体，并将所需的细胞级分(单核细胞)倒入无菌聚苯乙烯瓶中以进行另外的处理。或者，在阳性粘附选择试验中，将用CD1+/CD14+抗体包被的磁珠与单核细胞混合，将磁体抵靠柱子放置，并用PBS溶液将未结合细胞冲洗出柱子。随后从珠子上洗下单核细胞。在阳性粘附选择中，利用单核细胞附着于特定表面的特性，通过使白细胞提取法产物由上而下地沿着倾斜的柱子流动来分离单核细胞。

或者，采用针对CD3、CD4和CD8的单克隆抗体，通过荧光激活细胞分选(FACS)除去骨髓细胞中的淋巴细胞和MHC类阳性细胞。将剩余的细胞在37℃下、5％CO₂气氛中在补充有人AB血清的基底细胞培养基中培养过夜。选择人AB血清是因为其比其它血清类型以更快的速率使细胞生长，并且不含血清的培养基产生具有低得多的T细胞刺激能力的DC。24小时后，将细胞在粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)和900U/ml的重组IL-4的存在下重新接种并培养。3至4天后，将培养基更换成新鲜的细胞因子培养基。

或者，使用以下方法制备真皮树突细胞(DDC)：将来自健康人类志愿者的Keratome在RPMI 1640中终浓度为1.2U/ml的细菌蛋白酶分散酶2型溶液中于37℃下孵育1小时。孵育期后，表皮和真皮得以轻松分离。然后用PBS洗涤数次后，将表皮和真皮片切成小块(1-10mm)，并置于补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640中，并置于10cm组织培养板中。2-3天后，去除组织块，并收集培养基。将离开组织切片迁移到培养基中的细胞离心，重悬于1-2ml新鲜培养基中，并用台盼蓝染色。通过在甲泛葡胺梯度上分离来实现进一步富集。使细胞在3ml高渗14.5％甲泛葡胺柱上分层，并在室温下以650g沉降10分钟。收集低密度的间期细胞，并用连续两次较低高渗性的洗液(含有10％FBS和40mM NaCl的RPMI 1640)进行洗涤，以使细胞恢复至等渗。

当收集单核细胞时，它们的数目可能只有几千个。在多步骤方案中使用重组人生长因子rhu白介素-4(IL-4)和rhu粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)来实现将DC数扩充至5000万左右。在加入IL-4和GM-CSF后，评估细胞数目的扩充和其中成熟DC标志物(CD11⁺、CD80⁺、CD83⁺)的发展，以及I类(用于将短肽呈递给CD8⁺细胞)和II类MHC复合物(用于将更长的肽呈递给CD4⁺辅助诱导T淋巴细胞)的表达增加。大约3-4天后，测量成熟DC的数目。例如，将单核细胞富集的级分置于Nuclon包被的Cell Factory(Thermoscientific)中，其中在前24小时之后添加不含血清的DC培养基(CellGro,Inc.)，该培养基中补充有GMP-2％人AB血清、500IU/ml(约50ng/ml)rhuIL-4(CellGenix)和500IU/ml(约50ng/ml)rhuGM-CSF(CellGenix)。终产物大约为1L的总培养基体积。在培养约72小时后，针对以下标志物对不成熟DC群体进行评估：CD1⁺CD11⁺CD14⁺。

实施例11.脉冲处理树突细胞

多种肿瘤抗原来源用于高质量DC：肽、来自自体肿瘤的裂解物、完整肿瘤细胞和编码特定肿瘤抗原的RNA。通过手术或抽血获得含有白血病细胞或淋巴瘤细胞的切除活检物或血液样品，随后进行磁性选择以获得白血病/淋巴瘤细胞。一旦获得肿瘤细胞，便将它们进行条形编码，并在类似于先前对于白细胞提取法所述的经批准的容器中运输至GMP设施。样品在通过细菌污染测试后可在-70℃下冷冻。

通过几种方法制备完整自体肿瘤细胞裂解物。为了制备该裂解物，可使用水浴或其它程序将肿瘤样品再温热至约35℃。像Miltenyi GentleMACS系统这样的自动化细胞处理器的开发使得样品可以被手动切碎，悬浮在PBS溶液中，然后用预先选择的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。将细胞添加至酶混合物中，然后转移至MiltenyiGentleMACS离解器。可使用次氯酸盐溶液在对肿瘤肽的损伤最小的情况下将单细胞悬浮液进行膜裂解，该次氯酸盐溶液将杀死任何残留的肿瘤细胞，中和dT_H2细胞因子，并且由于较好的CTL亲和力、亲合力和激活而增加免疫原性。添加次氯酸盐之后，将培养板在37摄氏度、5％CO₂下孵育1小时，轻轻地手动搅拌30min以将次氯酸盐分散开。将细胞洗涤两次以中和裂解反应(例如，采用HBSS)。次氯酸盐处理的细胞可经历后续的冻融循环。或者，样品不分离肿瘤细胞。相反，留下的样品含有肿瘤细胞和支持细胞(例如，来自肿瘤微环境的细胞)。用次氯酸钙裂解细胞以消除红细胞并产生凋亡体和坏死体，而不破坏CTL诱导所需的肽。

在产生不成熟的DC的第三天添加来自GentleMACS的裂解物。将不成熟的DC与肿瘤裂解物共培养约16小时。最后一步是采用炎性信号进行成熟化。将临床等级的LPS(60EU/ml)(R&D Invivogen)和干扰素-γ(2000IU/ml，约100ng/ml)(R&D Systems)添加至培养瓶中并孵育约12小时，以使脉冲处理的DC成熟。在暴露于LPS之后，评估DC中CD80/CD83⁺活化标志物的上调，以及IL-12p70产量的增加。该阶段的过程中测试包括无菌性(如前所述)、活力(通过台盼蓝染料排除法确定的活细胞％)和特异性(通过CD11c流式细胞术测量的DC％)。

在最后的无菌性、特异性和活力测试后，将DC转移到适合在蒸汽相N2中在-130℃下冷冻的硬塑料容器中，储存至多1年，然后运送到诊所以供使用。将该容器在冷冻下运输过夜，然后在干浴中再温热至37℃，之后在30分钟内与0.9％NaCl溶液同时静脉内施用。

实施例12.用于癌症治疗的联合递送

登革病毒的施用与其它病毒疫苗注射相似。受试者的肩部(三角肌)区域的皮肤区域用酒精清洁，然后在皮下注射0.5ml病毒以模仿蚊子叮咬。一旦在DV注射2-3天后受试者发热达到38.5℃，即通过淋巴管内微导管向受试者输注脉冲处理的(经引发的)树突细胞。重复注射，直到受试者呈疾病阴性。该实施例中的DC株为DENV-1#45AZ5或DENV-2#1710。DC输注使用如实施例6制备的细胞。

实施例13.癌细胞系中的登革病毒细胞毒性分析

在存在或不存在DV上清液(MOI 2)的情况下，将两种不同的癌细胞系FEMX和624.28各自分别与CTL共培养6小时，并使用LDH释放试验对每组条件下的细胞死亡进行定量。按照实施例7所述的方法用登革病毒感染WBC后获得DV上清液。DV上清液将CTL杀死FEMX细胞的能力几乎提高了一倍：在模拟上清液的存在下，CTL杀死了51％的FEMX细胞，而在DV上清液的存在下，CTL杀死了91％的FEMX细胞。DV上清液显著提高了CTL杀死624.28细胞的能力：在模拟上清液的存在下，CTL杀死了5％的624.28细胞，而在DV上清液的存在下，CTL杀死了51％的624.28细胞。参见图6和图7。

实施例14.登革病毒激活自然杀伤细胞靶向癌细胞的分析

NK细胞杀伤的行业基准是针对K562肿瘤，因为它们是非抗原匹配的。显示登革病毒处理刺激NK细胞杀死约100％的K562(数据未示出)。

对于NK细胞而言，FEMX和624.28肿瘤通常更难以杀死。624.28细胞是具有高HLA的晚期癌症中黑素瘤细胞的代表，并且被CTL攻击杀死。FEMX细胞是具有HLAA2正常表达的黑素瘤细胞，HLA A2是被NK-92细胞裂解的抑制物。因此，预期FEMX细胞对NK攻击具有抗性。

在存在或不存在DV上清液的情况下，将FEMX和624.28癌细胞系分别与NK细胞共培养，并对每种条件下的细胞死亡进行定量。登革病毒使NK细胞消灭癌细胞的能力提高了一倍，导致在10小时内杀死超过85％。另外，DV和树突细胞的组合在10小时内提供了超过90％的杀死率。参见图8和图9。

观察到DV激活的NK针对624.28细胞和FEMX细胞的高裂解。在模拟上清液的存在下，NK细胞杀死了33％的624.28细胞，而在DV上清液的存在下，杀死了86％的624.28细胞。在模拟上清液的存在下，NK细胞杀死了48％的FEMX细胞，而在DV上清液的存在下，杀死了88％的FEMX细胞。

实施例15.登革病毒诱导的来自WBC的上清液

如实施例7所述用登革病毒感染WBC后获得DV上清液。将黑素瘤624.28细胞系暴露于单独的DV上清液(MOI 2)6小时，并测定细胞毒性。作为对照，将624.28细胞暴露于单独的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或模拟病毒上清液。图10显示了该实验的结果。用DV上清液处理624.28细胞，单独的DV上清液导致约66％的细胞死亡。

实施例16.用于治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞

在鼠模型中测试了登革病毒(DV)株(DENV-2#1710或DENV-1#45AZ5)和肿瘤抗原引发的树突细胞(DC)。通过尾静脉注射以1x10⁶或1x10⁷pfu/m1向C57BL/6小鼠接种0.05ml DV。在施用DV后的第5、10、15和20天，通过静脉内输注以2000IU(rIL-2)和500IU(rIFN-γ)施用重组鼠IL-2(Genzyme)和IFN-γ(Sigma Pharmaceuticals)。DV施用后7天，用分开与2种肽一起孵育的小鼠DC经静脉内注射免疫C57BL/6小鼠。合成肽。使用来自卵清蛋白的H-2b-限制性肽(OVA-8)——SIINFEKL(SEQ ID NO:7)作为对照。使用来源于抗原gp100/pme117的B16黑素瘤相关H-2b-限制性肽(EGSRNQDWL(SEQ ID NO:1))和来源于TRP-1/75的B16黑素瘤相关H-2b-限制性肽(TAYRYHLL(SEQ ID NO:2))脉冲处理鼠DC(详见实施例1)。以14天的间隔进行另外两次DC免疫。在最后一次DC输注后三天，用5×10⁴个活B16黑素瘤细胞在侧尾静脉中静脉内攻击小鼠，然后跟踪记录存活率，将其记录为在肿瘤注射后随时间推移(以天计)的存活动物百分比。

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

<110> 普莱瓦克斯免疫肿瘤学公司

<120> 采用登革病毒和树突细胞进行癌症治疗的组合物和方法

<130> 48253-707.601

<140>

<141>

<150> 62/520,345

<151> 2017-06-15

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 1

Glu Gly Ser Arg Asn Gln Asp Trp Leu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 2

Thr Ala Tyr Arg Tyr His Leu Leu

1 5

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 3

ggatcccaag aaggggccat 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 4

ggcagctcca tagattgct 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 5

ggtgttgctg cagatggaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 6

gtgtcacaga cagtgaggt 19

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 7

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 8

<211> 10735

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 8

agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60

ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggg 120

tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180

ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctttc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240

ttttatagca ttcctaagat ttctagccat acctccaaca gcaggaattt tggctagatg 300

gggctcattc aagaagaatg gagcgatcaa agtgttacgg ggtttcaaga aagaaatctc 360

aaacatgttg aacataatga acaggaggaa aagatctgtg accatgctcc tcatgctgct 420

gcccacagcc ctggcgttcc atctgaccac ccgaggggga gagccgcaca tgatagttag 480

caagcaggaa agaggaaaat cacttttgtt taagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540

ccttattgca atggatttgg gagagttatg tgaggacaca atgacctaca aatgcccccg 600

gatcactgag acggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg agacatgggt 660

gacctatgga acatgttctc aaactggtga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcact 720

ggcaccacac gtagggcttg gtctagaaac aagaaccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780

cgcttggaaa caaatacaaa aagtggagac ctgggctctg agacacccag gattcacggt 840

gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggatcatttt 900

tattttgctg atgctggtaa ctccatccat ggccatgcgg tgcgtgggaa taggcaacag 960

agacttcgtg gaaggactgt caggagctac gtgggtggat gtggtactgg agcatggaag 1020

ttgcgtcact accatggcaa aagacaaacc aacactggac attgaactct tgaagacgga 1080

ggtcacaaac cctgccgtcc tgcgcaaact gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140

caccgattcg agatgtccaa cacaaggaga agccacgctg gtggaagaac aggacacgaa 1200

ctttgtgtgt cgacgaacgt tcgtggacag aggctggggc aatggttgtg ggctattcgg 1260

aaaaggtagc ttaataacgt gtgctaagtt taagtgtgtg acaaaactgg aaggaaagat 1320

agtccaatat gaaaacttaa aatattcagt gatagtcacc gtacacactg gagaccagca 1380

ccaagttgga aatgagacca cagaacatgg aacaactgca accataacac ctcaagctcc 1440

cacgtcggaa atacagctga cagactacgg agctctaaca ttggattgtt cacctagaac 1500

agggctagac tttaatgaga tggtgttgtt gacaatgaaa aaaaaatcat ggctcgtcca 1560

caaacaatgg tttctagact taccactgcc ttggacctcg ggggcttcaa catcccaaga 1620

gacttggaat agacaagact tgctggtcac atttaagaca gctcatgcaa aaaagcagga 1680

agtagtcgta ctaggatcac aagaaggagc aatgcacact gcgttgactg gagcgacaga 1740

aatccaaacg tctggaacga caacaatttt tgcaggacac ctgaaatgca gattaaaaat 1800

ggataaactg attttaaaag ggatgtcata tgtaatgtgc acagggtcat tcaagttaga 1860

gaaggaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctagtg caggttaaat acgaaggaac 1920

agatgcacca tgcaagatcc ccttctcgtc ccaagatgag aagggagtaa cccagaatgg 1980

gagattgata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca acattgaagc 2040

ggagccacct tttggtgaga gctacattgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100

aagctggttc aagaagggaa gcagtatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgtggagc 2160

acgaaggatg gccatcctgg gagacactgc atgggacttc ggttctatag gaggggtgtt 2220

cacgtctgtg ggaaaactga tacaccagat ttttgggact gcgtatggag ttttgttcag 2280

cggtgtttct tggaccatga agataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340

ctcaaggagc acgtcccttt caatgacgtg tatcgcagtt ggcatggtca cactgtacct 2400

aggagtcatg gttcaggcgg actcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaactcaa 2460

atgtggaagc ggcatttttg tcaccaatga agtccacacc tggacagagc aatataaatt 2520

ccaggccgac tcccctaaga gactatcagc ggccattggg aaggcatggg aggagggtgt 2580

gtgtggaatt cgatcagcca ctcgtctcga gaacatcatg tggaagcaaa tatcaaatga 2640

attaaaccac atcttacttg aaaatgacat gaaatttaca gtggtcgtag gagacgttag 2700

tggaatcttg gcccaaggaa agaaaatgat taggccacaa cccatggaac acaaatactc 2760

gtggaaaagc tggggaaaag ccaaaatcat aggagcagat gtacagaata ccaccttcat 2820

catcgacggc ccaaacaccc cagaatgccc tgataaccaa agagcatgga acatttggga 2880

agttgaagac tatggatttg gaattttcac gacaaacata tggttgaaat tgcgtgactc 2940

ctacactcaa gtgtgtgacc accggctaat gtcagctgcc atcaaggata gcaaagcagt 3000

ccatgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacttgga agttggcaag 3060

agcctccttc atagaagtta agacatgcat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120

tggagtcctg gaaagtgaga tgataatccc aaagatatat ggaggaccaa tatctcagca 3180

caactacaga ccaggatatt tcacacaaac agcagggccg tggcacttgg gcaagttaga 3240

actagatttt gatttatgtg aaggtaccac tgttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3300

aggaccatct cttagaacca caacagtcac aggaaagaca atccatgaat ggtgctgtag 3360

atcttgcacg ttaccccccc tacgtttcaa aggagaagac gggtgctggt acggcatgga 3420

aatcagacca gtcaaggaga aggaagagaa cctagttaag tcaatggtct ctgcagggtc 3480

aggagaagtg gacagttttt cactaggact gctatgcata tcaataatga tcgaagaggt 3540

aatgagatcc agatggagca gaaaaatgct gatgactgga acattggctg tgttcctcct 3600

tctcacaatg ggacaattga catggaatga tctgatcagg ctatgtatca tggttggagc 3660

caacgcttca gacaagatgg ggatgggaac aacgtaccta gctttgatgg ccactttcag 3720

aatgagacca atgttcgcag tcgggctact gtttcgcaga ttaacatcta gagaagttct 3780

tcttcttaca gttggattga gtctggtggc atctgtagaa ctaccaaatt ccttagagga 3840

gctaggggat ggacttgcaa tgggcatcat gatgttgaaa ttactgactg attttcagtc 3900

acatcagcta tgggctacct tgctgtcttt aacatttgtc aaaacaactt tttcattgca 3960

ctatgcatgg aagacaatgg ctatgatact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020

gtccacgact tctcaaaaaa caacatggct tccggtgttg ctgggatctc ttggatgcaa 4080

accactaacc atgtttctta taacagaaaa caaaatctgg ggaaggaaaa gctggcctct 4140

caatgaagga attatggctg ttggaatagt tagcattctt ctaagttcac ttctcaagaa 4200

tgatgtgcca ctagctggcc cactaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgtcat 4260

atctggaagc tcggccgatt tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaagaaga 4320

agcagaacac tctggtgcct cacacaacat actagtggag gtccaagatg atggaaccat 4380

gaagataaag gatgaagaga gagatgacac actcaccatt ctcctcaaag caactctgct 4440

agcaatctca ggggtatacc caatgtcaat accggcgacc ctctttgtgt ggtatttttg 4500

gcagaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccctc cagaagtgga 4560

aagagcagtc cttgatgatg gcatttatag aattctccaa agaggattgt tgggcaggtc 4620

tcaagtagga gtaggagttt ttcaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcaccag 4680

gggagctgtc ctcatgtacc aagggaagag actggaacca agttgggcca gtgtcaaaaa 4740

agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaacg cgggagaaga 4800

agtgcaggtg attgctgttg aaccggggaa gaaccccaaa aatgtacaga cagcgccggg 4860

taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagct ctagacttta aacccggcac 4920

atctggatct cctatcgtga acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980

ggtgacaaca agtggtacct acgtcagtgc catagctcaa gctaaagcat cacaagaagg 5040

gcctctacca gagattgagg acgaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100

acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160

aagaaagctg cgcacgctag tcttagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220

ggcgctcaag ggaatgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacggg 5280

aaaggagata gttgacctta tgtgtcacgc cactttcact atgcgtctcc tgtctcctgt 5340

gagagttccc aattataata tgattatcat ggatgaagca cattttaccg atccagccag 5400

catagcagcc agagggtata tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatttt 5460

catgacagcc actccccccg gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg cagttatcca 5520

agatgaggaa agagacattc ctgaaagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580

tttcccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640

ctgtttaaga aagaatggga aacgggtggt ccaattgagc agaaaaactt ttgacactga 5700

gtaccagaaa acaaaaaata acgactggga ctatgttgtc acaacagaca tatccgaaat 5760

gggagcaaac ttccgagccg acagggtaat agacccgagg cggtgcctga aaccggtaat 5820

actaaaagat ggcccagagc gtgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggctag 5880

cgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaaccaaaat aaggaaggcg atcagtatat 5940

ttacatggga cagcctctaa acaatgatga ggaccacgcc cattggacag aagcaaaaat 6000

gctccttgac aacataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccggagag 6060

agaaaagagt gcagcaatag acggggaata cagactacgg ggtgaagcga ggaaaacgtt 6120

cgtggagctc atgagaagag gagatctacc tgtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180

aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg ctttgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240

ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300

ccgctggctg gatgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgaat tcaaagagtt 6360

cgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420

acatttaacg caaagggccc agaacgcctt ggacaatctg gttatgttgc acaactctga 6480

acaaggagga aaagcctata gacacgccat ggaagaacta ccagacacca tagaaacgtt 6540

aatgctccta gctttgatag ctgtgctgac tggtggagtg acgttgttct tcctatcagg 6600

aaggggtcta ggaaaaacat ccattggcct actctgcgtg attgcctcaa gtgcactgtt 6660

atggatggcc agtgtggaac cccattggat agcggcctct atcatactgg agttctttct 6720

gatggtgttg cttattccag agccggacag acagcgcact ccacaagaca accagctagc 6780

atacgtggtg ataggtctgt tattcatgat attgacagtg gcagccaatg agatgggatt 6840

actggaaacc acaaagaagg acctggggat tggtcatgca gctgctgaaa accaccatca 6900

tgctgcaatg ctggacgtag acctacatcc agcttcagcc tggactctct atgcagtggc 6960

cacaacaatt atcactccca tgatgagaca cacaattgaa aacacaacgg caaatatttc 7020

cctgacagct attgcaaacc aggcagctat attgatggga cttgacaagg gatggccaat 7080

atcaaagatg gacataggag ttccacttct cgccttgggg tgctattctc aggtgaaccc 7140

gctgacgctg acagcggcgg tattgatgct agtggctcat tatgccataa ttggacccgg 7200

actgcaagca aaagctacta gagaagctca aaaaaggaca gcagccggaa taatgaaaaa 7260

cccaactgtc gacgggatcg ttgcaataga tttggaccct gtggtttacg atgcaaaatt 7320

tgaaaaacag ctaggccaaa taatgttgtt gatactttgc acatcacaga tcctcctgat 7380

gcggaccaca tgggccttgt gtgaatccat cacactagcc actggacctc tgactacgct 7440

ttgggaggga tctccaggaa aattctggaa caccacgata gcggtgtcca tggcaaacat 7500

ttttagggga agttatctag caggagcagg tctggccttt tcattaatga aatctctagg 7560

aggaggtagg agaggcacgg gagcccaagg ggaaacactg ggagaaaaat ggaaaagaca 7620

gctaaaccaa ttgagcaagt cagaattcaa cacttacaaa aggagtggga ttatagaggt 7680

ggatagatct gaagccaaag aggggttaaa aagaggagaa acgactaaac acgcagtgtc 7740

gagaggaacg gccaaactga ggtggtttgt ggagaggaac cttgtgaaac cagaagggaa 7800

agtcatagac ctcggttgtg gaagaggtgg ctggtcatat tattgcgctg ggctgaagaa 7860

agtcacagaa gtgaaaggat acacgaaagg aggacctgga catgaggaac caatcccaat 7920

ggcaacctat ggatggaacc tagtaaagct atactccggg aaagatgtat tctttacacc 7980

acctgagaaa tgtgacaccc tcttgtgtga tattggtgag tcctctccga acccaactat 8040

agaagaagga agaacgttac gtgttctaaa gatggtggaa ccatggctca gaggaaacca 8100

attttgcata aaaattctaa atccctatat gccgagtgtg gtagaaactt tggagcaaat 8160

gcaaagaaaa catggaggaa tgctagtgcg aaatccactc tcaagaaact ccactcatga 8220

aatgtactgg gtttcatgtg gaacaggaaa cattgtgtca gcagtaaaca tgacatctag 8280

aatgctgcta aatcgattca caatggctca caggaagcca acatatgaaa gagacgtgga 8340

cttaggcgct ggaacaagac atgtggcagt agaaccagag gtggccaacc tagatatcat 8400

tggccagagg atagagaata taaaaaatga acacaaatca acatggcatt atgatgagga 8460

caatccatac aaaacatggg cctatcatgg atcatatgag gtcaagccat caggatcagc 8520

ctcatccatg gtcaatggtg tggtgagact gctaaccaaa ccatgggatg tcattcccat 8580

ggtcacacaa atagccatga ctgacaccac accctttgga caacagaggg tgtttaaaga 8640

gaaagttgac acgcgtacac caaaagcgaa acgaggcaca gcacaaatta tggaggtgac 8700

agccaggtgg ttatggggtt ttctctctag aaacaaaaaa cccagaatct gcacaagaga 8760

ggagttcaca agaaaagtca ggtcaaacgc agctattgga gcagtgttcg ttgatgaaaa 8820

tcaatggaac tcagcaaaag aggcagtgga agatgaacgg ttctgggacc ttgtgcacag 8880

agagagggag cttcataaac aaggaaaatg tgccacgtgt gtctacaaca tgatgggaaa 8940

gagagagaaa aaattaggag agttcggaaa ggcaaaagga agtcgcgcaa tatggtacat 9000

gtggttggga gcgcgctttt tagagtttga agcccttggt ttcatgaatg aagatcactg 9060

gttcagcaga gagaattcac tcagtggagt ggaaggagaa ggactccaca aacttggata 9120

catactcaga gacatatcaa agattccagg gggaaatatg tatgcagatg acacagccgg 9180

atgggacaca agaataacag aggatgatct tcagaatgag gccaaaatca ctgacatcat 9240

ggaacctgaa catgccctat tggccacgtc aatctttaag ctaacctacc aaaacaaggt 9300

agtaagggtg cagagaccag cgaaaaatgg aaccgtgatg gatgtcatat ccagacgtga 9360

ccagagagga agtggacagg ttggaaccta tggcttaaac accttcacca acatggaggc 9420

ccaactaata agacaaatgg agtctgaggg aatcttttca cccagcgaat tggaaacccc 9480

aaatctagcc gaaagagtcc tcgactggtt gaaaaaacat ggcaccgaga ggctgaaaag 9540

aatggcaatc agtggagatg actgtgtggt gaaaccaatc gatgacagat ttgcaacagc 9600

cttaacagct ttgaatgaca tgggaaaggt aagaaaagac ataccgcaat gggaaccttc 9660

aaaaggatgg aatgattggc aacaagtgcc tttctgttca caccatttcc accagctgat 9720

tatgaaggat gggagggaga tagtggtgcc atgccgcaac caagatgaac ttgtaggtag 9780

ggccagagta tcacaaggcg ccggatggag cttgagagaa actgcatgcc taggcaagtc 9840

atatgcacaa atgtggcagc tgatgtactt ccacaggaga gacttgagat tagcggctaa 9900

tgctatctgt tcagccgttc cagttgattg ggtcccaacc agccgcacca cctggtcgat 9960

ccatgcccac catcaatgga tgacaacaga agacatgttg tcagtgtgga atagggtttg 10020

gatagaggaa aacccatgga tggaggacaa gactcatgtg tccagttggg aagacgttcc 10080

atacctagga aaaagggaag atcaatggtg tggttcccta ataggcttaa cagcacgagc 10140

cacctgggcc accaacatac aagtggccat aaaccaagtg agaaggctca ttgggaatga 10200

gaattatcta gacttcatga catcaatgaa gagattcaaa aacgagagtg atcccgaagg 10260

ggcactctgg taagccaact cattcacaaa ataaaggaaa ataaaaaatc aaacaaggca 10320

agaagtcagg ccggattaag ccatagcacg gtaagagcta tgctgcctgt gagccccgtc 10380

caaggacgta aaatgaagtc aggccgaaag ccacggttcg agcaagccgt gctgcctgta 10440

gctccatcgt ggggatgtaa aaacccggga ggctgcaaac catggaagct gtacgcatgg 10500

ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560

acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcac 10620

aacaacaaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680

attccaggca cagaacgcca aaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735

<210> 9

<211> 3392

<212> PRT

<213> 登革病毒

<400> 9

Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Thr Gly Arg Pro Ser Phe Asn Met Leu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Ser Gln Leu Ala Lys Arg

20 25 30

Phe Ser Lys Gly Leu Leu Ser Gly Gln Gly Pro Met Lys Leu Val Met

35 40 45

Ala Phe Ile Ala Phe Leu Arg Phe Leu Ala Ile Pro Pro Thr Ala Gly

50 55 60

Ile Leu Ala Arg Trp Gly Ser Phe Lys Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val

65 70 75 80

Leu Arg Gly Phe Lys Lys Glu Ile Ser Asn Met Leu Asn Ile Met Asn

85 90 95

Arg Arg Lys Arg Ser Val Thr Met Leu Leu Met Leu Leu Pro Thr Ala

100 105 110

Leu Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly

130 135 140

Val Asn Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu

145 150 155 160

Asp Thr Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Thr Glu Pro Asp

165 170 175

Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Ala Thr Glu Thr Trp Val Thr Tyr Gly

180 185 190

Thr Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala

195 200 205

Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp

210 215 220

Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp

225 230 235 240

Ala Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Val Ile Ala Leu Phe Leu Ala His

245 250 255

Ala Ile Gly Thr Ser Ile Thr Gln Lys Gly Ile Ile Phe Ile Leu Leu

260 265 270

Met Leu Val Thr Pro Ser Met Ala Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn

275 280 285

Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val

290 295 300

Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr

305 310 315 320

Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu

325 330 335

Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser

340 345 350

Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr

355 360 365

Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly

370 375 380

Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys

385 390 395 400

Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys

405 410 415

Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly

420 425 430

Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala

435 440 445

Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp

450 455 460

Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr

465 470 475 480

Met Lys Lys Lys Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu

485 490 495

Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn

500 505 510

Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln

515 520 525

Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu

530 535 540

Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala

545 550 555 560

Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ile Leu Lys Gly

565 570 575

Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val

580 585 590

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly

595 600 605

Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly

610 615 620

Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp

625 630 635 640

Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser

645 650 655

Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe

660 665 670

Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly

675 680 685

Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser

690 695 700

Ile Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe

705 710 715 720

Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys

725 730 735

Ile Gly Ile Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser

740 745 750

Thr Ser Leu Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr

755 760 765

Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys

770 775 780

Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val

785 790 795 800

His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg

805 810 815

Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile

820 825 830

Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn

835 840 845

Glu Leu Asn His Ile Leu Leu Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val

850 855 860

Val Gly Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg

865 870 875 880

Pro Gln Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala

885 890 895

Lys Ile Ile Gly Ala Asp Val Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly

900 905 910

Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro Asp Asn Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp

915 920 925

Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu

930 935 940

Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr Gln Val Cys Asp His Arg Leu Met Ser

945 950 955 960

Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp

965 970 975

Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe

980 985 990

Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser

995 1000 1005

Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly

1010 1015 1020

Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln

1025 1030 1035

Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp

1040 1045 1050

Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp Glu His Cys Gly Asn

1055 1060 1065

Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr Gly Lys Thr Ile

1070 1075 1080

His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Phe

1085 1090 1095

Lys Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Val

1100 1105 1110

Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala Gly

1115 1120 1125

Ser Gly Glu Val Asp Ser Phe Ser Leu Gly Leu Leu Cys Ile Ser

1130 1135 1140

Ile Met Ile Glu Glu Val Met Arg Ser Arg Trp Ser Arg Lys Met

1145 1150 1155

Leu Met Thr Gly Thr Leu Ala Val Phe Leu Leu Leu Thr Met Gly

1160 1165 1170

Gln Leu Thr Trp Asn Asp Leu Ile Arg Leu Cys Ile Met Val Gly

1175 1180 1185

Ala Asn Ala Ser Asp Lys Met Gly Met Gly Thr Thr Tyr Leu Ala

1190 1195 1200

Leu Met Ala Thr Phe Arg Met Arg Pro Met Phe Ala Val Gly Leu

1205 1210 1215

Leu Phe Arg Arg Leu Thr Ser Arg Glu Val Leu Leu Leu Thr Val

1220 1225 1230

Gly Leu Ser Leu Val Ala Ser Val Glu Leu Pro Asn Ser Leu Glu

1235 1240 1245

Glu Leu Gly Asp Gly Leu Ala Met Gly Ile Met Met Leu Lys Leu

1250 1255 1260

Leu Thr Asp Phe Gln Ser His Gln Leu Trp Ala Thr Leu Leu Ser

1265 1270 1275

Leu Thr Phe Val Lys Thr Thr Phe Ser Leu His Tyr Ala Trp Lys

1280 1285 1290

Thr Met Ala Met Ile Leu Ser Ile Val Ser Leu Phe Pro Leu Cys

1295 1300 1305

Leu Ser Thr Thr Ser Gln Lys Thr Thr Trp Leu Pro Val Leu Leu

1310 1315 1320

Gly Ser Leu Gly Cys Lys Pro Leu Thr Met Phe Leu Ile Thr Glu

1325 1330 1335

Asn Lys Ile Trp Gly Arg Lys Ser Trp Pro Leu Asn Glu Gly Ile

1340 1345 1350

Met Ala Val Gly Ile Val Ser Ile Leu Leu Ser Ser Leu Leu Lys

1355 1360 1365

Asn Asp Val Pro Leu Ala Gly Pro Leu Ile Ala Gly Gly Met Leu

1370 1375 1380

Ile Ala Cys Tyr Val Ile Ser Gly Ser Ser Ala Asp Leu Ser Leu

1385 1390 1395

Glu Lys Ala Ala Glu Val Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu His Ser

1400 1405 1410

Gly Ala Ser His Asn Ile Leu Val Glu Val Gln Asp Asp Gly Thr

1415 1420 1425

Met Lys Ile Lys Asp Glu Glu Arg Asp Asp Thr Leu Thr Ile Leu

1430 1435 1440

Leu Lys Ala Thr Leu Leu Ala Ile Ser Gly Val Tyr Pro Met Ser

1445 1450 1455

Ile Pro Ala Thr Leu Phe Val Trp Tyr Phe Trp Gln Lys Lys Lys

1460 1465 1470

Gln Arg Ser Gly Val Leu Trp Asp Thr Pro Ser Pro Pro Glu Val

1475 1480 1485

Glu Arg Ala Val Leu Asp Asp Gly Ile Tyr Arg Ile Leu Gln Arg

1490 1495 1500

Gly Leu Leu Gly Arg Ser Gln Val Gly Val Gly Val Phe Gln Glu

1505 1510 1515

Gly Val Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Val Leu

1520 1525 1530

Met Tyr Gln Gly Lys Arg Leu Glu Pro Ser Trp Ala Ser Val Lys

1535 1540 1545

Lys Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Trp Arg Phe Gln Gly Ser

1550 1555 1560

Trp Asn Ala Gly Glu Glu Val Gln Val Ile Ala Val Glu Pro Gly

1565 1570 1575

Lys Asn Pro Lys Asn Val Gln Thr Ala Pro Gly Thr Phe Lys Thr

1580 1585 1590

Pro Glu Gly Glu Val Gly Ala Ile Ala Leu Asp Phe Lys Pro Gly

1595 1600 1605

Thr Ser Gly Ser Pro Ile Val Asn Arg Glu Gly Lys Ile Val Gly

1610 1615 1620

Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Thr Thr Ser Gly Thr Tyr Val Ser

1625 1630 1635

Ala Ile Ala Gln Ala Lys Ala Ser Gln Glu Gly Pro Leu Pro Glu

1640 1645 1650

Ile Glu Asp Glu Val Phe Arg Lys Arg Asn Leu Thr Ile Met Asp

1655 1660 1665

Leu His Pro Gly Ser Gly Lys Thr Arg Arg Tyr Leu Pro Ala Ile

1670 1675 1680

Val Arg Glu Ala Ile Lys Arg Lys Leu Arg Thr Leu Val Leu Ala

1685 1690 1695

Pro Thr Arg Val Val Ala Ser Glu Met Ala Glu Ala Leu Lys Gly

1700 1705 1710

Met Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Thr Ala Val Lys Ser Glu His Thr

1715 1720 1725

Gly Lys Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Met

1730 1735 1740

Arg Leu Leu Ser Pro Val Arg Val Pro Asn Tyr Asn Met Ile Ile

1745 1750 1755

Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg

1760 1765 1770

Gly Tyr Ile Ser Thr Arg Val Gly Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile

1775 1780 1785

Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Glu Ala Phe Pro Gln

1790 1795 1800

Ser Asn Ala Val Ile Gln Asp Glu Glu Arg Asp Ile Pro Glu Arg

1805 1810 1815

Ser Trp Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Ile Thr Asp Phe Pro Gly Lys

1820 1825 1830

Thr Val Trp Phe Val Pro Ser Ile Lys Ser Gly Asn Asp Ile Ala

1835 1840 1845

Asn Cys Leu Arg Lys Asn Gly Lys Arg Val Val Gln Leu Ser Arg

1850 1855 1860

Lys Thr Phe Asp Thr Glu Tyr Gln Lys Thr Lys Asn Asn Asp Trp

1865 1870 1875

Asp Tyr Val Val Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe

1880 1885 1890

Arg Ala Asp Arg Val Ile Asp Pro Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val

1895 1900 1905

Ile Leu Lys Asp Gly Pro Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met

1910 1915 1920

Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly

1925 1930 1935

Arg Asn Gln Asn Lys Glu Gly Asp Gln Tyr Ile Tyr Met Gly Gln

1940 1945 1950

Pro Leu Asn Asn Asp Glu Asp His Ala His Trp Thr Glu Ala Lys

1955 1960 1965

Met Leu Leu Asp Asn Ile Asn Thr Pro Glu Gly Ile Ile Pro Ala

1970 1975 1980

Leu Phe Glu Pro Glu Arg Glu Lys Ser Ala Ala Ile Asp Gly Glu

1985 1990 1995

Tyr Arg Leu Arg Gly Glu Ala Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met

2000 2005 2010

Arg Arg Gly Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Tyr Lys Val Ala Ser

2015 2020 2025

Glu Gly Phe Gln Tyr Ser Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Glu

2030 2035 2040

Arg Asn Asn Gln Val Leu Glu Glu Asn Met Asp Val Glu Ile Trp

2045 2050 2055

Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu Arg Pro Arg Trp Leu Asp

2060 2065 2070

Ala Arg Thr Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Leu Arg Glu Phe Lys Glu

2075 2080 2085

Phe Ala Ala Gly Arg Arg Ser Val Ser Gly Asp Leu Ile Leu Glu

2090 2095 2100

Ile Gly Lys Leu Pro Gln His Leu Thr Gln Arg Ala Gln Asn Ala

2105 2110 2115

Leu Asp Asn Leu Val Met Leu His Asn Ser Glu Gln Gly Gly Lys

2120 2125 2130

Ala Tyr Arg His Ala Met Glu Glu Leu Pro Asp Thr Ile Glu Thr

2135 2140 2145

Leu Met Leu Leu Ala Leu Ile Ala Val Leu Thr Gly Gly Val Thr

2150 2155 2160

Leu Phe Phe Leu Ser Gly Arg Gly Leu Gly Lys Thr Ser Ile Gly

2165 2170 2175

Leu Leu Cys Val Ile Ala Ser Ser Ala Leu Leu Trp Met Ala Ser

2180 2185 2190

Val Glu Pro His Trp Ile Ala Ala Ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe

2195 2200 2205

Leu Met Val Leu Leu Ile Pro Glu Pro Asp Arg Gln Arg Thr Pro

2210 2215 2220

Gln Asp Asn Gln Leu Ala Tyr Val Val Ile Gly Leu Leu Phe Met

2225 2230 2235

Ile Leu Thr Val Ala Ala Asn Glu Met Gly Leu Leu Glu Thr Thr

2240 2245 2250

Lys Lys Asp Leu Gly Ile Gly His Ala Ala Ala Glu Asn His His

2255 2260 2265

His Ala Ala Met Leu Asp Val Asp Leu His Pro Ala Ser Ala Trp

2270 2275 2280

Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr Thr Ile Ile Thr Pro Met Met Arg

2285 2290 2295

His Thr Ile Glu Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser Leu Thr Ala Ile

2300 2305 2310

Ala Asn Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly Leu Asp Lys Gly Trp Pro

2315 2320 2325

Ile Ser Lys Met Asp Ile Gly Val Pro Leu Leu Ala Leu Gly Cys

2330 2335 2340

Tyr Ser Gln Val Asn Pro Leu Thr Leu Thr Ala Ala Val Leu Met

2345 2350 2355

Leu Val Ala His Tyr Ala Ile Ile Gly Pro Gly Leu Gln Ala Lys

2360 2365 2370

Ala Thr Arg Glu Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys

2375 2380 2385

Asn Pro Thr Val Asp Gly Ile Val Ala Ile Asp Leu Asp Pro Val

2390 2395 2400

Val Tyr Asp Ala Lys Phe Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ile Met Leu

2405 2410 2415

Leu Ile Leu Cys Thr Ser Gln Ile Leu Leu Met Arg Thr Thr Trp

2420 2425 2430

Ala Leu Cys Glu Ser Ile Thr Leu Ala Thr Gly Pro Leu Thr Thr

2435 2440 2445

Leu Trp Glu Gly Ser Pro Gly Lys Phe Trp Asn Thr Thr Ile Ala

2450 2455 2460

Val Ser Met Ala Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala

2465 2470 2475

Gly Leu Ala Phe Ser Leu Met Lys Ser Leu Gly Gly Gly Arg Arg

2480 2485 2490

Gly Thr Gly Ala Gln Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Arg

2495 2500 2505

Gln Leu Asn Gln Leu Ser Lys Ser Glu Phe Asn Thr Tyr Lys Arg

2510 2515 2520

Ser Gly Ile Ile Glu Val Asp Arg Ser Glu Ala Lys Glu Gly Leu

2525 2530 2535

Lys Arg Gly Glu Thr Thr Lys His Ala Val Ser Arg Gly Thr Ala

2540 2545 2550

Lys Leu Arg Trp Phe Val Glu Arg Asn Leu Val Lys Pro Glu Gly

2555 2560 2565

Lys Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr

2570 2575 2580

Cys Ala Gly Leu Lys Lys Val Thr Glu Val Lys Gly Tyr Thr Lys

2585 2590 2595

Gly Gly Pro Gly His Glu Glu Pro Ile Pro Met Ala Thr Tyr Gly

2600 2605 2610

Trp Asn Leu Val Lys Leu Tyr Ser Gly Lys Asp Val Phe Phe Thr

2615 2620 2625

Pro Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser

2630 2635 2640

Ser Pro Asn Pro Thr Ile Glu Glu Gly Arg Thr Leu Arg Val Leu

2645 2650 2655

Lys Met Val Glu Pro Trp Leu Arg Gly Asn Gln Phe Cys Ile Lys

2660 2665 2670

Ile Leu Asn Pro Tyr Met Pro Ser Val Val Glu Thr Leu Glu Gln

2675 2680 2685

Met Gln Arg Lys His Gly Gly Met Leu Val Arg Asn Pro Leu Ser

2690 2695 2700

Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Cys Gly Thr Gly

2705 2710 2715

Asn Ile Val Ser Ala Val Asn Met Thr Ser Arg Met Leu Leu Asn

2720 2725 2730

Arg Phe Thr Met Ala His Arg Lys Pro Thr Tyr Glu Arg Asp Val

2735 2740 2745

Asp Leu Gly Ala Gly Thr Arg His Val Ala Val Glu Pro Glu Val

2750 2755 2760

Ala Asn Leu Asp Ile Ile Gly Gln Arg Ile Glu Asn Ile Lys Asn

2765 2770 2775

Glu His Lys Ser Thr Trp His Tyr Asp Glu Asp Asn Pro Tyr Lys

2780 2785 2790

Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Val Lys Pro Ser Gly Ser

2795 2800 2805

Ala Ser Ser Met Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Thr Lys Pro

2810 2815 2820

Trp Asp Val Ile Pro Met Val Thr Gln Ile Ala Met Thr Asp Thr

2825 2830 2835

Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr

2840 2845 2850

Arg Thr Pro Lys Ala Lys Arg Gly Thr Ala Gln Ile Met Glu Val

2855 2860 2865

Thr Ala Arg Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ser Arg Asn Lys Lys Pro

2870 2875 2880

Arg Ile Cys Thr Arg Glu Glu Phe Thr Arg Lys Val Arg Ser Asn

2885 2890 2895

Ala Ala Ile Gly Ala Val Phe Val Asp Glu Asn Gln Trp Asn Ser

2900 2905 2910

Ala Lys Glu Ala Val Glu Asp Glu Arg Phe Trp Asp Leu Val His

2915 2920 2925

Arg Glu Arg Glu Leu His Lys Gln Gly Lys Cys Ala Thr Cys Val

2930 2935 2940

Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Gly Glu Phe Gly

2945 2950 2955

Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala

2960 2965 2970

Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Met Asn Glu Asp His

2975 2980 2985

Trp Phe Ser Arg Glu Asn Ser Leu Ser Gly Val Glu Gly Glu Gly

2990 2995 3000

Leu His Lys Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Asp Ile Ser Lys Ile Pro

3005 3010 3015

Gly Gly Asn Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg

3020 3025 3030

Ile Thr Glu Asp Asp Leu Gln Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp Ile

3035 3040 3045

Met Glu Pro Glu His Ala Leu Leu Ala Thr Ser Ile Phe Lys Leu

3050 3055 3060

Thr Tyr Gln Asn Lys Val Val Arg Val Gln Arg Pro Ala Lys Asn

3065 3070 3075

Gly Thr Val Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser

3080 3085 3090

Gly Gln Val Gly Thr Tyr Gly Leu Asn Thr Phe Thr Asn Met Glu

3095 3100 3105

Ala Gln Leu Ile Arg Gln Met Glu Ser Glu Gly Ile Phe Ser Pro

3110 3115 3120

Ser Glu Leu Glu Thr Pro Asn Leu Ala Glu Arg Val Leu Asp Trp

3125 3130 3135

Leu Lys Lys His Gly Thr Glu Arg Leu Lys Arg Met Ala Ile Ser

3140 3145 3150

Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala Thr

3155 3160 3165

Ala Leu Thr Ala Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Ile

3170 3175 3180

Pro Gln Trp Glu Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp Gln Gln Val

3185 3190 3195

Pro Phe Cys Ser His His Phe His Gln Leu Ile Met Lys Asp Gly

3200 3205 3210

Arg Glu Ile Val Val Pro Cys Arg Asn Gln Asp Glu Leu Val Gly

3215 3220 3225

Arg Ala Arg Val Ser Gln Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Glu Thr

3230 3235 3240

Ala Cys Leu Gly Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Met Tyr

3245 3250 3255

Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Ala Ala Asn Ala Ile Cys Ser

3260 3265 3270

Ala Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Ser Arg Thr Thr Trp Ser

3275 3280 3285

Ile His Ala His His Gln Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Ser

3290 3295 3300

Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Pro Trp Met Glu Asp

3305 3310 3315

Lys Thr His Val Ser Ser Trp Glu Asp Val Pro Tyr Leu Gly Lys

3320 3325 3330

Arg Glu Asp Gln Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly Leu Thr Ala Arg

3335 3340 3345

Ala Thr Trp Ala Thr Asn Ile Gln Val Ala Ile Asn Gln Val Arg

3350 3355 3360

Arg Leu Ile Gly Asn Glu Asn Tyr Leu Asp Phe Met Thr Ser Met

3365 3370 3375

Lys Arg Phe Lys Asn Glu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Leu Trp

3380 3385 3390

Claims (42)

1.一种治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：

a)向有需要的受试者施用登革病毒，其中该受试者患有黑素瘤；以及

b)将经引发的树突细胞施用于所述受试者，其中所述经引发的树突细胞通过使树突细胞与肿瘤抗原接触而产生。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。

4.根据权利要求1所述的方法，其包括在施用一定剂量的登革病毒之前至少一周从所述受试者获得所述树突细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒以约30,000PFU/mL的浓度施用。

9.根据权利要求1所述的方法，其包括在施用一定剂量的登革病毒后4天至10天施用经引发的树突细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中皮下施用所述登革病毒。

11.根据权利要求1所述的方法，其中经由肿瘤内注射施用所述登革病毒。

12.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述受试者表现出发热症状时施用经引发的树突细胞。

13.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述受试者已达到101°F的体温时施用经引发的树突细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，其包括在第一时间向所述受试者施用第一份经引发的树突细胞，并且在第二时间施用第二份经引发的树突细胞。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一时间和所述第二时间相隔至多30天。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一时间和所述第二时间相隔约3天。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一份经引发的树突细胞中经引发的树突细胞的数目为10⁴个细胞至10⁸个细胞。

18.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一份经引发的树突细胞和第二份经引发的树突细胞之每一个中经引发的树突细胞的总数为10⁶个细胞至10⁹个细胞。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是同种异体的。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是自体的。

21.根据权利要求1所述的方法，其包括从所述受试者获得树突细胞。

22.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤裂解物接触。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约16ng/mL IL-12p70。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约29ng/mL IL-12p70。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒是血清型1、2、3、4或5。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒是DENV2#1710。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒是DENV1#45AZ5。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述登革病毒是S16803、HON 1991C、HON 1991D、HON 1991B、HON 1991A、SAL 1987、TRI 1981、PR 1969、IND 1957、TRI 1953、TSV01、DS09-280106、DS31-291005、1349、GD01/03、44、43、China 04、FJ11/99、FJ-10、QHD13CAIQ、CO/BID-V3358、FJ/UH21/1971、GU/BID-V2950、American Asian、GWL18、IN/BID-V2961、Od2112、RR44、1392、1016DN、1017DN、1070DN、98900663DHF、BA05i、1022DN、NGC、Pak-L-2011、Pak-K-2009、Pak-M-2011、PakL-2013、Pak—L-2011、Pak-L-2010、Pak-L-2008、PE/NFI1159、PE/IQA2080、SG/D2Y98P-PP1、SG/05K3295DK1、LK/BID/V2421、LK/BID-V2422、LK/BID-V2416、1222-DF-06、TW/BID-V5056、TH/BID-V3357、US/BID-V5412、US/BID-V5055、IQT1797、VN/BID-V735、US/Hawaii/1944、CH53489或341750。

29.一种治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：

a)向有需要的受试者施用DENV1#45AZ5，其中该受试者患有黑素瘤；

b)从所述受试者获得树突细胞；

c)使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤抗原接触，以生成经引发的树突细胞；以及

d)向所述受试者施用所述经引发的树突细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述DENV1#45AZ5以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述DENV1#45AZ5以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。

34.根据权利要求29所述的方法，其中所述DENV1#45AZ5以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。

35.根据权利要求29所述的方法，其中所述DENV1#45AZ5以约30,000PFU/mL的浓度施用。

36.一种治疗或减轻黑素瘤的方法，其包括：

a)向有需要的受试者施用DENV2#1710，其中该受试者患有黑素瘤；

b)从所述受试者获得树突细胞；

c)使所述树突细胞与来自所述受试者的肿瘤抗原接触，以生成经引发的树突细胞；以及

d)向所述受试者施用所述经引发的树突细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期黑素瘤。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述黑素瘤是晚期的，并且是III期或IV期黑素瘤。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述DENV2#1710以10⁴pfu至10⁸pfu的量施用。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述DENV2#1710以10⁵pfu至10⁷pfu的量施用。

41.根据权利要求36所述的方法，其中所述DENV2#1710以10,000PFU/mL至90,000PFU/mL的浓度施用。

42.根据权利要求36所述的方法，其中所述DENV2#1710以约30,000PFU/mL的浓度施用。

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