CN110988308A - 一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法 - Google Patents

一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于土壤硝化技术领域，具体涉及一种可同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，包括以下步骤：S1、将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵，密封反应器，在黑暗环境下恒温震荡，分别于第2h、4h、15h、22h、24h吸取土壤悬浮液，过滤离心，测定硝态氮浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为土壤硝化潜势；S2、将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵，密封反应器，加入乙炔气体，在黑暗环境下恒温震荡，其它步骤同上，测定加入乙炔后的土壤硝化潜势；S3、将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵，密封反应器，加入辛炔气体，在黑暗环境下恒温震荡，其它步骤同上，测定加入辛炔后的土壤硝化潜势。

Description

一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法
技术领域
本发明属于土壤硝化技术领域，具体涉及一种可同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法。
背景技术
硝化作用，即将氨氧化为硝酸盐的过程，是由微生物驱动的生物地球化学过程，可分为异养硝化和自养硝化两种类型，其中自养硝化是众多生物界硝化作用的主导。传统的自养硝化过程分为两步，第一步是由氨氧化微生物包括氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)完成的氨氧化作用，将NH4 +氧化成NO2 -；第二步是由亚硝酸盐氧化细菌(NOB)完成的亚硝酸盐氧化，将NO2 -氧化成NO3 -。土壤硝化作用是自然界中连接氧化态和还原态无机氮库的重要环节，在维持全球氮平衡中起着关键作用；且关于因硝化作用引起的环境污染问题，亦日益受到研究者们的重视，因此测定硝化作用有重要意义。
硝化潜势是表征土壤硝化作用强度的重要指标，现阶段测定土壤硝化潜势多采用土壤培养法，如张慧等(张慧,袁红朝,朱亦君,etal.不同利用方式对红壤坡地微生物多样性和硝化势的影响[J].生态学杂志,2011,30(06):1169-1176)一文中所采用的土壤培养法：称取新鲜土壤样品(相当于300g烘干土重)2份，以100mgN·kg－1烘干土重的比例加入(NH4)2SO4，调节土壤含水量至田间持水量的60％，装于500ml烧杯中，用锡箔纸封口，于25℃避光培养3周，每周测定土壤NO3 －-N含量(其间称重并定时补充失去的水分)，以培养时间为横坐标，以NO3 －-N含量为纵坐标，求出斜率，即土壤硝化势(mg·kg－1·d－1)。
现阶段的土壤培养法仅能得到土壤整体所具有的硝化潜势，不能区分测定异养硝化、自养硝化的硝化潜势，以及自养硝化中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的硝化潜势，具有一定局限性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种测定土壤硝化潜势的方法，该方法可同时获得土壤异养硝化和自养硝化的硝化潜势，以及自养硝化中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的硝化潜势，为土壤不同硝化作用的研究提供了便利。
本发明的上述发明目的通过以下技术方案来实现：一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，包括以下步骤：
S1、测定土壤整体硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，分别于第2h、4h、15h、22h、24h吸取土壤悬浮液，立即过滤离心，测定硝态氮浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为土壤硝化潜势；
S2、测定加入乙炔后的硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，加入乙炔气体，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，其它步骤同上，测定加入乙炔后的土壤硝化潜势；
S3、测定加入辛炔后的硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，加入辛炔气体，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，其它步骤同上，测定加入辛炔后的土壤硝化潜势。
氨单加氧酶是异养硝化过程中起催化作用的关键酶之一，乙炔可以特异性且不可逆地灭活氨单加氧酶：乙炔作为AMO底物，参与催化氧化，生成不饱和环氧化物(具有高活性)，其与异养硝化催化反应中的蛋白质(AMO的成分)发生共价结合从而抑制AMO的活性。因此在土壤中加入乙炔，土壤的自养硝化作用得到抑制，步骤S2测定的加入乙炔后的土壤硝化潜势，实际获得的是土壤的异养硝化潜势。
本发明步骤S3中加入的辛炔，经发明人试验发现，对土壤环境中的AOB具有明显的抑制作用，但是对AOA无影响。因此在土壤中加入辛炔，土壤自养硝化中的AOB硝化作用得到抑制，步骤S3测定的加入辛炔后的土壤硝化潜势，实际为土壤的异养硝化和AOA硝化潜势。
根据步骤S1获得的土壤整体硝化潜势，扣除步骤S2获得的土壤异养硝化潜势，可获得土壤自养硝化潜势。根据步骤S1获得的土壤整体硝化潜势，扣除步骤S3获得的土壤异养硝化和AOA硝化潜势，可获得土壤AOB自养硝化潜势。而土壤AOA自养硝化潜势＝土壤自养硝化潜势-土壤AOB自养硝化潜势。因此，本发明的测定方法可以同时测定不同类型的硝化潜势。
作为优选，步骤S2中，反应器中乙炔气体浓度为0.01-0.05％(v/v)。
进一步优选，步骤S2中，反应器中乙炔气体浓度为0.02-0.03％(v/v)。
乙炔浓度在一定范围内时，其对氨单加氧酶的抑制效果随着浓度的增加而增加，当乙炔浓度为0.03％(v/v)，抑制氨单加氧酶的效果最好。
作为优选，步骤S3中，反应器中辛炔气体浓度为1.5-2.2％(v/v)。
进一步优选，步骤S3中，反应器中辛炔气体浓度为1.8-2.0％(v/v)。
辛炔浓度在1.8-2.0％内时，其对AOB的抑制效果随着浓度的增加而增加，而继续增加辛炔浓度，可能会对AOA产生一定的抑制作用，导致步骤S3测定的硝化潜势偏低。
作为优选，辛炔气体的制备方法包括以下步骤：在反应瓶中加入玻璃珠和辛炔液体，加入空气增压，将反应瓶剧烈摇晃，获得辛炔气体。
所述辛炔优选为1-辛炔。
作为优选，步骤S1中，每克土壤样品中加入0.01-0.05mmol硫酸铵。
作为优选，步骤S2和步骤S3中每克土壤样品中加入0.005-0.008mmol硫酸铵。
硫酸铵作为土壤硝化底物，步骤S1中每克土壤样品中加入的硫酸铵要高于步骤S2和S3中每克土壤样品中要加入的硫酸铵，这是因为步骤S1中的土壤硝化潜势没有得到抑制，底物硫酸铵含量要高，而步骤S2和S3中的土壤硝化潜势部分得到抑制，底物硫酸铵含量如果过高，会加大测定结果误差。
作为优选，步骤S1、步骤S2和步骤S3中，震荡转速为100-300rpm。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明所采用的土壤培养方法测定硝化潜势，可同时获得土壤异养硝化和自养硝化的硝化潜势，以及自养硝化中氨氧化古菌和氨氧化细菌的硝化潜势，为土壤不同硝化作用的研究提供了便利。
具体实施方式
在下文中，将通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明，然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明以下具体实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
本发明以下实施例中所采用的土壤采自宁波市北仑区春晓镇民丰村的水稻土壤，pH为6.6。土壤在进行硝化潜势测定前，先进行前处理：土壤采样后，经自然风干，去除石块、动植物残体等异物，2mm过筛；取风干过筛土壤，加水调节土壤含水量至田间持水量的50％，装于塑料烧杯中，用保鲜膜封口，并均匀扎孔，保证透气性，于25℃恒温箱中培养5-10天，在培养期间，每天用称重法加去离子水使得含水量保持一致。
本发明以下实施例中所采用的1-辛炔气体的制备：在125ml的瓶子中加入适量玻璃珠，加入40ml的1-辛炔液体，密封，然后加入100ml的空气增压，将瓶子剧烈摇晃，获得1-辛炔气体。
实施例1
本实施例的同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，包括以下步骤：
S1、测定土壤整体硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml三角瓶中并加入100ml 2.0mM的硫酸铵，用纱布封住瓶口，放置于摇床上25℃黑暗震荡24h，摇床转速为200rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立即过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为土壤硝化潜势。
S2、测定加入乙炔后的硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml棕色血清瓶中，并加入100ml 1.0mM的硫酸铵，加上硅胶塞并用铝盖密封，加入50μl的乙炔气体，使血清瓶中乙炔浓度为0.02％v/v，放置于摇床上25℃恒温黑暗震荡24h，摇床转速为200rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立马过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为添加乙炔抑制剂的土壤硝化潜势。
S3、测定加入1-辛炔后的硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml棕色血清瓶中，并加入100ml 1.0mM的硫酸铵，加上硅胶塞并用铝盖密封，加入5.0ml的1-辛炔气体，使血清瓶中1-辛炔浓度为2.0％v/v，放置于摇床上25℃恒温黑暗震荡24h，摇床转速为200rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立马过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为添加1-辛炔抑制剂的土壤硝化潜势。
实施例2
本实施例的同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，包括以下步骤：
S1、测定土壤整体硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml三角瓶中并加入100ml 1.5mM的硫酸铵，用纱布封住瓶口，放置于摇床上25℃黑暗震荡24h，摇床转速为180rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立即过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为土壤硝化潜势。
S2、测定加入乙炔后的硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml棕色血清瓶中，并加入100ml 0.75mM的硫酸铵，加上硅胶塞并用铝盖密封，加入25μl的乙炔气体，使血清瓶中乙炔浓度为0.01％v/v，放置于摇床上25℃恒温黑暗震荡24h，摇床转速为180rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立马过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为添加乙炔抑制剂的土壤硝化潜势。
S3、测定加入1-辛炔后的硝化潜势：取15g预培养7天后的土壤样品，置于250ml棕色血清瓶中，并加入100ml 0.75mM的硫酸铵，加上硅胶塞并用铝盖密封，加入4.5ml的1-辛炔气体，使血清瓶中1-辛炔浓度为1.8％v/v，放置于摇床上25℃恒温黑暗震荡24h，摇床转速为180rpm。分别于第2h、4h、15h、22h、24h取样，每次吸取10ml土壤悬浮液，立马过滤离心，测定离心液中硝态氮的浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为添加1-辛炔抑制剂的土壤硝化潜势。
实施例3
实施例3的测定方法与实施例2的区别仅在于，实施例3步骤S2中加入的乙炔气体浓度为0.03％(v/v)，步骤S3中加入的1-辛炔气体浓度为2.0％(v/v)，其它与实施例2相同。
实施例4
实施例4的测定方法与实施例2的区别仅在于，实施例4步骤S2中加入的乙炔气体浓度为0.05％(v/v)，步骤S3中加入的1-辛炔气体浓度为2.2％(v/v)，其它与实施例2相同。
实施例1-4的步骤S1、S2和S3在2h、4h、15h、22h、24h测定的硝态氮浓度以及绘制曲线线性回归后获得的硝化潜势如表1所示。
表1实施例1-4的步骤S1、S2和S3在不同取样时间测定的硝态氮浓度(mg/kg)以及绘制曲线线性回归后获得的硝化潜势(mg·kg-1soil·h-1)
Figure BDA0002346485820000061
从表1中可以看出，培养时间与硝态氮浓度具有较好的相关性，相关系数R2均为0.9以上。根据表1测定结果计算土壤AOA硝化潜势和AOB硝化潜势，结果如表2所示。
表2实施例1-4的土壤整体硝化潜势、异养硝化潜势、AOA硝化潜势和AOB硝化潜势
Figure BDA0002346485820000062
因此，本发明可以同时测定土壤异养硝化和自养硝化的硝化潜势，以及自养硝化中氨氧化古菌和氨氧化细菌的硝化潜势。
本文中上述描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (9)

1.一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，测定方法包括以下步骤：
S1、测定土壤整体硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，分别于第2h、4h、15h、22h、24h吸取土壤悬浮液，立即过滤离心，测定硝态氮浓度，以培养时间为横坐标，以硝态氮浓度为纵坐标，求出斜率，即为土壤硝化潜势；
S2、测定加入乙炔后的硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，加入乙炔气体，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，其它步骤同上，测定加入乙炔后的土壤硝化潜势；
S3、测定加入辛炔后的硝化潜势：将土壤样品置于反应器中并加入硫酸铵溶液，密封反应器，加入辛炔气体，在黑暗环境下于20-30℃恒温震荡，其它步骤同上，测定加入辛炔后的土壤硝化潜势。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S2中，反应器中乙炔气体浓度为0.01-0.05％(v/v)。
3.根据权利要求1或2所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S2中，反应器中乙炔气体浓度为0.02-0.03％(v/v)。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S3中，反应器中辛炔气体浓度为1.5-2.2％(v/v)。
5.根据权利要求1或4所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S3中，反应器中辛炔气体浓度为1.8-2.0％(v/v)。
6.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，辛炔气体的制备方法包括以下步骤：在反应瓶中加入玻璃珠和辛炔液体，加入空气增压，将反应瓶剧烈摇晃，获得辛炔气体。
7.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S1中，每克土壤样品中加入0.01-0.05mmol硫酸铵。
8.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S2和步骤S3中，每克土壤样品中加入0.005-0.008mmol硫酸铵。
9.根据权利要求1所述的一种同时测定土壤中不同类型硝化潜势的方法，其特征在于，步骤S1、步骤S2和步骤S3中，震荡转速为100-300rpm。
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