CN110982849B

CN110982849B - 一种同时生产乙醇和羧酸的方法及其应用

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Publication number: CN110982849B
Application number: CN201911354619.1A
Authority: CN
Inventors: 黄振兴; 余江南; 廖家林; 阮文权
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110982849A

Abstract

本发明公开了一种同时生产乙醇和羧酸的方法及其应用，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明提供了一种同时生产乙醇和羧酸的方法，此方法仅需简单的将未经灭菌的果蔬废弃物在一定的条件下进行自发酵，即可获得同时含有乙醇和羧酸的乙醇型酸化发酵液。利用此方法发酵300h，即可使乙醇型酸化发酵液中乙醇、乙酸、丁酸和乳酸的含量分别高达27.5、8.23、0.54和0.5g/L。利用此方法发酵得到的乙醇型酸化发酵液中，乙醇和羧酸的COD当量比值为4～7：10～12，因此，利用此方法发酵获得的乙醇型酸化发酵液可直接在接种厌氧污泥后用于己酸的发酵生产，无需额外添加乙醇作为电子供体，大大降低了己酸发酵的成本。

Description

一种同时生产乙醇和羧酸的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种同时生产乙醇和羧酸的方法及其应用，属于发酵技术领域以及生物技术领域。

背景技术

己酸为含有六个碳原子的中链脂肪酸(C₅H₁₁COOH)，疏水性强，能量密度高，是一种重要的化工原料，可直接用于动物饲料、绿色抗菌剂和缓蚀剂生产。其酯类产品广泛应用于食品香料、树脂、橡胶、制药等工业。此外，己酸是生物燃料的合成前体，可以通过有机化学的方法间接转化为生物柴油或喷气燃料。

已酸的生产方法可分为化学合成法、天然产物提取法和微生物催化法三种。其中，化学合成法主要是以石油为原料，通过催化氧化等化工途径制备己酸。受石油资源日益短缺和环保要求不断提高的影响，这一方法已不适用于现代工业化生产。并且，由于安全性存在问题，利用这一方法制备得到的己酸的应用也受到了越来越多的限制，特别是在食品和医药领域。

天然产物提取法主要是从椰子油等富含己酸的原料中提取己酸。与化学合成法相比，利用这一方法制备得到的己酸安全性更高。但是，由于受到原料、地域等因素的影响，这一方法也不适用于现代工业化生产。

微生物催化法主要是通过生物发酵制备己酸。与化学合成法相比，这利用这一方法制备得到的己酸安全性也很高，并且，与天然产物提取法相比，这一方法不受原料、地域等因素的影响。因此，微生物催化法在制备己酸方面具备极大的工业化潜力。但是，现有的微生物催化法仍存在一定的缺陷。

例如，公开号为CN108486172A的专利申请文本中记载了一种以果蔬废弃物为底物、以额外添加的乙醇作为电子供体、以厌氧污泥为发酵剂发酵生产己酸的方法。由于这一方法需要额外投加乙醇作为电子供体，大大增加了利用这一方法生产己酸的生产成本，阻碍了利用这一方法生产己酸的工业化进程。因此，急需找到降低利己酸生产成本的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低的生产己酸的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种同时生产乙醇和羧酸的方法，所述方法为将含有果蔬废弃物的发酵体系于温度为15～45℃、pH为2.5～5.0、转速为12～60rpm的条件下进行发酵，得到同时含有乙醇和羧酸的发酵液；所述果蔬废弃物未经灭菌。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中，乙醇和羧酸的COD当量比值为4～7：10～12。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中，乙醇和羧酸的COD当量比值为5.7：10.4。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸是指乙酸、丁酸和乳酸。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸是指乙酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系的总固体浓度(TS)为7～10％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系的挥发性固体(VS)含量为80～120g-VS/L。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度(TS)为7～10％、挥发性固体(VS)含量为80～120g-VS/L的发酵体系，然后将发酵体系于温度为15～45℃、pH为2.5～5.0、转速为12～60rpm的条件下进行发酵，得到同时含有乙醇和羧酸的发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度(TS)为7～10％、挥发性固体(VS)含量为80～120g-VS/L的发酵体系，然后将发酵体系于温度为34～36℃、pH为4.0～4.5、转速为60rpm的条件下进行发酵，得到同时含有乙醇和羧酸的发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述果蔬废弃物含糖。

在本发明的一种实施方式中，所述果蔬废弃物的含糖量不低于8％(m/m)。

本发明还提供了一种乙醇型酸化发酵液，所述乙醇型酸化发酵液是使用上述方法发酵得到的。

本发明还提供了上述方法在生产乙醇和/或羧酸中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸是指乙酸。

本发明还提供了一种生产己酸的方法，所述方法为先在上述乙醇型酸化发酵液中接种厌氧污泥，得到发酵体系，然后将发酵体系于温度为15～45℃、pH为2～8.5、转速为15～150rpm的条件下进行发酵，得到含有己酸的发酵液，最后将发酵液进行提取，获得己酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先在上述乙醇型酸化发酵液中接种厌氧污泥，得到发酵体系，然后将发酵体系于温度为30℃、pH为4.5、转速为60rpm的条件下进行发酵，得到含有己酸的发酵液，最后将发酵液进行提取，获得己酸。

在本发明的一种实施方式中，所述厌氧污泥在乙醇型酸化发酵液中的接种量为10～350g-VS/L。

在本发明的一种实施方式中，所述厌氧污泥在乙醇型酸化发酵液中的接种量为35g-VS/L。

本发明还提供了上述同时生产乙醇和羧酸的方法或上述乙醇型酸化发酵液或上述生产己酸的方法在生产己酸中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种同时生产乙醇和羧酸的方法，此方法仅需简单的将未经灭菌的果蔬废弃物在一定的条件下进行自发酵，即可获得同时含有乙醇、乙酸、丁酸和乳酸的乙醇型酸化发酵液。

(2)利用本发明的同时生产乙醇和羧酸的方法发酵300h，即可使乙醇型酸化发酵液中乙醇、乙酸、丁酸和乳酸的含量分别高达27.5g/L、8.23g/L、0.54g/L和0.5g/L。

(3)利用本发明的方法发酵得到的乙醇型酸化发酵液中，乙醇和羧酸的COD当量比值为4～7：10～12，因此，利用本发明的方法发酵获得的乙醇型酸化发酵液可直接在接种厌氧污泥后用于己酸的发酵生产，无需额外添加乙醇作为电子供体，大大降低了己酸发酵的成本。

(4)本发明提供了一种生产己酸的方法，此方法仅需简单的将厌氧污泥接种至由未经灭菌的果蔬废弃物自发酵获得的乙醇型酸化发酵液中进行发酵，即可获得含有己酸的己酸发酵液，成本较低。

(5)利用本发明的生产己酸的方法发酵720h，即可使己酸发酵液中己酸的含量高达13.7g/L。

附图说明

图1：真菌高通量测序流程。

图2：不同组别发酵液中不同组分的浓度变化情况；其中，A为不同组别发酵液中乙醇的浓度变化情况，B为不同组别发酵液中乙酸的浓度变化情况，C为不同组别发酵液中丁酸的浓度变化情况，D为不同组别发酵液中乳酸的浓度变化情况。

图3-5：不同组别发酵体系中细菌分布情况。

图6：不同组别发酵体系中真菌分布情况(科水平)。

图7：不同组别发酵体系中真菌分布情况(目水平)。

图8：不同组别发酵体系中真菌分布情况(种水平)。

图9：发酵体系中微生物菌群结构和发酵特性关联的RDA分析结果。

具体实施方式

下述实施例中涉及的果蔬废弃物收集自江南大学周边农贸市场，由腐烂的苹果、香蕉、菠萝、梨这几种成分组成；下述实施例中涉及的厌氧污泥取自无锡市某糖浆厂厌氧废水处理单元；下述实施例中涉及的安琪干酵母购自安琪酵母股份有限公司(SY，Saccharomyces cereverevisiae)。

下述实施例中涉及的细菌高通量测序方法如下：

先使用

DNA(MoBio，12888-50)土壤DNA提取试剂盒提取发酵体系的基因组DNA，然后对细菌16S rRNA基因的V3-V4区利用通用引物进行扩增，最后采用IlluminaMiseq测序平台(苏州凯杰转化医学研究有限公司)对扩增产物进行高通量测序；

其中，通用引物如下：

338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'(SEQ ID NO.1)；

806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'(SEQ ID NO.2)。

下述实施例中涉及的真菌高通量测序方法如下：

先使用

DNA(MoBio，12888-50)土壤DNA提取试剂盒提取发酵体系的基因组DNA，然后对真菌基因组的ITS1F-ITS2区利用通用引物进行扩增，最后采用IlluminaMiseq测序平台(苏州凯杰转化医学研究有限公司)对扩增产物进行高通量测序(真菌高通量测序流程具体可见图1)；

其中，通用引物如下：

ITS1F:5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'(SEQ ID NO.3)；

ITS2R:5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3(SEQ ID NO.4)'。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

总固体浓度(TS)、总化学需氧量(TCOD)、挥发性固体(VS)含量的检测方法：具体可参考文献“APHA,2012，Standard Methods for the Examination of 410 WaterandWastewater.American Public Health Association/American Water WorksAssociation/Water Environment Federation,Washington,DC,USA.”中所记载的标准方法。

乙醇、羧酸含量的检测方法：取发酵液在经12000rpm离心、0.45μm水系滤膜过滤和3mol/L磷酸预酸化后，使用配备有火焰离子检测器(flame ionization detector，FID)和30m×0.25mm×0.25μm毛细管柱(Intercap FFAP，岛津技迩)的气相色谱仪(GC-2010plus，岛津)，同时测定羧酸或各种羧酸的浓度；仪器设置为：进样口(INJ)和检测器(FID)的温度设置均为250℃；柱箱温度控制程序设置为：首先维持始温度70℃ 2min，以15℃/min ramp的升温速率升高至210℃，并在210℃保续2分钟，而后进入冷却，进入下一检测周期；载气(99.999％N₂，无锡市鑫锡仪科技有限公司)的流量为60ml/min；氢气、高压空气流量分别设置为40和400mL/min；检测获得的各组分的出峰时间与标准品出峰时间比对进行定性，根据各组分出峰面积和外标标准浓度外标出峰浓度定量(外标法)。

转化率的计算公式：转化率(％)＝(COD_乙醇+COD_羧酸)/COD_原料。

最大乙醇生产速率的计算公式：最大乙醇生产速率(g/L·d)＝max(δ乙醇浓度净产量/δ时间)。

乙醇产率的计算公式：乙醇产率(％)＝COD_乙醇/COD_原料。

发酵结束评判标准：主要产物达到最大产量的95％时即为发酵结束。

醇酸比(COD-乙醇/COD-羧酸)的计算公式：醇酸比＝COD_乙醇/(COD_乙酸+COD_丁酸)。

实施例1：乙醇型酸化发酵液的生产

具体步骤如下：

实验共分为三组，分别为接种酵母组、自然酸化组和接种污泥组，其中：

接种酵母组：先在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度(TS)为8％、挥发性固体(VS)含量为78g-VS/L的发酵体系，然后以1:5000(m/m)的接种量在发酵体系中接种酵母(安琪干酵母粉)后将发酵体系于温度为34～36℃、pH为4.0～4.5、转速为60rpm的条件下发酵17d，得到发酵液，得到发酵液。

自然酸化组：先在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度(TS)为8％、挥发性固体(VS)含量为78g-VS/L的发酵体系，然后将发酵体系于温度为34～36℃、pH为4.0～4.5、转速为60rpm的条件下发酵17d，得到发酵液(此发酵液即为乙醇型酸化发酵液)。

接种污泥组：先在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度(TS)为8％、挥发性固体(VS)含量为78g-VS/L的发酵体系，然后以70g-VS/L的接种量在发酵体系中接种厌氧污泥后将发酵体系于温度为34～36℃、pH为4.0～4.5、转速为60rpm的条件下发酵17d，得到发酵液。

整个发酵过程中，每隔一天对三组发酵液进行取样，并检测三组发酵液中乙醇、乙酸、丁酸和乳酸的浓度变化情况(检测结果见图2)。

通过计算，对比三组发酵体系的发酵转化效能(检测结果见表1)。

发酵前，检测三组发酵体系中细菌和真菌的分布情况(检测结果见图3-8)，并根据三组发酵体系中细菌和真菌的分布情况，通过冗余分析(RDA)得到发酵体系中微生物菌群结构和发酵特性之间的关联(分析结果见图9)。

由图2可知，整体而言，接种酵母组和自然酸化组的转化规律较为接近，和接种污泥组的发酵特性差异较大。

其中，由图2A可知，就乙醇生产规律来看，接种酵母组在发酵前4天的乙醇产量明显高于自然酸化组，但是，在发酵第4～8天的阶段，自然酸化组17.8～28.3g/L)的乙醇产量略低于接种酵母组(21.2～30.6g/L)，随着发酵继续进行，发酵9天后，接种酵母组的乙醇生产持续进行，乙醇最终产量达到31.9±1.1g/L，而自然酸化组的乙醇最终产量为27.5±1.6g/L，相较于接种酵母组低16.0％；接种污泥组的乙醇产量在整个发酵过程中明显低于接种酵母组和自然酸化组，其乙醇最终产量为6.92±2.21g/L，相较于接种酵母组低78.3％。可见，自然酸化组和接种酵母组出现了可观的乙醇生产，而以接种厌氧污泥为代表的细菌型乙醇转化整体效能明显弱于自然酸化和接种酵母。

由图2B可知，就乙酸生产规律来看，各组最高乙酸产量由高到低排序为接种污泥组>自然酸化组>接种酵母组，分别为12.84g/L，8.23g/L，4.90g/L，同时，自然酸化组和接种污泥组的乙酸生产趋势在3～4天内，快速达到最高峰，而接种酵母组的乙酸产量最高峰在8天达到，整体提升缓慢。可见，自然酸化组和接种酵母组出现了可观的乙酸生产。

由图2C可知，就丁酸生产规律来看，接种污泥组的丁酸浓度提升明显，在8天内基本达到21.33±1.1g/L，相较之下，接种酵母组和自然酸化组的丁酸生产非常微弱，仅为0.14～0.54g/L。

由图2C可知，就乳酸生产规律来看，接种污泥组的乳酸最终产量为4.3±0.4g/L，相较之下，接种酵母组和自然酸化组的乳酸生产相对较少，均少于0.5g/L。

由表1可知，接种污泥对于发酵体系的整体转化效率和缩短发酵周期作用明显，而对于乙醇生产速率和乙醇产率并无明显促进；其中，自然酸化组的整体乙醇产率和所产发酵液的醇酸比略低于接种酵母组，但基本满足己酸发酵的要求。

综合图2和表1，自然酸化可取代接种酵母以获得满足己酸生产要求的同时含有乙醇和羧酸的乙醇型酸化发酵液。

由图3-5可知，从门水平看，自然酸化组和接种酵母组的发酵体系中的细菌主要是以厚壁菌门和变形菌门为主，其中，自然酸化组和接种酵母组的发酵体系中厚壁菌门的相对丰度分别为84.7％和46.0％、变形菌门的相对丰度分别为15.2％和53.9％，二者共同贡献了自然酸化组和接种酵母组99％以上的相对丰度；而接种污泥组的发酵体系中的细菌在门水平分布相对分散，除厚壁菌门和变形菌门丰度较高之外，还有拟杆菌门、放线菌门和绿湾菌门，其中，接种污泥组的发酵体系中放线菌门的相对丰度达到43.2％以上。进一步分析纲水平的菌群分布发现，主要由α-变形菌纲导致了接种酵母组和自然酸化组在变形菌门的差异。从种水平来看，Clostridium sensu stricto 1(37.0％和21.5％)、Clostridiumbutyricum(36.9％和21.6％)、Lactobacillus brevis(18.1％和4.1％)、unculturedClostridium sp(8.9％和2.0％)贡献了自然酸化组和接种酵母组大部分的相对丰度，这些微生物具有厌氧酸化产酸功能，为乙醇发酵过程中产生部分羧酸提供了基础；巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)在接种酵母组中相对丰度最高，达到了45.8％，该类微生物被认为是酿酒过程中引起产酸的主要贡献者，适当的羧酸生产利于后续的己酸转化；接种污泥组中相对丰度最高的乔治菌属(Georgenia uncultured bacterium)(21.7％)和Bifidobacterium thermophilum RBL67(19.7％)则分别被是产挥发性脂肪酸和乳酸的关键微生物。可见，自然酸化组、接种酵母组和接种污泥组的发酵体系中的细菌以产酸细菌为主，并未发现大量的产醇细菌。

由图6-8可知，从目水平看，自然酸化组和接种酵母组的发酵体系中的真菌高度集中于酵母目，其中，自然酸化组的发酵体系中毕赤膜醭酵母(Pichia membranifaciens)的相对丰度为99.9％以上，接种酵母组的发酵体系中毕赤膜醭酵母(Pichiamembranifaciens)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相对丰度分别为95.1％和5.0％，毕赤膜醭酵母(Pichia membranifaciens)为在果皮蔬菜茎叶等附着的野生土著菌种，可能更适应果蔬废弃物的底物环境，而在大体利用相同的底物情况下，外加的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可能仅能在较短时间内提高生产效率，但是在长期的发酵过程中难以获得竞争优势。可见，自然酸化组和接种酵母组和接种污泥组的发酵体系中的真菌以产醇真菌为主，且此产醇真菌为果皮蔬菜茎叶等附着的野生土著菌种。

由图9可知，酵母目对于乙醇生产的关联性十分显著，而污泥对于提高水解酶活、提升羧酸产量起到关键作用，并且，对比自然酸化组和接种酵母组的发酵体系中的细菌分布物明显可以看出，左侧的10个微生物与乙醇生产的酵母丰度呈现出一定的关联，除去已经阐述过的3个Clostridium、1个Lactobacillus以及Acetobacter pasteurianus之外，Vagococcus lutrae、Enterobacter unclassified、Kluyvera intermedia等三种微生物常被发现存在于白酒酿造的混合菌群大曲中，有助于复杂底物的降解，Mangrovibacterunclassified被认为存在于土壤微生物，Ralstonia uncultured bacterium被认为是一种青枯病菌，可随腐败果蔬废弃物微生物而进入体系，这些微生物将废弃物中复杂底物水解产生简单糖类，进而可被酵母菌利用产醇。可见，自然酸化组和接种酵母组和接种污泥组的发酵体系中的细菌对于产醇也有一定辅助作用，且这些辅助产醇的真菌也为果皮蔬菜茎叶等附着的野生土著菌种。

综合图3-9，自然酸化可取代接种酵母以获得满足己酸生产要求的同时含有乙醇和羧酸的乙醇型酸化发酵液的关键是未经灭菌的果蔬废弃物上附着的野生土著菌种。

表1不同组发酵体系的发酵转化效能

实施例2：乙醇型酸化发酵液的应用

具体步骤如下：

在实施例1的自然酸化组所产发酵液以30g-VS/L的接种量接种厌氧污泥，得到发酵体系；将发酵体系于温度为30℃、pH为4.5、转速为60rpm的条件下发酵720h，得到发酵液。

检测发酵液中己酸的含量，检测结果为：发酵液中含有13.7g/L己酸。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种同时生产乙醇和羧酸的方法及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcctacgg gaggcagcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgcgttct tcatcgatgc 20

Claims

1.一种生产己酸的方法，其特征在于，所述方法为将在果蔬废弃物中添加水，得到总固体浓度为7~10%、挥发性固体含量为80~120 g-VS/L的发酵体系，然后将发酵体系于温度为34~36℃、pH为4.0~4.5、转速为12~60 rpm的条件下进行发酵，得到同时含有乙醇和羧酸的发酵液；

所述果蔬废弃物未经灭菌；

所述发酵液中，乙醇和羧酸的COD当量比值为4~7：10~12；

向所述同时含有乙醇和羧酸的发酵液中接种厌氧污泥得到发酵体系后，发酵得到含有己酸的发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种生产己酸的方法，其特征在于，接种厌氧污泥后的发酵条件为温度为15~45℃、pH为2~8.5、转速为15~150 rpm。

3.如权利要求2所述的一种生产己酸的方法，其特征在于，所述厌氧污泥的接种量为10~350 g-VS/L。

4.权利要求1~3任一所述方法在生产己酸中的应用。