CN110975960A - 一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统及控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，包括：基座；芯片放置台；解旋恒温热源和退火恒温热源；热源放置架；X‑Y轴双向滑台，安装于基座，用以驱动芯片放置台及热源放置架沿X向和/或Y向运动；照相机；控制器，用以控制X‑Y轴双向滑台、解旋恒温热源、退火恒温热源及照相机定时运行。本申请采用程序化机械式移动方式，实现了qPCR与dPCR功能的整合，利用X‑Y轴双向滑台实现了稳定的热循环，并且利用X‑Y轴双向滑台的双轴联动实现了扫描式的荧光检测，一定程度解决了目前dPCR仪集成化低和荧光拍摄效果不佳的问题，显著地提升了检测效率，其控制精准，自动化程度好。本发明还提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，具有上述有益效果。

Description

一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统及控制方法

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，更具体地说，涉及一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统。本发明还涉及一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法。

背景技术

PCR反应是一种用于体外扩展特定DNA片段的分子生物学技术，PCR技术广泛应用于农业生产、食品检测、医学诊断等领域。

PCR仪的发展经历了三代：常规型PCR仪、实时荧光PCR仪和数字PCR仪，三代PCR仪都通过特定温度循环来实现基因扩增，然而，在DNA的定量方式上，三种仪器却有较大区别：常规型PCR仪不能实现样品DNA浓度的定量测量；实时荧光PCR仪可以通过自身的荧光检测模块实现对DNA浓度的相对定量；相较于前两代PCR仪，数字PCR是最先进的核酸检测定量技术，其检测灵敏度远超过上述两种仪器。

针对实时荧光PCR仪与数字PCR仪，两种仪器在反应性能方面各有特色：首先，在试验成本上，实时荧光PCR仪一般不需要定制的微流控芯，即使需要定制芯片，芯片的制造成本也可以很低，而数字PCR仪通常需要特制的微流控芯片，微流控芯片的价格昂贵，因此单次试验成本较高；其次，在核酸浓度检测的灵敏度方面，实时荧光PCR仪可以轻松的区分出两倍的浓度差异，但当样品浓度差异很低时，实时荧光PCR仪性能不佳，而数字PCR理论上可以实现单个核酸分子的痕量检测，检测极为灵敏；再次，在反应通量方面，实时荧光PCR仪更容易实现高通量的反应，而数字PCR仪在高通量方面存在不足。通过比较实时荧光PCR仪与数字PCR仪的性能，发现两种不同仪器在同一指标之间有很强的互补性。

然而，目前，市面上还没有一种融合了dPCR仪与qPCR仪功能的集成式复合型PCR系统，首先，数字PCR仪各功能单元的集成存在困难，在一台设备上实现三个功能单元(即：液滴生成单元、基因扩增单元和荧光检测单元)难度很大；其次，qPCR仪与dPCR仪的荧光检测方式不同，利用一台设备实现这两种检测方式存在困难；此外，如若采用三个单独的单元实现集成功能，不仅设备整体尺寸大，重量较重，成本较高，而且控制较为复杂，检测效率低，无法满足现场快速检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，实现了dPCR和qPCR功能的集合，具备两种模式下的液滴生成、基因扩增和荧光检测功能，只需在最初进行人工上样，中途无需停机及人工操作，检测效率高，性能可靠，成本低，应用范围广泛。本发明的另一核心是提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，具有上述技术效果。

本发明提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，包括：

基座；

芯片放置台，用以放置芯片；

解旋恒温热源，用以加热所述芯片实现DNA双链解旋；

退火恒温热源，用以对所述芯片进行低温退火及适温延伸以实现引物与单链核酸模板结合及核苷酸在互补链的延伸增长；

热源放置架，用以放置所述解旋恒温热源及所述退火恒温热源；

X-Y轴双向滑台，安装于所述基座，用以驱动所述芯片放置台及所述热源放置架沿X向和Y向运动；

照相机，用以定时对所述芯片进行拍照；

激光源和光源，用以补充光源；

控制器，用以控制所述X-Y轴双向滑台、所述解旋恒温热源、所述退火恒温热源及所述照相机定时运行。

优选的，所述X-Y轴双向滑台包括X向滚珠丝杠、用以驱动所述X向滚珠丝杠运行的X向步进电机、Y向滚珠丝杠和用以驱动所述Y向滚珠丝杠运行的Y向步进电机，所述X向滚珠丝杠和所述Y向滚珠丝杠上各安装有放置平台。

优选的，还包括：

恒温加热热源，置于所述热源放置架、用以将所述芯片快速加热至解旋温度；

恒温制冷热源，置于所述热源放置架，用以将所述芯片快速降低至退火温度。

优选的，还包括围设于所述解旋恒温热源、所述退火恒温热源、所述恒温加热热源及所述恒温制冷热源的底部及四周的保温部件。

优选的，还包括用以容纳所述基座的保温盒。

优选的，所述解旋恒温热源、所述退火恒温热源、所述恒温加热热源及所述恒温制冷热源可以为加热片或者恒温TEC设备。

优选的，所述芯片可以为微点阵列芯片；或者所述芯片设有液滴生成流道，所述液滴生成流道为Y型、T型或者十字型。

本发明还提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，包括如下步骤：

利用X-Y轴双向滑台平移热源放置架或者芯片放置台，以使解旋恒温热源对芯片进行加热和保温，实现DNA双链解旋；

利用所述X-Y轴双向滑台机械式平移，以使所述芯片在室温下冷却至退火温度；

利用所述X-Y轴双向滑台机械式平移，以使退火恒温热源对所述芯片进行保温，实现碱基配对和延伸；

由控制器控制照相机对所述芯片进行拍照；

重复上述步骤；

分析各照片中荧光亮度，绘制荧光亮度曲线。

优选的，所述利用X-Y轴双向滑台平移热源放置架或者芯片放置架，以使解旋恒温热源对芯片进行加热和保温，实现DNA双链解旋之前，还包括步骤：利用恒温加热热源将所述芯片快速加热至解旋温度；

所述利用所述X-Y轴双向滑台机械式平移，以使退火恒温热源对所述芯片进行保温，实现碱基配对和延伸步骤之后，还包括步骤：利用恒温制冷热源将所述芯片快速冷却至退火温度。

优选的，还包括步骤：将所述芯片划分为若干个片区，在各所述片区中滴入待测核酸的标准样本和待测样本，对各所述片区的交接部位进行拍照和荧光检测分析。

与上述背景技术相比，本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，提供了dPCR与qPCR两种工作模式：在两种工作模式下，通过控制器控制X-Y轴双向滑台的往复运动来实现热循环；在dPCR模式下，通过进行程序化机械平移驱动精准控制X-Y轴双向滑台的位移，由此驱动芯片放置台或者热源放置架至目标位置，以相继实现解旋恒温热源对芯片中的DNA进行高温解链，以及退火恒温热源对待检测试剂进行退火保温，完成碱基配对和延伸，通过X-Y轴双向滑台的往复驱动实现温度循环，完成PCR扩增；扩增后，控制器向激光源和光源发送指令，以补充环境光源亮度，并且控制照相机对芯片中心区域进行拍照，通过控制器安装软件对拍摄的照片进行后期合成分析、液滴数量统计，及样本浓度计算，最终得到样本浓度。由此，本申请利用机械滑移式热耦合结构实现了稳定的热循环，并且利用二维滑台的双轴联动实现了扫描式的荧光检测，解决了目前dPCR仪集成化低和荧光拍摄效果不佳的问题，与此同时，实现了qPCR仪与dPCR仪功能的融合。本申请所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，采用程序化机械精准位移控制，实现对芯片位置在光源和检测区间的精准定位，实现各个芯片位置中微液滴相同激发光强度的高精准自动化荧光检测，消除了芯片自身尺寸造成的光强均匀性误差，实现了耦合一体化光路分析和机械系统与光学系统的高度集成，只需在最初进行人工上样，中途无需停机及人工操作，显著地提升了检测效率，并且该设备体积小，重量轻，成本低。本发明还提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，具有上述技术效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的结构示意图(控制器未示出)；

图2为图1中X-Y轴双向滑台的结构示意图；

图3为图2中具有快速升降温功能的X-Y轴双向滑台的结构示意图；

图4为本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的工作流程图；

图5为图4中具有升降温功能的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的工作流程图；

图6为应用于本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的芯片无气泡产生的工艺流程图；

图7为应用本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统在qPCR模式下测得的温度循环曲线图；

图8为应用本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统在qPCR模式下试验测得的梯度浓度曲线图；

图9为应用市面上的qPCR仪试验得到的梯度浓度曲线图；

图10为应用本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统在qPCR模式下试验测得的溶出曲线；

图11为应用本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统在dPCR模式下测得的温度循环曲线图；

图12为本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统中恒温热源系统的示意图。

其中，1-基座、2芯片、3-芯片放置台、4-解旋恒温热源、5-退火恒温热源、6-热源放置架、7-X-Y轴双向滑台、8-照相机、9-控制器、10-恒温加热热源、11-恒温制冷热源、12-激光源和光源。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

PCR的反应原理类似于生物体内DNA的复制过程，最大的区别在于PCR的反应环境是在体外。一次PCR扩增反应主要包括三个阶段：(1)变性，模板DNA在95℃下变性，DNA的双链结构打开，形成单链；(2)退火，温度降低到55℃左右，引物按照碱基互补配对的原则与DNA单链结合在一起。(3)延伸，72℃左右时，在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

请参考图1至图5，图1为本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的结构示意图(控制器未示出)；图2为图1中X-Y轴双向滑台的结构示意图；图3为图2中具有快速升降温功能的X-Y轴双向滑台的结构示意图；图4为本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的工作流程图；图5为图4中具有升降温功能的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的工作流程图。

本发明提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，主要包括基座1、芯片放置台3、解旋恒温热源4和退火恒温热源5、热源放置架6、X-Y轴双向滑台7、照相机8、激光源和光源12，以及控制器9。

X-Y轴双向滑台7安装在基座1上，且沿X向及Y向分布，芯片2放置在芯片放置台3上；解旋恒温热源4用以将芯片2加热至DNA双链解旋温度，例如95℃，并保温完成DNA的高温解链过程，退火恒温热源3用以将芯片2恒温保温至50℃至70℃低温，DNA完成碱基配对和延伸过程，实现引物与单链核酸模板结合以及核苷酸在互补链上的延伸增长，解旋恒温热源4和退火恒温热源5放置在热源放置架6上；X-Y轴双向滑台7用以放置芯片放置台3或者热源放置架6，在X-Y轴双向滑台7的直线驱动下，实现芯片2或者两个热源沿X向及Y向的直线移动。

X-Y轴双向滑台7、解旋恒温热源4和退火恒温热源5均与控制器9电连接，可以通过数据线连接，也可以为无线连接，在控制器9内存控制程序的控制下，实现X-Y轴双向滑台7驱动芯片放置台3或者热源放置架6运行，进而将芯片2依次移送至解旋恒温热源4和退火恒温热源5的正上方，进行解旋加热和退火恒温加热，或者将解旋恒温热源4和退火恒温热源5相继移送至芯片2的正下方，由此，本发明实现了恒温热源的耦合，通过程序化控制X-Y轴双向滑台7实现机械位移的精确控制，由此实现数字PCR升降温循环扩增过程的精确控制，其结构紧凑，布局合理，占用空间小，易于携带，温度循环效率高。

在上述实施例的基础上，还可以在基座1上进一步设置照相机8、激光源和光源12及同轴光源转换镜头，该照相机8通过镜筒保持架安装在基座1上，激光源和光源12用以补充光源，照相机8、激光源和光源12均与控制器9相连，在控制器9的控制下实现补光、滤光及对芯片2进行拍照，以便于后续通过软件实现样本浓度计算，自动化程度高，控制精准。

为了验证复合型PCR系统的qPCR功能和dPCR功能，进行了相关的试验验证。

qPCR试验所采用的试剂包括：10μL的premix-混合液，6μL的水，2μL的正向和反向引物，1μL的EvaGreen Dye-荧光染料，2μL的PGEM-3ZF(+)1-质粒；PGEM-32F(+)1-质粒的引物序列为F；5’-CCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCC-3’；R:5’-GTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCG-3’。

dPCR试验所采用的试剂包括：10μL的Premix-混合液，8μL的水，0.75μL的正向和反向引物，0.5μL的探针，2μL的UPE-Q质粒。UPE-Q的引物序列为F：5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3；R:5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’，UPE-Q的探针序列为:5’-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-3’。

参考图6。具体公开了一种芯片无气泡产生的工艺：

首先，根据实际反应通量确定PDMS大小，将固化后的PDMS切成目标尺寸；然后，利用打孔器在PDMS表面打4个微型孔洞(可根据反应通量调节孔洞数量)；其次，将PDMS与玻璃片通过等离子键合在一起；再次，在试剂的添加过程中，需要注意试剂添加的顺序，预先在反应腔内注入矿物油等油性试剂2.5μL，再向矿物油中注入1.5μL的反应试剂。最后，再次添加2.5μL矿物油，附着于反应试剂的表面。

上述芯片制备流程简单，成本低廉，通过添加小孔数量即可实现高通量试验，经过上述步骤有效避免了PCR反应试剂添加过程中气泡的产生，满足了后续升降温高效率反应需求。

dPCR反应使用的芯片为QuantStudio^TM 3D Digital PCR Chip-实时荧光定量3D数字PCR芯片，该数字PCR芯片有4万个反应微腔，整个芯片的尺寸为10mm×10mm，其操作流程简单，可以通过手动添加实现。

试验中，利用X-Y轴双向滑台7实现温度循环和芯片顺序动作，具体来说，本申请中的复合型PCR系统由两部分组成：荧光检测系统和温度循环系统，由于qPCR反应每个循环都需要对荧光进行拍摄，而dPCR反应下只需要进行终点拍摄，所以控制系统分为两个部分，分别实现两种不同模式的试验。

在温度循环系统中，主要包括两部分：机械滑移式热耦合结构和恒温热源，其中，热耦合结构由X-Y机械滑台7，芯片放置台3(底部安装有铜片)，热源放置架6、解旋恒温热源4和退火恒温热源5，1个USB风扇，以及两个温控器组成，解旋恒温热源4和退火恒温热源5上涂有导热硅胶，以改善热源与芯片放置台3的热传导情况。

由于复合型PCR系统在两种模式下对温度循环的要求不同，但温度循环的实现方式是相同的。

以芯片2移动为例。当复合型PCR系统处于qPCR模式时，USB风扇打开，可调高温块温度设置为115℃，反应初始阶段，芯片2在120℃的快速升温区进行快速升温，升温时间为28s，快速升温完成后，芯片2在X轴滑台带动下，到达95℃解旋恒温热源4，停留10s，变性完成后，芯片2快速移动到快速降温区(利用USB风扇实现快速降温)，停留20s，进行快速降温，降温完成后，芯片2移动到60℃退火恒温热源5聚合区，停留35s，此时完成了一个温度循环。一个循环一共需要93s，一个完整的qPCR试验需要完成40个循环，因此一次试验只需要62分钟。

当复合型PCR系统处于dPCR模式时，升降温速度不能超过2℃/s，快速升温区的温度设置为115℃。反应初始阶段，芯片2在55℃聚合区预热，预热时间为120s，预热完成后，芯片2到达115℃快速升温区并在这里停留90s，快速升温完成后，芯片2到达95℃变性区，变性区停留30s，变性完成后，芯片2快速移动至快速降温区，停留75s，快速降温完成后，进入55℃聚合区，停留67s。此时完成一个温度循环，一个温度循环需要167s，一个完整的dPCR需要60个循环，因此一次试验需要2.8小时。

在荧光检测系统中，仅需要保证其性能满足dPCR模式的需要即可，那么同样可以满足qPCR模式的需要，而dPCR模式对荧光检测系统性能有很高的要求，既需光源能够均匀的照射到芯片2上，又需要相机具有高分辨率和大倍率。然而，高分辨率和大倍率带来了一个很严重的问题，相机的视场太小以至于不能拍摄到整个芯片2。为了解决上述技术问题，本申请中的荧光检测系统主要由激光源和光源12，照相机8和镜头组成，照相机8优选为CMOS相机。

为了使芯片2上的各个液滴获得均匀的光照，本申请根据现有CMOS相机镜头尺寸，自行设计制作了同轴光源结构，其包含一个激光器，一片平面均化片，一片滤波片，一块分光镜和镜筒。均为现有技术。平面均化片将圆形激光光源扩成方形光斑，激光的中心波长为480nm，激光遇到分光镜(分光镜对480nm光产生全反射)发生反射，从而使激光均匀的照射在芯片2上。受到激光激发的荧光(波长大约是500nm)穿过分光镜(分光镜对500nm光产生全透射)，经过滤光片(过滤到其他杂光，包括部分480nm的激光)到达CMOS镜头中，进而被CMOS相机捕获。

复合型PCR系统在dPCR模式下，本申请所采用的芯片2是2万乘2万的微阵列芯片，芯片2内的液滴体积在皮升级别，因此在荧光检测时，需要采用高分辨率的CMOS相机，并应用高放大倍率的镜头，这就导致相机获得视场很小，没法一次完成荧光拍摄。本发明利用扫描式拍照来解决这个问题，当芯片2顺序运动时，CMOS相机对它依次拍照，最后，通过对所得照片的处理，拼接成一幅完整的荧光照片，由此解决了高分辨率与拍摄所需大视场的矛盾的问题。

所公知的是，芯片2的顺序动作是实现扫描动作的关键，扫描式拍照是获得高清图片的常用手段，扫描动作要求芯片2与照相机8产生相对的移动。在本申请中，利用X-Y轴双向滑台7的X，Y轴联动，使芯片相对于照相机8产生相对移动，从而完成扫描动作。

虽然复合型PCR系统需要满足两种模式的荧光检测需要，但只要荧光检测系统的性能能够满足dPCR模式的需要，那么它也能满足qPCR模式的需要。dPCR模式对荧光检测系统性能有很高的要求，既需光源能够均匀的照射到芯片2上，又需要照相机8具有高分辨率和大倍率。然而，高分辨率和大倍率带来了一个很严重的问题，照相机8的视场太小以至于不能拍摄到整个芯片2，为了解决上述问题，本申请中荧光检测系统主要由激光源和光源12，CMOS相机和镜头组成。

复合型PCR系统在dPCR模式下，采用的芯片2是2万乘2万的微阵列芯片，芯片2内的液滴体积在皮升级别，因此在荧光检测时，需要采用高分辨率的CMOS相机，并应用高放大倍率的镜头，这就导致相机获得视场很小，无法一次完成荧光拍摄。本申请采用扫描式拍照来解决此问题，当芯片2顺序运动时，CMOS相机对芯片2依次进行拍照，最后，通过对所得照片的处理，拼接成一幅完整的荧光照片，这样就解决了高分辨率与拍摄所需大视场的矛盾。

在qPCR模式时，本申请采用的染料没有选择特异性，只要是双链DNA，染料就会结合并发出荧光，通过溶解曲线我们可以判断引物有没有发生非特异性扩增。在qPCR反应结束之后，调节加热片的温度，使加热片从60℃加热到95℃，在这个过程中，温度每次升高1℃，并维持5s，此时检测一次荧光强度。通过编程实现上述温度变化，荧光强度分析由控制器9处理。

应用本申请所提供的复合型PCR系统在qPCR模式下与现有技术qPCR反应效果对比：

本文采用两步法对核酸进行扩增，请参考图7，展示了复合型PCR系统实际的温度循环曲线，由此可以看到95℃和60℃这两个关键温度保持良好，并且没有温度过冲现象。按照这个温度循环，将相同试剂分别放在复合型PCR系统上和现有技术中的实时荧光PCR仪上进行试验，循环温度都为40℃，如图8和图9所示，本申请选取了三组试验结果得到了图8展示的复合型PCR系统的扩增试验结果，与市面上的qPCR仪相比，两种仪器在数值上存在有差异，本发明中采取20作为复合型PCR系统反应的荧光阙值，荧光阙值与扩增曲线的交点为Ct值，复合型PCR的Ct值分别为15.7，20.1，24.2，27.3，不同浓度的扩增曲线的Ct值间距较为均匀；而市面上的qPCR的Ct值为12.8，16.13，20.09，23.40，可见两个仪器得到的曲线具有相似性。为了检验复合型PCR系统反应的产物，本申请进一步进行了溶解试验(图10)，溶解曲线显示不同浓度的亮度衰减峰值很接近，在81℃左右，这就说明反应产物是特异性的。

应用本申请所提供的复合型PCR系统在dPCR模式下与现有技术qPCR反应效果对比：

图11展示了复合型PCR系统在dPCR模式下，实际的温度循环曲线，可以看到95℃和55℃这两个关键温度保持非常好，温度上升和下降的速度基本满足设计要求，温度的平台期明显。

综上所述，本申请通过试验证明了利用X-Y轴双向滑台7搭建一个融合了qPCR仪功能与dPCR仪功能的复合型PCR系统是切实可行的。复合型PCR系统初步解决了数字PCR仪的集成化问题，并且提供了两种核酸定量的方式，使用者可以根据定量精度和试验成本等实际需要选择合适的模式，复合型PCR系统所使用的各部件，例如X-Y轴双向滑台7、CMOS相机等、计算机等控制器设备价格低廉，性能稳定，能够精准地完成数字PCR和实时荧光PCR试验。

在一种具体实施例中，上述X-Y轴双向滑台7包括X向步进电机、X向滚珠丝杠、Y向步进电机和Y向滚珠丝杠，X向滚珠丝杠及Y向滚珠丝杠上设有放置平台，X向步进电机及X向滚珠丝杠整体置于Y向放置平台上，当Y向滚珠丝杠运行时，由Y向放置平台带动X向步进电机及X向滚珠丝杠整体沿Y向运动，此后，通过X向步进电机实现X向位移调整。

由上述可知，本发明在控制器9作用下，实现机械精准运动、热循环及荧光检测一体化自动控制，人工将待检测试剂加入到芯片2中，再将芯片2放置到芯片放置台3上，将芯片放置台3安装到X-Y机械滑移平台3上，热源放置架6上安装有解旋恒温热源4和退火恒温热源5，当控制器9分别对恒温热源4，以及机械滑移平台3上的步进电机发生指令时，芯片1由安装在滑台3上的芯片夹具2带动，在两个恒温热源4间按程序指令实现循环移动。具体温度循环过程为：设置退火恒温热源5的温度为60℃，解旋恒温热源4的温度为95℃，芯片2在60℃的恒温热源里存放30s，然后移动到95℃的解旋恒温热源4中存放10s。芯片完成60℃→95℃→60℃的温度循环，DNA进行一次复制，芯片在X-Y机械滑移平台的带动下移动，反复经过不同温度区，完成PCR扩增；完成扩增后，控制器9向激光源和光源12发送指令，打开光源，对芯片2进行照射，照相机8在计算机的控制下，对芯片2中心区域进行拍照，完成后，机械滑移平台3的X向步进电机和Y向步进电机接受指令，将芯片2移动到下一分区域，进行拍照；最后，通过软件实现样本浓度计算，绘制曲线。

进一步地，可以实现实时荧光定量PCR的快速升降温功能，具体来说，可以在热源放置架6上加装恒温加热热源10和恒温制冷热源11，结合上述解旋恒温热源4和退火恒温热源5构成快速升降温系统，恒温加热热源10和恒温制冷热源11均可以由蓄电池供电，也可以为交流电源供电，恒温加热热源10和恒温制冷热源11均与控制器9相连。

举例说明，在控制器9作用下，四个热源加热到目标温度，芯片2在60℃解旋恒温热源4下停留30s后，控制器9向X-Y轴双向滑台7发送指令，X-Y轴双向滑台7驱动芯片2沿X向移动40mm，Y向步进电机工作，芯片2沿Y轴移动60mm，此时芯片2到达135℃恒温加热热源10下，停留10s，停留时间到达后，X向步进电机和Y向步进电机依次工作，最终到达解旋恒温热源4处，完成快速升温过程；快速降温阶段，在95℃解旋恒温热源4停留10s后，Y向步进电机和X向步进电机依次工作，使得芯片2达到0℃恒温制冷热源11处，停留10s后，芯片2达到60℃，在X-Y轴双向滑台7的带动下，到达60℃退火恒温热源5处，完成快速降温阶段。

如图12所示，图12显示了恒温热源系统。主要分为四个区域，区域A为快速冷却区域，它可以通过加速通过USB风扇的气流来实现快速冷却。区域B是聚合区域，单链DNA与引物结合并延伸形成双链；区域C是变性区域，DNA变成单链；区域D是快速加热区域，可以通过高温加热器实现快速加热；箭头表示芯片放置台3的移动过程。由X轴滑块驱动，切屑台的移动过程为b-d-c-a-b。

由此可知，通过X-Y轴双向滑台7的程序化动作，辅以四个恒温热源，可以实现快速升降温功能。换言之，本实施例实现了变性温度、退火与延伸温度、过冷低温以及过热高温热源的偶联，实现快速升降温定量PCR技术，满足野外现场等场所需要快速扩增检测的使用需求。

为了减少散热降低能耗，可以在解旋恒温热源4、退火恒温热源5、恒温加热热源10以及恒温制冷热源11的底部及四周设置保温设备，例如，由保温硅胶和/或保湿泡沫构成的保温层，以减少热量散失，满足低能耗温度循环的需求。

此外，还可以设置保温盒，该保温盒罩设于基座1外部，用以容纳包括基座1、X-Y轴双向滑台7、照相机8在内的整个PCR平台，保温盒由防水保温层构成，尤其适用于零下温度的严酷环境现场野外检测需求。还可以在保温盒内设置加热设备，例如加热灯和/或加热丝和/或加热片，以维持保温盒内温度恒定，确保各部件良好运行，延长各部件使用寿命。

上述解旋恒温热源4、退火恒温热源5、恒温加热热源10和恒温制冷热源11具体为现有技术中的加热片或者恒温TEC设备。

上述芯片2可以为微点阵列芯片，或者在芯片2上设置液滴生成流道，其可以为Y型、T型或者十字型，将液体经不同流道汇入生成液滴，操作便捷。

本发明还提供一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，包括如下步骤：

步骤一，利用X-Y轴双向滑台7平移热源放置架6或者芯片放置台3，以使解旋恒温热源4对芯片2进行加热和保温，实现DNA双链解旋；

步骤二，利用X-Y轴双向滑台7机械式平移，以使芯片2在室温下冷却至退火温度；

步骤三，利用X-Y轴双向滑台7机械式平移，以使退火恒温热源5对芯片2进行保温，实现碱基配对和延伸；

步骤四，由控制器9控制照相机8对芯片2进行拍照；

步骤五，重复上述步骤；

步骤六，分析各照片中荧光亮度，绘制荧光亮度曲线。

在上述步骤一之前，还包括步骤：将油性试剂添加至芯片2中；将PCR反应试剂添加至油性试剂表面；将油性试剂再次添加至PCR反应试剂表面。

在进行qPCR试验时，发现试剂在反应孔内产生了大量了气泡在变性阶段温度较高的情况下，气泡快速膨胀然后破裂，这就导致了反应试剂被挤出反应孔，导致试验失败。经分析认为产生气泡的原因是：在PDMS与玻璃片键合时，孔边缘的PDMS下表面产生了划伤(开孔器开孔过程中造成)，使得反应孔边缘与玻璃片接触处存在气体，在变性阶段受到高温气体膨胀产生了气泡。

为了解决上述问题，通过改变试剂添加顺序来实现。试剂的添加过程为：首先，将试剂滴加到专用的加载器上；然后，利用加载器将试剂涂抹到芯片2表面并在芯片2表面滴一层油；最后，将盖子盖在芯片2上，并通过注射口将芯片2用油填充满。

由于矿物油的粘性要远远大于试剂(试剂性质与水的性质相似，并且试剂添加量少)，首先添加矿物油，充分利用矿物油的粘性，使它填满所有的缺陷坑；再添加试剂。利用上述方法，完全解决了qPCR反应时反应孔内产生气泡的问题，试验的成功率也得到提升。

关于芯片之中防止气泡产生的技术,本专利另外提出一种替代方案，通过直接将光滑表面的模具，例如圆柱形的小金属棒，在硅胶等前聚体从液态变成固态凝聚的过程中就将光滑表面小金属棒放在其中，这样的话在凝固之后就可以在其中形成一个一个的小的微孔，并且可以控制下底面的厚度很薄，从而实现更好的导热效率。这样的话，只需要将PCR的样本放在凝固之后的小孔子中进行一个循环就可以实现，没有气泡的产生。解决气泡的另外一种替代方案就是直接通过比较光滑的模板结构拷贝到PDMS等材质之中，然后将这一个带结构的PDMS与另外光滑表面的PDMS进行键合。但是在键合过程之中，避免通过等离子体对表面的处理，而是采用另外两种潜在方案:第1种技术是控制两个PDMS相应的前聚体比例不一样，例如一个采用是1:10配比，另外一个采用1:20配比，这样再加热80温度的情况下，一个小时左右就可以实现；第2种方法就是对于那一个光滑表面的PDMS在固态或者半固态的情况之下，就与那一个带有结构的PDMS进行连接，这样的话在高温下，例如95℃和100℃之下，二者就很快实现了键合。

在上述实施例的基础上，可以进一步提高升温速率，实现快速升降温，具体来说，在步骤：利用X-Y轴双向滑台7平移热源放置架6或者芯片放置台3，以使解旋恒温热源4对芯片2进行加热和保温，实现DNA双链解旋之前，可以通过恒温加热热源10将芯片2快速加热至解旋温度，然后，利用解旋恒温热源4对DNA进行解旋保温加热，由此可以缩短加热时间，提高加热效率。

为了更进一步地提高降温效率，可以在步骤：利用所述X-Y轴双向滑台7机械式平移，以使所述芯片2在室温下冷却至退火温度之后，执行快速降温工艺，具体来说，利用恒温制冷热源11将芯片2快速冷却至退火温度，然后，再利用退火恒温热源5对芯片2进行退火保温处理，由此缩短冷却时间，提高冷却效率。

在上述实施例的基础上，可以进行进一步改进。具体地，可以利用控制器9对芯片2进行分区，例如，可以将芯片划分为2X2，3X3，4X4或者5X5的片区，照相机8的初始位置位于芯片的中间区域，通过X，Y轴的移动带动芯片移动，可实现不同分区的精准移动从而实现对整个区域的拍照。后处理阶段，通过软件对拍摄的照片进行合成、分析及液滴数量统计，计算出样本浓度，通过多重点阵芯片体系，并且在每一个芯片2中，分别放入待测核酸的标准品样本以及待测样本，通过机械平移实现温度循环的同时，在退火温度区域，对于多重芯片的交接部位均进行荧光检测分析，从而实现每一个芯片交界部位在每一个温度循环的微点阵荧光强度的绘制与统计分析，由此可以绘制所有芯片荧光增强的曲线，以实现实时荧光定量PCR的功能，而在反应结束之后，利用多重新芯片各个区域进行正交平移，实现每一个细分区域所有荧光液滴的亮度分析，并进一步的满足数字PCR反应之后所有荧光点的分析统计需求。

经试验验证，通过对芯片2进行荧光拍照，通过比较利用CMOS相机在芯片2中心位置拍摄的照片与扫描式拍照(芯片分为4个区域，分别拍摄)，可以较为明显得出，采用扫描式拍照图像边缘的光照得到改善，成像质量得到提高；再将芯片2分为9个区域后，扫描的图像光照很均匀，成像质量很高，为后续的统计分析提供了良好的保障。

需要说明的是，在本说明书中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体与另外几个实体区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

以上对本发明所提供的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法及具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。例如，上述实现实时荧光PCR及数字PCR的两种芯片模式可以以一种芯片来替换。假如做一个高通量微液滴点阵芯片，在芯片之内区分出来几个不同的区域进行空间隔离,就可以在每一个隔离空间之内作为单独的反应单元，只要在一部分的反应单元之内通入已知模板浓度的梯度标准品，可以在温度循环过程之中，通过第一圈荧光信号检测进行标准工作曲线绘制；另一些反应单元之内就可以通入未知浓度的待测样本，并可以在荧光优化区域之内(例如所有反应单元交界部分)实现每一个温度循环所有点阵荧光信号同步分析。假如未知样本区域所有液滴均显示明显荧光,就可以通过这些液滴出现荧光平均Ct值与标准工作曲线进行比较，从而算出相应的模板数量；假如未知样本有一部分液滴显荧光，有一部分液滴不显示荧光,就可以进一步通过片区移动的方式，将区域内所有液滴荧光数字进行分析，并进一步结合波斯分布定律进行未知样本核酸浓度绝对定量。

Claims (10)

1.一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，包括：

基座(1)；

芯片放置台(3)，用以放置芯片(2)；

解旋恒温热源(4)，用以加热所述芯片(2)实现DNA双链解旋；

退火恒温热源(5)，用以对所述芯片(2)进行低温退火及适温延伸以实现引物与单链核酸模板结合及核苷酸在互补链的延伸增长；

热源放置架(6)，用以放置所述解旋恒温热源(4)及所述退火恒温热源(5)；

X-Y轴双向滑台(7)，安装于所述基座(1)，用以驱动所述芯片放置台(3)及所述热源放置架(6)沿X向和Y向运动；

照相机(8)，用以定时对所述芯片(2)进行拍照；

激光源和光源(12)，用以补充光源；

控制器(9)，用以控制所述X-Y轴双向滑台(7)、所述解旋恒温热源(4)、所述退火恒温热源(5)及所述照相机(8)定时运行。

2.根据权利要求1所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，所述X-Y轴双向滑台(7)包括X向滚珠丝杠、用以驱动所述X向滚珠丝杠运行的X向步进电机、Y向滚珠丝杠和用以驱动所述Y向滚珠丝杠运行的Y向步进电机，所述X向滚珠丝杠和所述Y向滚珠丝杠上各安装有放置平台。

3.根据权利要求2所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，还包括：

恒温加热热源(10)，置于所述热源放置架(6)、用以将所述芯片(2)快速加热至解旋温度；

恒温制冷热源(11)，置于所述热源放置架(6)，用以将所述芯片(2)快速降低至退火温度。

4.根据权利要求3所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，还包括围设于所述解旋恒温热源(4)、所述退火恒温热源(5)、所述恒温加热热源(10)及所述恒温制冷热源(11)的底部及四周的保温部件。

5.根据权利要求4所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，还包括用以容纳所述基座(1)的保温盒。

6.根据权利要求5所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，所述解旋恒温热源(4)、所述退火恒温热源(5)、所述恒温加热热源(10)及所述恒温制冷热源(11)可以为加热片或者恒温TEC设备。

7.根据权利要求1～6任一项所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统，其特征在于，所述芯片(2)可以为微点阵列芯片；或者所述芯片(2)设有液滴生成流道，所述液滴生成流道为Y型、T型或者十字型。

8.一种具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用X-Y轴双向滑台(7)平移热源放置架(6)或者芯片放置台(3)，以使解旋恒温热源(4)对芯片(2)进行加热和保温，实现DNA双链解旋；

利用所述X-Y轴双向滑台(7)机械式平移，以使所述芯片(2)在室温下冷却至退火温度；

利用所述X-Y轴双向滑台(7)机械式平移，以使退火恒温热源(5)对所述芯片(2)进行保温，实现碱基配对和延伸；

由控制器(9)控制照相机(8)对所述芯片(2)进行拍照；

重复上述步骤；

分析各照片中荧光亮度，绘制荧光亮度曲线。

9.根据权利要求8所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，其特征在于，所述利用X-Y轴双向滑台(7)平移热源放置架(6)或者芯片放置台(3)，以使解旋恒温热源(4)对芯片(2)进行加热和保温，实现DNA双链解旋之前，还包括步骤：利用恒温加热热源(10)将所述芯片(2)快速加热至解旋温度；

所述利用所述X-Y轴双向滑台(7)机械式平移，以使退火恒温热源(5)对所述芯片(2)进行保温，实现碱基配对和延伸步骤之后，还包括步骤：利用恒温制冷热源(11)将所述芯片(2)快速冷却至退火温度。

10.根据权利要求9所述的具有dPCR与qPCR功能的复合型PCR系统的控制方法，其特征在于，还包括步骤：将所述芯片(2)划分为若干个片区，在各所述片区中滴入待测核酸的标准样本和待测样本，对各所述片区的交接部位进行拍照和荧光检测分析。

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