CN110972940A - 一种高效培养米斛种苗的方法及所用培养基 - Google Patents

一种高效培养米斛种苗的方法及所用培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效培养米斛种苗的方法，以N6为基本培养基，在不同的生长阶段激素的种类、有机添加物的种类和混合使用的比例。本方法包括米斛无菌播种、原球茎分化、壮苗生根培养、试管苗移栽各步骤。本发明采用的培养基独特、材料易得:不受产地、季节的影响，方法可操作性强，种子萌发率及分化率高、并成功地获得了大量健壮、生长较一致、移栽成活率≥95%的组培苗，为米斛人工快繁探索了一条新的途径。

Description

一种高效培养米斛种苗的方法及所用培养基
技术领域
本发明涉及一种濒危珍稀药用植物种苗繁殖方法，具体涉及一种混合使用不同有机添加物高效培养米斛种苗的方法。
背景技术
米斛(Dendrobium huoshanense)具有很高的药用价值，自古以来就被认为是石斛中的极品，由于其自身繁殖能力低，人为过度采摘，致使野生资源基本灭绝，成为濒危珍稀植物，被列入《中国物种红色目录》中的“极危”（国家保护一级）品种。
米斛中富含多糖、氨基酸和石斛碱、石斛胺碱等十多种生物碱。经中国医学科学院药用植物研究所鉴定：米斛多糖含量为18.974%，总生物碱含量为0.030%。能有效提高机体免疫功能，对人体眼、咽、肺、胃、肠、肾等器官和血液、心血管等疾病有特殊疗效。能抗白内障，延缓衰老，抗突变，抗肿瘤。现代中医学研究证明，米斛具有滋养阴津(《中国药学大词典》)、增强体质(《药性论》)、补益脾胃(《本草再新》)、延年益寿(《神农本草经》)等功效作用，被称为药材界的“软黄金”。
米斛在药用及保健方面的突出作用越来越被市场接受，但是资源缺乏的瓶颈十分突出。据文献资料报道，米斛在种苗生产过程中，存在种源混杂、激素成分控制不严格、种苗变异率高、原球茎出苗率低、出苗不齐，培苗无根少根、不健壮，移栽成活率低等问题，这些因素的存在均不利于米斛产业的可持续健康发展。因此研究米斛高效快速增值技术，获得健壮、移栽易成活的优质培苗具有重要意义。本发明采用的培养基独特，材料易得：不受产地、季节的影响，可操作性强，种子萌发及分化率高，并成功地获得了大量健壮、生长较一致的组培苗，为米斛人工快繁探索了一条新的途径。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种高效培养米斛种苗的方法，该方法可操作性强，材料易得，不受产地、季节的影响，种子萌发及分化率高，瓶苗健壮，栽种易成活。
本发明通过对得到的成熟而未开裂的蒴果，在种子萌发培养基上进行无菌播种，原球茎分化后再转移到壮苗培养基上培养，形成的试管苗经过无太阳光直射的自然光照下炼苗后出瓶栽培，试管苗移栽成活率达到95%以上，由于靠本发明人利用了培养基上培养出壮苗，经长期摸索终于找到适合壮苗的培养基作为发明点，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案是：一种高效培养米斛种苗的的米斛人工育种方法，包括以下的步骤：
⑴无菌播种：取发育成熟而未开裂的米斛蒴果作为外植体，用70～75%（v/v）酒精消毒30～60秒后，用无菌水冲洗1～2次，后用质量分数为1%～2%的次氯酸钠消毒10～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次后晾干。切开果实，用接种针将黄色粉末状种子接种到装有80-140ml种子萌发培养基的培养瓶中培养，种子萌发成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L香蕉+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
⑵原球茎分化：将无菌播种获得的密集原球茎分散接种到装有80-140ml原球茎分化培养基的培养瓶中培养，，使其分化形成完整的1～2cm的新芽，所述的原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L土豆+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
⑶壮苗生根培养：将原球茎分化培养基上获得的较密集的新芽接种到装有80-140ml壮苗生根培养基的培养瓶中培养，新芽进一步形成2.5～6cm高的带根小苗，所述的壮苗生根培养基为1/2N6培养基+NAA 0.1～0.5mg/L+50～100g/L（土豆+香蕉（1:0.5～1.2）））+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
⑷试管苗移栽：当小苗形成的植株长至2.5～6厘米时，将培养瓶转移至无太阳光直射的自然光照下炼苗7～14天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移至树皮、碎石按体积比3:1的混合基质中栽培，得到4～8cm、每丛有3～5个芽的种苗；
在上述⑴-⑶各步骤中所用的培养基pH均为5.4～5.9，所添加的土豆和香蕉经去皮后，打成泥状，培养温度25～30℃，每天光照10～12个小时，光照度1500～2000lx。
本发明具有下列优点和效果：
目前，有关有机添加物在米斛植物组培中的应用虽有不少的报道，但对米斛不同的生长阶段有机添加物的混合应用的研究尚未见报道。本发明利用香蕉和土豆各自的作用特点，将它们有机的结合在一起应用在米斛不同的培育阶段，有机物的混合使用在米斛壮苗生根阶段起到了意想不到的作用。本发明采用的培养基独特，是将两种有机物巧妙地结合在一起，材料易得：不受产地、季节的影响，可操作性强，种子萌发及分化率高，并成功地获得了大量健壮、生长较一致的组培苗，为米斛人工快繁探索了一条新的途径。具体分析如下：
1.香蕉、土豆都含有多种天然植物激素及丰富的无机盐离子，都可以增进米斛的生物量，但它们的添加量都有个最佳点，超过这个点，将不利于米斛组培苗的生长。
2.添加合适的香蕉泥（前面并未提到“香蕉泥”）质量分数，试管苗的茎和根加长加粗明显，还可维持培养基的PH值在5.0～5.5之间有缓冲作用，但达到一定质量分数时，随着培养基渗透压升高，抑制了植株对水分和养分的吸收，进而抑制了植株正常生长发育，瓶苗会出现早黄甚至死亡。
3.添加合适的土豆泥（前面并未提到“土豆泥”）对米斛瓶苗茎和根的作用不及香蕉泥，但是对瓶苗叶绿素含量的提高效果要高于香蕉泥，使组培苗的叶子能较长时间保持翠绿，生机旺盛。
4.有实验表明，随着继代次数的增加，有机附加物C H其在丛芽增殖过程中效果不明显。
5.基于以上的分析，米斛各个培育期所采用的培养基及培育结果如下：
5.1种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L香蕉+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；试验获得了直径为1.5～2.0mm左右的饱满深绿，致密的原球茎。
5.2原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L土豆+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；试验分化率≥95%，获得了完整的1～2cm的新芽，颜色鲜绿。本项研究中发现添加香蕉提取物原球茎逐渐褐化，大部分死亡，实验证明土豆提取物能有效地促进米斛原球茎分化，这可能与土豆中含有一定量的内源激素外，还可能是土豆贮藏组织含有高钾有关。
5.3壮苗生根培养基为1/2N6培养基+NAA 0.1～0.5mg/L+50～100g/L（土豆+香蕉）+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水； 试验获得了根数≥10条，分蘖数2～3支，叶片数3～5条，株高2.5～6cm，茎粗2.5～5mm，叶色碧绿的优质组培苗。
实验的最终目的是希望获得健壮，丛芽较少、生长较一致、栽培成活率较高的组培苗，所以在壮苗生根阶段，将土豆和香蕉混合使用，且总量比其它生长期减少了一半。总而言之，在米斛的组织培养中，添加香蕉提取液、土豆提取液可促进幼苗的生长和发育，但添加的比例我们认为因植物生长发育阶段而定。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：一种高效培养米斛种苗的方法，包括以下步骤：
⑴无菌播种：取发育成熟而未开裂的米斛蒴果作为外植体，用72%（V/V）酒精消毒50秒后，用无菌水冲洗2次，后用质量分数为1%的次氯酸钠消毒10分钟，再用无菌水漂洗5次后晾干；切开果实，用接种针将黄色粉末状种子接种到装有100ml左右种子萌发培养基的培养瓶中培养，种子萌发成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA0.3mg/L+150g/L香蕉+25g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；获得了直径为1.5～2.0mm左右的饱满深绿，致密的原球茎。
⑵原球茎分化：将无菌播种获得的密集原球茎分散接种到装有120ml左右原球茎分化培养基的培养瓶中培养，，使其分化形成完整的1～2cm的新芽，所述的原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+200g/L土豆+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.7g/L活性炭，其余为水；试验分化率≥95%，获得了完整的1～2cm的新芽，颜色鲜绿。
⑶壮苗生根培养：将原球茎分化培养基上获得的较密集的新芽接种到装有120ml左右壮苗生根培养基的培养瓶中培养，所述的壮苗生根培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+100g/L香蕉+28g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；
在上述⑴-⑶各步骤中所用的培养基pH均为5.4～5.9，所添加的土豆和香蕉经去皮后，用食物料理机打成泥状，培养温度25～30℃，每天光照11个小时，光照度1500～2000lx。
实施例1在预实验中，采用原球茎分化培养为1/2N6培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA0.3mg/L+150g/L土豆+50g/L香蕉+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.7g/L活性炭，研究发现，添加香蕉后只有部分原球茎分化，而大部分原球茎逐渐褐化，甚至死亡。
实施例1壮苗生根培养采用香蕉作为有机添加物，同时还有细胞分裂素6-BA,在培养50-60天时，组培苗茎和根加长加粗明显，丛生芽也增殖明显，出现了许多小苗和弱苗，随着培养时间的延长，培养基出现褐化，瓶苗出现早黄甚至死亡，这与实验设想的获得健壮、丛芽较少，生长较一致的情况不符，这可能是由于添加了过量的香蕉和细胞分裂素6-BA ，导致植株过分增值营养不够而早衰。
实施例2一种高效培养米斛种苗的方法，包括以下步骤：
⑴无菌播种：取发育成熟而未开裂的米斛蒴果作为外植体，用72%（V/V）酒精消毒50秒后，用无菌水冲洗2次，后用质量分数为1%的次氯酸钠消毒10分钟，再用无菌水漂洗5次后晾干；切开果实，用接种针将黄色粉末状种子接种到装有100ml左右种子萌发培养基的培养瓶中培养，种子萌发成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA0.3mg/L+150g/L香蕉+25g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；获得了直径为1.5～2.0mm左右的饱满深绿，致密的原球茎。
⑵原球茎分化：将无菌播种获得的密集原球茎分散接种到装有120ml左右原球茎分化培养基的培养瓶中培养，，使其分化形成完整的1～2cm的新芽，所述的原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+200g/L土豆+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.7g/L活性炭，其余为水；试验分化率≥95%，获得了完整的1～2cm的新芽，颜色鲜绿。
⑶壮苗生根培养：将原球茎分化培养基上获得的较密集的新芽接种到装有120ml左右壮苗生根培养基的培养瓶中培养，所述的壮苗生根培养基为1/2N6培养基+NAA 0.2mg/L+100g/土豆+28g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；
在上述⑴-⑶各步骤中所用的培养基pH均为5.4～5.9，所添加的土豆和香蕉经去皮后，用食物料理机打成泥状，培养温度25～30℃，每天光照11个小时，光照度1500～2000lx。
实施例2壮苗生根培养采用土豆作为有机添加物，同时去掉6-BA,在培养70-80天左右时，组培苗叶色翠绿，分蘖数2-3支，植株高在 2.5～6厘米，生长较一致，但根系不发达，不适合栽种。
实施例3：一种高效培养米斛种苗的方法，包括以下步骤：
⑴无菌播种：取发育成熟而未开裂的米斛蒴果作为外植体，用72%（V/V）酒精消毒50秒后，用无菌水冲洗2次，后用质量分数为1%的次氯酸钠消毒10分钟，再用无菌水漂洗5次后晾干；切开果实，用接种针将黄色粉末状种子接种到装有100ml左右种子萌发培养基的培养瓶中培养，种子萌发成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA0.3mg/L+150g/L香蕉+25g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；获得了直径为1.5～2.0mm左右的饱满深绿，致密的原球茎。
⑵原球茎分化：将无菌播种获得的密集原球茎分散接种到装有120ml左右原球茎分化培养基的培养瓶中培养，，使其分化形成完整的1～2cm的新芽，所述的原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+200g/L土豆+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.7g/L活性炭，其余为水；试验分化率≥95%，获得了完整的1～2cm的新芽，颜色鲜绿。
⑶壮苗生根培养：将原球茎分化培养基上获得的较密集的新芽接种到装有120ml左右壮苗生根培养基的培养瓶中培养，所述的壮苗生根培养基为1/2N6培养基+NAA 0.2mg/L+60g/L土豆+40g/L香蕉+28g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.8g/L活性炭，其余为水；
⑷试管苗移栽：当小苗形成的植株长至2.5～6厘米时，将培养瓶转移至无太阳光直射的自然光下炼苗7～14天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移至树皮、碎石按体积比3:1的混合基质中栽培；
在上述⑴-⑶各步骤中所用的培养基pH均为5.4～5.9，所添加的土豆和香蕉经去皮后，用食物料理机打成泥状，培养温度25～30℃，每天光照11个小时，光照度1500～2000lx。
实施例3在壮苗生根培养中同时添加了土豆和香蕉（土豆：香蕉=1:0.7，质量比），在培养70-80天左右时，试验获得了根数≥10条，分蘖数2～3支，叶片数3～5片，株高2.5～6cm，茎粗2.5～5mm，叶色碧绿的优质组培苗。在适宜的春季（4月初）移栽14-21天时，每丛都有3～5个新芽长出，进入冬季时株高达4～8cm，成活率达到了98%以上。

Claims (6)

1.一种高效培养米斛种苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
⑴无菌播种；
⑵原球茎分化；
⑶壮苗生根培养。
2.根据权利要求1所述的高效培养米斛种苗的方法，其特征在于：
⑴无菌播种：取发育成熟而未开裂的米斛蒴果作为外植体，用70～75%酒精消毒30～60秒后，用无菌水冲洗1～2次，后用质量分数为1%～2%的次氯酸钠消毒10～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次后晾干；切开果实，用接种针将黄色粉末状种子接种到装有80-140ml种子萌发培养基的培养瓶中培养，种子萌发成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L香蕉+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
⑵原球茎分化：将无菌播种获得的密集原球茎分散接种到装有80-140ml原球茎分化培养基的培养瓶中培养，使其分化形成完整的1～2cm的新芽，所述的原球茎分化培养基为1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L土豆+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
⑶壮苗生根培养：将原球茎分化培养基上获得的较密集的新芽接种到装有80-140ml壮苗生根培养基的培养瓶中培养，新芽进一步形成4～6cm高的带根小苗，所述的壮苗生根培养基为1/2N6培养基+NAA 0.1～0.5mg/L+50～100g/L（土豆+香蕉）+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
在上述⑴-⑶各步骤中所用的培养基pH均为5.4～5.9，所添加的土豆和香蕉经去皮后，打成泥状，培养温度25～30℃，每天光照10～12个小时，光照度1500～2000lx。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：还包括：⑷试管苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养瓶转移至无太阳光直射的自然光下炼苗7～14天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移至树皮、碎石按体积比3:1的混合基质中栽培，得到4～8cm、每丛有3～5个芽的种苗。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤（3）的壮苗生根培养基中土豆和香蕉的用量质量比1:0.5～1.2。
5.一种高效培养米斛种苗的培养基，包括：
种子萌发培养基：1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L香蕉+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
原球茎分化培养基：1/2N6培养基+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+100～200g/L土豆+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水；
壮苗生根培养基：1/2N6培养基+NAA 0.1～0.5mg/L+50～100g/L（土豆+香蕉）+20～30g/L蔗糖+4～7g/L琼脂+0.5～1g/L活性炭，其余为水。
6.根据权利要求5所述的高效培养米斛种苗的培养基，其特征在于：壮苗生根培养基中土豆和香蕉的用量质量比为1:0.5～1.2。
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