CN110964820A - 膀胱癌生物标志物tjp1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种膀胱癌生物标志物TJP1及其应用。本发明发现了TJP1在膀胱癌组织中的表达量与肿瘤恶性程度指标KI67的表达呈明显的正相关，表明TJP1可能作为膀胱癌恶性程度的指标来预示膀胱癌的发生发展。通过3D培养检测TJP1敲低后对膀胱癌血管生成拟态的影响，发现TJP1敲低后可明显降低血管生成拟态的效果，TJP1过表达会增强血管生成拟态的效果，表明TJP1明显地影响了膀胱癌早期血管生成的效果，从而影响膀胱癌的发生发展。而且TJP1敲低后可明显抑制裸鼠成瘤的血管生成以及血管生成拟态的效果，提示TJP1可作为膀胱癌发生发展的生物标志物。

Description

膀胱癌生物标志物TJP1及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种膀胱癌生物标志物TJP1及其应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，找到明显影响膀胱癌发生发展，转移以及复发的调节因子以及研究清楚其作用的具体机制对于膀胱癌的治疗是非常重要的。多方面对膀胱癌治疗的机制研究表明，膀胱癌的发生发展是一个极其复杂的过程，而近30年来，尚无靶向药物被批准用于治疗膀胱癌，迫切需要取得研究进展来提高膀胱癌的诊断和治疗水平。因此找到膀胱癌诊断标志物，针对高危人群进行筛查，并找到合理的用药方案来提高病人的生存率，以及减少膀胱癌的复发率是泌尿生殖系肿瘤亟待解决的科学问题。
肿瘤内部的血管生成对肿瘤的生长具有重要的作用，肿瘤血管为肿瘤组织提供新陈代谢所必需的的氧气和营养，从而使肿瘤得以迅速的生长。在研究黑色素瘤的微循环中发现了一种与经典肿瘤血管生成途径完全不同的，不依赖于内皮细胞的全新的血管生成模式。黑色素瘤细胞通过自身变形与细胞外基质相互作用，模仿血管壁结构的模式，形成可输送血液的管道系统，从而重建了肿瘤的微循环，并在某个环节与宿主血管相连使得肿瘤获得血管供应，这个过程称为血管生成拟态。血管生成拟态可能是一种重要的肿瘤存活机制，在肿瘤进展早期可能完全剥夺肿瘤的血液供应，从而促进肿瘤的发生发展。许多研究表明血管生成拟态与多种肿瘤患者预后密切相关，可作为预后的独立预测因子。因此，找到影响血管生成拟态形成的环节以及抑制血管生成拟态形成可以明显抑制肿瘤的发生发展。紧密连接蛋白(Tight junction protein 1,TJP1,Gene ID:7082)则是细胞紧密连接的一部分，并可以调节肌动蛋白细胞骨架重塑，在细胞紧密连接以及细胞分化中发挥了及其重要的作用。近年来随着研究的发展，TJP1在不同肿瘤中的异常表达以及对肿瘤的转移以及侵袭的作用逐步被发现，然而TJP1与膀胱癌之间是否存在联系仍未被明确。
发明内容
基于此，有必要提供一种可用于膀胱癌的检测、治疗或预后评估的生物标志物。
本发明发现了一种膀胱癌的生物标志物—TJP1基因。
作为本发明的一方面，本发明提出TJP1基因作为生物标志物在制备用于膀胱癌的检测、治疗或预后评估的试剂、试剂盒、药物或装置中的应用。
作为本发明的另一方面，本发明还提供了一种核糖核酸，所述核糖核酸能够特异性地抑制TJP1基因的表达，所述核糖核酸为shRNA，且所述核糖核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种PCR引物组合物，包括能够在mRNA水平检测TJP1基因表达水平的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种抗体，所述抗体为能够特异性结合TJP1蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的敲低膀胱癌细胞TJP1基因表达的方法，包括以下步骤：使用上述核糖核酸包装相应的慢病毒，然后感染膀胱癌细胞。
本发明还提供了上述核糖核酸、上述PCR引物组合物及上述抗体在制备用于膀胱癌的检测或治疗的试剂、试剂盒或装置中的应用。
本发明还提供了一种用于检测或治疗膀胱癌的试剂或试剂盒，包括上述核糖核酸、上述PCR引物组合物和/或上述抗体。
我们通过在裸鼠皮下移植瘤中检测TJP1的表达发现TJP1在膀胱癌组织中的表达量与肿瘤恶性程度指标KI67的表达呈明显的正相关，表明TJP1可能作为膀胱癌恶性程度的指标来预示膀胱癌的发生发展。进一步地，我们发现膀胱癌细胞中有血管生成拟态的效果，并构建了膀胱癌T24以及5637稳定敲低TJP1的细胞系，通过3D培养检测TJP1敲低后对膀胱癌血管生成拟态的影响，结果发现TJP1敲低后可明显降低血管生成拟态的效果。同时，构建TJP1过表达的细胞系检测血管生成拟态，发现TJP1过表达会增强血管生成拟态的效果，表明TJP1明显地影响了膀胱癌早期血管生成的效果，从而影响膀胱癌的发生发展。随后，我们将膀胱癌T24以及5637稳定敲低TJP1的细胞系混合基质胶注射入裸鼠皮下进行基质栓实验检测动物体内效果，结果表明TJP1敲低后可明显抑制裸鼠成瘤的血管生成以及血管生成拟态的效果，提示TJP1可作为膀胱癌发生发展的生物标志物。本发明有助于开发针对TJP1基因表达的检测试剂盒，以预测膀胱癌病人的恶性程度，也有助于寻找降低TJP1基因表达的分子抗癌药物，从而可在膀胱癌发生的早期通过抑制肿瘤的血管生成来抑制肿瘤的发生发展，提高膀胱癌患者的生存率，使患者节约医疗费用，延长生存时间，能够产生显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为PIKO.1载体的质粒图谱；
图2为构建的膀胱癌细胞T24的TJP1敲低细胞系在蛋白水平以及mRNA水平的效果验证；
图3为构建的膀胱癌细胞5637的TJP1敲低细胞系在蛋白水平以及mRNA水平的效果验证；
图4为免疫组化实验检测TJP1以及KI67的表达的结果图；
图5为膀胱癌T24细胞系敲低TJP1后血管生成拟态的检测结果；
图6为膀胱癌5637细胞系敲低TJP1后血管生成拟态的检测结果；
图7为构建的Dox诱导TJP1过表达的膀胱癌T24细胞系在蛋白水平以及mRNA水平的效果验证；
图8为构建的Dox诱导TJP1过表达的膀胱癌5637细胞系在蛋白水平以及mRNA水平的效果验证；
图9为膀胱癌T24细胞系通过Dox诱导过表达TJP1后血管生成拟态的检测结果；
图10为膀胱癌5637细胞系通过Dox诱导过表达TJP1后血管生成拟态的检测结果；
图11为膀胱癌细胞T24的TJP1敲低细胞系的成瘤表面血管图；
图12为膀胱癌细胞5637的TJP1敲低细胞系的成瘤表面血管图；
图13为膀胱癌细胞T24的TJP1敲低细胞系成瘤后CD31表达和PAS染色的结果图；
图14为膀胱癌细胞5637的TJP1敲低细胞系成瘤后CD31表达和PAS染色的结果图；
图15为临床膀胱癌病人标本的Ki67、TJP1、CD31以及PAS染色分析结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一、TJP1基因表达与肿瘤恶性程度标志物KI67的相关性分析
1、设计敲低TJP1所用的shRNA序列
设计得到如表1所示的两条shRNA序列以及对照序列Con-shRNA，将上述序列交给引物合成公司(上海生物工程有限公司)合成(PAGE级纯化)。
表1
Figure BDA0002319429890000051
2、载体连接
将设计的shRNA序列连接到PIKO.1载体，PIKO.1载体购于Addgene公司，其质粒图谱如图1所示。
酶切载体：PlKO.1载体使用AgeI以及EcoRI两个内切酶进行酶切，37℃酶切3～4小时。磷酸化TJP1的shRNA序列并退火：TJP1的shRNA序列两端含有AgeI以及EcoRI两个酶切位点的粘性末端，将shRNA引物溶解后于PCR仪中37℃，30分钟，然后95℃，15分钟，然后梯度降温到25℃，退火形成双链DNA。载体与shRNA序列连接重组：将PlKO.1载体与带有粘性末端的双链DNA在T4 DNA连接酶作用下16℃过夜连接。
3、转化
取Stbl3感受态置于冰上融化，加入连接产物，轻弹管壁混匀，置于冰上30min，42℃水浴90s，迅速转移到冰上，放置5分钟，加入500μL LB培养基，放到37℃的摇床中培养1～2小时，用涂布棒均匀涂在氨苄抗性的固体LB培养基平板中，放在37℃的摇床中过夜培养。
用200μl枪头挑取单个菌落放于5mL氨苄抗性的LB培养基的EP管中，放入37℃的摇床继续摇菌，待菌液浑浊，取菌液进行菌液PCR鉴定，选取阳性克隆进一步测序鉴定。
4、扩大培养提取质粒
测序结果正确后，取阳性克隆的菌液扩大培养，采用Magen公司中提质粒试剂盒进行病毒载体的高纯度无内毒素抽提。
5、转染
使用293T细胞进行慢病毒包装体系的质粒转染细胞，采用Lipo3000的脂质体转染试剂，将慢病毒系统质粒psPAX2，pMG2.G以及重组的PlKO.1的shRNA和对应的sh-Control载体转染进293T细胞，24小时到48小时后收细胞上清。
6、感染宿主细胞
将细胞上清液过0.45μm的低吸附无菌过滤器进行过滤，将T24以及5637细胞的上清液去除，将过滤的上清液加入需要进行敲低的T24以及5637细胞系中。对T24以及5637加入不同浓度的嘌呤霉素进行抗性筛选，选取48小时后细胞几乎全部被杀死的浓度作为嘌呤霉素筛选稳定表达细胞的浓度。病毒上清感染宿主细胞24小时后，在T24以及5637的构建细胞系中加入测定的嘌呤霉素的浓度，通过嘌呤霉素筛选出被转染进去的稳定表达的细胞。
将稳定表达的细胞进行扩大培养，并提取细胞裂解液进行Western blot以及RT-qPCR检测。通过Western blot方法检测蛋白水平TJP1的表达，对比TJP1的shRNA和对应的sh-Control的稳定细胞系中TJP1的表达，确定TJP1的敲低效果。通过RT-qPCR检测mRNA水平TJP1的表达，确定转录水平TJP1的敲低效果，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。结果如图2和图3所示，表明成功构建得到膀胱癌T24以及5637稳定敲低TJP1的细胞系。
SEQ ID NO.3：ACCAGTAAGTCGTCCTGATCC
SEQ ID NO.4：TCGGCCAAATCTTCTCACTCC
7、免疫组化染色(使用优宁维ABsin免疫组化试剂盒进行检测)
通过扩大培养上述细胞系，将T24敲低TJP1的细胞系以每只裸鼠每侧2×106细胞注射到裸鼠背部皮下两侧。待裸鼠成瘤2个月后将裸鼠解剖，取皮下肿瘤进行固定，并切取部分肿瘤进行包埋并切片，随后进行免疫组化染色。
(1)组织脱蜡：将组织石蜡切片于65℃烘箱放置2h，从烘箱取出后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各10min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各3min，PBS洗5min，重复洗涤3遍；
(2)抗原修复：高压锅内加入1L的抗原修复液，将切片架放入高压锅内，开始煮沸，当高压锅进入高压状态时开始计时，进行抗原修复2～3min(具体修复时间以要检测的蛋白性质决定)，自然冷却；
(3)PBS浸泡洗涤5min，重复洗涤3遍；
(4)用3％的甲醇配制的H2O2浸泡玻片，封闭内源性过氧化物酶，室温10min；
(5)PBS浸泡洗涤5min，重复洗涤3遍；
(6)超级封闭液封闭：取出玻片，依照组织大小滴加适量超级封闭液，室温封闭内源性生物素5min，不要超过10分钟；
(7)甩除超级封闭液，勿洗，滴加适量一抗稀释液配制的CD31抗体溶液(1:50)，确保覆盖全部组织，4℃孵育过夜；
(8)PBS浸泡洗涤5min，重复洗涤3遍；
(9)滴加一抗放大液，37℃孵育10min；
(10)滴加辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，37℃孵育10min；
(11)PBS浸泡洗涤5min，重复洗涤3遍；
(12)DAB显色1～3min，具体时间以显微镜下观察控制，自来水冲洗，终止显色；
(13)苏木素复染，1min左右，不易染色过深，用梯度浓度75％、85％、95％、100％的乙醇脱水，每个浓度浸泡3min；
(14)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各浸泡10min，取出后立即用中性树胶封片，避免气泡产生，自然晾干。
(15)显微镜下观察病理切片，组织上有棕色的显色即为蛋白的阳性染色。
结果如图4所示，通过免疫组化实验检测TJP1以及KI67的表达，结果表明TJP1敲低的细胞系中TJP1的表达量明显降低，且TJP1敲低后明显抑制了KI67的表达，表明TJP1的表达与肿瘤的恶性程度相关，即抑制TJP1的表达可抑制肿瘤的发生发展。
二、TJP1基因表达与膀胱癌的血管生成拟态效果的相关性分析
构建Dox(多西环素)诱导TJP1过表达的膀胱癌T24以及5637细胞系，结合上述膀胱癌T24以及5637稳定敲低TJP1的细胞系，检测TJP1基因表达与膀胱癌的血管生成拟态效果的相关性。
将200μl的枪头放置冰箱或冰上预冷20min～30min，从-20℃冰箱中取出Matrigel基质胶(BD 254234)，将其置于4℃冰箱待其融化。融化后取50μl/孔Matrigel基质胶直接加入96孔板中，加入时避免产生气泡，置于细胞培养箱中30min以上待其凝固。然后待细胞消化完全后，终止消化，计数后用培养基重悬细胞并调整细胞密度为(2～3)×10000个/100μl。待胶凝固后，取出96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，做好标记后放入细胞培养箱常规培养12～24h。待细胞有血管生成拟态趋势后将孔板拿出，弃去旧液，每孔加入50μl的Calcein-AM，浓度为1μM，室温孵育20～30min，然后去荧光显微镜下观察，发现细胞被染色后拍照。
结果如图5～10所示，我们发现TJP1敲低后可明显降低血管生成拟态的效果，且TJP1过表达会增强血管生成拟态的效果，表明TJP1明显地影响了膀胱癌早期血管生成，即抑制TJP1的表达可抑制膀胱癌早期血管生成效果。
三、TJP1基因敲低后在动物体内的效果
将200μl以及1mL的枪头放置冰箱或冰上预冷20～30min，从-20℃冰箱中取出Matrigel基质胶(BD 254230)，将其置于4℃冰箱待其融化。待细胞消化完全后，终止消化，计数，每只裸鼠每侧注射2×106细胞数。并将细胞按照基质胶与培养基3:1的比例混悬，每侧总体积为200μL。用胰岛素注射针头皮下注射裸鼠背部两侧。待10～15天后，将裸鼠处死，取出背部两侧的基质栓，观察肿瘤表面血管可明显发现TJP1敲低的细胞系成瘤表面血管明显减少，如图11～12所示。随后在多聚甲醛中固定48小时以上后进行石蜡包埋，然后将包埋的组织切片进行免疫组化染色，通过免疫组化实验检测CD31的表达以及血管生成拟态指标染色方法PAS染色检测血管生成以及血管生成拟态的效果。
将石蜡切片于65℃烘箱放置2h，从烘箱取出后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各10min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各3min，PBS洗5min，重复洗涤3遍。蒸馏水浸洗2min，水龙头下冲洗2min，再入蒸馏水浸洗2次。将切片浸入高碘酸溶液，室温染色8min。水龙头下冲洗2min，再入蒸馏水浸洗2次。将切片浸入雪夫(Schiff)试剂室温避光染色20min。水龙头下冲洗15min，再入蒸馏水浸洗2次。将切片浸入苏木精染色液进行细胞核染色1min，将切片浸入酸性乙醇分化液分化2～5s左右。蒸馏水浸洗2次，水龙头下冲洗20min，使其返蓝。用梯度浓度75％、85％、95％、100％的乙醇脱水，每个浓度浸泡3min。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各浸泡10min，取出后立即用中性树胶封片，避免气泡产生，自然晾干。显微镜下观察病理切片，组织上有明显的紫红色成环的染色即为血管生成拟态阳性染色。
结果如图13～14所示，发现TJP1敲低后CD31的表达明显降低，且PAS染色成环数明显降低，表明JTP1敲低后可明显抑制血管生成以及血管生成拟态的效果，即在抑制TJP1的表达可抑制体内膀胱癌早期血管生成效果。
四、临床数据分析
从临床病理科随机选取58例膀胱癌临床病人标本(临床膀胱癌病人标本由中山大学第五附属医院病理科提供)进行免疫组化染色分析，对标本进行Ki67、TJP1、CD31以及PAS染色分析，Ki67是恶性肿瘤的标志物，CD31是内皮细胞的标志物，PAS是血管生成拟态的标志物。结果如图15所示，表明在Ki67高表达的组织中TJP1也有明显的高表达，且TJP1高表达明显增加了PAS以及CD31的表达。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中山大学
<120> 膀胱癌生物标志物TJP1及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgggcctgc atacaataaa gcaaactcga gtttgcttta ttgtatgagg cttttg 56
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgggcgatc tcataaactt cgtaactcga gttacgaagt ttatgagatc gctttttg 58
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accagtaagt cgtcctgatc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcggccaaat cttctcactc c 21

Claims (8)

1.TJP1基因作为生物标志物在制备用于膀胱癌的检测、治疗或预后评估的试剂、试剂盒、药物或装置中的应用。
2.一种膀胱癌生物标志物，其特征在于，所述膀胱癌生物标志物为TJP1基因。
3.一种核糖核酸，其特征在于，所述核糖核酸能够特异性地抑制TJP1基因的表达，所述核糖核酸为shRNA，且所述核糖核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.一种PCR引物组合物，其特征在于，包括能够在mRNA水平检测TJP1基因表达水平的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体为能够特异性结合TJP1蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.一种非疾病的诊断和治疗目的的敲低膀胱癌细胞TJP1基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求3所述的核糖核酸包装相应的慢病毒，然后感染膀胱癌细胞。
7.权利要求3所述的核糖核酸、权利要求4所述的PCR引物组合物及权利要求5所述的抗体在制备用于膀胱癌的检测或治疗的试剂、试剂盒或装置中的应用。
8.一种用于检测或治疗膀胱癌的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的核糖核酸、权利要求4所述的PCR引物组合物和/或权利要求5所述的抗体。
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