CN110964114A

CN110964114A - 一种双靶点抗原结合分子

Info

Publication number: CN110964114A
Application number: CN201811149882.2A
Authority: CN
Inventors: 徐立忠; 王明; 须珏华; 邹珊珊; 黄黎明; 赵璟; 王少雄
Original assignee: Shanghai Bogun Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bogun Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN110964114B

Abstract

本发明涉及一种双靶点抗原结合分子，包含：双靶点抗原结合分子的药物组合物及其用于治疗疾病的用途。另外，本发明还涉及产生双靶点抗原结合分子的方法。

Description

一种双靶点抗原结合分子

技术领域

本发明涉及一种双靶点抗原结合分子、一种包含所述双靶点抗原结合分子的药物组合物、及其用于治疗疾病的用途。此外，本发明还涉及一种制造所述双靶点抗原结合分子的方法。

背景技术

双靶点抗原结合分子靶向两种不同的抗原，例如，T细胞的CD3分子和癌细胞的肿瘤特异性抗原对于癌症治疗具有重大前景。在这些分子中，已经有一些投入到了市场。然而，直至现在，此类双特异性抗体的治疗效果并不如所期望的那样令人满意。实例为卡妥索(Catumaxomab，EpCAM×CD3双特异抗体，由于源于脱靶ADCC效应的重大副作用已经退出市场)。另举一例，博纳吐(Blinatumomab，CD19×CD3双特异性T细胞衔接体)，由于它的半衰期短而且用药方式不方便，为患者施用此种药物的热情受到了严重打击。本发明的目的在于，开发一种克服此类问题的、新一代的双靶点抗原结合分子。

发明内容

本发明涉及新一代双靶点抗原结合分子，一方面，它展示出结合和消减靶细胞的良好效果，另一方面，它显示出带有降低的Fc介导副作用的常规IgG药代动力学(例如长的血浆半衰期)。本发明提供的此类分子在一定程度上满足了临床上对双靶点抗原结合分子的需要。

具体地在一个方面，正如本发明所提供的是双靶点抗原结合分子，其包含能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，和能够特异性靶细胞抗原的第二抗原结合部，其中第一抗原结合部包含scFv，第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab结合相同的靶细胞抗原。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab结合相同靶细胞抗原的不同表位。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab结合靶细胞抗原的相同表位。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab衍生自相同的抗体。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab衍生自结合相同靶细胞抗原的不同抗体。

在某些实施方案中，在本发明的双靶点抗原结合分子中，所述scFv从scFv的N末端至C末端包含重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，或从scFv的N末端至C末端包含轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)。在优选的实施方案中，所述双靶点抗原结合分子还包含Fc结构域，其由能够稳定接合的第一和第二亚基组成。在某些实施方案中，第二抗原结合部包含第一Fab，它在其Fab重链的C末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的N末端或者scFv的重链可变区(V_H)的N末端，并且所述scFv的C末端与Fc结构域的第一和第二亚基之一连接，并且第二抗原结合部包含第二Fab，它在其Fab重链的C末端融合在Fc结构域的另一个亚基上。在特定的实施方案中，第一Fab在Fab重链的C末端融合至scFv的重链可变区(V_H)的N末端，或者第一Fab在Fab重链的C末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的N-末端。

在某些实施方案中，在本发明的双靶点抗原结合分子中，第二抗原结合部包含第一Fab，它在其Fab重链的N末端融合至scFv的轻链可变区的C末端或者scFv的重链可变区(V_H)的C末端，并且第一Fab的Fab重链的C末端与Fc的第一和第二亚基之一连接，并且第二抗原结合部包含第二Fab，它在其Fab重链的C末端与Fc结构域的另一个亚基融合。在特定的实施方案中，第一Fab在Fab重链的N末端与scFv的重链可变区(V_H)的C末端融合，或者其中第一Fab在Fab重链的N末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的C末端。

在某些实施方案中，根据本发明的双靶点抗原结合分子包含仅一个能够特异性结合T细胞激活抗原的抗原结合部。

根据任何上述实施方案，本发明的双靶点抗原结合分子的组分，例如，第一抗原结合部，第二抗原结合部，scFv的轻链可变区(V_L)，scFv的重链可变区(V_H)，Fc结构域可以直接融合(例如，通过末端羧基和氨基形成的肽键)或通过本领域已知的各种连接体融合，特别是肽连接体，其包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。适宜地，非免疫原性肽连接体包括，例如：(GxSy)n，其中x和y分别是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数，并且n是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数。在具体的实施方案中，在本发明的双靶点抗原结合分子中，第二抗原结合部包含第一Fab，它在其Fab重链的N末端与scFv的C末端融合，或其Fab重链的C末端与scFv的N末端融合(通过具有通式(GxSy)n的肽连接体)，其中，其中x和y分别是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数，并且n是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数。在具体的实施方案中，在本发明的双靶点抗原结合分子中，scFv的重链可变区(V_H)通过具有以下通式(GxSy)n的肽连接体与轻链可变区(V_L)连接，其中x和y分别是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数，并且n是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数。

在某些实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部经由铰链区或铰链区的一部分与Fc结构域连接。在某些实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部通过具有通式(GxSy)n的肽连接体与Fc结构域连接，其中x和y分别是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数，并且n是选自1-10，优选2-8、2-7、2-6、2-5、2-4的任何整数。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，所述Fc结构域是人IgG Fc结构域，优选为人IgG1或IgG4的Fc结构域。在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，所述Fc结构域包含一个或多个修饰，所述修饰促进了所述Fc结构域的第一和第二亚单元的接合。在优选的实施方式中，在所述Fc结构域的一个亚单元的CH3域中，氨基酸残基被具有更大的侧链体积的氨基酸残基所取代，由此在所述亚单元的CH3域中生成一个突起，而在所述Fc结构域的其它亚单元的CH3域中，氨基酸残基被具有更小的侧链体积的氨基酸残基所取代，由此在第二亚单元的CH3域中生成一个凹陷，其中，所述突起能够伸入所述凹陷中。在优选的实施方式中，在所述Fc结构域的一个亚单元的CH3域中，T366残基被具有更大的侧链体积的氨基酸残基所取代。在更优选的实施方式中，在Fc结构域的一个亚单元的CH3域中，一种或多种选自T366、L368、Y407的残基被一种或多种具有更小的侧链体积的氨基酸残基所取代。在进一步优选的实施方式中，所述Fc结构域在一个亚单元中包含T366W取代基，而在Fc结构域的其他亚单元中包含T366S、L368A和/或Y407V取代基。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，所述Fc结构域展示出降低的结合于Fc受体的亲和力和/或降低的效应器功能(相比于天然的IgG1或IgG4的Fc结构域)。

在某些实施方案中，在根据本发明的上述双靶点抗原结合分子中，所述Fc结构域包含一种或多种降低对Fc受体结合和/或效应器功能的氨基酸取代，优选地，所述一种或多种氨基酸取代处于一个或多个下述位置：这些位置选自L/F234、L235、D265、N297和P329。更优选，每个Fc结构域的亚单元包含如下两个降低对活化Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代：L/F234A和L235A。

在某些实施方案中，在根据本发明的上述双靶点抗原结合分子中，所述Fc受体是Fcγ受体，而所述效应器功能为：抗体依赖的、细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；抗体依赖的、细胞介导的吞噬作用(ADCP)；或者补体介导的细胞毒作用(CDC)。

在某些实施方案中，根据本发明的上述双靶点抗原结合分子包含：在IgG的S228位置处的氨基酸取代，优选：在S228位置处的氨基酸取代是S228P。

在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab两者都是抗CD20Fab。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab包含选自SEQ ID NO：3、4、5、8、9和10的一个，两个，三个，四个，五个或六个CDR。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含选自SEQ ID NO：13、14、15、18、19和20的一个，两个，三个，四个，五个或六个CDR。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab是相同的并且包含选自SEQ ID NO：3、4、5、8、9和10的六个CDR，。

在某些实施方案中，本发明的上述双靶点抗原结合分子包含第一Fab和第二Fab和抗CD3scFV，其中第一Fab和第二Fab二者都包含选自SEQ ID NO：3、4、5、8、9和10的六个CDR，抗CD3scFV包含选自SEQ ID NO：13、14、15、18、19和20的六个CDR。

在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链的可变区包含分别由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列，或所述重链可变区和轻链可变区包含分别与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab是相同的并且包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所表示。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含重链和轻链的可变区，其包含分别如SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：17所表示的氨基酸序列，或包含分别与SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含重链和轻链的可变区，其包含分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：17所表示的氨基酸序列，或包含分别与SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：17具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的上述双靶点抗原结合分子包含第一Fab和第二Fab，其包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所表示，并且CD3scFV包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所表示。在某些实施方案中，本发明的上述双靶点抗原结合分子包含第一Fab和第二Fab，其包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所表示，并且CD3scFV包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：17所表示。

在一方面，本发明涉及：一种双靶点抗原结合分子，其包含：a)人类IgG的Fc结构域，由能够稳定接合的第一和第二亚单元组成、b)能够特异性结合T细胞激活抗原的第一抗原结合部，其包含scFv、以及c)能够特异结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，其包含第一Fab和第二Fab，其中，

1)在scFv的重链可变区(V_H)的N端，或者在scFv的轻链可变区(V_L)的N端，scFv融合于第一Fab的Fab重链的C端，而在scFv的重链可变区(V_H)或者轻链可变区(V_L)的C端，scFv融合于Fc结构域的第一亚单元，后者包含在T366位的具有更大侧链的氨基酸取代，

2)在Fab重链的C端，第二Fab融合于Fc结构域的第二亚单元，后者包含在T366、L368和/或Y407位的一个或多个具有更小的侧链体积的氨基酸取代。

在优选的实施方式中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，Fc结构域在第一亚单元包含T366W取代，而在Fc结构域的第二亚单元包含T366S、L368A和Y407V取代。在更优选的实施方式中，Fc结构域进而包含降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的一个或多个氨基酸取代。在进一步优选的实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代处于一个或多个下述位置：这些位置选自L/F234、L235、D265、N297和P329。在最优选的实施方式中，Fc结构域的每个亚单元包含降低对活化Fc受体结合和/或效应器功能的两个下述氨基酸取代：L/F234A和L235A。

在某些实施方案中，根据本发明的双靶点抗原结合分子进而包含：在下述位置的氨基酸取代：IgG4的S228，优选S228P。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，scFv通过肽连接体，优选通过(GxSy)n融合在Fab重链上，其中，x和y各自为选自1-5的任意整数，而n为选自1-5的任意整数。

本领域技术人员可以理解，在scFv的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)之间可以有一个连接体，后者包含在根据本发明的双靶点抗原结合分子中。所述连接体可以是肽连接体，优选为(GxSy)n，其中，x和y各自为选自1-5的任意整数，而n为选自1-5的任意整数。

在一方面，本发明还考虑一种双靶点抗原结合分子，其包含：a)人类IgG的Fc结构域，由能够稳定接合的第一和第二亚单元组成、b)能够特异性结合T细胞激活抗原的第一抗原结合部，其包含scFv、以及c)能够特异结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，其包含第一Fab和第二Fab，其中，

1)在scFv的重链可变区(V_H)的C端，或者在scFv的轻链可变区(V_L)的C端，scFv融合于第一Fab的Fab重链的N端，而在Fab重链的C端，第一Fab融合于Fc结构域的第一亚单元，后者包含在T366位置处的具有更大侧链的氨基酸取代，

2)在Fab重链的C端，第二Fab融合于Fc结构域的第二亚单元，后者包含在T366、L368和/或Y407位置处的一个或多个具有更小的侧链体积的氨基酸取代。优选地，Fc结构域在第一亚单元包含T366W取代，而在Fc结构域的第二亚单元包含：T366S、L368A和Y407V取代。更优选地，Fc结构域进而包含降低对Fc受体结合和/或效应器功能的一个或多个氨基酸取代。进一步优选，所述一个或多个氨基酸取代处于一个或多个下述位置：这些位置选自L/F234、L235、D265、N297和P329基团。最优选，Fc结构域的每个亚单元包含：两个下述氨基酸取代：其降低了在起激活作用的Fc受体上的结合和/或效应器功能，其中所述氨基酸取代为L/F234A和L235A。

在某些实施方案中，根据本发明的双靶点抗原结合分子包含：在下述位置的氨基酸取代：IgG4的S228，优选S228P。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，Fc结构域的第一亚单元和第二亚单元经过修饰以包含一个或多个带有静电荷氨基酸，其有利于形成异质二聚体。优选，Fc结构域的第一亚单元包含下述氨基酸突变：E356K、E357K和/或D399K，而所述第二亚单元包含下述氨基酸突变：K370E、K409E和/或K439E。更优选，Fc结构域的第一亚单元包含K392D和K409D氨基酸突变，而Fc结构域的第二亚单元包含E356K和D399K(DDKK)氨基酸突变。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，所述T细胞激活抗原选自：由下述构成的组中的任一个：CD3、4-1BB、PD-1和CD40L/CD154。

在某些实施方案中，在根据本发明的双靶点抗原结合分子中，所述靶细胞抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或者肿瘤相关抗原(TAA)。优选，所述靶细胞抗原选自：由下述构成的组中的任一个：CD19、CD20、CD33、CD38、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、癌胚抗原(CEA)、B7-H1、B7-H3、B7-H4、磷脂酰肌醇聚糖-3、间皮蛋白、滋养层特异性糖蛋白(5T4)、转铁蛋白受体(TfR1)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

在某些实施方案中，根据本发明的双靶点抗原结合分子是重定向T细胞的双特异性抗原结合抗体，或者是能够特异性结合T细胞激活抗原和靶细胞抗原的抗体片段。

在一方面，本公开涉及一种分离的多核苷酸(其编码了本发明的双靶点抗原结合分子)、一种多肽(经由所述分离出多核苷酸编码)、一种载体(其包含所述分离的多核苷酸)、或者一种宿主细胞(其包含所述分离的多核苷酸或者所述载体)。

在一方面，本公开考虑了一种制造根据本发明的双靶点抗原结合分子的方法，其包含下述步骤：a)在适合于表达所述双靶点抗原结合分子的条件下培养宿主细胞，b)收获所述双靶点抗原结合分子。同时，本发明还被拓展至用本发明的方法制造的双靶点抗原结合分子。

在一方面，本发明覆盖了药物组合物，包含：根据本发明的双靶点抗原结合分子和在药学上可接受的载体；本发明覆盖了制品或者试剂盒，其包含在容器中的所述双靶点抗原结合分子或者根据本发明的药物组合物，以及说明书，其表述如何使用所述双靶点抗原结合分子。

在一方面，本公开还披露了根据本发明的双靶点抗原结合分子或者药物组合物的用途，例如，用于治疗不同种类的癌症的用途。

在一方面，本发明所覆盖的主题还有：所述双靶点抗原结合分子用于制造有此需要的个体的疾病的药物的用途。

在一方面，本发明涉及一种治疗个体的疾病(特别是癌症)的方法，包含：对所述个体施加能有效治疗的量的、根据本发明的所述双靶点抗原结合分子或者所述药物组合物。

在一方面，本发明涉及一种诱导靶细胞发生细胞溶解的方法，包含：在有T细胞存在的条件下使靶细胞接触所述双靶点抗原结合分子。

在上述实施方式中，根据本发明的双靶点抗原结合分子优选为重定向T细胞的双特异性抗原结合抗体或者它的片段(其能够特异性结合T细胞激活抗原和靶细胞抗原)。所述细胞激活抗原可以选自：由下述构成的组中的任一个：CD3、4-1BB、PD-1和CD40L/CD154，而所述靶细胞抗原可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或者肿瘤相关抗原(TAA)。优选，所述靶细胞抗原选自由下述构成的组中的任一个：CD19、CD20、CD33、CD38、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、癌胚抗原(CEA)、B7-H1、B7-H3、B7-H4、磷脂酰肌醇聚糖-3、间皮蛋白、滋养层特异性糖蛋白(5T4)、转铁蛋白受体(TfR1)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

具体地，本发明涉及：

1.一种双靶点抗原结合分子，其包含能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，和能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，

其中第一抗原结合部包含scFv，第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。

2.根据项1所述的双靶点抗原结合分子，其中所述scFv包含：从scFv的N末端至C末端的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，或从scFv的N末端到C末端的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)。

3.根据项1或2所述的双靶点抗原结合分子，还包含Fc结构域，所述Fc结构域由能够稳定接合的第一和第二亚基组成。

4.根据项3所述的双靶点抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部包含在所述Fab重链的C末端与scFv融合的第一Fab，第二抗原结合部包含在Fab重链的C末端与Fc结构域融合的第二Fab。

5.项4的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的C-末端融合至scFv的重链可变区(V_H)的N-末端。

6.项4的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的C-末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的N-末端。

7.根据项3所述的双靶点抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部包含在所述Fab重链的N末端与scFv融合的第一Fab，且所述第二抗原结合部包含在Fab重链的C末端与Fc结构域融合的第二Fab。

8.根据项7所述的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的N末端与scFv的重链可变区(V_H)的C末端融合。

9.根据项7的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的N末端与scFv的轻链可变区(V_L)的C末端融合。

10.根据项1-9中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其包含不超过一个能够特异性结合T细胞活化抗原的抗原结合部。

11.根据项1至10中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中第一和第二抗原结合部通过连接体彼此融合。

12.根据项11的双靶点抗原结合分子，其中所述连接体是肽连接体。

13.根据项11所述的双靶点抗原结合分子，其中所述连接体是(GxSy)n，并且x和y分别是选自1-5的任何整数，并且n是选自1-5的任何整数。

14.根据项3-13中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中Fc结构域是人IgG Fc结构域。

15.根据项14的双靶点抗原结合分子，其中Fc结构域是人IgG1或IgG4的Fc结构域。

16.根据项3-15中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中Fc结构域包含一个或多个促进Fc结构域的第一和第二亚基接合的修饰。

17.根据项16所述的双靶点抗原结合分子，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3内生成突起，且在氨基酸残基的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，其中所述突起可突出到所述空腔中。

18.根据项17所述的双靶点抗原结合分子，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，T366残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基取代。

19.根据项17所述的双靶点抗原结合分子，其中在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，选自T366，L368和Y407的一个或多个残基被一个或多个具有更小氨基酸残基的氨基酸残基所替换。

20.根据项17-19中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含第一亚基中T366W的取代，和Fc结构域第二亚基中的T366S，L368A和/或Y407V的取代。

21.根据项3至20中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中与天然IgG1或IgG4的Fc结构域相比，所述Fc结构域展示了：对Fc受体的结合的亲和力降低和/或效应器功能降低。

22.根据项3至21中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，其降低了与Fc受体的结合和/或效应器功能。

23.根据项22所述的双靶点抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸取代位于：选自L/F234，L235，D265，N297和P329的组中的一个或多个位置。

24.根据项23所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的每个亚基包含两个氨基酸取代，其减少了与活化Fc受体的结合和/或效应器功能，其中所述氨基酸取代是L/F234A和L235A。

25.根据项21-24中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc受体是Fcγ受体。

26.根据项21-25中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

27.根据项1-26中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其在IgG4的S228位置包含氨基酸取代。

28.根据项27所述的双靶点抗原结合分子，其中S228位置的氨基酸取代是S228P。

29.一种双靶点抗原结合分子，其包含a)人IgG的Fc结构域，其由能够稳定接合的第一和第二亚基组成，b)能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，其包含scFv，和c)能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，其包含第一Fab和第二Fab，其中

1)scFv在scFv的重链可变区(V_H)的N末端或scFv的轻链可变区(V_L)的N末端与第一Fab的Fab重链的C-末端融合，或者在scFv重链可变区(V_H)或scFv轻链可变区(V_L)的C-末端与Fc结构域的第一亚基融合，包含：用具有更大侧链的氨基酸残基取代T366，

2)在Fab重链的C末端，第二Fab与Fc结构域的第二亚基融合，包含：T366，L368和/或Y407的一个或多个氨基酸残基取代，其中所述氨基酸残基具有更小的侧链体积。

30.根据项29所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含第一亚基中T366W的取代，和所述Fc结构域的第二亚基中的T366S，L368A和Y407V取代。

31.根据项29或30所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域还包含一个或多个氨基酸取代，其降低了与Fc受体的结合和/或效应器功能。

32.根据项31所述的双靶点抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸取代位于：选自L/F234，L235，D265，N297和P329的组的一个或多个位置。

33.根据项32所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的每个亚基包含两个氨基酸取代，其降低了与活化Fc受体的结合和/或效应器功能，其中所述氨基酸取代是L/F234A和L235A。

34.根据项29-33中任一项所述的双靶点抗原结合分子，还包含在IgG4的S228位置处的氨基酸取代。

35.根据项34所述的双靶点抗原结合分子，其中S228位置的氨基酸取代是S228P。

36.根据项29-35中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述scFv通过肽连接体与所述第一Fab的Fab重链融合。

37.根据项36所述的双靶点抗原结合分子，其中所述肽连接体是(GxSy)n，其中所述x和y分别是选自1至5的任何整数，并且n是选自1-5的任何整数。

38.一种双靶点抗原结合分子，其包含a)人IgG的Fc结构域，其由能够稳定接合的第一和第二亚基组成，b)能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，包含scFv，和c)能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，包含第一Fab和第二Fab，其中

1)scFv在scFv的重链可变区(V_H)的C末端或scFv的轻链可变区(V_L)的C末端的融合至第一Fab的Fab重链的N末端，而第一Fab在Fab重链C末端与Fc结构域的第一亚基融合，包含：用具有更大侧链的氨基酸残基取代T366，

2)第二Fab在Fab重链C末端与Fc结构域的第二亚基融合，包含：T366，L368和/或Y407的一个或多个氨基酸残基取代，其中所述氨基酸残基具有更小的侧链体积。

39.根据项38所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含：第一亚基中T366W的取代，以及Fc结构域在第二亚基中的T366S，L368A和Y407V取代。

40.根据项38或39所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域还包含一个或多个氨基酸取代，其减少与Fc受体的结合和/或效应器功能。

41.根据项40所述的双靶点抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自L/F234，L235，D265，N297和P329的组的一个或多个位置。

42.根据项41所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的每个亚基包含两个氨基酸取代，其降低与活化Fc受体的结合和/或效应器功能，其中所述氨基酸取代是L/F234A和L235A。

43.根据项38-42中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其进一步包含IgG4的S228位置的取代。

44.根据项43所述的双靶点抗原结合分子，其中S228位置的取代是S228P。

45.根据项36-44中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述scFv通过肽连接体与所述第一Fab的Fab重链融合。

46.根据项45所述的双靶点抗原结合分子，其中所述肽连接体是(GxSy)n，其中所述x和y分别是选自1至5的任何整数，并且n是选自1-5的任何整数。

47.根据项3-46中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的第一亚基和所述第二亚基已被修饰为：包含一个或多个静电上有利于杂二聚体形成的带电氨基酸。

48.根据项47所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的第一亚基包含：氨基酸突变E356K，E357K和/或D399K，所述第二亚基包含：氨基酸突变K370E，K409E和/或K439E。

49.根据项47所述的双靶点抗原结合分子，其中所述Fc结构域的第一亚基包含：氨基酸突变K392D和K409D，所述Fc结构域的第二亚基包含：氨基酸突变E356K和D399K(DDKK)。

50.根据项1-49中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述T细胞活化抗原是：选自CD3,4-1BB，PD-1和CD40L/CD154的组的任何一种。

51.根据项1-50中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述靶细胞抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。

52.根据项1-50中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其中所述靶细胞抗原是选自下组的任一种：CD19，CD20，CD33，CD38，黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)，细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)，表皮生长因子受体(EGFR)，HER2，癌胚抗原(CEA)，B7-H1，B7-H3，B7-H4，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，间皮素，滋养层糖蛋白(5T4)，转铁蛋白受体1(TfR1)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

53.根据项1-52中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其是能够特异性结合T细胞活化抗原和靶细胞抗原的T细胞重定向双特异性抗原结合抗体或其片段。

54.一种经分离的多核苷酸，其编码：根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子。

55.由根据项54所述经分离的多核苷酸编码的多肽。

56.一种载体，其包含根据项54的经分离的多核苷酸。

57.一种宿主细胞，其包含根据项54所述的经分离的多核苷酸或根据项56所述的载体。

58.一种产生根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子的方法，包括步骤：a)在适于表达双靶点抗原结合分子的条件下培养根据项57所述的宿主细胞和b)收获所述双靶点抗原结合分子。

59.通过项58的方法产生的双靶点抗原结合分子。

60.一种药物组合物，其包含：根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子和药学上可接受的载体。

61.一种制品或试剂盒，其包含：在容器中的、根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子或根据项60所述的药物组合物，以及示出如何使用所述双靶点抗原结合分子的说明书。

62.根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子或根据项60所述的药物组合物的作为药物的用途。

63.根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子或根据项60所述的药物组合物，其用于治疗有需要的个体中的疾病。

64.根据项63所述的双靶点抗原结合分子或药物组合物，其中所述疾病是癌症。

65.根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子在制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药物中的用途。

66.一种治疗个体中的疾病的方法，包含：给予所述个体治疗有效量的、根据项1至53中任一项所述的双靶点抗原结合分子或根据项60所述的药物组合物。

67.根据项65所述的用途或项66所述的方法，其中所述疾病是癌症。

68.一种诱导靶细胞发生细胞溶解的方法，包含：在T细胞存在下使靶细胞与根据项1-53中任一项所述的双靶点抗原结合分子相接触。

附图说明

图1A-B所述双特异性的抗体(TRAB)结构的设计图。所述双特异性抗体包含第一抗体结合部(其能够特异性结合T细胞激活抗原)、第二抗体结合部(其能够特异性结合靶细胞抗原：TSA或TAA)、以及由第一和第二亚单元组成的Fc结构域，其中，第一抗原结合部包含scFv而第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。为了图示说明，所述设计图举CD3作为T细胞激活抗原的实例，而取TAA作为靶细胞抗原。图示说明的双特异性抗体命名为TAA×CD3SimBody^TM和SomBody^TM。

图2A-B分子A和分子B CD20×CD3(Fab-scFv)₂-Fc融合蛋白的结构。

图3A-B两个CD20×CD3SimBody^TMTRAB的结构。

图4A-B分子C和分子D CD20×CD3(Fab-scFv)₂-Fc融合蛋白的结构。

图5A-B两个CD20×CD3SomBody^TMTRAB的结构。

图6构建出的质粒的示意图，其用于制造CD20×CD3Sim Body^TM或CD20×CD3SomBody^TMTRAB。

图7A-B在蛋白A纯化后对测试对象进行SDS-PAGE分析。

图8在阳离子交换后对CD20×CD3Sim Body^TM-A进行SDS-PAGE分析。

图9在阳离子交换后对CD20×CD3Sim Body^TM-B进行SDS-PAGE分析。

图10在阳离子交换后对CD20×CD3Som Body^TM-C进行SDS-PAGE分析。

图11在阳离子交换后对CD20×CD3Som Body^TM-D进行SDS-PAGE分析。

图12A-H对CD20×CD3Sim Body^TM或Som Body^TM测试对象进行SEC-HPLC分析。

图13A-H对CD20×CD3Sim Body^TM或Som Body^TM测试对象进行NR-CE-SDS分析。

图14A-H对CD20×CD3Sim Body^TM或Som Body^TM测试对象进行R-CE-SDS分析。

图15 CD20×CD3Sim Body^TM对CD20阳性Raji细胞的结合曲线。

图16 CD20×CD3Som Body^TM对CD20阳性Raji细胞的结合曲线。

图17 CD20×CD3Sim Body^TM对CD3阳性Jurkat细胞的结合曲线。

图18 CD20×CD3Som Body^TM对CD3阳性Jurkat细胞的结合曲线。

图19 CD20×CD3Som Body^TM重定向T细胞(来自于人类PBMC细胞)用于溶解人类淋巴B细胞系Dauli，以浓度依赖方式。

图20A-D使用CD20×CD3Sim Body^TM的早期和晚期T细胞活化。

图21体内B细胞耗竭研究的给药和取样收集图示。

图22体内研究的CD19+B细胞耗竭(消减)百分比

图23体内研究的CD4+T细胞百分比变化

图24体内研究的CD8+T细胞百分比变化

图25 CD20×CD3Sim Body^TM-A的全分子量的质谱分析。

图26 CD20×CD3Sim Body^TM-A轻链的分子量的质谱分析。

图27A-B CD20×CD3Sim Body^TM-A重链1和重链2的分子量的质谱分析。

具体实施方式

本发明涉及双靶点抗原结合分子，尤其是包含两种不同抗原结合组分的双特异性T细胞重定向抗体(TRAB)，一种用于特异性结合T细胞活化抗原，另一种用于特异性结合靶细胞抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。通过与T细胞活化抗原和靶细胞抗原的特异性结合，双特异性分子(抗体)将T细胞重定向至包括癌细胞的靶细胞所在的位点，并且靶细胞被活化的T细胞和/或其他效应细胞破坏(通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC))。

定义

如在本发明中所使用的，“双靶点抗原结合分子”是指该分子不仅能够打靶并结合T细胞活化抗原，还能够打靶并结合靶细胞抗原。双靶点抗原结合分子包括，例如，抗体，抗体片段和双重打靶并且结合抗原的多肽，例如CD3分子和任何TSA或TAA抗原。该分子可以表现为组装抗体或由衍生自抗体的不同部分组装而成的聚合多肽分子，例如CDR结构域，可变区，CH1，CH2和/或CH3结构域，Fv，scFv和Fab片段和/或Fc结构域。组装出的抗体和多肽分子特异性地结合抗原，例如CD3分子和任何TSA或TAA抗原。

本发明的术语“抗体(Ab)或抗体(Abs)”涵盖具有天然抗体结构特征的抗体和具有不同于天然抗体但对一种或多种特异性抗原具有结合特异性的结构特征的抗体样分子。术语抗体是指包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。

术语“重链”，“轻链”，“轻链可变区”(“V_L”)，“重链可变区”(“V_H”)，“框架区”(“FR”)，“重链恒定结构域”(“CH”)，“轻链恒定结构域”(“CL”)是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成的(例如，重组的)结合蛋白(例如，人源化抗体)的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如IgG)的基本结构单元是具有两条轻链和两条重链的四聚体。每条链的氨基末端(“N”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变区。每条链的羧基末端(“C”)部分限定恒定区，其中轻链具有单个恒定结构域，重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，天然存在的IgG分子的轻链结构是N-V_L-CL-C，IgG重链的结构是N-V_H-CH1-H-CH2-CH3-C(其中H是铰链区)。IgG分子的可变区包含互补决定区(CDR)，其含有与抗原和非CDR区段接触的残基，称为框架区段，其维持结构并决定CDR环的定位。因此，V_L和V_H结构域具有结构N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C。

如本文所用，短语“双特异性抗体”或“双特异性抗原结合抗体”是指具有双重结合特异性的抗体(如上文所定义)，其中一种结合特异性用于与T细胞活化抗原特异性结合，例如CD3,4-1BB，PD-1或CD40L/CD154，另一种用于与靶细胞抗原特异性结合，例如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)，如CD19，CD20，CD33，CD38，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)，细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)，表皮生长因子受体(EGFR)，HER2，癌胚抗原(CEA)，B7-H1，B7-H3，B7-H4，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，间皮素，滋养层糖蛋白(5T4)，转铁蛋白受体1(TfR1)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

天然抗体通常是杂合四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链或轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变区(V_H)，随后是几个恒定区。每条轻链的一端具有可变区(V_L)，另一端具有恒定区；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定区对齐，轻链可变区(V_L)与重链的可变结构域(V_H)对齐。

在天然抗体中，变异性不是通过抗体的可变区均匀分布。它集中在轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变域的更高保守部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR区，通过三个CDR连接。每条链中的CDR在FR区附近保持在一起，并且来自另一条链的CDR有助于形成抗体的抗原结合位点[参见Kabat，E.A等，免疫学目的的蛋白质序列国立卫生研究院，贝塞斯达，MD(1987)]。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，诸如抗体参与到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

如本文所用的抗体可以是完整的抗体分子或“抗体片段”。如本文所用的“抗体片段”定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分，其中该部分不含恒定的重链结构域(即CH2，CH3和CH4，取决于完整抗体的Fc区的抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')₂，Fv和scFv片段。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，以及残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。“Fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是指下述Fab'，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。通过裂解作为胃蛋白酶消化产物的F(ab')₂的铰链半胱氨酸处的二硫键，产生出F(ab')片段。

“Fv”片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段，由紧密，非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成，而“单链Fv(scFv)”片段由一个单链多肽链中的柔性肽连接体共价连接的一个重链和一个轻链可变区组成。在该构型中，重链和轻链的每个可变区的三个CDR相互作用以在V_H-V_L二聚体的表面上限定抗原结合位点。总共六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。

在本发明的某些实施方案中，双靶点抗原结合分子(包括T细胞重定向双特异性抗原结合抗体)包含含有scFv的第一抗原结合部，其中scFv包含：重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，后者是从scFv的N-末端到C-末端，或者：轻链的可变区(V_L)和重链可变区(V_H)，后者是从scFv的N-末端到C-末端。在优选的实施方案中，scFv可以是抗CD3scFv，抗-4-1BBscFv或抗CD40L/CD154scFv，衍生自任何抗CD3抗体，抗-4-1BB抗体或抗CD40L/CD154抗体。在本发明的某些实施方案中，双靶点抗原结合分子(T细胞重定向双特异性抗原结合抗体)包含第二抗原结合部，其包含在Fab重链的C末端与scFv融合的第一Fab，而第二抗原结合部在Fab重链的C末端融合至Fc结构域。在优选的实施方案中，第一Fab和第二Fab是相同的并且特异性结合TSA和TAA抗原(抗TSA Fab或抗TAA Fab)。Fab片段可衍生自抗任何抗原的任何抗体，所述抗原选自CD19，CD20，CD33，CD38，黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)，细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，表皮生长因子受体(EGFR)，HER2，癌胚抗原(CEA)，B7-H1，B7-H3，B7-H4，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，间皮素，滋养层糖蛋白(5T4)，转铁蛋白受体1(TfR1)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

如本文所用，术语“抗原结合部”是指特异性结合抗原的多肽。在本发明中，第一抗原结合部和第二抗原结合部与至少两种不同的抗原结合。例如，第一抗原结合部结合T细胞活化抗原，第二抗原结合部结合靶细胞抗原，例如癌细胞表达的蛋白质。在结构中，抗原结合部包含来自抗体的片段，例如，通过肽连接体连接的Fab和scFv片段。

在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子(T细胞重定向双特异性抗原结合抗体)包含Fc结构域，其包含第一亚基和能够稳定接合的第二亚基。

“Fc结构域”也可以称为“Fc区”，意指片段可结晶结构域是抗体的尾部区域，其与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc结构域(区)由两个相同的亚基(第一亚基和第二亚基)组成，每个亚基由衍生自抗体重链的CH2和CH3恒定结构域组成；IgM和IgE Fc结构域(区)由两个相同的亚基(第一亚基和第二亚基)组成，每个亚基由衍生自抗体重链的CH2，CH3和CH4恒定结构域组成。Fc结构域结合各种细胞受体和补体蛋白。以这种方式，它介导抗体的不同生理作用。

Fc结构域(区)位于抗体重链的C末端区域。尽管边界可稍微变化，但人IgG重链Fc区被定义为从Cys226延伸至羧基末端。IgG的Fc区包含两个恒定结构域，CH2和CH3。人IgGFc区的CH2结构域(也称为“Cγ2”结构域)通常从氨基酸231延伸至氨基酸338，并且人IgGFc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。

术语“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230。通过将第一个和最后一个半胱氨酸残基形成在相同位置的重链间SS键，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。如上所述，Fc结构域来自人IgG，优选地，人IgG1或IgG4，优选地，包含促进Fc结构域的第一和第二亚基结合的一种或多种修饰，例如，通过产生突入穴结构以加强结合。通过用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基，可以产生这种结合到针孔的结构，从而在CH3内产生突起(纽扣)。第一亚基的结构域，并用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔(孔)，其中突起可突出至空腔中，以促进Fc结构域的第一和第二亚基的稳定接合。

改变Fc结构域可以促进重链杂二聚体的生成，导致包含两种不同重-轻链对的双特异性抗体。为了促进杂二聚体的形成，设计一对Fc亚基之间的界面以通过例如引入突入穴结构来最大化杂二聚体的百分比，如上所述。这提供了一种机制，用于增加杂二聚体相对于其他不需要的终产物如同型二聚体的产率。CH3修饰包括，例如，一条重链上的Y407V/T366S/L368A和另一条重链上的T366W；一条重链上的S354C/T366W和另一条重链上的Y349C/Y407V/T366S/L368A。在美国专利7,183,076中描述了另外的改进，其导致一条链上的突起(纽扣)和另一条链上的空腔(孔)；以及Merchant等，1998，Nat.Biotech 16：677-681。可用于产生杂二聚体的其他修饰包括但不限于改变跨Fc二聚体界面的电荷极性的那些，使得静电匹配的Fc亚基的共表达导致杂二聚化。改变电荷极性的修饰包括但不限于：

K370E/D399K/K439D D356K/E357K/K409D

K409D D399K

K409E D399K

K409E D399R

K409D D399R

D339K E356K

D399K/E356K K409D/K392D

D399K/E356K K409D/K439D D399K/E357K K409D/K370D

D399K/E356K/E357K K409D/K392D/K370D

D399K/E357K K409D/K392D

K392D/K409D D399K

K409D/K360D D399K。

它们也在WO 2007/147901中公开；Gunasekaran等，2010，JBC 285：19637-46。此外，戴维斯等人(2010，Prot.Eng.Design&Selection 23：195-202)描述了使用链交换的工程化结构域(SEED)CH3区域的杂二聚体Fc平台，它是人IgG和IgA CH3结构域的衍生物(也参见WO 2007/110205)。

Fc结构域的其他修饰和/或取代和/或添加和/或缺失对于本领域技术人员而言是显而易见的，以实现稳定接合和/或促进杂二聚体形成。本领域公开的这些Fc变体可以与本发明公开的Fc结构域组合，并且公开的那些文献将Fc变体整体并入本申请作为参考。

如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚体Fc结构域的两种多肽之一，即包含能够稳定自接合的免疫球蛋白重链的C-末端恒定区的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

当提及抗体时，每个结构域的氨基酸分配符合Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991)，其通过引用明确地并入本文。在整个本说明书中，IgG重链中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号，并且是指人IgG1EU抗体的编号。

如本文所用，术语“癌症”是指由细胞的异常不受控制的生长引起的肿瘤或肿瘤。如本文所用，癌症明确包括白血病和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是指良性肿瘤，其仍然是局部的。在其他实施方案中，癌症是指恶性肿瘤，其侵入并破坏邻近的身体结构并扩散到远处。在一些实施方案中，癌症与特定癌抗原相关。

将参照特定实施例并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求限制。如在本说明书和权利要求中使用的术语“包含”不排除其他因素或者步骤。在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况，例如：“一个”或“所述”，“上述”，这包括该名词的复数形式，除非另有特别说明。

除非本文特别定义，否则术语或定义具有与本发明领域技术人员相同的含义。关于通常用于遗传工程技术的术语和方法，例如多肽，多核苷酸，载体，宿主细胞，克隆，转染，转导，表达等，从业者可特别参考，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，NewYork(1999)。

本发明的双靶点抗原结合分子

本发明涉及双靶点抗原结合分子，其包含能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，和能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，其中第一抗原结合分子抗原结合部包含scFv，第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。在优选的实施方案中，双靶点抗原结合分子还包含Fc结构域，其由能够稳定接合的第一和第二亚基组成。在优选的实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子是T细胞重定向双特异性抗原结合抗体，或其能够特异性结合T细胞活化抗原和靶细胞抗原的片段。

在一个方面，本发明涉及双靶点抗原结合分子，其包含能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，和能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部。在某些实施方案中，第一抗原结合部包含scFv，第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。在某些实施方案中，scFv中轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)可以在方向上反转。在某些实施方案中，在Fab重链的C末端，第一Fab与融合在Fc结构域上的scFv相融合；而在Fab重链的C末端，第二Fab与Fc结构域相融合。因此，组装出的双靶点抗原结合分子的一种多肽的结构可以呈现为N-V_H(第一Fab)-V_L(scFv)-V_H(scFv)-Fc或N-V_H(第一Fab)-V_H(scFv)-V_L(scFv)-Fc，组装出的双靶点抗原结合分子的另一多肽的结构可以表示为N-V_H(第二Fab)-Fc。

在某些实施方案中，第一Fab在Fab重链的N末端融合至scFv的重链可变区(V_H)的C末端；第二Fab在Fab重链的C末端与Fc结构域融合。在某些实施方案中，第一Fab在Fab重链的N末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的C末端。在某些实施方案中，scFv中轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)可以在方向上反转。因此，组装出的双靶点抗原结合分子的一种多肽的结构可以表示为N-V_L(scFv)-V_H(scFv)-V_H(第一Fab)-Fc或N-V_H(scFv)-V_L(scFv)-V_H(第一Fab)-Fc，并且组装出的双靶点抗原结合分子的另一多肽的结构可以呈现为N-V_H(第二Fab)-Fc。

为了组装出本发明的双靶点抗原结合分子，衍生自抗体的部分，例如CDR，FR，V_H，V_L，scFv，Fab，CH1，CH2和CH3可以通过连接体彼此融合，优选通过本文所述的肽连接体(GxSy)n，或者通过共价键，例如通过末端羧基和氨基形成的肽键。

基于第一抗原结合部和第二抗原结合部，本发明的双靶点抗原结合分子特异性结合T细胞活化抗原和靶细胞抗原。“特异性结合”是指结合对抗原具有选择性，并且可以区别于不需要的或非特异性的相互作用。特异性结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术测量，例如，表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中，抗原结合部与不相关蛋白的结合程度小于抗原结合部与抗原结合的约10％，例如，通过SPR测量。

抗原结合分子或结合同源抗原的抗体的能力可以由“亲和力”决定，“亲和力”是指分子(例如受体)的单个结合位点与它的结合伙伴(例如配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员之间的1：1相互作用。亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，解离常数(KD)是解离和接合速率常数的比率(分别为k_off和k_on)。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的成熟方法测量，包括表面等离子体共振(SPR)。

在进一步优选的实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子在免疫球蛋白重链的C末端区域包含“Fc结构域”或“Fc区”，其含有至少一部分恒定区。例如，IgG CH2和IgG CH3可以形成亚基，并且本文所述的抗原结合分子或抗体的Fc结构域可以包含IgG Fc结构域的第一亚基和第二亚基，并且还包含修饰，该修饰促进了Fc结构域的第一和第二亚基的接合并且减少或阻止了包含Fc结构域的亚基的多肽与同样的多肽的接合以形成同型二聚体。如本文所用的促进接合的修饰特别包括：对期望接合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)中的每一个进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进两个Fc结构域亚基的接合。例如，促进接合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一个或两个的结构或电荷，以便分别使它们在空间上或静电上有利地结合。因此，(杂)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，它们在另有组分融合于每个亚基(例如抗原结合部)的意义上可能是不相同的。在一些实施方案中，促进接合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个具体实施方案中，促进接合的修饰包含：Fc结构域的两个亚基中的每一个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基接合的修饰包含：介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO2009/089004中所述的那样。通常，该方法涉及通过带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同型二聚体形成变得静电不利，而杂二聚化在静电上有利。

例如，本发明的双靶点抗原结合分子的一个亚基包含：用具有更大侧链的氨基酸残基取代T366，而另一个亚基包含：用更小侧链体积的氨基酸残基对T366，L368和/或Y407的一个或多个取代。在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子的一个亚基包含：氨基酸突变E356K，E357K和/或D399K，另一个亚基包含：氨基酸突变K370E，K409E和/或K439E。在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子的一个亚基包含：氨基酸突变K392D和K409D，另一个亚基包含：氨基酸突变E356K和D399K(DDKK)。

在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子还包含：降低与Fc受体的结合和/或效应器功能的一个或多个氨基酸取代，例如所述的一个或多个氨基酸取代的位置选自以下的位置：L/F234，L235，D265，N297和P329。在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子还包含：IgG4的S228(优选S228P)位置上的取代。

本发明的双靶点抗原结合分子的制备

本发明的双靶点抗原结合分子包含：能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，以及能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，其中第一抗原结合部包含scFv，而第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab。

所述scFv和Fab分子可以是任何现有技术的，或者任何未来的scFv和Fab分子。它们可以衍生自任何物种的天然存在的抗体，包括但不限于小鼠，山羊，兔和人类等，或者可以是重组的，CDR移植的，人源化的和/或体外产生的(例如通过噬菌体表现选择出的)。例如，scFv和Fab分子可以通过用所需抗原对动物免疫病随后分离出目标抗体片段的mRNA，并通过逆转录和聚合酶链反应获得，产生了含有数百万个克隆的目标抗体片段的基因文库。筛选技术如噬菌体表现和核糖体表现有助于鉴别出结合抗原的克隆。另一种方法使用来自未预先免疫的动物的基因文库。这些天然文库通常仅含有对所需抗原具有低亲和力的抗体，使下述成为必要：通过使用随机诱变作为额外步骤来进行亲和力的成熟化。当鉴别出最有效的克隆时，优化它们的DNA序列，例如以改善它们对酶的稳定性。另一个目标是人源化以防止人类生物体对抗体的免疫反应。最后一步是在大肠杆菌，酿酒酵母或其他合适的生物体中翻译经优化的抗体片段。

在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab都是抗CD20Fab。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab包含选自SEQ ID NO：3、4、5、8、9和10的一个，两个，三个，四个，五个或六个CDR。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含选自SEQ ID NO：13、14、15、18、19和20的一个，两个，三个，四个，五个或六个CDR。在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab是相同的并且包含选自SEQ ID NO：3、4、5、8、9和10的六个CDR。

在某些实施方案中，第一Fab和第二Fab包含重链和轻链的可变区，其包含分别由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列，或包含分别与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含重链和轻链的可变区，其包含分别与SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所表示的氨基酸序列，或包含分别与SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD3scFV包含重链和轻链的可变区，其包含分别与SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：17具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子包含第一Fab和第二Fab，其包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所表示，并且CD3scFV包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17所表示。在某些实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子包含第一Fab和第二Fab，其包含重链和轻链的可变区，分别如SEQID NO：2和SEQ ID NO：7所表示，并且CD3scFV包含重链和轻链的可变区，分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：17所表示。

本发明的双靶点抗原结合分子包含不同的抗原结合部，并且在一个实施方案中与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高双靶点抗原结合分子的产率和纯度，因此有利的是在双靶点抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽接合的修饰。

因此，在特定实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基接合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点位于Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“突入穴”修饰，其包含Fc结构域的两个亚基之一中的“突”修饰和两个亚基中另一个中的“孔”修饰。突入穴技术被描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248,7-15(2001)。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“纽扣”)和在第二多肽的界面中的相应空腔(“孔”)，使得突起可以定位在空腔中以便促进杂二聚体的形成并阻碍同型二聚体的形成。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过：位点特异性诱变或者肽合成。

在某些实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基接合的修饰包含介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO2009/089004中所述。通常，该方法涉及通过带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同型二聚体的形成变得静电不利，但杂二聚化在静电上有利。

在一个方面，本发明提供了双靶点抗原结合分子，其包含能够特异性结合T细胞活化抗原的第一抗原结合部，以及能够特异性结合靶细胞抗原的第二抗原结合部，和Fc，其由第一和第二亚基组成，其中第一抗原结合部包含scFv，第二抗原结合部包含第一Fab和第二Fab，并且其中第一亚基和所述第二亚基已被修饰为：包含一个或更多个加载电荷的氨基酸，其在静电上有利于杂二聚体的形成。

Fc结构域赋予双靶点抗原结合分子有利的药代动力学特性，包括长的血浆半衰期，但同时，它可能导致(不希望的)双靶点抗原结合分子打靶表达Fc受体的细胞，而非抗原靶细胞。因此，在特定实施方案中，根据本发明的双靶点抗原结合分子展示了：与天然IgGFc结构域相比，对Fc受体的结合亲和力降低和/或效应器功能降低。在一个这样的实施方案中，双靶点抗原结合分子表现出：小于50％，40％，30％，20％，10％，5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或小于50％，40％，30％，20％，10％，5％的效应器功能(与包含天然IgG Fc结构域的双靶点抗原结合分子相比)。在一个具体实施方案中，Fc受体是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自CDC，ADCC，ADCP和细胞因子分泌物中的一种或多种。期望保留：对新生儿Fc受体(FcRn)的基本相似的结合亲和力。

在一个实施方案中，降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸取代，例如，PCT专利申请PCT/EP2012/055393中所述的那些，并入本文。通过引用的全部内容。PCT/EP2012/055393还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。

本发明的双靶点抗原结合分子可以通过例如固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，分离编码双靶点抗原结合分子(片段)的一种或多种多核苷酸，并将其插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地分离和测序这种多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的载体，优选表达载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含有双靶点抗原结合分子(片段)的编码序列的表达载体以及合适的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/基因重组。参见，例如，Maniatis等人，Molecular Cloning：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)中描述的技术；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y(1989)。

治疗用途

本发明的双靶点抗原结合分子可用于治疗肿瘤，尤其是人类肿瘤。在特定的实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子可以诱导肿瘤细胞的细胞溶解。在特定的实施方案中，本发明的双靶点抗原结合分子可以抑制肿瘤细胞的生长。

对于疾病的治疗，本发明的双靶点抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型，途径给药，患者的体重，疾病的严重程度和病程，预防或治疗目的，先前或同时的治疗干预，患者的临床病史和对本发明的双靶点抗原结合分子的反应，以及主治医师自由裁量。在任何情况下，负责施用的从业者将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点上的单次或多次给药，推注给药和脉冲输注。

本发明的双靶点抗原结合分子适合一次或在一系列治疗中给予患者。根据疾病的类型和严重程度，本发明的双靶点抗原结合分子的约1mg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)可以是施用给患者的初始候选剂量。例如，通过一次或多次单独给药，或通过连续输注给药。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以为约1mg/kg至100mg/kg或更多。然而，其他剂量方案可能是可用的。

通过常规技术可以容易地监测治疗的进展，并且对治疗有效量的决定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的本发明的双靶点抗原结合分子的血浆水平。通过注射给药的常用患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天，通常为约0.5至1mg/kg/天。

药物组合物和制品

本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的双靶点抗原结合分子和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指所用剂量和浓度的无毒容纳剂，其在适当地施用于动物(例如人)时不产生不利，过敏或其他不良反应。药学上可接受的载体包括任何和所有溶剂，缓冲剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐剂，抗氧化剂，蛋白质，药物，药物稳定剂，聚合物，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，类似物质及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack PrintingCompany，1990，第1289-1329页，在此引入作为参考。

本发明的双靶点抗原结合分子可以与治疗中的一种或多种其他药剂联合给药。例如，本发明的双靶点抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用，具有互补活性并且没有副作用。另外的治疗剂包括癌症化疗药物，例如免疫调节剂和细胞抑制剂。本发明的双靶点抗原结合分子和治疗中的一种或多种其他药剂可以放入制品的不同容器中。在某些实施方案中，制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，注射器，静脉注射溶液袋等。标签或包装说明书示出了本发明的双靶点抗原结合分子和一种或多种其他药剂在治疗中的用途，以及一种方法，其用于治疗：在治疗中需要本发明的双靶点抗原结合分子和一种或多种其他药剂的疾病。另外，所述制品还可包含：一个或多个容器，其容纳从商业和用户角度所需的其它材料，包括其他缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器。

实施例

实施例1SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体的分子结构设计和验证研究

SimBody^TM及SomBody^TM设计

本发明采用改良的IgG4构型来构建新型双特异结合抗体，简述如下：将IgG4的S228位突变为P以防止IgG4的Fab臂交换，F234A和L235A突变减少与高亲和性Fc受体的结合；仅有一侧臂具有与CD3特异性结合，使新一类的TRABs仅以低亲和力肿瘤细胞时激活T细胞，该亲和力不会触发通过CD3的T细胞激活，除非该特异性抗体被靶标肿瘤细胞以多共价方式呈递给T细胞。

基于上述设计，新型TRAB双特异抗体有以下特征和组成组分：1)一个T细胞衔接组分：抗CD3scFv(V_H-V_L或V_L-V_H的串联形式)；2)肿瘤细胞打靶组分：抗肿瘤相关抗原TAA的IgG4单克隆抗体，其中一条重链具有T366W突变，另一条重链具有T366S、L368A、Y407V突变；把抗CD3scFv 3)或者：嵌入至抗TAA Fab与TRAB分子的重链区的铰链-Fc区域之间，后者锚定了纽扣突变并且通过基于(G₄S)n(n＝1或2)的连接体与抗TAA Fab(V_H-CH1)的C端连接，被命名为SimBody^TM；4)或者：通过基于(G₄S)n(n＝1或2)的连接体连接至锚定在纽扣突变的重链上，被命名为SomBody^TM。用cDNA分别把编码一条轻链和两条不同重链的质粒共转染CHO细胞会导致形成稳定的突入穴杂二聚体的IgG4样BsAb(见图1A和1B)，并可以通过蛋白A亲和层析纯化。

如图1A和1B所示，SimBody ^TM和SomBody ^TM TRAB均包含：1)T细胞衔接组分，V_H-V_L或V_L-V_H方向的抗CD3scFv，由所有TRAB共享；2)打靶IgG4mAb的肿瘤相关抗原，其中：一条重链中为纽扣(T366W)突变而另一条中为孔(T366S/L368A/Y407V)突变；(A)对于SimBody^TM，抗-CD3scFv插入抗TAA Fab和TRAB分子H链上的铰链-Fc区域之间，该区域含有纽扣突变并共价连接到抗TAA Fab(V_H-CH1)的C-末端(通过(G₄S)n连接体)，其中n＝1或2；而(B)对于SomBody ^TM，抗CD3scFv通过其H链上的基于(G₄S)n的连接体共价连接到抗TAA mAb的N末端，所重链锚定纽扣突变，其中n＝1或2。

验证研究

为验证SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体结构的可行性，本发明构建了如图2-5所示的一系列CD20x CD3SimBody^TM和SomBody^TM双特异抗体，表达纯化后通过流式细胞分析仪评估其对人类B细胞和T细胞的结合活性。人类化的莫罗单抗-CD3和FDA批准的奥法木单抗序列被用于此验证研究。

CD20x CD3双特异抗体(分子A和分子B)含有两条相同的重链(抗CD20-连接体-抗CD3scFv-IgG4融合蛋白)，其中抗CD3scFv结构为V_H-(G₄S)₃-V_L或V_L-(G₄S)₃-V_H，连接体为(G₄S)n(n＝1or 2)。见图2。

CD20x CD3SimBody^TM双特异抗体含有两条不同的重链：一条重链由抗CD20重链可变区和IgG4重链恒定区组成(含S228P,F234A,L235A,T366S,L368A和Y407V突变)，另一条重链由抗CD20Fab(V_H-CH1)，(G4S)2，抗CD3scFv(V_H-(G₄S)₃-V_L或V_L-(G₄S)₃-V_H)，及含S228P，F234A，L235A，T366W突变的IgG4(铰链-CH2-CH3)组成。见图3。

额外的CD20x CD3双特异抗体(分子C和分子D)含有两条相同的重链(抗CD3scFv-连接体-抗CD20-IgG4PAA融合蛋白)，其中抗CD3scFv结构为V_H-(G₄S)₃-V_L或V_L-(G₄S)₃-V_H，连接体为(G₄S)n(n＝1或2)。见图4。

最后，CD20x CD3SomBody^TM双特异抗体包括两条不同的重链：一条重链由抗CD20重链可变区和IgG4重链恒定区组成(含S228P,F234A,L235A,T366S,L368A和Y407V突变)，另一条重链由抗CD3scFv(V_H-(G₄S)₃-V_L或V_L-(G₄S)₃-V_H)，(G₄S)₂，抗CD20Fab(V_H-CH1)，及含S228P，F234A，L235A，T366W突变的IgG4(铰链-CH2-CH3)组成。见图5。

抗-CD20Fab和抗-CD3scFv序列如下：

具体序列如下所示：

SEQ ID NO:1

Gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggcaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttaatgattatgccatgcactgggtccggcaagctccagggaagggcctggagtgggtctcaactattagttggaatagtggttccataggctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtccctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaagatatacagtacggcaactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca

SEQ ID NO:2

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:3

GFTFNDYA

SEQ ID NO:4

ISWNSGSI

SEQ ID NO:5

AKDIQYGNYYYGMDV

SEQ ID NO:6

Gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa

SEQ ID NO:7

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK

SEQ ID NO:8

QSVSSY

SEQ ID NO:9

DAS

SEQ ID NO:10

QQRSNWPIT

SEQ ID NO:11

caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagcaccgacaagagcaagagcaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca

SEQ ID NO:12

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS

SEQ ID NO:13

GYTFTRYT

SEQ ID NO:14

INPSRGYT

SEQ ID NO:15

ARYYDDHYSLDY

SEQ ID NO:16

Gacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagacccccggcaaggcccccaagcgctggatctacgacaccagcaagctggccagcggcgtgcccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccttcaccatcagcagcctgcagcccgaggacatcgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccttcaccttcggccagggcaccaagctgcagatcacc

SEQ ID NO:17

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQIT

SEQ ID NO:18

SSVSY

SEQ ID NO:19

DTS

SEQ ID NO:20

QQWSSNPFT

SEQ ID NO:21

caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagccgcgacaatagcaagaacaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccggcgtgtacttctgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca

SEQ ID NO:22

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS

实施例2SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体的基因合成、质粒构建

为制备CD20x CD3SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体，按照以下描述构建各自重链及轻链质粒。具体简述如下：

首先，全基因合成含有抗CD20重链-IgG4PAA(含S228P,F234A,L235A突变)以及孔突变(T366S,L368A,Y407V)的DNA片段，利用Not I/Hind III限制性内切酶双酶切克隆至载体pCDNA3.3以构建含抗CD20重链IgG4PAA的质粒#12509。其次，全基因合成抗CD20抗体轻链的DNA片段，并利用NheI I/Hind III限制性内切酶双酶切克隆至载体pCDNA3.3以构建含抗CD20轻链的质粒#12501。通过

Site-Directed Mutagenesis Kit(New EnglandBiolabs,Catlog#E0552S)，利用以下引物对：

正向引物1：5’-GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT-3’；

SEQ ID NO:23

反向引物1：5’-TGGTTCTTGGTCATCTCCTCCTGGGATG-3’；

SEQ ID NO:24

正向引物2：5’-CTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCG-3’；

SEQ ID NO:25

反向引物2：5’-GAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGC-3’

SEQ ID NO:26。

将质粒#12509的Fc区域(S366,A368,V407)位点突变为不含穴突变的抗CD20重链-IgG4PAA(含S228P,F234A,L235A突变)的质粒#13166。

然后，全基因合成含CH1-(G₄S)2-抗-CD3scFv(V_H-V_L或V_L-V_H)-铰链-CH2-CH3IgG4PAA(含S228P,F234A,L235A突变)的DNA片段(序列#3和#4)，通过NheI和HindIII酶切克隆至质粒#12509，以取代原来的抗体恒定区CH1-铰链-CH2-CH3区域，以生成质粒#14606和#13672。全基因合成含抗-CD3(#1或#2)scFv(V_H-V_L或V_L-V_H)-(G₄S)₂-抗-CD20V_H的DNA片段，通过NheI/Not I限制性内切酶双酶切克隆至载体#13166以构建质粒#13735和#13736。接着，通过

Site-Directed Mutagenesis Kit(New England Biolabs,Catlog#E0552S)，利用以下引物对

(1)正向引物:

5’-AACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC-3’

SEQ ID NO:27

(2)反向引物:

5’-CTTGGTCATCTCCTCCTGGGATGGGGGCAGGGTGTACA-3’

SEQ ID NO:28

分别将质粒#14606，#13678，#13735和#13736生成带有纽扣突变(T366W)的质粒#14606，#13678，#13737和#13738。成功构建的质粒分别如表1所述，示意图见图6。

表1.编码CD20×CD3SimBody^TM或CD20×CD3SomBody^TM双特异抗体重链和轻链的质粒表

实施例3抗体表达，纯化及SDS-PAGE分析

按表2所列组合，分别将编码重链和轻链的质粒混合，共转染200ml的Expi-CHO-S细胞(Thermo Fisher,cat#A29127)中表达相应的双特异抗体。将转染后的Expi-CHO-S细胞置于37℃，5％CO₂培养箱内培养8-10天后，取细胞培养上清液，按照GE供应商的推荐方法，装载入Mab Select Sure蛋白A亲和层析柱(GE Healthcare，cat#GE-17543804)洗脱分离目标抗体，最终将目标抗体置换至1×PBS缓冲液中。

对于SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体，在蛋白A亲和层析后采用GE HP-SP阳离子交换柱(GE Healthcare，cat#29051324)进行第二步纯化，并利用SDS-PAGE、分子筛液相色谱法(SEC-HPLC)、还原和非还原毛细管电泳(R-CE-SDS、NR-CE-SDS)等分析方法对不同洗脱组分进行收集和评估，以优化SimBody^TM或SomBody^TM双特异抗体洗脱条件。最后，利用各自在280nm条件下的消光系数通过NanoPhotometer(Implen,

NP80-Touch)检测并计算总抗体产量。

表2.用于Expi-CHO-S细胞共转染的质粒组合

将3μg目标抗体蛋白样品置于4×蛋白加样缓冲液(Life Technology，Cat#NP007)中，在65℃孵育5-10分钟，通过SDS-PAGE方法评价蛋白纯度，采用8％的非还原SDS-PAGE胶，以鉴别出目标受试抗体在非还原状态下的分子大小，纯度和聚集情况。

图7所示为一步蛋白A亲和层析纯化后，在非还原条件下目的抗体的纯度。所有受试抗体都有一条大于180KDa的主带，CD20×CD3SimBody^TM和CD20×CD3SomBody^TM双特异抗体在95-180Kda之间还有些低分子条带。

CD20×CD3SimBody^TM和CD20×CD3SomBody^TM经过阳离子交换纯化，收集不同洗脱组分，并采用非还原SDS-PAGE进行分析，结果见图8-图11。取各受试抗体的最佳洗脱组分(SimBody^TM-A：CEX洗脱组分1，SimBody^TM-B：CEX洗脱组分3，SomBody^TM-C：CEX洗脱组分7，SomBody^TM-D：CEX洗脱组分2)进行进一步质量分析。

实施例4受试抗体SEC-HPLC分析

采用分子排阻液相色谱法对实施例3中的最佳洗脱组分进行质量分析。将受试抗体在ddH2O中稀释至浓度1mg/mL，加载至HPLC色谱仪(Agilent1200)的色谱柱(TSKgelG3000SWXL)；流动相为50mM PB溶液(pH 7.0)和300mM NaCl，流速为0.8ml/min；紫外吸光度为280nm。数据分析采用Waters Empower 3软件。

如图12所示，CD20×CD3SimBody^TM-A和SomBody^TM-C主峰百分比>98％，伴有少量低分子量(LMW)片段或高分子量(HMW)聚集体；CD20×CD3SimBody^TM-B和SomBody^TM-D主峰百分比>64％，伴有较多的高分子量聚集体(>25％)。所有受试抗体的HMW聚集体、单体主峰和LMW片段的百分比详见表3。

表3.受试抗体的SEC-HPLC纯度分析结果汇总

实施例5非还原和还原CE-SDS分析

采用毛细管电泳法(CE-SDS，Beckman毛细管50um ID×20cm)分析实施例3中的受试抗体最佳洗脱组分的纯度。通过SDS-MW Analysis试剂盒(北京博思雅生化技术研究院，cat#BSYK018)对受试抗体进行还原和非还原处理，方法如下：非还原：100μg受试抗体样品加入75μl浓度为1％SDS缓冲液，用0.1M Tris-HCl定容至95μl，加入5μl碘乙酰胺，涡旋混匀后在70℃孵育5min，8℃下6000g离心1min。还原：100μg受试抗体样品加入75μl浓度为1％SDS缓冲液，用0.1M Tris-HCl定容至95μl，加入5μlβ-巯基乙醇，涡旋混匀后在70℃孵育5min，8℃下6000g离心1min。分别用毛细管电泳仪(Beckman，型号：PA800plus)进行纯度分析。

结果表明，非还原(NR-CE-SDS)条件下，本发明的分子A、分子B、分子C和各SimBody^TM/SomBody^TM纯度均达到90％以上；分子D主峰纯度较低，且有比例较高的片段峰出现。在还原(R-CE-SDS)条件下，本发明的各个分子都具有和还原SDS-PAGE类似的结果。具体结果详见图13-14和表4-5。

表4.CD20×CD3SimBody^TM和SomBody^TM纯化后非还原CE-SDS分析结果

表5.CD20×CD3SimBody^TM和SomBody^TM纯化后还原CE-SDS分析结果

实施例6受试抗体与人B细胞和T细胞的体外结合活性

人类B细胞(Raji)或T细胞(Jurkat)用1×PBS洗涤1次后置于1×PBS+1％FBS溶液中悬浮，以1×10⁵/孔,50μL/孔的密度接种至96孔板。将50μL/孔的受试抗体(从10μg/mL开始进行3倍梯度稀释)加入细胞悬浮液，在冰上共孵育60分钟后离心，用冷的1×PBS+1％FBS冲洗细胞2次。接着，每孔加入100μL稀释1:200的山羊抗人IgG-PE标记的抗体(Abcam，cat#ab98596)和细胞，在冰上孵育60分钟后离心，用冷的1×PBS+1％FBS冲洗细胞2次后将其重新悬浮于200μL PBS+1％FBS中，利用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)检测MFI(平均荧光强度)信号，以评价不同浓度的受试抗体与人B细胞和T细胞的结合活性。用

Prism 6软件绘制生成非线性回归曲线，并从剂量-反应曲线关系计算受试抗体与人B或T细胞结合的EC50。

所有受试抗体(CD20×CD3SimBody^TM和SomBody^TM)在人类B细胞(Raji)中产生的荧光信号具有浓度依赖性，并显示出与阳性对照(抗-CD20IgG4PAA)类似的结合活性(图15、图16和表6、表7)。CD20×CD3SimBody^TM和SomBody^TM与阳性对照(抗-CD20IgG4PAA)相比具有更高的结合曲线平台。

表6.CD20×CD3SimBody^TM与Raji细胞结合的EC50值

受试/对照样品	EC50(nM)	批号
			分子A	2.11	20180225
分子B	3.45	20180225
			CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-A	4.09	20180301
CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-B	4.70	20180302
			阴性对照(CD3-M1-IgG4PAA)	>67	20171010
阳性对照(CD20-IgG4PAA)	3.26	20171113

表7.CD20×CD3SomBody^TM与Raji细胞结合的EC50值

受试/对照样品	EC50(nM)	批号
			分子C	10.76	20180319
分子D	15.23	20180319
			CD20×CD3SomBody<sup>TM</sup>-C	6.672	20180321
CD20×CD3SomBody<sup>TM</sup>-D	6.425	20180322
			阴性对照(CD3-M1-IgG4PAA)	>67	20171010
阳性对照(CD20-IgG4PAA)	1.694	20171113

与阳性对照(抗-CD3M1IgG4PAA)相比，CD20×CD3SimBody^TM和SomBody^TM与人T细胞(Jurkat)的结合活性都出现了不同程度的降低(图17、图18)，其EC50值详见表8、表9。

表8.CD20×CD3SimBody^TM与Jurkat细胞结合的EC50值

受试/对照样品	EC50(nM)	批号
			分子A	0.22	20180225
分子B	>503	20180225
			CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-A	>581	20180301
CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-B	>581	20180302
			阳性对照(CD3-M1-IgG4PAA)	0.18	20171010
阴性对照(CD20-IgG4PAA)	>670	20171113

表9.CD20×CD3SomBody^TM与Jurkat细胞结合的EC50值

受试/对照样品	EC50(nM)	批号
			分子C	0.2014	20180319
分子D	0.6003	20180319
			CD20×CD3SomBody<sup>TM</sup>-C	16.65	20180321
CD20×CD3SomBody<sup>TM</sup>-D	96.79	20180322
			阳性对照(CD3-M1-IgG4PAA)	0.155	20171010
阴性对照(CD20-IgG4PAA)	>670	20171113

实施例7人外周血T细胞定向杀伤人B淋巴瘤细胞的体外实验

CD20阳性的Daudi细胞作为靶细胞，用含有HEPES/L-Glutamine/10％FBS的RPMI1640培养基清洗一次，以2E4细胞/孔、50μl/孔的密度接种至96孔板的每个孔中。将新鲜分离的人PBMCs作为效应细胞，用RPMI 1640培养基清洗一次，以2E5细胞/孔、50μL/孔的密度接种至相应的96孔板。效应细胞与靶细胞的比值为10:1(E:T＝10:1)。随后加入20μl的相应受试抗体(从100μg/ml开始梯度稀释10倍)，在37℃，5％CO₂条件下孵育1天。第二天将板取出放置至22℃，在阳性对照孔(只含有Daudi细胞)内加入15μl裂解液，于350×g条件下离心30min。

从实验96孔板板中取50μl上清液置于新的96孔板(Costar，catlog#3599)内，每孔加入50μl CytoTox

试剂(Promega catlog#G1780)。在室温下避光孵育30min，用SpectraMax在490nm或492nm波长下检测吸光度，计算测试孔细胞裂解百分比。用

Prism 6软件拟合非线性回归曲线，根据剂量-响应曲线关系计算半数最大有效浓度(EC50)。

结果详见图19、表10。

表10.CD20×CD3SimBody^TM对Daudi细胞毒性的EC50值

受试/对照样品	批号	EC50(pM)
			阳性对照(CD20×CD3CrossMab)	20170629	30
CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-A	20180301	2
			CD20×CD3SimBody<sup>TM</sup>-B	20180302	1150

实施例8T细胞激活试验

在实施例7人外周血T细胞定向杀伤人B淋巴瘤细胞实验的同时评估CD20×CD3SimBody^TM诱导T细胞激活的作用，具体实施步骤详见实施例7描述。待实施例7中所述每孔取50μL上清液进行细胞毒性评价后，剩余细胞用PBS+1％FBS清洗细胞一次，用以下抗体对细胞进行染色和分析。

染色步骤如下：

将CD69-PE、CD25-PE、CD8-FITC、CD4-PerCP抗体以1:25的比例稀释在PBS+1％FBS溶液中，按照50μL/孔加入测试孔内，冰上孵育30min。将染色后的细胞离心，用PBS+1％FBS清洗2次，加入200μL PBS+1％FBS将细胞重悬后，用流式细胞仪(Guava,Millipore)检测。结果用

Prism 6软件拟合非线性回归曲线，根据剂量-响应曲线关系计算半数最大有效浓度(EC50)。详见表11、表12、图20。

表11.CD20×CD3SimBody^TM诱导早期T细胞激活的EC50值

表12.CD20×CD3SimBody^TM诱导晚期T细胞激活的EC50值

实施例9HSC-NSG小鼠体内B细胞耗竭(消减)实验

取12只雌性重症免疫缺陷(NSG，NOD scid gamma)小鼠，用hCD34+人造血干细胞(HSCs)经20-24周重建小鼠免疫系统，使其体内人B/T细胞达到稳态，其中B细胞百分比约为45.89％，hCD4+、hCD8+T细胞百分比分别平均为38.20％、8.67％。

将上述HSC-NSG小鼠分为A(CD20×CD3SimBody^TM-A1μg/kg)、B(CD20×CD3SimBody^TM-A10μg/kg)、C(抗CD20单克隆抗体(IgG1)100μg/kg)、D(抗CD20单克隆抗体(IgG1)500μg/kg)四组，每组3只，单次静脉注射给药，详见表13。分别于给药前及给药后1、3、7天眼眶取血(图21)，每次取80μL置于含有肝素钠的试管中。取新鲜制备的BD PharmLyse:ddH2O(1:1)的溶液裂解红细胞，剩余细胞用1000μL FACS缓冲液(1×PBS,2％FBS)清洗2次，与相应检测指标的抗体在冰上孵育30min。复洗2次，采用NovoCyte 3130流式细胞仪分析样品。检测指标为：hCD19+；hCD45+；hCD4+；hCD8+；hCD2。

B细胞指数hCD19+/hCD2-相对百分比详见图22,T细胞指数hCD4+/hCD8+/hCD2+相对百分比详见图23、图24。

表13试验分组及给药方案

实施例10采用质谱测定：双特异抗体的结构

采用LC/MS(Agilent 6530Q-TOF)测量在还原或非还原条件下CD20×CD3SimBody^TM-A的完整分子量。将受试抗体在50μL 0.05M tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中稀释至终浓度为1mg/mL。流动相为0.1％甲酸和0.1％甲酸-乙腈溶液，受试样品上样量为10μg/样品。如图25-图27所示，实际测量的分子量值与理论分子量的差值为1.43Da，轻链差值为0.15Da，重链1差值为0.53Da，重链2差值为0.39Da。

序列表

<110> 上海博槿生物科技有限公司

<120> 一种双靶点抗原结合分子

<130> PB00126

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD20 Fab的VH的核苷酸序列

<400> 1

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaact attagttgga atagtggttc cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatata 300

cagtacggca actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD20 Fab的VH的氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VH中的CDR1的氨基酸序列

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VH中的CDR2的氨基酸序列

<400> 4

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VH中的CDR3的氨基酸序列

<400> 5

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 6

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD20 Fab的VL的核苷酸序列

<400> 6

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa a 321

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VL的氨基酸序列

<400> 7

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VL中的CDR1的氨基酸序列

<400> 8

Gln Ser Val Ser Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VL中的CDR2的氨基酸序列

<400> 9

Asp Ala Ser

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD20 Fab的VL中的CDR3的氨基酸序列

<400> 10

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr

1 5

<210> 11

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD3 scFV (#1)的VH的核苷酸序列

<400> 11

caggtgcagc tggtgcagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180

aaccagaagg tgaaggaccg cttcaccatc agcaccgaca agagcaagag caccgccttc 240

ctgcagatgg acagcctgcg ccccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgctactac 300

gacgaccact actcgctgga ctactggggc cagggcaccc ccgtgaccgt gtcctca 357

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV (#1)的VH的氨基酸序列

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VH中的CDR1的氨基酸序列

<400> 13

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VH中的CDR2的氨基酸序列

<400> 14

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VH中的CDR3的氨基酸序列

<400> 15

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD3 scFV的VL的核苷酸序列

<400> 16

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgca gcgccagcag cagcgtgagc tacatgaact ggtaccagca gacccccggc 120

aaggccccca agcgctggat ctacgacacc agcaagctgg ccagcggcgt gcccagccgc 180

ttcagcggca gcggcagcgg caccgactac accttcacca tcagcagcct gcagcccgag 240

gacatcgcca cctactactg ccagcagtgg agcagcaacc ccttcacctt cggccagggc 300

accaagctgc agatcacc 318

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VL的氨基酸序列

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr

100 105

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VL中的CDR1的氨基酸序列

<400> 18

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 19

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VL中的CDR2的氨基酸序列

<400> 19

Asp Thr Ser

1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV的VL中的CDR3的氨基酸序列

<400> 20

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 21

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码anti-CD3 scFV (#2)的VH的核苷酸序列

<400> 21

caggtgcagc tggtgcagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc cgctacacca tgcactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccca gccgcggcta caccaactac 180

aaccagaagg tgaaggaccg cttcaccatc agccgcgaca atagcaagaa caccgccttc 240

ctgcagatgg acagcctgcg ccccgaggac accggcgtgt acttctgcgc ccgctactac 300

gacgaccact actcgctgga ctactggggc cagggcaccc ccgtgaccgt gtcctca 357

<210> 22

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD3 scFV (#2)的VH的氨基酸序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 23

ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggct 29

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 24

tggttcttgg tcatctcctc ctgggatg 28

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 25

cttcttcctc tacagcaggc taaccg 26

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 26

gagccgtcgg agtccagcac gggaggc 27

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 27

aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctacc 40

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 28

cttggtcatc tcctcctggg atgggggcag ggtgtaca 38

Claims

2.根据权利要求1所述的双靶点抗原结合分子，其中所述scFv包含：从scFv的N末端至C末端的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，或从scFv的N末端到C末端的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)。

3.根据权利要求1或2所述的双靶点抗原结合分子，还包含Fc结构域，所述Fc结构域由能够稳定接合的第一和第二亚基组成。

4.根据权利要求3所述的双靶点抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部包含在所述Fab重链的C末端与scFv融合的第一Fab，第二抗原结合部包含在Fab重链的C末端与Fc结构域融合的第二Fab。

5.权利要求4的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的C-末端融合至scFv的重链可变区(V_H)的N-末端。

6.权利要求4的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的C-末端融合至scFv的轻链可变区(V_L)的N-末端。

7.根据权利要求3所述的双靶点抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部包含在所述Fab重链的N末端与scFv融合的第一Fab，且所述第二抗原结合部包含在Fab重链的C末端与Fc结构域融合的第二Fab。

8.根据权利要求7所述的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的N末端与scFv的重链可变区(V_H)的C末端融合。

9.根据权利要求7的双靶点抗原结合分子，其中第一Fab在Fab重链的N末端与scFv的轻链可变区(V_L)的C末端融合。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的双靶点抗原结合分子，其包含不超过一个能够特异性结合T细胞活化抗原的抗原结合部。