CN110964000B - 一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于凝血酶分析检测技术领域，尤其涉及一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用。本发明提供的修饰标签与适配体I共同修饰在纳米金表面，能够得到纳米金探针，该纳米金探针配合修饰有适配体II的磁性粒子共同构成检测探针，该检测探针能够特异性识别凝血酶并构成三明治结构。通过外加磁场固定三明治结构，去除基质溶液，再加入次氯酸钠溶液与三明治结构中的修饰标签发生氧化还原反应，使纳米金上数量远大于凝血酶的信号标签释放，用于质谱检测。因此，本发明提供的修饰标签制得的检测探针能够实现凝血酶的信号转化及信号放大，并借助高效液相色谱质谱联用技术高灵敏度定量检测凝血酶。

Description

一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用
技术领域
本发明涉及凝血酶分析检测技术领域，尤其涉及一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用。
背景技术
高效液相色谱质谱联用技术具有灵敏度高、准确度好、适合批量处理等优点，已广泛用于各个分析领域。然而蛋白多肽类大分子由于分子量大，与质谱检测器离子源的兼容性较差，离子化效率偏低，导致蛋白多肽类大分子的质谱响应极低。
以质谱标签为基础的质谱信号转化、放大技术已被报道用于蛋白类大分子的检测。质谱标签是一类具有高质谱响应，可大量修饰在纳米材料表面，实现信号转化及信号放大的小分子。借助质谱标签、纳米材料等新分析技术，扩大质谱的应用范围，已经成为了质谱应用研究的热点。
凝血酶是血液中的一种丝氨酸蛋白酶，可将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，同时激活多个凝血因子，促进血液凝固。它在多种疾病过程中扮演重要角色，如血栓栓塞性疾病、炎症反应和心血管疾病。因此，建立灵敏的凝血酶检测方法在临床研究和诊断方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用，该修饰标签制得的检测探针能够实现凝血酶的信号转化及信号放大，并借助高效液相色谱质谱联用技术高灵敏度定量检测凝血酶。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种修饰标签，具有式I所示结构：
Figure BDA0002306038600000011
本发明提供了上述技术方案所述修饰标签的制备方法，包括以下步骤：
将硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷混合，进行第一反应，得到中间体I；
将所述中间体I、肼和甲醇混合，进行第二反应，得到中间体II；
将所述中间体II、甲醇和2-氨基-3-吡啶甲醛在酸性条件下进行第三反应，得到修饰标签。
优选的，所述硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷的用量比为1g：(1.3～3)g：(0.3～0.6)g：(4～10)mL：(30～100)mL。
优选的，所述中间体I、肼和甲醇的用量比为1g：(1～2)mL：(10～50)mL。
优选的，所述中间体II、2-氨基-3-吡啶甲醛和甲醇的用量比为100mg：(70～200)mg：(20～50)mL。
本发明提供了一种检测探针，包括纳米金探针和磁性粒子探针，所述纳米金探针为修饰有适配体I和修饰标签的纳米金，所述适配体I为5’端带有巯基的核苷酸序列，所述修饰标签为上述技术方案所述修饰标签；所述磁性粒子探针为修饰有适配体II的磁性纳米粒子，所述适配体II为5’端带有氨基的核苷酸序列。
优选的，所述纳米金与适配体I的摩尔比为1:20～100；所述纳米金与修饰标签的摩尔比为1:300～2000。
优选的，所述适配体I的核苷酸序列为：5’-SH-T5-GGT TGG TGT GGT TGG-3’；所述适配体II的核苷酸序列为：5’-NH2-T12-AGT CCG TGG TAG GGCAGG TTG GGG TGA CT-3’。
本发明提供了上述技术方案所述检测探针在凝血酶定量检测中的应用。
优选的，将所述检测探针用于凝血酶定量检测的方法包括以下步骤：将纳米金探针、磁性粒子探针、反应缓冲溶液与凝血酶样品混合，进行结合，外加磁场去除基质溶液后，向所得反应体系中加入次氯酸钠溶液，进行氧化还原反应，将所生成的信号标签用于质谱检测。
本发明提供了一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用，本发明提供的修饰标签与适配体I共同修饰在纳米金表面，能够得到纳米金探针，该纳米金探针配合修饰有适配体II的磁性粒子能够构成检测探针，该检测探针能够特异性识别凝血酶并构成三明治结构，外加磁场去除基质溶液后，通过次氯酸钠与三明治结构中的修饰标签发生氧化还原反应释放出信号标签用于质谱检测。因此，本发明提供的修饰标签制得的检测探针能够实现凝血酶的信号转化及信号放大，并借助高效液相色谱质谱联用技术高灵敏度定量检测凝血酶。
附图说明
图1为本发明纳米金探针的修饰过程、磁性粒子探针的合成及检测探针检测凝血酶的原理图；
图2为实施例1制备的修饰标签的质谱图；
图3为实施例1制备的纳米金的透射电子显微镜图；
图4为实施例3的特异性实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种修饰标签，具有式I所示结构：
Figure BDA0002306038600000031
本发明提供了上述技术方案所述修饰标签的制备方法，包括以下步骤：
将硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷混合，进行第一反应，得到中间体I；
将所述中间体I、肼和甲醇混合，进行第二反应，得到中间体II；
将所述中间体II、甲醇和2-氨基-3-吡啶甲醛在酸性条件下进行第三反应，得到修饰标签。
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷混合，进行第一反应，得到中间体I。在本发明中，所述硫辛酸的结构式如下所示：
Figure BDA0002306038600000041
在本发明中，所述硫辛酸(原料I)、二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、乙醇(EtOH)和二氯甲烷的用量比优选为1g：(1.3～3)g：(0.3～0.6)g：(4～10)mL：(30～100)mL，更优选为1g：2g：(0.4～0.5)g：(6～8)mL：(50～80)mL。在本发明中，所述混合和第一反应的过程优选为先将硫辛酸、乙醇、4-二甲氨基吡啶和4/5体积的二氯甲烷混合均匀后，置于冰水浴中，冷却至0℃，然后取二环己基碳二亚胺溶于剩余的二氯甲烷中，滴加至上述冰水浴体系中，在0℃条件下进行搅拌反应1h后，移去冰水浴，在室温条件下继续反应24h。本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的搅拌速率能够维持反应正常进行即可。在第一反应过程中，DCC和DMAP作为催化剂，二氯甲烷作为溶剂，硫辛酸与乙醇酯化反应生成中间体I。
完成所述第一反应后，本发明优选将所得反应体系进行旋蒸除去溶剂，然后进行柱层析分离，得到黄色油状液体(中间体I)。在本发明中，所述柱层析分离所用洗脱液优选为石油醚和乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为15:1。
得到中间体I后，本发明将所述中间体I、肼和甲醇混合，进行第二反应，得到中间体II。在本发明中，所述中间体I、肼和甲醇的用量比优选为1g：(1～2)mL：(10～50)mL，更优选为1g：1.5mL：(20～30)mL。在本发明中，所述肼优选为水合肼(NH2NH2·H2O)。在本发明中，所述混合和第二反应的过程优选为先将所述中间体I溶于甲醇中，然后加入水合肼，在40℃条件下搅拌过夜，进行第二反应，中间体I与肼反应生成中间体II。本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的搅拌速率能够维持反应正常进行即可。
完成所述第二反应后，本发明优选向所得体系中加入乙酸乙酯(过量)，用盐水(饱和氯化钠)洗涤有机层；然后取出有机层，加入MgSO4干燥；再将所得物料依次进行过滤、浓缩和柱层析分离，得到黄色固体产物(中间体II)。在本发明中，所述柱层析分离所用洗脱液优选为二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为15:1。本发明对所述过滤和浓缩的过程没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程即可。
得到中间体II后，本发明将所述中间体II、甲醇和2-氨基-3-吡啶甲醛在酸性条件下进行第三反应，得到修饰标签。在本发明中，所述2-氨基-3-吡啶甲醛的结构式如下所示：
Figure BDA0002306038600000051
在本发明中，所述中间体II、2-氨基-3-吡啶甲醛和甲醇的用量比优选为100mg：(70～200)mg：(20～50)mL，更优选为100mg：(100～150)mg：(30～40)mL。在本发明中，所述酸性条件由三氟乙酸(TFA)提供，所述三氟乙酸与甲醇的体积比优选为50μL:30mL。在本发明中，所述中间体II、甲醇和2-氨基-3-吡啶甲醛在酸性条件下进行第三反应的过程优选为：将中间体II、2-氨基-3-吡啶甲醛和甲醇置于100mL圆底烧瓶中，混合均匀后，加入50μL三氟乙酸，磁力搅拌反应过夜，中间体II与2-氨基-3-吡啶甲醛发生脱水反应，缩合制备修饰标签。本发明对所述磁力搅拌的速率没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程能够维持反应正常进行即可。
完成所述第三反应后，本发明优选将所得体系进行旋蒸除去溶剂，然后柱层析分离，得到黄色固体产物，即修饰标签，名称为N’-(2-氨基吡啶-3-次甲基)-1,2-二硫戊环基-3-戊酰肼(TAPA)。在本发明中，所述柱层析所用洗脱液优选为二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为15:1。
在本发明中，所述修饰标签的制备过程如下所示：
Figure BDA0002306038600000061
本发明提供了一种检测探针，包括纳米金探针和磁性粒子探针，所述纳米金探针为修饰有适配体I和修饰标签的纳米金，所述适配体I为5’端带有巯基的核苷酸序列，所述修饰标签为上述技术方案所述修饰标签；所述磁性粒子探针为修饰有适配体II的磁性纳米粒子，所述适配体II为5’端带有氨基的核苷酸序列。
在本发明中，所述适配体I的核苷酸序列优选为：5’-SH-T5-GGT TGG TGT GGTTGG-3’，在本发明中，所述适配体I的核苷酸序列能够特异性识别凝血酶。
在本发明中，所述纳米金与适配体I的摩尔比优选为1:20～100，更优选为1:40～80，最优选为1:50～60；所述纳米金与修饰标签的摩尔比优选为1:300～2000，更优选为1:500～1500，最优选为1:800～1200。
本发明对所述纳米金的合成方法和尺寸没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的合成方法和尺寸即可。在本发明的具体实施例中，所述纳米金的制备方法优选为柠檬酸钠法，具体步骤为：取100mL HAuCl4水溶液(1mM)至双颈烧瓶中，组装冷凝回流装置，油浴加热至120℃，充分搅拌，当冷凝液滴以1滴/s的速度回流时，迅速加入10mL柠檬酸钠溶液(38.8mM)，反应15min后，关闭加热装置，继续搅拌冷却至室温，将所得溶液以0.22μM滤膜过滤，4℃保存，得到纳米金溶液(纳米金的粒径为13nm)。本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的过程即可；本发明对所述迅速加入柠檬酸溶液的过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的操作过程即可。
在本发明中，制备纳米金探针过程中，所述纳米金和TAPA优选以溶液的形式使用；所述纳米金探针的制备方法优选包括以下步骤：
将适配体I和三(2-羧乙基)膦(TCEP)混合，进行活化，得到活化产物物料；
将所述活化产物物料与纳米金溶液混合，进行第一修饰，得到第一修饰产物；
将所述第一修饰产物与TAPA溶液混合，进行第二修饰，得到纳米金探针。
本发明将适配体I和三(2-羧乙基)膦(TCEP)混合，进行活化，得到活化产物物料。在本发明中，所述适配体I优选以溶液的形式使用，所述适配体I溶液的溶剂优选为PB缓冲液(10mM，pH 8.0)；所述适配体I溶液的浓度优选为100μM。在本发明中，所述三(2-羧乙基)膦优选以溶液的形式使用，所述三(2-羧乙基)膦溶液的溶剂优选为PB缓冲液(10mM，pH8.0)，所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度优选为10mM。在本发明中，所述活化的温度优选为37℃，时间优选为2h。本发明利用三(2-羧乙基)膦活化适配体I上的巯基，便于后续修饰过程。
完成所述活化后，本发明无需进行任何处理，直接将所得活化产物物料与纳米金溶液混合，进行第一修饰，得到第一修饰产物。在本发明中，所述纳米金溶液优选为上述技术方案所述纳米金的制备方法制备而得的纳米金溶液；所述纳米金溶液的浓度优选为2.5nM；所述适配体I溶液、三(2-羧乙基)膦溶液和纳米金溶液的体积比优选为1.5μL:10μL:1mL。在本发明中，所述第一修饰的温度优选为室温，时间优选为16h。在第一修饰过程中，适配体I与纳米金通过硫金键直接连接。
完成所述第一修饰后，本发明优选向所得体系中加入1M氯化钠溶液，进行老化36h，然后离心去除上清液后，将所得物料重新分散在PB缓冲液(10mM，pH 8.0)中，得到第一修饰产物(2.5nM)，记为Au-apt1。
得到第一修饰产物后，本发明将所述第一修饰产物与TAPA溶液混合，进行第二修饰，得到纳米金探针。在本发明中，所述TAPA溶液优选为TAPA溶于PB缓冲液(10mM，pH 8.0)中所得溶液，所述TAPA溶液的浓度优选为100μM。在本发明中，所述第一修饰产物优选以溶液的形式使用，所述第一修饰产物的溶液与TAPA溶液的体积比优选为40:1。在本发明中，所述第二修饰的温度优选为室温，时间优选为30min。在第二修饰过程中，Au-apt1与TAPA通过硫金键直接连接。
完成所述第二修饰后，本发明优选将所得体系离心去除上清液，得到纳米金探针，记为Au-apt1/TAPA。将所述纳米金探针分散在反应缓冲溶液中，得到纳米金探针溶液。在本发明中，所述反应缓冲溶液优选为Tris-HCl buffer，所述反应缓冲溶液的浓度优选为25mM，pH值优选为7.4，所述反应缓冲溶液中优选含有NaCl(142mM)、MgCl2(5mM)和KCl(15mM)。
在本发明中，所述磁性粒子探针为修饰有适配体II的磁性纳米粒子，所述适配体II为5’端带有氨基的核苷酸序列；所述适配体II的核苷酸序列优选为：5’-NH2-T12-AGT CCGTGG TAG GGCAGG TTG GGG TGA CT-3’。在本发明中，所述适配体II的核苷酸序列能够特异性识别凝血酶。
本发明对所述氨基化磁性纳米粒子的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。在本发明具体实施例中，所用的氨基化磁性纳米粒子购自天津倍思乐色谱技术开发中心，所述氨基化磁性纳米粒子的粒径优选为1～2μm。在本发明中，所述氨基化磁性纳米粒子的市售商品中，氨基化磁性纳米粒子分散在10mM PB中。
在本发明中，所述磁性粒子探针的制备方法优选为戊二醛交联法，即通过戊二醛将氨基化磁性纳米粒子与适配体II连接，得到磁性粒子探针；具体包括以下步骤：
将氨基化磁性纳米粒子、戊二醛水溶液和PB缓冲液混合，进行A反应，得到第一反应物料；
将所述第一反应物料与适配体II混合，进行B反应，得到第二反应物料；
向所述第二反应物料中加入硼氢化钠溶液，进行C反应，得到磁性粒子探针。
本发明将氨基化磁性纳米粒子、戊二醛水溶液和PB缓冲液混合，进行A反应，得到第一反应物料。在本发明中，所述氨基化磁性纳米粒子优选以溶液的形式使用，所述氨基化磁性纳米粒子溶液所用溶剂优选为PB缓冲液(10mM，pH 8.0)，所述磁性纳米粒子溶液的质量分数优选为1％。在本发明中，所述戊二醛水溶液的质量分数优选为50％；所述PB缓冲液的浓度优选为10mM。在本发明中，所述氨基化磁性纳米粒子溶液和PB缓冲液的用量比优选为400μL:4mL；所述戊二醛的用量优选以戊二醛在混合所得体系中终浓度为2.5％为准。在本发明中，所述A反应的温度优选为室温，时间优选为2h。在A反应过程中，氨基化磁性纳米粒子表面的氨基与戊二醛的其中一个醛基脱水缩合，另一个的醛基后续与氨基化适配体反应。
完成所述A反应后，本发明将所得体系在外加磁场条件下去除溶液，将所得物料用超纯水清洗三次，分散于柠檬酸钠缓冲液(3×SSC，4mL)中，得到第一反应物料。在本发明中，所述SSC即为常规柠檬酸钠缓冲液(0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，HCl调节pH值至7.0)；3×SCC即为3倍浓度。本发明对所述外加磁场的磁场强度没有特殊的限定，能够实现分离效果即可。
得到第一反应物料后，本发明将所述第一反应物料与适配体II混合，进行B反应，得到第二反应物料。在本发明中，所述适配体II优选以溶液的形式使用，所述适配体II溶液的溶剂优选为PB缓冲液(10mM，pH 8.0；所述适配体II溶液的浓度优选为100μM。在本发明中，所述B反应优选在振摇条件下进行，所述B反应的时间优选为12h。本发明对所述振摇的具体条件没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的条件，能够保证反应顺利进行即可。完成所述B反应后，无需进行任何处理，即得到第二反应物料。在B反应过程中，A反应后的戊二醛另一个醛基与适配体II的氨基反应，脱水缩合，从而将适配体修饰在氨基化磁性纳米粒子表面。
得到第二反应物料后，本发明向所述第二反应物料中加入硼氢化钠溶液，进行C反应，得到磁性粒子探针。本发明对所述硼氢化钠溶液的浓度没有特殊限定，所述硼氢化钠的用量保证过量即可，在本发明的实施例中，所述硼氢化钠的浓度优选为5mg/mL。在本发明中，所述C反应的温度优选为室温，时间优选为30min。在C反应过程中，戊二醛与氨基反应生成的C＝N键不够稳定，加入还原剂硼氢化钠将C＝N键还原为稳定的C-N键。
完成所述C反应后，本发明优选将所得产物用上述柠檬酸钠缓冲液清洗三次，得到磁性粒子探针，记为MBs-apt2。将所述磁性粒子探针分散在反应缓冲溶液中,4℃保存，得到磁性粒子探针溶液。在本发明中，所述反应缓冲溶液优选为Tris-HCl buffer，所述反应缓冲溶液的浓度优选为25mM，pH值优选为7.4，所述反应缓冲溶液优选含有NaCl(142mM)、MgCl2(5mM)和KCl(15mM)。
本发明提供了上述技术方案所述检测探针在凝血酶定量检测中的应用。在本发明中，将所述检测探针用于凝血酶定量检测的方法优选包括以下步骤：将纳米金探针、磁性粒子探针、反应缓冲溶液与凝血酶样品混合，进行结合；外加磁场去除基质溶液后，向所得反应体系中加入次氯酸钠溶液，进行氧化还原反应，将所生成的信号标签用于质谱检测。
本发明将纳米金探针、磁性粒子探针、反应缓冲溶液与凝血酶样品混合，进行结合。在本发明中，所述纳米金探针、磁性粒子探针和凝血酶样品优选以溶液的形式进行混合，所述纳米金探针溶液的浓度优选为10nM，所述磁性粒子探针溶液的浓度优选为1mg/mL。在本发明中，所述混合和结合的过程优选为先将磁性粒子探针溶液与含有凝血酶的待测样品混合均匀，进行第一结合，然后在外加磁场条件下，去除基质溶液，向所得体系中加入纳米金探针溶液和反应缓冲溶液，进行第二结合。在本发明中，所述磁性粒子探针溶液、凝血酶样品溶液、纳米金探针溶液和反应缓冲溶液的体积比优选为30:200:30:100，在本发明中，所述第一结合和第二结合均优选在37℃水浴条件下进行，所述第一结合和第二结合的时间均优选为1h。
在本发明中，所述反应缓冲溶液优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为25mM，pH值优选为7.4，所述Tris-HCl缓冲液中优选含有NaCl(142mM)、MgCl2(5mM)和KCl(15mM)。在结合过程中，纳米金探针和磁性粒子探针特异性与凝血酶形成三明治结构。
结合完成，本发明将所得体系外加磁场去除基质溶液后，向所得反应体系中加入次氯酸钠溶液，进行氧化还原反应，将所生成的信号标签用于质谱检测。本发明优选先在外加磁场条件下去除所得体系中的过量纳米金探针，并用反应缓冲液清洗1次，然后向所得反应体系中加入次氯酸钠溶液，进行氧化还原反应，将所生成的信号标签用于质谱检测。在本发明中，所述次氯酸钠溶液的质量分数优选为0.005％，本发明对所述次氯酸钠的具体用量没有特殊的限定，能够与体系中修饰标签反应完全即可。本发明对所述次氯酸钠溶液的种类和来源没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知种类和来源的次氯酸钠溶液即可。在本发明中，所述氧化还原反应的时间优选为1min。生成信号标签后，本发明优选通过离心取上清液进行质谱进样分析。
在氧化还原反应过程中，三明治结构中的修饰标签与次氯酸钠溶液中的次氯酸根发生氧化还原反应，生成信号标签，2-氨基-3-吡啶甲醛(APA)。
在本发明中，修饰标签与次氯酸钠反应生成信号标签的过程如下所示：
Figure BDA0002306038600000111
图1为本发明纳米金探针的修饰过程、磁性粒子探针的合成及检测探针检测凝血酶的原理图，其中，a为纳米金探针的修饰过程，首先在纳米金表面修饰适配体I，形成纳米金-适配体I复合物，再加入修饰标签，最终形成纳米金探针。b为磁性粒子探针的合成及检测探针检测凝血酶的原理图，在磁性粒子表面修饰适配体II形成磁性粒子探针，磁性粒子探针与凝血酶结合后，加入纳米金探针，构成三明治结构，通过外加磁场固定三明治结构，去除基质溶液，再加入次氯酸钠溶液与三明治结构中的修饰标签发生氧化还原反应，释放出大量信号标签，借助液质联用仪进行检测。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
修饰标签的制备：取硫辛酸1.03g,乙醇4.24mL,4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.31g，二氯甲烷40mL置于100mL圆底烧瓶中，混合均匀后置于冰水浴中，冷却至0℃；取二环己基碳二亚胺(DCC)1.54g，溶于10mL二氯甲烷中后，滴加至上述冰水浴体系中，在0℃条件下搅拌反应1h后，移去冰浴，室温继续反应24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离产物(洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝15:1)，旋蒸接取柱层析分离产物，得到黄色油状液体(中间体I)；将所述中间体I1g溶于18mL甲醇中，加入水合肼(NH2NH2·H2O)1.4mL，40℃搅拌过夜；反应完成后，加入乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤有机层，取出有机层后，加MgSO4吸水干燥，将所得物料过滤、浓缩后，柱层析分离(洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝15:1)，旋蒸接取柱层析分离产物，得到黄色固体产物(中间体II)。取中间体II 132mg，2-氨基-3-吡啶甲醛97.7mg，甲醇30mL置于100mL圆底烧瓶中，混合均匀后，加入50μL三氟乙酸，磁力搅拌反应过夜；反应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离(洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝15:1)，旋蒸接取柱层析分离产物，得到黄色固体产物，即为修饰标签，记为TAPA。
纳米金的合成：取100mL HAuCl4水溶液(1mM)至双颈烧瓶中，组装冷凝回流装置，油浴加热至120℃，充分搅拌。当冷凝液滴以每秒1滴的速度回流时，迅速加入10mL柠檬酸钠溶液(38.8mM)，反应15min后，关闭加热装置，继续搅拌冷却至室温，将合成所得的纳米金溶液以0.22μM滤膜过滤，4℃保存，得到纳米金溶液。
纳米金探针的制备：取1.5μL 100μM适配体I与10μL 10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)混合2h，加入1mL 2.5nM纳米金溶液，室温反应16h；反应结束后，加入100μL 1M氯化钠溶液，老化36h；离心去除上清液后，重新分散在1mLPB缓冲液(10mM，pH 8.0)中，得到第一修饰产物Au-apt1。取Au-apt1400μL与10μL 100μM TAPA混合均匀，室温反应30min，离心去除上清液后，重新分散在反应缓冲溶液(25mM Tris-HCl buffer(142mM NaCl,5mM MgCl2，15mM KCl，pH 7.4))中，得到纳米金探针溶液。
磁性粒子探针的制备：取400μL 1％的氨基化磁性纳米粒子，10mM PB缓冲液清洗三次后分散在4mL 10mM PB缓冲液中，加入质量分数为50％的戊二醛水溶液使得体系中戊二醛的终浓度为2.5％，室温轻摇反应2h，外加磁场去除溶液后，用超纯水清洗3次，重新分散在4mL的柠檬酸钠缓冲液(3×SSC)中。加入20μL 100μM的适配体II，振摇反应过夜；向所得体系中加入硼氢化钠溶液(5mg/mL，50μL)室温反应30min后，用柠檬酸钠缓冲液清洗三次，分散在反应缓冲溶液(25mM Tris-HCl buffer(142mM NaCl，5mM MgCl2，15mM KCl，pH7.4))中，4℃保存，得到磁性粒子探针溶液。
图2为实施例1制备的修饰标签的质谱图，图中325.0(m/z)为TAPA的分子离子峰，137.0(m/z)为TAPA碎裂产生的主要子离子峰，从而能够证明制得的修饰标签为TAPA。
图3为实施例1制备的纳米金的透射电子显微镜图，由图可以看出，纳米金形态规则，粒径均一，具有良好的分散性，平均粒径约为13nm。
实施例2
标准曲线的制备
取磁性粒子探针溶液50μL，分别加入0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM凝血酶标准溶液100μL，混合均匀后，置于37℃水浴中反应1h。反应完成后，在外加磁场条件下，去除溶液，加入100μL反应缓冲液(25mM Tris-HCl buffer(142mM NaCl，5mM MgCl2，15mMKCl，pH 7.4))，纳米金探针溶液100μL，混匀后置于37℃水浴中反应1h。反应完成后，在外加磁场条件下，去除过量纳米金探针，并用反应缓冲液清洗1次，向所得体系中加入50μL0.005％的次氯酸钠溶液，5μL 10ng/mL的内标呋喃妥英溶液，涡旋1min，充分反应，离心取上清液30μL质谱进样分析，并以凝血酶浓度为横坐标，以质谱响应比值数据为纵坐标，绘制标准曲线。
结果显示，当凝血酶浓度在0.05～10nM之间时，质谱响应比值与凝血酶的浓度成线性关系，线性回归方程为y＝0.9002x+0.6597，线性相关系数R2＝0.9914，这说明，本发明的纳米金探针和磁性离子探针能够实现凝血酶样品的检测，且检测灵敏度高，检出限为0.007nM。
实施例3
特异性实验
为了证明本发明的检测方法对于凝血酶检测的特异性，将实施例2所述方法应用于以下溶液的检测：0.1nM凝血酶，空白10mM PB缓冲液，10nMβ-葡萄糖醛酸酶，10nM肝素，10nM牛血清白蛋白，具体检测结果见图4。
如图4所示，凝血酶的浓度仅为其他蛋白溶液浓度的百分之一，但其质谱响应远大于其他蛋白溶液样品的响应，该结果证明本发明的方法对凝血酶具有很高的特异性。
实施例4
生物样品检测
为了证明本发明在生物样品检测中的适用性，将实施例2所述方法应用于稀释血浆中的凝血酶检测。用10nM PB缓冲液将空白血浆样品稀释100倍，并制成含不同浓度凝血酶(0.1、1、10nM)的稀释血浆样品各3份。
检测结果显示，不同浓度凝血酶的回收率在89.6～110.4％之间，证明该方法可应用于生物样品的检测。
由以上实施例可知，本发明提供了一种修饰标签及其制备方法、检测探针及其应用。本发明提供的修饰标签与适配体I共同修饰在纳米金表面，能够得到纳米金探针，该纳米金探针配合修饰有适配体II的磁性粒子能够构成检测探针，该检测探针能够特异性识别凝血酶并构成三明治结构，外加磁场分离出三明治结构后，通过次氯酸钠与三明治结构中的修饰标签发生氧化还原反应释放出信号标签，用于质谱检测。因此，本发明提供的修饰标签制得的检测探针能够实现凝血酶的信号转化及信号放大，并借助高效液相色谱质谱联用技术高灵敏度定量检测凝血酶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种修饰标签，其特征在于，具有式I所示结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式I。
2.权利要求1所述修饰标签的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷混合，进行第一反应，得到中间体I；
将所述中间体I、肼和甲醇混合，进行第二反应，得到中间体II；
将所述中间体II、甲醇和2-氨基-3-吡啶甲醛在酸性条件下进行第三反应，得到修饰标签；
所述中间体I的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
所述中间体II的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硫辛酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、乙醇和二氯甲烷的用量比为1g：（1.3~3）g：（0.3~0.6）g：（4~10）mL：（30~100）mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体I、肼和甲醇的用量比为1g：（1~2）mL：（10~50）mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体II、2-氨基-3-吡啶甲醛和甲醇的用量比为100mg：（70~200）mg：（20~50）mL。
6.一种检测探针，其特征在于，包括纳米金探针和磁性粒子探针，所述纳米金探针为修饰有适配体I和修饰标签的纳米金，所述适配体I为5’端带有巯基的核苷酸序列，所述修饰标签为权利要求1所述修饰标签或权利要求2~5任一项所述制备方法制备得到的修饰标签；所述磁性粒子探针为修饰有适配体II的磁性纳米粒子，所述适配体II为5’端带有氨基的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的检测探针，其特征在于，所述纳米金与适配体I的摩尔比为1:20~100；所述纳米金与修饰标签的摩尔比为1:300~2000。
8.根据权利要求6所述的检测探针，其特征在于，所述适配体I的核苷酸序列为：5’-SH-T5-GGT TGG TGT GGT TGG-3’；所述适配体II的核苷酸序列为：5’-NH2-T12-AGT CCG TGGTAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’。
9.权利要求6~8任一项所述检测探针在制备定量检测凝血酶探针中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述检测探针用于凝血酶定量检测的方法包括以下步骤：将纳米金探针、磁性粒子探针、反应缓冲溶液与凝血酶样品混合，进行结合；外加磁场去除基质溶液后，向所得反应体系中加入次氯酸钠溶液，进行氧化还原反应，将所生成的信号标签用于质谱检测。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101672770A (zh) * 2008-08-11 2010-03-17 中国科学院长春应用化学研究所 基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法
CN102757425A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 台州职业技术学院 一种新型的硫辛酰肼衍生物其及制备方法和应用
CN108707184A (zh) * 2018-05-21 2018-10-26 浙江大学 一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用
EP3177605B1 (en) * 2014-08-07 2019-03-27 Boehringer Ingelheim International GmbH Method for producing dabigatran etexilate methanesulphonate

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101672770A (zh) * 2008-08-11 2010-03-17 中国科学院长春应用化学研究所 基于金纳米探针和核酸适配子无标记比色测定凝血酶的方法
CN102757425A (zh) * 2012-07-30 2012-10-31 台州职业技术学院 一种新型的硫辛酰肼衍生物其及制备方法和应用
EP3177605B1 (en) * 2014-08-07 2019-03-27 Boehringer Ingelheim International GmbH Method for producing dabigatran etexilate methanesulphonate
CN108707184A (zh) * 2018-05-21 2018-10-26 浙江大学 一种用于凝血酶活性检测的质谱探针及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"α-硫辛酸及其酰肼衍生物的合成和抗肿瘤活性研究";徐庙军;《化学通报》;20121231;第75卷(第9期);第837-841页 *

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