CN110960507B - 低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明药物制剂领域，涉及一种低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙‑脂质纳米药物共递送系统及其制备方法，本发明以生物可降解的脂质材料制备的纳米粒作为载体，并物理包载天然药物PIC的磷酸化前药PIC‑POOH，外层静电吸附LMWH，利用纳米制剂的长循环特性和实体肿瘤组织的EPR效应富集于肿瘤部位，进而调节肿瘤细胞转移相关通路，抑制新生血管生成，抗肿瘤转移。实验证明该药物共递送系统能抑制肿瘤细胞的EMT进程，通过小管形成实验证明能显著抑制肿瘤新生血管生成，通过体内给药评价证明了该药物共递送系统在小鼠模型上可减少肺部转移的形成，并延长荷瘤小鼠生存期；具有明显的抗肿瘤转移效果，尤其减少三阴性乳腺癌转移，并具有良好的安全性。

Description

低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物 共递送系统

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及将半衰期短的天然药物单体用化学合成的方法制成前药包载于具有长循环功能的生物可降解脂质纳米结构中，同时在其表面吸附上低分子量肝素，以共同递送两种药物进入肿瘤中并达到增强抗肿瘤转移的目的。

背景技术

乳腺癌是一种在全世界范围内的多发恶性肿瘤，具有临床发病率高，恶性程度高，预后不良等特点。尤其是针对三阴性乳腺癌的治疗效果和预后较差，原因是该类乳腺癌细胞具有高度的迁移、侵袭特性，导致其在体内形成实体瘤后容易发生向远端部位的转移，在临床上，90％的三阴性乳腺癌病人出现肿瘤转移，而对于肝、肺等器官的肿瘤转移灶难以实施有效的手术切除，同时循环系统中的肿瘤细胞难以被完全清除，导致肿瘤转移不仅难以控制而且易复发。总之，目前为止传统的治疗方案均难以控制三阴性乳腺癌转移的发生和发展，因此有必要探寻新的思路抑制三阴性乳腺癌的转移。

三阴性乳腺癌的转移与多条细胞通路相关，目前认为比较重要的是：肿瘤细胞在肿瘤相关刺激因子如转化生长因子-β(TGF-β)的刺激下由上皮样细胞转化为间质样细胞，进而使得肿瘤细胞侵袭性增加，更容易进入循环系统，转移到远端组织；同时，实体瘤中的肿瘤新生血管在肿瘤细胞转移过程中起到“高速公路”的作用，使得肿瘤细胞更好的进入循环系统，故抑制肿瘤新生血管生成可以有效抑制原位肿瘤细胞向正常组织的转移。传统的化疗药如顺铂、阿霉素等药物因其直接杀伤增殖细胞，但无法对以上两条通路起到针对性的作用，而且化疗药物长期使用后普遍具有全身毒性，导致病人在治疗过程需忍受较大痛苦；不仅如此，传统化疗药物无法有效进入肿瘤组织，难以有效进入肿瘤实质起到抑制肿瘤转移的作用。天然药物PIC，能特异性调节乳腺癌细胞由上皮样细胞转化为间充质样细胞相关通路，抑制肿瘤细胞向高度迁移性的表型转化，且体外实验已经证明其无明显细胞毒性；LMWH能明显抑制肿瘤新生血管生成，且无明显细胞毒性和溶血反应；两者结合能明显抑制三阴性乳腺癌转移的发生和发展。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，以共同递送两种药物进入肿瘤中并达到增强抗肿瘤转移的目的。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，该共递送系统共同递送两种药物进入肿瘤中并达到增强抗肿瘤转移的目的。

本发明以生物可降解的脂质材料制备的纳米粒作为载体，并物理包载天然药物PIC的磷酸化前药PIC-POOH，外层静电吸附LMWH，利用纳米制剂的长循环特性和实体肿瘤组织的EPR效应富集于肿瘤部位，进而调节肿瘤细胞转移相关通路，抑制新生血管生成，起到抗肿瘤转移的作用。

本发明所采用的模型药物为PIC，化学合成PIC-POOH后通过物理包载的方式将其包载于生物可降解的脂质材料当中。

本发明采用的LMWH为依诺肝素钠(MW＝288.25)，无明显细胞毒性和溶血毒性，将该化合物静电吸附于脂质纳米表面，能更好地进入肿瘤，进而起到抑制肿瘤新生血管的作用。

本发明所采用的细胞为小鼠的三阴性乳腺癌细胞4T1和人源的脐静脉内皮细胞HUVEC均为本领域所公认且市购获得。

本发明所采用的小鼠为雌性Balb/c小鼠为本领域所公认且市购获得。

本发明提供了了该天然药物前药的合成方法和药物递释系统的制备方法，以及相关的药效学评价。本递药系统中，通过将天然药物白皮衫醇(PIC)制成磷酸前药(PIC-POOH)与氯化钙形成的纳米沉淀制备成磷酸钙纳米粒，采用生物可降解的高分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，带正电核的脂质(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)以及小分子胆固醇作为制剂材料，通过脂质体薄膜水化法包被磷酸钙纳米粒制备纳米脂质体(Ca-P)，最后通过静电将依诺肝素钠即低分子量肝素(LMWH)吸附于其表面，构建新型纳米药物共递送系统(H-Ca-P)。

本发明中，基于天然药物普遍具有半衰期短，清除快，无法聚集于肿瘤的特点，应用纳米技术后能够显著延长药物在血液循环中的稳定性和循环时间，而且由于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)，纳米制剂能更好地在肿瘤部位蓄积进而发挥作用；白皮衫醇(PIC)水溶性较大，故利用传统的纳米载药方式如逆向蒸发法、乙醇注入法等直接包载原药的方法难以实现有效的药物包载，而将其通过化学合成方法修饰成磷酸化前药后可以与氯化钙在水相中形成纳米沉淀，后采用薄膜水化法包载该沉淀形成磷酸钙-脂质纳米结构，其中，DSPE-PEG2000作为外磷脂层的主要成分，其生物相容性好、毒性低并可以增加制剂在体内的循环时间，DOTAP是一种常用的阳离子脂质，可以使得磷脂层外侧带有正电荷，进而形成阳离子脂质纳米载体，小分子胆固醇可以降低磷脂层的流动性进而增加脂质层的稳定性，故采用以上材料形成的磷酸钙-脂质纳米结构，具有生物相容性好，体内循环时间长，药物包封率和载药量高等特点，使得药物更好地浓集于肿瘤部位并发挥药效；同时，利用静电吸附作用可以将负电荷的LMWH牢固的结合于阳离子脂质纳米载体的表面，起到同时将两种药物递送并蓄积于实体肿瘤的效果，充分发挥二者抗肿瘤转移的作用。

本发明通过蛋白质印迹实验(Western Blot)证明了该药物共递送系统能抑制肿瘤细胞的EMT进程，通过小管形成实验(Tube formation)证明了该药物共递送系统能显著抑制肿瘤新生血管生成，通过体内给药评价证明了该药物共递送系统在小鼠模型上可以减少肺部转移的形成，并延长荷瘤小鼠生存期；具有明显的抗肿瘤转移效果。

附图说明

图1是化合物核磁谱图，

图A是原药PIC的化合物磷谱(³¹P NMR)，

图B是前药PIC-POOH的化合物磷谱(³¹P NMR)。

图2是药物共递送系统的表征，

图A是Ca-P的场发射电镜图，

图B是H-Ca-P的场发射电镜图，

图C是Ca-P和H-Ca-P的粒径图，

图D是Ca-P和H-Ca-P的电位图。

图3小管形成实验的定性和定量结果，

图A是对照组(Control)的HUVEC细胞小管形成的定性结果，

图B是PIC组的HUVEC细胞小管形成的定性结果，

图C是Ca-P组的HUVEC细胞小管形成的定性结果，

图D是LMWH组的HUVEC细胞小管形成的定性结果，

图E是H-Ca-P组的HUVEC细胞小管形成的定性结果，

图F是各组的HUVEC细胞小管形成的定量结果。

图4是采用Western Blot评价药物共递送系统对于肿瘤细胞EMT过程的影响，

图A是肿瘤组织中E-cadherin和Vimentin的Western blot结果，

图B是肿瘤组织中E-cadherin的Western Blot的定量结果，

图C是肿瘤组织中Vimentin的Western Blot的定量结果。

图5是采用HE染色技术评价药物共递送系统对肿瘤细胞肺转移的抑制情况，图A是生理盐水组HE切片的典型区域，

图B是LMWH组HE切片的典型区域，

图C是PIC组HE切片的典型区域，

图D是Ca-P组HE切片的典型区域，

图E是H-Ca-P组HE切片的典型区域，

图F是切片中转移区域所占总区域的百分比统计结果。

图6是小鼠体重曲线。

图7是小鼠生存期。

具体实施方式：

实施例1：PIC-POOH的合成和表征

采用两步化学合成PIC-POOH。第一步，称取200mg的PIC固体粉末，780mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，注射器取0.89ml的三乙胺于无水20ml四氢呋喃中，搅拌后逐滴加入3ml的氯代磷酸二乙酯，加入完毕后氮气保护，加热至70℃回流，24h后终止反应，后经硅胶柱层析纯化，除去反应杂质和副产物，得到中间产物磷酸酯化的白皮杉醇(PIC-POOET)；第二步，称取50mg的PIC-POOET，溶于5ml二氯甲烷中，搅拌后逐滴加入0.33ml三甲基溴硅烷，室温搅拌4h后旋蒸除去二氯甲烷，加入甲醇搅拌30min后终止反应，后经半制备色谱柱纯化，除去反应杂质和副产物，得到最终产物PIC-POOH。用³¹P NMR表征反应物和终产物结构；

结果显示：原料PIC在³¹P NMR无明显磷信号，而终产物PIC-POOH在³¹P NMR上有明显磷信号(δ1.08,-0.11,-3.13,-3.19,-4.36,-4.59,-4.73)且解析后与结构一致，证明该反应方案成功将磷酸基团合成到原料PIC上进而生成PIC-POOH。

实施例2：制备低分子量肝素包裹的磷酸钙-脂质纳米粒

采用PIC-POOH溶液和氯化钙溶液在油相中结合的反向微乳法制备磷酸钙纳米内核。采用薄膜水化法包载磷酸钙纳米内核制备磷酸钙-脂质纳米粒：称取16.8mg的DSPE-PEG2000，8.6mg的阳离子脂质材料DOTAP和4.6mg的胆固醇，加入2ml三氯甲烷将其溶解，加入0.7ml分散于三氯甲烷的磷酸钙纳米沉淀，充分混匀后加入500ml圆底烧瓶内，旋蒸除去三氯甲烷，加入6ml蒸馏水水化贴于瓶内壁上的脂质，冰浴条件下超声2.4min，超声条件为功率240W，间隔时间2S，即制成Ca-P，取出备用；

采用静电吸附的方式将LMWH包裹于Ca-P外部。称取3mg的LMWH，加入至3ml的磷酸钙-脂质纳米粒中，搅拌30min后，在10kDa的超滤管中离心30min，沉淀即为制得的H-Ca-P。用Malvern粒径/Zeta电位测定仪测定纳米粒的粒径和电位；

结果显示：Ca-P和H-Ca-P的粒径分别为：62.98nm和76.90nm，电位分别为：-24.7mv和37.4mv。粒径增加，电位由正变负表明LMWH成功通过静电吸附到磷酸钙-脂质纳米粒表面。从场发射电镜图可以看到两种纳米粒外观圆整，无明显聚集现象。

实施例3：药物共递送系统对于抑制肿瘤新生血管生成的评价

采用小管形成实验模拟体内肿瘤新生血管生成情况。将基质胶在4℃化冻后，在冰浴的条件下，取50uL加入到在预冷的96孔板中，转移至37℃下孵育30min待基质胶聚合。每孔加入1×10⁴个HUVEC细胞，离心去上清后，分别用含有PIC，LMWH，Ca-P，H-Ca-P的DMEM溶液(PIC和PIC-POOH浓度为5μmol/L，LMWH浓度为3.5μmol/L)重悬，接种至预铺基质胶的96孔板中。对照组采用不含药物的DMEM溶液。共孵育12h后，在相差显微镜下观察拍照，并利用Image J 1.46version软件定量视野中各组形成的小管的管腔数；

结果显示：对照组孵育12h后，形成了完整的小管结构。而实验组中，PIC组和Ca-P组能形成相对完整的小管结构，说明天然药物PIC无法有效抑制肿瘤新生血管，而LMWH组和H-Ca-P组在视野中未形成完整的小管结构，小管长度的定量结果进一步显示显示LMWH及其构成的药物共递送系统可以有效抑制肿瘤新生血管的生成。

实施例4：药物共递送系统对于乳腺癌原位瘤模型动物的体内药效学评价

原位瘤乳腺癌动物模型的建立：取对数生长期的4T1细胞，用胰酶消化后离心，PBS清洗细胞后计数，将细胞浓度调整为3×10⁷cells/ml，置于冰盒备用。雌性Balb/c小鼠腹腔注射200μl的5％水合氯醛麻醉，待小鼠麻醉后，碘伏消毒其伤口，用脱毛膏将小鼠右侧第三和第四对乳脂垫附近的体毛褪下，后小心将细胞悬液接种于小鼠的第四对右侧的乳脂垫内，可观察到小鼠乳脂垫处明显充盈，慢慢移出针头，在伤口处滴适量抗生素，观察小鼠至苏醒后继续饲养，接种后每天观察动物状态，在接种4T1细胞6天后进行实验；

将实验小鼠随机分成五组，每组10只，对照组注射生理盐水，实验组分别为PIC组，LMWH组，Ca-P组和H-Ca-P组，每两天给药一次，共给药8次(PIC和PIC-POOH的给药剂量为0.020mmol/kg/次，LMWH的0.034mmol/kg/次)，最后一次给药结束后的第三天，各组小鼠处死一只，取出肿瘤以做Western blot备用，其余小鼠每隔两天计量体重，第38天处死四只各组小鼠后取肺，进行石蜡包埋和HE染色，记录各组小鼠肺部肿瘤转移面积所占切片总面积的百分比。余下的5只小鼠进行生存期统计，并进行生存期曲线绘制；

结果显示：各组小鼠均未出现明显的体重下降，证明该药物共递送系统无明显毒性。HE染色显示H-Ca-P组小鼠肺部转移面积最小(黑色线圈出的区域为细胞核密集的肿瘤细胞转移区域，即肺转移灶)，显示构建的药物共递送系统有良好的抗转移作用，且治疗效果优于游离药物组。生存期结果显示，H-Ca-P组小鼠中位生存期最长，证明该药物共递送系统能显著延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存时间。

实施例5：药物共递送系统对于抑制肿瘤细胞EMT过程的评价

采用Western blot法定量细胞内EMT过程相关蛋白，其中包含细胞上皮样表型的E钙粘蛋白(E-cadherin)和间质样表型的波形蛋白(Vimentin)，表征药物共递送系统对于肿瘤细胞EMT进程的影响。取实施例4的肿瘤组织，将各组织剪碎后加入RIPA(200μl/20mg)于冰上进行匀浆，充分裂解后于12000rpm/min离心10min离心取上清，将上清转移到新的预冷EP管中，弃去沉淀，用BCA试剂盒定量后加入适量的5X的上样缓冲液，涡旋混匀后于95℃干式加热器上加热5min，上样；

结果显示：相对于对照组和LMWH组，PIC组、Ca-P组和H-Ca-P组的肿瘤组织中的E-钙粘蛋白的表达有一定程度的上升，波形蛋白的表达明显下降，且制剂组的作用效果明显好于游离药物组。综上结果表明，构建的药物共递送系统能够有效抑制乳腺癌细胞的EMT进程，降低肿瘤细胞的侵袭性。

Claims (10)

1.一种低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，以生物可降解的脂质材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和阳离子脂质材料( 2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)作为制剂材料，采用薄膜水化法包载白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH与氯化钙共沉淀形成的无定形纳米沉淀制备纳米脂质体；通过静电吸附作用将负电性的低分子量肝素LMWH包裹于上述纳米脂质体表面制成磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统。

2.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所用的生物可降解的脂质材料为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，( 2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)以及胆固醇。

3.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，通过(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)所带的正电荷与低分子量肝素LMWH所带的负电荷的静电吸引作用将低分子量肝素LMWH吸附于纳米脂质体Ca-P表面构成纳米药物共递送系统H-Ca-P。

4.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所述共递送系统包载抗乳腺癌天然药物白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH。

5.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所述共递送系统中通过白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH与氯化钙形成无定形磷酸钙纳米沉淀内核。

6.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所述共递送系统中采用薄膜水化法包载白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH与氯化钙共沉淀形成的无定形纳米沉淀制备纳米脂质体。

7.按权利要求1所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所述共递送系统中将天然抗转移药物PIC通过化学合成方法将磷酸基团连接到PIC的酚羟基上进而合成为白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH。

8.按权利要求4所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统，其特征在于，所述共递送系统中，PIC通过两步反应合成为PIC-POOH，第一步为，以无水四氢呋喃(THF)作溶剂，PIC与氯代磷酸二乙酯反应生成磷酸酯化的中间产物(PIC-POOET)；第二步为，以二氯甲烷做溶剂，PIC-POOET与三甲基溴硅烷反应后，再继续与甲醇反应最终生成产物白皮杉醇磷酸前药PIC-POOH；

所述PIC-POOET是：白皮杉醇与氯代磷酸二乙酯反应生成的磷酸酯化白皮杉醇。

9.按权利要求3所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统在制备用于抑制肿瘤新生血管的生成进而抑制肿瘤转移制品中的用途，其中低分子量肝素LMWH吸附在纳米制剂表面，进入肿瘤组织后抑制肿瘤新生血管的生成。

10.权利要求4所述的低分子量肝素和天然药物前药构成的磷酸钙-脂质纳米药物共递送系统在制备用于抑制肿瘤细胞由上皮样细胞转化为间充质样细胞的过程，降低肿瘤细胞的侵袭性进而抑制肿瘤转移的制品中的用途。

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