CN110954516B - 一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法，涉及基因工程的生物传感器技术领域，基于砷诱导型启动子构建的细菌生物传感器稳定性差、灵敏性低、检测仍不够方便的问题。本发明包括以下步骤：(1)在无细胞体系的细胞提取物、供能溶液、氨基酸混合溶液和超纯水混合体系中加入质粒puc18‑ep3ars‑GFP；(2)孵育后，加入诱导试剂As2O3溶液；(3)孵育后，检测荧光表达。本发明的有益效果在于：本发明可以避免砷的全菌生物传感器的菌液长时间培养，同时也解决了由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及砷进入胞内引起复杂的副反应的干扰而导致的检测结果的稳定性、灵敏性较差的问题，实现快递便捷稳定的砷检测。

Description

一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程的生物传感器技术领域，广谱型基于诱导型启动子的体外检测系统，具体涉及一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法。
背景技术
环境问题一直以来是世界各国普遍关注的焦点，全球变暖、能源匮乏、大气污染、人口膨胀和物种灭绝时时刻刻威胁着人类的生存环境，中国作为全球最大的发展中国家，环境污染问题日益严重，我国的江河湖泊普遍遭受污染，全国75％的湖泊出现了不同程度的富营养化：90％的城市水域污染严重，南方城市总缺水量的60-70％是由于水污染造成，水污染降低了水体的使用功能，加剧了水资源短缺。重金属是水污染中一类主要的污染物，目前中国由于在重金属的开采、冶炼、加工过程中，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤引起严重的环境污染。如随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害，重金属在人体内能和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等，对人体会造成很大的危害，例如，日本发生的水俣病(汞污染)和骨痛病(镉污染)等公害病，都是由重金属污染引起的。重金属具有富集性，在空气、泥土、水和食物等都存在广泛分布，且不易降解。因此，加强重金属的检测和监控，在源头上减少暴露风险极其重要。
本发明以重金属砷污染为例，全世界有许多砷重污染区域，我国的多数省份都有砷污染的潜在高危区。砷的化合物多数毒性较强，砷中毒会导致腹泄、脏器损伤、发育不良、心血管病及糖尿病等多种疾病，由于痕量砷对生物体遗传物质就有致突性(Liu,S.X.,etal.,Induction of oxyradicals by arsenic:implication for mechanismofgenotoxicity.Proc Natl Acad Sci U S A,2001.98(4))，砷是地壳中天然成份，在空气、水体到土壤等自然环境中广泛分布。人类的采矿及工业冶炼等行为加剧了砷进入人类食物链的程度。砷的主要存在形式是无机砷，而无机砷对于生物体具有极高毒性(Organization,W.H.,IPCS environmental health criteria 224 arsenic andarseniccompounds.Geneva:International Program on Chemical Safety.WorldHealthOrganization,2001.)。鉴于砷污染的广泛性和对人类健康的严重危害，实现对砷的快速检测成为防止砷污染的关键问题。经典的砷检测方法，如原子吸收光度法、荧光光谱法、电感耦合等离子质谱法、电化学方法等(Tyson,JμLian."The Determination ofArsenicCompounds:A Critical Review."Isrn Analytical Chemistry 2013(2013).Ljubinka V., Vladana N.,Onjia Antonije E.,Analytical methods for arsenicspeciation analysis.J.Serb.Chem.Soc.,2013.78(10))，虽然灵敏性高，可以精确测定环境中砷的量，但由于依赖昂贵的精密仪器(如ICP-MS、X射线荧光光谱仪等)，需特殊培训过的专业人员在专业的实验室才能进行。
近年来，随着生物技术的快速发展及基因工程手段的日趋成熟，生物传感器技术的出现为砷的检测提供了一种新的手段。生物传感器可通过生物感应元件将待测物浓度与可测信号建立浓度梯度关系，在污染物的分析中具有极大的发展潜力和前景。砷的生物传感器利用细菌内砷的天然防御系统，即细菌内砷诱导型启动子及防御调控基因作为生物感应元件。在砷诱导型启动子的下游连接报告基因，通过建立报告基因信号与砷浓度梯度对应关系，实现对砷的检测(Stocker,J.,et al.(2003)."Development of a Set ofSimpleBacterial Biosensors for Quantitative and Rapid Measurements ofArsenite andArsenate in Potable Water."Environmental Science&Technology 37(20)：4743-4750.)。
我们前期研究通过流式细胞术高通量筛选的方法，针对砷诱导型操纵子进行定向进化并构建出灵敏性提高了12倍的砷细菌生物传感器(Li,L.,et al.,Evolvedbacterialbiosensor for arsenite detection in environmental water.Environ SciTechnol,2015.49(10))，相较于传统的物理化学检测方法，细菌生物传感器不仅反应时间快，而且容易操作。
专利201510160702.0公开了一种砷诱导型操纵子基因及其应用，将砷诱导型操纵子用于砷诱导型生物传感器的优化构建，用于检测砷含量，基于该操纵子构建的砷诱导型细菌生物传感器，其灵敏度高，对砷检测专一、背景荧光低。
但同时，但在研究中发现，细菌生物传感器在稳定性、灵敏性及快捷操作上，仍然难以应用到实际环境污染物的检测。其原因主要是：(1)由于细胞壁和细胞膜屏障，待检物质进入胞内受到不同程度的制约，即胞外待检样浓度往往高于胞内；(2)待检物质进入胞内引起的复杂生物反应，影响报告基因的转录和翻译，降低检测的灵敏性；(3)细菌是个复杂的反应体系，胞内的蛋白表达过程十分复杂，涉及多种物质代谢和能量代谢过程，个体间差异、细菌的生长状态、培养条件及营养状态等等，均可影响检测结果的稳定性；(4)细菌的培养操作不便且耗时较长。
砷的细菌生物传感器的工作主要依赖于其砷诱导型启动子对砷的响应。在没有砷存在的条件下，砷诱导型启动子需要微量启动，启动合成下游ArsR蛋白，该蛋白结合在下游砷结合位点(abs)，阻止自身及下游基因的进一步表达；在砷存在的条件下，诱导高效启动砷诱导型启动子，砷与ArsR蛋白结合并造成其构象变化，ArsR蛋白从砷结合位点上解离，从而使下游基因得以表达(Xu,C.,Zhou,T.,Kuroda,M.and Rosen,B.P.(1998)Metalloidresistance mechanisms in prokaryotes.J.Biochem.(Tokyo)123,16–23.)。
无细胞蛋白表达体系进行蛋白质的体外表达源于上世纪六十年代(TissieresA.,H.J.W.,Factors affecting amino acid incorporation into proteins byEscherichiacoli ribosomes.Proc Natl Acad Sci U S A,1961.47:p.2015-2023.)。主要是模拟细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。八十年代未，通过细胞抽提物促进了无细胞体系中蛋白表达(Spirin,A.S.,et al.,A continuous cell-free translationsystemcapable of producing polypeptides in high yield.Science,1988.242(4882):p.1162-4.)，极大的推动了无细胞蛋白表达体系的发展和应用(Caschera,F.andV.Noireaux,Preparation of amino acid mixtures for cell-freeexpressionsystems.Biotechniques,2014.58(1):p.40-3.)。目前，无细胞蛋白表达技术已成熟，大肠杆菌抽提物体系的蛋白表达能力已达到几十毫克到几百毫克。与细胞内蛋白的表达一样，无细胞蛋白表达体系主要组成部分为DNA基因组件、核糖体、RNA聚合酶、转肽酶、氨酰-tRNA合成酶、翻译因子及必要的小分子(如核苷、氨基酸、缓冲盐离子等)。无细胞蛋白表达体系已被广泛用于重组蛋白的生产、功能蛋白组学、蛋白高通量合成与体外进化等领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于砷诱导型启动子构建的细菌生物传感器检测时间长的问题，提供一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法，包括以下步骤：
(1)在无细胞体系的细胞提取物、供能溶液、氨基酸混合溶液和超纯水混合体系中加入质粒puc18-ep3ars-GFP，于37℃孵育30min；ep3ars的序列如SEQ ID No : 1所示；
(2)孵育后，加入诱导试剂As 2 O 3 溶液，于37℃孵育2h；
(3)孵育后，检测荧光表达。
有益效果：本发明以重金属污染物砷的检测为例，避免砷的全菌生物传感器的菌液长时间培养，同时也解决了由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及砷进入胞内引起复杂的副反应的干扰而导致的检测结果的稳定性、灵敏性较差的问题，实现快递便捷稳定的砷检测；孵育30min后添加诱导试剂As 2 O 3 溶液，荧光强度表达较高。
优选的，所述无细胞体系的细胞提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌Rosetta活化后，接种于含有氯霉素抗性的2YT+P液体培养基中，传代培养至OD 600 为2.0-3.0，获得菌液；
(2)将步骤(1)中获得的菌液离心，收集沉淀，将沉淀重悬于缓冲溶液A，离心，获得沉淀，于-80℃过夜保存；
(3)将步骤(2)中过夜保存的沉淀物重悬于缓冲溶液A，于冰上超声处理后，离心，获得上清液；
(4)往步骤(3)的上清液中加入DTT溶液，于37℃孵育80min，离心，收集上清液；
(5)将收集的上清液于缓冲溶液B中进行透析，将透析后获得的上清液离心，制得无细胞体系的细胞提取物。
优选的，所述步骤(1)中2YT+P液体培养基主要由以下原料制成：16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、40mM K 2 HPO 4 、22mM KH 2 PO 4 、其余为水。
优选的，所述步骤(1)中氯霉素的加入量为2YT+P液体培养基总重量的1‰。
优选的，所述步骤(1)中大肠杆菌Rosetta的活化培养条件为于37℃，200rpm条件下培养。
优选的，所述步骤(2)中的缓冲溶液A为S30A缓冲溶液，所述S30A缓冲溶液的制备方法包括以下步骤：将14mM谷氨酸镁、60mM谷氨酸钾、50mM Tris混合后用水定容至1L，用醋酸调pH至7.7，高压灭菌，使用前加入终浓度为2mM的无菌DTT，于4℃保存。
优选的，取步骤(2)中过夜保存的沉淀物1g加入1mL S30A缓冲溶液。
优选的，所述步骤(3)中超声处理的输出功率为300W，超声3s后，冷却6s，超声时间为10min。
优选的，所述超声处理后，于12000g，4℃，离心10min，将上清移至离心管，每管上清液中加入3μL 1M DTT溶液，于37℃孵育80min，12000g，4℃，离心10min，收集上清液。
优选的，所述步骤(5)中的缓冲溶液B为S30B缓冲溶液，所述S30B缓冲溶液的制备方法包括以下步骤：将14mM谷氨酸镁、60mM谷氨酸钾、用水定容至1L，用2M Tris调pH至8.2,高压灭菌，使用前加入终浓度为1mM的无菌DTT，于4℃保存。
优选的，所述步骤(5)中将上清液于4℃透析3h。
优选的，将制得的无细胞体系的细胞提取物置于液氮中冷冻后，于-80℃保存。
优选的，所述供能溶液主要由以下重量份数的原料制成：将41份ATP、42.5份GTP、23.7份CTP、4.7份UTP、10份CoA(辅酶A)、11份NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、12.3份cAMP(环磷酸腺苷)、1.74份亚叶酸、7.26份亚精胺、345份3-PGA(3-磷酸甘油酸)、10份tRNA、0.4份PEG8000、595份Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶于超纯水，利用KOH调pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
优选的，所述供能溶液主要由以下重量份数的原料制成：将41mg ATP、42.5mgGTP、23.7mg CTP、4.7mg UTP、10mg CoA(辅酶A)、11mg NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、12.3mgcAMP(环磷酸腺苷)、1.74mg亚叶酸、7.26mg亚精胺、345mg 3-PGA(3-磷酸甘油酸)、10mgtRNA、0.4mgPEG8000、595mg Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶于20mL超纯水，利用KOH调pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
优选的，所述氨基酸混合溶液主要由以下重量份数的原料制成：将12份L-苏氨酸、15份L-谷氨酸、7份甘氨酸、12份L-缬氨酸、9份L-丙氨酸、13份L-天冬氨酸、13份L-天冬酰胺、16份L-半胱氨酸盐酸盐、20份L-色氨酸、18m份L-酪氨酸、16份L-苯丙氨酸、10份L-丝氨酸、12份L-脯氨酸、13份L-亮氨酸、15份L-蛋氨酸、15份L-谷氨酰胺、13份L-异亮氨酸、20份L-精氨酸盐酸盐、21份L-组氨酸盐酸盐、18份L-赖氨酸盐酸盐溶于超纯水中，醋酸调节pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
优选的，所述氨基酸混合溶液主要由以下重量份数的原料制成：将12mg L-苏氨酸、15mg L-谷氨酸、7mg甘氨酸、12mg L-缬氨酸、9mg L-丙氨酸、13mg L-天冬氨酸、13mg L-天冬酰胺、16mg L-半胱氨酸盐酸盐、20mg L-色氨酸、18mg L-酪氨酸、16mg L-苯丙氨酸、10mg L-丝氨酸、12mg L-脯氨酸、13mg L-亮氨酸、15mg L-蛋氨酸、15mg L-谷氨酰胺、13mgL-异亮氨酸、20mg L-精氨酸盐酸盐、21mg L-组氨酸盐酸盐、18mg L-赖氨酸盐酸盐溶于20mL超纯水，醋酸调节pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
本发明的优点在于：
(1)本发明的一种基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法，以重金属污染物砷的检测为例，避免砷的全菌生物传感器的菌液长时间培养，同时也解决了由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及砷进入胞内引起复杂的副反应的干扰而导致的检测结果的稳定性的问题，实现快递便捷稳定的砷检测；
(2)与现有技术相比，从培养菌体过夜到检测需要2天的时间，本技术从诱导表达到检测只需要3h，大大的节约了时间，可以快速检测，同时无细胞表达体系可以排除细菌体内的干扰反应。
附图说明
图1为本发明实施例1中质粒puc18的图谱；
图2为本发明实施例1中质粒puc18-ars-GFP的图谱；
图3为本发明实施例1中质粒puc18-ep3ars-GFP的图谱；
图4为本发明实施例2中无细胞表达体系进行体外砷诱导检测实验结果图；
图5为本发明实施例2中无细胞表达体系进行体外砷剂量效应检测的标准曲线；
图6为本发明对比例1中加入诱导试剂As 2 O 3 溶液后在不同的孵育时间下的荧光强度检测结果图；
图7为本发对比例2中砷的全菌生物传感器进行检测时，不同的单克隆检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
(一)试验材料
(1)2YT+P培养基的制备：
2YT+P液体培养基：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，40mM K 2 HPO4 ，22mM KH 2 PO 4 ；
2YT+P固体培养基：每升2YT+P液体培养基中加入琼脂15g；
氯霉素抗性的2YT+P固体培养基：将配置好的2YT+P固体培养基加热完全溶解，待温度降至55℃左右加入总重量1‰的氯霉素。
(2)缓冲溶液：
S30A缓冲溶液：14mM谷氨酸镁，60mM谷氨酸钾，50mM Tris，定容至1L，用醋酸调pH至7.7，高压灭菌(103.4kPa蒸汽压，121℃灭菌30min)，使用前加入终浓度为2mM的无菌DTT，存于4℃；
S30B缓冲溶液：14mM谷氨酸镁，60mM谷氨酸钾，定容至1L，用2M Tris调pH至8.2，高压灭菌(103.4kPa蒸汽压，121℃灭菌30min)，使用前加入终浓度为1mM的无菌DTT，存于4℃；
(3)供能溶液
41mg ATP；42.5mg GTP；23.7mg CTP；24.7mg UTP；10mg CoA；11mg NAD；12.3mgcAMP；1.74mg亚叶酸；7.26mg亚精胺；345mg 3-PGA；10mg tRNA；0.4mg PEG8000；595mgHepes溶于20mL超纯水，利用KOH调pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃；
(4)氨基酸混合溶液：
12mg L-苏氨酸；15mg L-谷氨酸；7mg甘氨酸；12mg L-缬氨酸；9mg L-丙氨酸；13mgL-天冬氨酸；13mg L-天冬酰胺；16mg L-半胱氨酸盐酸盐；20mg L-色氨酸；18mg L-酪氨酸；16mg L-苯丙氨酸；10mg L-丝氨酸；12mg L-脯氨酸；13mg L-亮氨酸；15mg L-蛋氨酸；15mgL-谷氨酰胺；13mg L-异亮氨酸；20mg L-精氨酸盐酸盐；21mg L-组氨酸盐酸盐；18mgL-赖氨酸盐酸盐共20种氨基酸溶于20mL超纯水，醋酸调节pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
(二)无细胞表达体系的细胞提取物的获得
(1)将大肠杆菌菌种Rosetta先进行活化，然后接种于5mL含有氯霉素抗性的2YT+P液体培养基中，在37℃，200rpm下过夜培养，获得菌液；
(2)将步骤(1)的菌液用50mL含有氯霉素抗性的2YT+P液体培养基按1:50扩大培养，于37℃，200rpm下培养约4h至OD600＝2.0，获得菌液；
(3)将步骤(2)的菌液用500mL含有氯霉素抗性的2YT+P液体培养基按1:50扩大培养，于37℃，200rpm下培养约5h至OD600＝2.0-3.0，获得菌液；
(4)将步骤(3)的菌液，4℃，5000g下离心10min，收集沉淀，将沉淀重悬于20mLS30A缓冲溶液，4℃，4000g下离心10min，重复一次；
(5)称量沉淀重量并记录，-80℃过夜保存；
(6)次日，1g沉淀物加入1mL S30A缓冲溶液重悬于冰上，冰上超声处理，输出功率300W，超声3s，冷却6s，超声时间10min；
(7)超声处理后，12000g，4℃，离心10min，将上清移至新的离心管；
(8)每管上清液加入3μL 1M DTT溶液，于37℃孵育80min，12000g，4℃，离心10min，收集上清液；
(9)上清液透析，900mL S30B缓冲溶液中4℃搅拌透析3h，3h后12000g，4℃，离心10min；
(10)最终上清液分装并在液氮中快速冷冻，存于-80℃。
实施例2
(一)基于无细胞表达体系试剂盒的砷生物传感器体外的可行性验证实验(无细胞表达体系试剂盒购于promega试剂盒：E-coli-S30-Extract-System-for-Circular-DNA)
(1)在试剂盒中的无细胞体系的细胞提取物、供能溶液、氨基酸混合溶液和去离子水混合体系中加入质粒puc18-ars-GFP、puc18-ep3ars-GFP和puc18各2μg，总体系50μL，于37℃孵育30min；质粒puc18、puc18-ars-GFP和puc18-ep3ars-GFP图谱分别如图1、图2和图3所示；其中质粒puc18-ars-GFP、puc18-ep3ars-GFP的构建获得方法参见专利201510160702.0一种砷诱导型操纵子基因及其应用；ep3ars的序列如SEQ ID No : 1所示；
无细胞表达反应体系为：(质粒的加入体积xμL取决于质粒浓度)
Figure 243599DEST_PATH_IMAGE001
(2)使用去离子水配置5mg/L的三氧化二砷溶液；
(3)在30min后，加入诱导试剂0.5μL三氧化二砷溶液，于37℃孵育2h；
(4)在2h后，利用酶标板于多功能酶标仪读取荧光值，检测荧光表达。
(二)实验结果
如图4所示，图中对照组质粒为puc18；实验组质粒为puc18-ars-GFP，puc18-ep3ars-GFP，-代表未添加三氧化二砷溶液验诱导，+代表添加三氧化二砷溶液诱导，结果显示puc18-ep3ars-GFP实验组荧光强度增加明显高于puc18-ars-GFP实验组和puc18对照组，验证砷生物传感器体外检测的可行性，砷在50μg/L的浓度下puc18-ep3ars-GFP荧光响应明显优于puc18-ars-GFP，有着4倍于背景对照的荧光响应。
实施例3
(一)基于无细胞表达体系的砷生物传感器的砷剂量效应实验
(1)在无细胞体系的细胞提取物、供能溶液、氨基酸混合溶液和去离子水混合体系中加入4μg puc18-ep3ars-GFP，总体系100μL，于37℃孵育30min；
无细胞表达反应体系为：(质粒的加入体积xμL取决于质粒浓度)
Figure 23336DEST_PATH_IMAGE002
(2)使用去离子水配置系列梯度浓度0～50μg/L的三氧化二砷溶液；
(3)在30min后，加入诱导试剂1μL三氧化二砷溶液，于37℃孵育2h；
(4)在2h后，利用酶标板于多功能酶标仪读取荧光值，检测荧光表达。
(二)实验结果
如图5所示，图5为无细胞表达体系进行体外砷剂量效应检测的标准曲线，为砷浓度为0～50μg/L时测定的标准曲线，可以看出基于无细胞表达体系的砷生物传感器有着良好的砷剂量依赖效应。
对比例1
本对比例与实施例2的区别之处在于，诱导试剂As 2 O 3 溶液后，调节不同的孵育时间，从图6可以看出，随着孵育时间的增加，检测体系的荧光强度也随之增加，但在2h时可以检测出荧光的明显增强，体现对照组与实验组的明显差异，体现出基于无细胞表达体系环境污染物的检测方法的便捷快速有效。
对比例2
采用专利201510160702.0一种砷诱导型操纵子基因及其应用中公开的细菌生物传感器对不同的单克隆进行检测
(1)将细菌生物传感器接种于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，；
(2)挑取单菌落，接种于1mL含有氨苄青霉素抗性的TB液体培养基中，在37℃，180rpm下过夜培养，获得检测菌液；
(3)将步骤(2)的检测菌液用上述含有氨苄青霉素抗性的TB液体培养基稀释50倍，获得稀释菌液；
(4)使用超纯水配制50μg/L的三氧化二砷溶液；
(5)直接取稀释菌液按照1：1体积比与三氧化二砷溶液混合，作为诱导组；同步取稀释菌液按照1：1体积比与超纯水混合，作为空白对照；在37℃，180rpm下培养1h，获得诱导菌液；
(6)将步骤(5)的诱导菌液置于12000rpm下离心，收集上清，再用1×PBS缓冲液漂洗3次，检测荧光表达。
测定结果如图所示，图7为不同的单克隆检测结果图，因为砷的全菌生物传感器的每一次检测都需要挑单克隆过夜培养，每个克隆的生长状态不一样，导致每次检测的不稳定性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Figure IDA0003820850030000011
Figure IDA0003820850030000021
Figure IDA0003820850030000031

Claims (4)

1.一种基于无细胞表达体系环境污染物砷的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在无细胞体系的细胞提取物、供能溶液、氨基酸混合溶液和超纯水混合体系中加入质粒puc18-ep3ars-GFP，于37℃孵育30min； ep3ars的序列如SEQ ID No : 1所示；
(2)孵育后，加入诱导试剂As2O3溶液，于37℃孵育2h；
(3)孵育后，检测荧光表达；
所述无细胞体系的细胞提取物的制备方法包括以下步骤：
(a)将大肠杆菌Rosetta活化后，接种于含有氯霉素抗性的2YT+P液体培养基中，传代培养至OD600为2.0-3.0，获得菌液；
(b)将步骤(a)中获得的菌液离心，收集沉淀，将沉淀重悬于缓冲溶液A，离心，获得沉淀，于-80℃过夜保存；
(c)将步骤(b)中过夜保存的沉淀物重悬于缓冲溶液A，于冰上超声处理后，离心，获得上清液；
(d)在步骤(c)的上清液中加入DTT溶液，于37℃孵育80min，离心，收集上清液；
(e)将收集的上清液于缓冲溶液B中进行透析，将透析后获得的上清液离心，制得无细胞体系的细胞提取物；
所述步骤(a)中2YT+P液体培养基主要由以下原料制成：16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、40mM K2HPO4、22mM KH2PO4、其余为水；
所述步骤(b)和步骤（c）中的缓冲溶液A均为S30A缓冲溶液，所述S30A缓冲溶液的制备方法包括以下步骤：将14mM谷氨酸镁、60mM谷氨酸钾、50mM Tris混合后用水定容至1L，用醋酸调pH至7.7，高压灭菌，使用前加入终浓度为2mM的无菌DTT，于4℃保存；
所述步骤(e)中的缓冲溶液B为S30B缓冲溶液，所述S30B缓冲溶液的制备方法包括以下步骤：将14mM谷氨酸镁、60mM谷氨酸钾用水定容至1L，用2M Tris调pH至8.2，高压灭菌，使用前加入终浓度为1mM的无菌DTT，于4℃保存；
所述供能溶液的制备方法包括以下步骤：将41份ATP、42.5份GTP、23.7份CTP、4.7份UTP、10份CoA、11份NAD、12.3份 cAMP、1.74份亚叶酸、7.26份亚精胺、345份3-PGA、10份tRNA、0.4份PEG8000、595份Hepes溶于超纯水，利用KOH调pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃；
所述氨基酸混合溶液：将12份L-苏氨酸、15份L-谷氨酸、7份甘氨酸、12份L-缬氨酸、9份L-丙氨酸、13份L-天冬氨酸、13份L-天冬酰胺、16份L-半胱氨酸盐酸盐、20份L-色氨酸、18份L-酪氨酸、16份L-苯丙氨酸、10份L-丝氨酸、12份L-脯氨酸、13份L-亮氨酸、15份L-蛋氨酸、15份L-谷氨酰胺、13份L-异亮氨酸、20份L-精氨酸盐酸盐、21份L-组氨酸盐酸盐、18份L-赖氨酸盐酸盐溶于超纯水中，醋酸调节pH至7.5-8.0，利用0.22μm滤器灭菌，分装存于-80℃。
2.根据权利要求1所述的基于无细胞表达体系环境污染物砷的检测方法，其特征在于：所述步骤(c)中超声处理的输出功率为300W，超声3s后，冷却6s，超声时间为10min。
3.根据权利要求1所述的基于无细胞表达体系环境污染物砷的检测方法，其特征在于：将制得的无细胞体系的细胞提取物置于液氮中冷冻后，于-80℃保存。
4.根据权利要求1所述的基于无细胞表达体系环境污染物砷的检测方法，其特征在于：所述步骤(a)中氯霉素的加入量为2YT+P液体培养基总重量的1‰。
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