CN102083978A - 以dna作为元件的生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供一种在成本、操作性、快速性方面优异的方法，该方法能够利用与分析物特异性结合的传感蛋白和由所述传感蛋白特异性识别的核酸，检测和/或定量被测试样中的分析物。本发明制作了将与砷结合的传感蛋白ArsR蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)融合而得到的ArsR-GFP，确认到该融合蛋白与特异性识别序列(P_ars-DNA)结合，并且，它们的结合被亚砷酸抑制。接着，制作了固定有Pars-DNA的板，发现ArsR-GFP在固定有P_ars-DNA的板上的结合量以亚砷酸浓度依赖的方式降低，由此完成了本发明。

Description

以DNA作为元件的生物传感器

技术领域

本发明涉及利用与分析物特异性结合的传感蛋白、和由该传感蛋白特异性识别的核酸来检测和/或定量被测试样中的分析物的方法等。

背景技术

目前，据报道，铅、镉或砷等有害金属化合物导致了土壤、地下水或地表水等的污染，在世界各地成为很大的问题。作为在环境中有害金属污染的分析中使用的方法，已知有火焰原子吸收光谱法(AAS)、无焰原子吸收光谱法(FLAA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等。但是，这些仪器分析法为了进行分析，需要对试样进行预处理，存在不仅无法应对现场的快速分析、而且操作成本高的缺点。

正在加紧进行可弥补这种仪器分析法的缺点的、有害金属的简易检测法的开发。作为这样的简易检测法之一，使用可识别检测对象物质的、来源于生物的酶、抗体、受体等被测分子作为传感元件的生物传感器受到关注。生物传感器中，检测反应基于生物化学反应或结合的特异性，因此可列举：能够进行高灵敏度测定、测定和检测快速且简便、操作成本低、传感器自身较小因而移动性优异等优点。另外，通过利用酶反应、抗原抗体反应、配体在受体上的结合等生物化学反应，具有能够进行与特定物质的特异性高的分析的特征，因此以少量试样即可进行分析，也可以实现传感系统的微小化。

在各种生物传感器的研究中，利用微生物细胞的生物传感器由于培养容易、基因操作容易，因而能够广泛地选择检测对象物质或报告基因，用途的扩大受到期待。重组微生物生物传感器利用了包含宿主细胞、对特定物质产生应答而促进下游基因转录的诱导型启动子以及启动子下游的报告基因这三个要素，并根据情况组合有用于检测报告物所发出的信号的装置的系统。该系统的情况下，常用作报告物的有来源于细菌或萤火虫的荧光素酶(参见非专利文献1～3)、来源于维多利亚水母的GFP(参见非专利文献2和4)、来源于大肠杆菌的LacZ(参见非专利文献2和5)等。

本发明人已经开发出了以类胡萝卜素合成系酶CrtA作为报告物、以海洋光合细菌嗜硫小红卵菌(Rhodovulum sulfidophilum)作为宿主的砷应答生物传感器(非专利文献6)。嗜硫小红卵菌具有作为类胡萝卜素合成系之一的球形烯途径，本来是蓄积其终产物球形烯酮(スフエロイデノン)而呈红色的细菌。但是，该传感器由于使用了破坏crtA而得到的crtA缺陷株，该crtA编码催化球形烯途径的最终阶段的球形烯单加氧酶(CrtA)，因而蓄积作为球形烯酮的前体的球形烯而呈黄色。因此，通过向嗜硫小红卵菌的菌体内导入以crtA作为报告基因、且在其上游插入有砷诱导型启动子的质粒，则在砷存在下CrtA活性恢复，产生由黄色向红色的色调变化。以这样的色调变化为指标，能够判断砷的存在。

此外，本发明人着眼于能够在厌氧条件下培养的淡水性红色细菌沼泽红假单胞菌、和沼泽红假单胞菌所具有的螺菌黄素途径中由八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)催化的从八氢番茄红素到番茄红素的脱氢反应，通过向沼泽红假单胞菌的菌体内导入在来源于大肠杆菌的砷诱导型操纵子/启动子区域的下游插入有报告基因crtI的质粒，并在砷存在下使CrtI活性恢复，开发出了不需要振荡培养器的砷应答生物传感器(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特愿2007-340804

非专利文献

非专利文献1：Wilson T，Hastings JW(1998)Bioluminescence AnnuRev Cell Dev Biol 14：197-230

非专利文献2：Stocker J，BalluchD，Gsell M，Harms H，Feliciano J，DaunertS，MalikKA，van der Meer JR(2003)Environ Sci Technol 37：4743-4750

非专利文献3：Trang PT，Berg M，Viet PH，van MuiN，van derMeerJR(2005)Environ Sci Technol 39：7625-7630

非专利文献4：Tsien RY(1998)Ann Rev Biochem 67：509-544

非专利文献5：Silhavy TJ，Beckwith JR(1985)Microbiol Rev49：398-418

非专利文献6：Fujimoto et al.，(2006)Appl Microbiol Biotechnol73(2)：332-338

发明内容

上述的使用微生物的生物传感器存在不仅需要用于培养的器具和时间、而且细胞所致的偏差较大等问题，为了解决这些问题，需要开发无细胞系生物传感器。本发明的课题在于提供一种在成本、操作性、快速性方面优异的方法，该方法能够利用与分析物特异性结合的传感蛋白和由所述传感蛋白特异性识别的核酸，检测和/或定量被测试样中的分析物。

为了解决上述课题，本发明人首先尝试开发了利用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer；FRET)的方法，即，开发了利用对DNA与蛋白质的相互作用所介导的复合体分子的高级结构的变化进行检测的荧光共振能量转移的体系。FRET是指激发能量从作为供体的能量供给体向作为受体的能量接受体转移的现象。其中重要的是，预先选择好作为供体的荧光分子的发射能级与作为受体的荧光分子的吸收能级相重叠的两个不同的荧光分子(图24)。如果在处于激发态的供体附近存在受体，则在供体尚未产生发光的期间内，该激发能量使受体被激发，从而能够检测到受体的发光。由于距离越近越容易产生FRET，因而可以作为检测分子间的相互作用、分子的结构变化的手段使用。

因此，对利用铅和镉传感蛋白ZntR的生物传感器进行了研究。大肠杆菌(E.coli)中存在基因zntA，该基因zntA编码起到将重金属排出到细胞外的作用的酶。在从该zntA的转录起始位点起上游的-10碱基和-35碱基的区域存在启动子区域DNA(以下，称为启动子DNA)的碱基序列，铅和镉传感蛋白ZntR与该启动子DNA结合，形成ZntR蛋白-启动子DNA的复合体。在不存在铅、镉化合物等重金属的条件下，启动子DNA的高级结构为曲折的状态。另一方面，在重金属存在下，重金属与ZntR蛋白结合，高级结构发生变化，与之相伴启动子DNA成为直链状。因而考虑是否可以利用该重金属的有无所引起的ZntR蛋白-启动子DNA复合体的高级结构的变化来进行重金属生物传感器的开发。

图25表示利用FRET对该重金属的有无所引起的高级结构变化进行外部提示的设计原理。首先，在启动子DNA的两个末端结合不同的两种荧光物质、即异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate；FITC)和四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine；TAMRA)。此时，通过FRET，TAMRA吸收FITC发出的荧光而被激发，从而发出荧光。在不存在重金属的条件下，启动子DNA的高级结构为曲折的状态，FITC与TAMRA接近，因而当照射FITC的激发光时，TAMRA被FITC发出的荧光激发，主要检测到TAMRA的荧光。但是，在重金属存在下，启动子DNA的高级结构变为直链状，因而FITC与TAMRA间的距离变长，TAMRA难以吸收FITC的荧光。因此，TAMRA难以被激发，主要检测到FITC的荧光。认为通过利用荧光光度计测定该重金属的有无所引起的荧光波长的变化，能够检测或者定量铅或镉化合物。

同样地，对利用砷传感蛋白ArsR的生物传感器进行了研究。大肠杆菌中存在对细胞提供砷抗性的砷抗性操纵子。砷抗性操纵子的表达由基因arsR所编码的砷传感蛋白ArsR调控。ArsR蛋白在不存在砷化合物的条件下与启动子DNA结合，形成ArsR蛋白-启动子DNA复合体。因此，RNA聚合酶无法与启动子DNA结合，砷抗性操纵子的转录被抑制。但是，在砷化合物的存在下，ArsR蛋白与砷化合物结合，其高级结构发生变化，ArsR蛋白从启动子DNA解离，因而RNA聚合酶与启动子DNA结合而开始砷抗性操纵子的转录。认为通过对这样的砷化合物的有无所引起的ArsR蛋白与启动子DNA的结合和解离的变化进行外部提示，能够开发出检测砷化合物的生物传感器。

另外，与使用ZntR蛋白的情况同样地，设想了通过FRET对蛋白质与DNA的结合和解离的变化进行外部提示的体系(图26)。首先，使TAMRA与启动子DNA的一个末端结合。另外，使用为了对ArsR蛋白进行荧光修饰而在ArsR蛋白上融合有绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein；GFP)的ArsR-GFP融合蛋白。此时，通过FRET，TAMRA吸收GFP发出的荧光而被激发，从而发出荧光。在不存在砷化合物的条件下，启动子DNA与ArsR-GFP融合蛋白为结合的状态，TAMRA与GFP接近，因而当照射GFP的激发光时，TAMRA被GFP发出的荧光激发，主要检测到TAMRA的荧光。但是，在砷化合物的存在下，启动子DNA链与ArsR-GFP融合蛋白变为解离的状态，因而TAMRA与GFP间的平均距离变长，TAMRA难以吸收GFP的荧光。因此，TAMRA难以被激发，主要检测到GFP的荧光。认为通过利用荧光光度计测定该砷化合物的有无所引起的荧光波长的变化，能够检测或者定量砷化合物。

但是，由后述的比较例可知，通过FRET法无法解决本发明的课题。因此，迫切需要开发不同的方法，本发明人着眼于与砷结合的传感蛋白ArsR蛋白、以及与镉和铅结合的传感蛋白CadC蛋白，将各蛋白质分别与绿色荧光蛋白(GFP)融合而制作ArsR-GFP、CadC-GFP。确认到这些融合蛋白与各自的特异性识别序列DNA结合，并且，它们的结合被金属离子抑制。接着，制作了固定有ArsR蛋白的识别序列DNA(P_ars-DNA)的板，发现ArsR-GFP在固定有P_ars-DNA的板上的结合量以亚砷酸浓度依赖的方式降低，由此完成了本发明。

即，本发明涉及以下方法。

(1)一种在水体系中检测或定量被测试样中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)和步骤(B)：

(A)在被测试样的存在下，使与所述分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸反应的步骤；

(B)检测或测定所固定的核酸上结合的传感蛋白的步骤。

(2)如上述(1)所述的方法，其特征在于，传感蛋白用能够检测的标记物进行了标记。

(3)如上述(1)所述的方法，其特征在于，传感蛋白是与能够检测的标记蛋白形成的融合蛋白。

(4)一种在水体系中检测或定量被测试样中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)和步骤(B)：

(A)在被测试样的存在下，使固定于支撑体上的、与所述分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸反应的步骤；

(B)检测或测定所固定的传感蛋白上结合的核酸的步骤。

(5)如上述(4)所述的方法，其特征在于，核酸用能够检测的标记物进行了标记。

另外本发明涉及以下方法。

(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的方法，其特征在于，传感蛋白与核酸的结合被分析物抑制。

(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其特征在于，传感蛋白为由金属应答操纵子编码的蛋白质。

(8)如上述(7)所述的方法，其特征在于，由金属应答操纵子编码的蛋白质为ArsR蛋白或CadC蛋白。

(9)如上述(1)～(8)中任一项所述的方法，其特征在于，分析物为重金属化合物。

(10)如上述(9)所述的方法，其特征在于，重金属化合物选自砷(As)化合物、镉(Cd)化合物和铅(Pb)化合物。

(11)如上述(10)所述的方法，其特征在于，预先对五价的砷(As(V))化合物进行还原处理，使其转变为三价的砷(As(III))化合物。

(12)如上述(9)～(11)中任一项所述的方法，其特征在于，在pH7.4的50mM以上的磷酸缓冲液中，进行传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸的反应。

(13)如上述(9)～(11)中任一项所述的方法，其特征在于，在40mM以上的氯化钠溶液中，进行传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸的反应。

此外，本发明涉及以下试剂盒。

(14)一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：与分析物特异性结合的传感蛋白，和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸。

(15)一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：固定于支撑体上的与分析物特异性结合的传感蛋白、和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸。

另外，本发明的实施方式中包括：特征在于传感蛋白用能够检测的标记物进行了标记的上述试剂盒；特征在于传感蛋白为与能够检测的标记蛋白形成的融合蛋白的上述试剂盒；特征在于核酸用能够检测的标记物进行了标记的上述试剂盒。

另外，本发明的实施方式中包括：特征在于传感蛋白与核酸的结合被分析物抑制的上述任一项所述的试剂盒；特征在于传感蛋白为由金属应答操纵子编码的蛋白质的上述任一项所述的试剂盒；特征在于由金属应答操纵子编码的蛋白质为ArsR蛋白或CadC蛋白的上述试剂盒；特征在于分析物为砷(As)、镉(Cd)、铅(Pb)等重金属的化合物的上述任一项所述的试剂盒。

附图说明

图1是表示细菌的有害金属抗性操纵子的转录调控机制的图。当环境中不存在有害金属离子时，由于传感蛋白与启动子DNA的结合，传感蛋白基因与其下游基因的表达被抑制。

图2是表示以DNA作为元件的有害金属生物传感器的原理的图。

图3是表示以DNA作为元件的砷化合物生物传感器的构成要素的图。

图4是表示为了产生重组ArsR-GFP而导入到E.coli BL21(DE3)(pLysS)中的质粒(pETarsRgfp)的制作程序的图。

图5是表示非变性(ネ一テイブ一)PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)中的P_ars-DNA与ArsR-GFP蛋白的复合体形成以及添加亚砷酸引起的复合体的解离的图。

图6是表示对添加到固定有P_ars-DNA的孔中后的蛋白质通过电泳进行分析的结果的图。泳道1：将蛋白粗提液添加到孔中，反应后除去提取液并进行孔清洗后，回收所结合的蛋白而得到的级分；泳道2：将蛋白粗提液添加到孔中，反应后除去提取液并进行孔清洗后，回收蛋白而得到的级分；泳道3：蛋白粗提液；泳道4：分子量标志物。

图7是表示随着所添加的蛋白粗提液量的变化，ArsR-GFP蛋白在固定有P_ars-DNA的板上的结合量的变化的图。

图8是表示利用以P_ars-DNA作为元件的生物传感器的亚砷酸的检测结果的图。＊表示P＜0.05的显著性差异，＊＊表示P＜0.005的显著性差异。

图9是表示清洗条件(缓冲液)引起的P_ars-ArsR-GFP复合体量的变化的图。各测定值表示在各次清洗结束后测定的荧光强度。

图10是表示将五价的砷As(V)还原为三价的砷As(III)的处理的流程的图。

图11是表示ArsR-GFP的不同形态对砷的应答性的差异的图。图表示n＝3的平均值±标准差。

图12是表示经硫代硫酸钠还原处理的As(V)的检测结果的图。砷浓度共为100μg/L。图表示n＝3的平均值±标准差。

图13是表示缓冲液和pH的差异对砷检测的影响的图。示出制备时的缓冲液pH。图表示n＝3的平均值±标准差。

图14是表示As(III)检测中的ArsR-GFP的标准曲线的图。曲线表示n＝3的平均值±标准差。R²＝0.95。

图15是表示砷传感器的交叉应答性的研究结果的图。图中，将不添加金属(-)的试样的荧光强度评价为1，示出n＝3的平均值±标准差。

图16是表示为了产生重组CadC-GFP蛋白而导入到E.coli BL21(DE3)(pLysS)中的质粒(pETcadCgfp)的制作程序的图。

图17是表示非变性PAGE中的P_cad-DNA与CadC-GFP蛋白的复合体形成以及添加二价铅引起的复合体的解离的图。

图18是表示对微孔板中的Pcad与CadC-GFP的复合体形成进行确认的概要图。E1、E2表示固定有Pcad34的孔、E3表示没有固定的孔。

图19是表示固定有Pcad34的孔中残存的蛋白的分析结果的图。泳道1、3、4的试样参见图18。泳道2为含有CadC-GFP的蛋白粗提液，泳道5为分子量标志物(预染蛋白分子量标志物、宽范围(6～175kDa)、NewEngland Biolabs公司)。

图20是表示CadC-GFP结合量随孔中Pcad34的添加浓度的变化的图。

图21是表示含有CadC-GFP的蛋白粗提液的添加量的研究结果的图。上图为在添加到固定有Pcad34的孔中后进行测定。下图为将孔清洗2次后进行测定。曲线表示n＝3的平均值±标准差。

图22是表示孵育前添加NaCl对铅的检测试验的影响的图。图表示n＝3的平均值±标准差。

图23是表示Pb(II)和Cd(II)检测中的CadC-GFP的标准曲线的图。曲线表示n＝3的平均值±标准差。＊和＊＊分别表示与0μg/L之间具有5％水平和1％水平的显著性差异。

图24是表示发生FRET时的供体与受体荧光分子的光谱的重叠的图。

图25是表示生物传感器中通过FRET检测铅和镉化合物的原理的图。

图26是表示生物传感器中通过FRET检测砷化合物的原理的图。

图27是表示未用His标签修饰的ZntR蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育的概要的图。

图28是表示重组ZntR蛋白表达的确认结果的图。

图29是表示利用肝素柱进行的ZntR蛋白纯化的色谱的结果的图。

图30是表示利用肝素柱得到的纯化级分中的ZntR蛋白的确认结果的图。

图31是表示蛋白质的部分纯化物中所含的ZntR蛋白的确认结果的图。

图32是表示使用了用FITC(左)或者TAMRA(右)标记的探针DNA的EMSA的结果的图。

图33是表示使用了用FITC和TAMRA进行双重标记的探针DNA的EMSA的结果的图。

图34是表示在双重标记的探针DNA和ZntR蛋白部分纯化液的混合反应液中、有无添加Pb的条件下的各荧光光谱的图。

图35是表示重组ArsR蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育的概要的图。

图36是表示重组ArsR-GFP融合蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育的概要的图。

图37是表示重组ArsR-GFP融合蛋白的表达确认结果的图。

图38是表示肝素柱纯化中以A₂₈₀和GFP的荧光强度为指标的色谱结果的图。

图39是表示肝素柱纯化级分中的ArsR-GFP融合蛋白的确认结果的图。

图40是表示离子交换柱纯化中以A₂₈₀和GFP的荧光强度为指标的色谱结果的图。

图41是表示离子交换柱纯化级分中的ArsR-GFP融合蛋白的确认结果的图。

图42是表示使用了ParsR-350探针DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的检测试验的结果的图。

图43是表示使用了ParsR-50探针DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的检测试验的结果的图。

图44是表示使用了R773-50探针DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的检测试验的结果的图。

具体实施方式

作为本发明的检测或定量被测试样中的分析物的方法，只要是以下[1]或[2]的方法则没有特别限定：[1]在被测试样的存在下，使与被测试样中的分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸反应，在水体系(水的存在下)中检测和/或测定所固定的核酸上结合的传感蛋白的方法；[2]在被测试样的存在下，使固定于支撑体上的、与该分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸反应，在水体系中检测和/或测定所固定的传感蛋白上结合的核酸的方法。在上述[1]的方法中，通过使用用能够检测的标记物进行了标记的传感蛋白、或与能够检测的标记蛋白融合的传感蛋白，并将未结合到所固定的核酸上的传感蛋白排出到体系外，能够在水体系中检测和/或测定所固定的核酸上结合的传感蛋白。另外，在上述[2]的方法中，通过使用用能够检测的标记物进行了标记的核酸，并将未结合到所固定的传感蛋白上的核酸排出到体系外，能够在水体系中检测和/或测定所固定的传感蛋白上结合的核酸。另外，作为被测试样，没有特别限定，可优选列举含有重金属的河川水、污水、井水、工厂废水、污染土壤等，在污染土壤等固态物的情况下，可以使用其水悬浮液或水提取液。

另外，作为本发明的被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，只要是以下[3]或[4]的试剂盒则没有特别限定：[3]一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：与分析物特异性结合的传感蛋白，和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸；[4]一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：与分析物特异性结合的固定于支撑体上的传感蛋白、和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸。在上述[3]的试剂盒中，通过使用用能够检测的标记物进行了标记的传感蛋白、或与能够检测的标记蛋白融合的传感蛋白，能够检测/测定所固定的核酸上结合的传感蛋白。另外，在上述[4]的试剂盒中，通过使用用能够检测的标记物进行了标记的核酸，能够检测/测定所固定的传感蛋白上结合的核酸。

作为在本发明的检测和/或定量被测试样中的分析物的方法中使用的传感蛋白，只要是能够与包含特定序列的核酸特异性结合、且上述与核酸的结合被特定的分析物所抑制的蛋白质，则没有特别限定，作为优选例子可列举由金属应答操纵子编码的传感蛋白。作为上述金属应答操纵子，没有特别限定，具体而言，作为例子可列举：编码ArsR蛋白的ars、编码CzcR的czc、编码CadC的cad、编码ChrB的chr、编码MerR1和Mrer2的mer、编码pbrR的pbr等，其中可优选例示ars、cad。上述由金属应答操纵子编码的传感蛋白分别识别特定的金属应答操纵子区域DNA序列，但在特定的金属离子的存在下，这些传感蛋白与金属离子结合，高级结构发生变化，从而无法与DNA结合。例如，上述ArsR蛋白与ars区域DNA结合，但该结合被砷抑制。另外，上述CadC蛋白与cad区域DNA结合，但该结合被镉、铅抑制。

上述[1]的本发明的检测和/或定量被测试样中的分析物的方法中，传感蛋白优选用能够检测的标记物进行了标记，作为上述能够检测的标记物，只要是现有公知的肽标记用的标记物则没有特别限定，例如，具体可列举：³²P、³H、¹⁴C、¹²⁵I等放射性同位素；FITC、TAMRA、SYBR绿、丹磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸酯等荧光物质；生物素、地高辛等生物学相关的结合结构；生物发光化合物；化学发光化合物等。另外，上述传感蛋白可以是与能够检测的标记蛋白融合而成的融合蛋白，作为上述标记蛋白，例如，具体可以例示碱性磷酸酶、HRP等酶，抗体的Fc区域，GFP等荧光物质等标记蛋白；MBP、凝集素、亲和素等具有结合能力的结合性蛋白；HA、FLAG、Myc等表位标签蛋白等。其中，ArsR蛋白与GFP的融合蛋白ArsR-GFP具有与ArsR蛋白的识别序列即P_ars-DNA结合的能力，并且该结合被亚砷酸以浓度依赖的方式抑制，因而能够作为优异的亚砷酸生物传感蛋白用于本发明的检测和/或定量亚砷酸的方法。

另外，上述[2]的本发明的检测和/或定量被测试样中的分析物的方法中，包含由传感蛋白特异性识别的序列的核酸优选用能够检测的标记物进行了标记。作为上述能够检测的标记物，只要是现有公知的核酸标记用的标记物则没有特别限定，例如，具体可列举：³²P、³H、¹⁴C、¹²⁵I等放射性同位素；FITC、TAMRA、SYBR绿、丹磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸酯等荧光物质；生物素、地高辛等生物学相关的结合结构；生物发光化合物；化学发光化合物等。

本发明的检测和/或定量被测试样中的分析物的方法中，作为固定传感蛋白或核酸的支撑体，只要是公知的支撑体则没有特别限定，具体而言，可例示：塑料(聚苯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯等)、琼脂糖、纤维素、亲水性聚乙烯醇、丙烯酸酯类聚合物、聚丙烯酰胺玻璃、金属等。另外，作为将传感蛋白或核酸固定到这些支撑体上的方法，只要是公知的方法则没有特别限定，例如，可以采用物理吸附法、或重氮法、肽法(酰胺衍生物法、酰氯树脂法、碳二亚胺树脂法、马来酸酐衍生物法、异氰酸酯衍生物法、溴化氰活化多糖法、纤维素碳酸酯衍生物法、使用缩合试剂的方法)、烷基化法等利用交联试剂的载体结合法等共价结合法，其中优选物理吸附法。另外，在将传感蛋白或核酸固定到支撑体上时，也可以介由其它物质间接地进行固定。具体而言，如下述实施例所示，可以通过对核酸进行生物素标记并利用物理吸附使生物素与支撑体(塑料板)结合，从而将核酸固定到支撑体上。

如上所述，在本发明中，从原理上说明了利用以细菌的启动子区域DNA和传感蛋白作为元件的砷、铅/镉检测用生物传感器能够进行重金属检测。该传感器是对细菌的转录开关引起的变化进行直接捕捉的无细胞型传感器，其特征在于，利用绿色荧光蛋白(GFP)等的荧光对构成转录开关的传感蛋白与启动子区域DNA之间产生的结合和解离这两种状态间的变化进行捕捉。以下，进行更具体的说明。

在本发明的检测和定量方法中，为了使传感部成为可更换和装卸的组件，将传感元件固定在96孔微孔板的孔内。所固定的元件为启动子区域DNA和传感蛋白这两类。在固定启动子区域DNA的情况下，通过使3’末端标记有生物素的启动子区域DNA在固定有链霉亲和素的96孔微孔板中反应，能够进行DNA的固定。该系统为，在固定有启动子区域DNA的微孔板的孔内使传感蛋白-GFP溶液反应后进行清洗操作，利用荧光酶标仪测定在孔内与启动子区域DNA保持结合状态的传感蛋白-GFP的荧光强度。

在本发明方法中，例如，培育分别生产传感蛋白ArsR-GFP和CadC-GFP的大肠杆菌菌株，确认到这些重组蛋白与启动子区域DNA以及重金属结合，此外，在使用ArsR-GFP的生物传感器的开发中，可知通过将含有As(III)的试样与ArsR-GFP混合，荧光强度减少。接着，对于使启动子区域DNA与传感蛋白-GFP的结合稳定化的条件、或者使结合成复合体与复合体解离的状态变化显著化的条件进行了研究。此外，在使用CadC-GFP的生物传感器的开发中，可知通过将含有Pb(II)或Cd(II)的试样与CadC-GFP混合，荧光强度减少。

其结果表明，首先，在检测试验的程序中，将含有传感蛋白-GFP的蛋白粗提液与试样、鲑鱼精子DNA、缓冲液混合，并在室温或冰上进行30分钟的孵育是很重要的。也考虑过将传感蛋白-GFP添加到孔中，先形成DNA-传感蛋白-GFP复合体后再添加试样，测定蛋白质的解离程度的方法，但这样的程序无法有效地发挥功能。另外还表明，在30分钟的孵育时存在40mM以上的NaCl，这在之后的测定时使荧光强度的变量显著化方面是很重要的。

在砷的检测中，通过利用硫代硫酸钠进行还原处理，能够与As(III)同等地检测As(V)。该情况下，首先加入盐酸调节为酸性条件，然后加入硫代硫酸钠，最后用氢氧化钠进行中和。经过该过程，与在试样中添加NaCl时同样地存在一定浓度的离子。另外，通过对缓冲液的最适pH的研究，确认到在pH7.4附近最能够发挥传感元件的功能。并且，判断出并不是只有pH重要，根据所使用的缓冲液种类的不同效果也会产生变化，确认到对于ArsR-GFP而言磷酸缓冲液是适合的，对于CadC-GFP而言三羟甲基氨基甲烷缓冲液是适合的。检测下限是：砷为5μg/L，铅为10μg/L，镉为1μg/L，表明能够进行世界卫生组织制定的饮用水基准值以下的检测。随着今后研究的进行，还可能达到更高的灵敏度。检测所需要的时间，包括将试样与蛋白提取液混合后最初进行的15分钟的孵育在内，估计在40分钟以内完成。并且确认：ArsR-GFP和CadC-GFP均未对100μM的其它金属显示出交叉应答性，而是与目标金属选择性应答。

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围不限于这些例示。

实施例1

[生物传感器的原理]

对利用荧光标记传感蛋白与DNA的相互作用的有害金属生物传感器的开发进行了尝试。如图1所示，ArsR蛋白、CadC蛋白等传感蛋白在大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)中起到调控有害金属抗性操纵子的转录活性的作用。这些蛋白质在不存在有害金属离子的条件下与启动子DNA结合，形成传感蛋白-启动子DNA复合体。利用以上的传感蛋白的性质，开发了用于检测砷、铅和镉化合物的生物传感器。图2表示生物传感器的原理。

DNA在基材表面的固定着眼于作为低分子维生素的生物素和作为碱性糖蛋白的链霉亲和素这两种物质。在这些物质间形成的结合具有10¹⁵M^-1以上的极高的结合常数，被认为是近似于不可逆的结合。着眼于该结合的理由是考虑在以下方面具有优点：用生物素能够修饰DNA链；链霉亲和素能够固定于96孔微孔板基材上；在酶联免疫吸附法中是通用的；结合不会直接影响DNA的链。此外由于利用96孔微孔板能够一并处理多个试样，因而可以期待构建高通量筛选的检测体系。采用在基材上修饰有链霉亲和素的96孔微孔板(Reacti-Bind链霉亲和素包被高结合力96孔板；PIERCE公司)。荧光强度的测定使用Corona荧光酶标仪MTP-601Lab(日立ハイテクノロジ一ズ公司)。测定条件是：激发滤光片使用490nm、荧光测定滤光片使用530nm，检测灵敏度为“自动”。

[生物传感器的构成要素]

图3表示砷化合物的生物传感器的构成要素。在大肠杆菌中，编码砷的细胞外排泵的arsB和arsC基因、与编码ArsR传感蛋白的arsR基因按照arsR-arsB-arsC的顺序形成操纵子，其转录活性受ArsR蛋白调控。砷化合物生物传感器中，选择了ArsR-GFP融合蛋白、和以arsR基因上游的ArsR蛋白结合位点(操纵子序列)为中心的50个碱基对构成的启动子区域DNA(P_ars-DNA)。关于启动子区域DNA，是将表1所示的ParsR-50-S-3-B(序列号1表示ParsR-50-S的序列)和ParsR-50-A(序列号2)等量混合，形成在启动子序列下游的3’末端标记有生物素的双链DNA(记作Pars-生物素)。然后，制备浓度为25pmol/100μL的Pars-生物素，用于固定。

表1

下划线表示ArsR结合序列。

另一方面，在金黄色葡萄球菌中，编码铅、镉的细胞外排泵的cadA基因与编码CadC传感蛋白的cadC基因按照cadC-cadA的顺序形成操纵子，其转录受CadC蛋白调控。铅和镉化合物的生物传感器中，选择了CadC-GFP融合蛋白、和以CadC基因上游的CadC蛋白结合位点(操纵子序列)为中心的34个碱基对构成的启动子区域DNA(P_cad-DNA)。关于启动子区域DNA，是将表2所示的PcadC34-S-3-B(序列号3表示PcadC34-S的序列)和PcadC34-A(序列号4)等量混合，形成在启动子序列下游的3’末端标记有生物素的双链寡核苷酸(记作Pcad34-生物素)。然后，制备浓度为20pmol/100μL的Pcad34-生物素，用于固定。

表2

名称	碱基序列
		PcadC34-S-3-B	5’-ATAATACACTCAAATAAATATTTGAATGAAGATG-生物素
PcadC34-A	5’-CATCTTCATTCAAATATTTATTTGAGTGTATTAT

下划线表示CadC结合序列。

实施例2

[实验材料和方法]

(1)菌株(大肠杆菌菌株)

基因克隆使用JM109、DH5α(TaKaRa公司制造)。另外，重组蛋白生产分别使用在pAcGFP1质粒DNA的Acgfp1基因的上游、以与Acgfp1基因相同的读码框插入有大肠杆菌K12的arsR基因的BL21(DE3)pLysS(Novagen公司)。另外，转化株的培养使用LB培养基，根据需要分别以50μg/mL、34μg/mL的终浓度添加了氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)。

(2)利用PCR进行arsR、cadC和Acgfp1碱基序列的扩增

聚合酶链反应(PCR)使用Pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen公司制造)。分别扩增大肠杆菌K12的arsR、金黄色葡萄球菌NCTC50581的内源性质粒DNA pI258上编码的cadC、pAcGFP1质粒DNA(Clontech公司制造)上编码的Acgfp1。

(3)试剂

亚砷酸使用偏亚砷酸钠98％(As(III))(Sigma公司制造)，二价铅使用醋酸铅(II)三水合物特级(和光纯药公司制造)。

(4)质粒DNA

在将PCR扩增得到的DNA片段进行克隆时，使用pGEM-T载体质粒DNA(Promega公司制造)，在制作用于生产重组蛋白的表达单元时，使用pET-3a质粒DNA(Novagen公司制造)。

(5)重组蛋白的生产条件和制备方法

将重组蛋白表达用BL21(DE3)pLysS转化株在添加有Amp和Cm的培养基(Amp⁺Cm⁺LB)5mL中、在37℃下培养过夜，将所得到的过夜培养液接种到0.5mL的Amp⁺Cm⁺LB中。将其在37℃下、在不添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的条件下培养约12小时。培养后，收集菌体，用50mM的Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH7.4)对菌体进行2次清洗后，重悬浮于4mL的细胞破碎用缓冲液(含有15％甘油的Tris-HCl)中，在-80℃下进行1次冻融。进行超声波破碎后，以15000rpm离心分离15分钟，将所得到的上清作为重组蛋白粗提液。该蛋白粗提液在-80℃冷冻保存，在试验时融解使用。在利用微孔板进行亚砷酸(As(III))的检测时，代替上述Tris-HCl，使用10mM的磷酸缓冲液(PBS，pH6.0)。另外，超声波破碎时将细胞悬浮于2mL的细胞破碎用缓冲液(含有15％甘油的PBS)中。

(6)凝胶迁移法(电泳迁移率变动分析法；EMSA)

以表3所示的组成将启动子DNA、重组蛋白和金属离子混合，在冰上进行3小时(使用ArsR-GFP的试验)或1小时(使用CadC-GFP的试验)的孵育。在反应液中加入表4的非变性PAGE用样品缓冲液5μL，使总体积为25μL。然后，利用非变性PAGE将反应液中的DNA和蛋白质展开，在暗条件下通过LED光源VISIRYAS(AE-6935B、ATTO公司制造)对所得凝胶照射蓝色光，使GFP融合蛋白可视化。

表3

表4

(7)利用微孔板的亚砷酸(As(III))的检测试验

向微孔板(Reacti-Bind链霉亲和素包被高结合力(HBC)黑色96孔板、Pierce公司制造)中添加在110μL的DNA固定用缓冲液(含有0.05％吐温20的Tris缓冲液-生理盐水(TBS))中溶解有30pmolP_ars-DNA的溶液，在室温下孵育2小时，由此在孔表面固定P_ars-DNA。用200μL的DNA固定用缓冲液进行2次清洗后，用200μL的TBS进行1次清洗。以表5所示的组成将蛋白粗提液和亚砷酸溶液混合，在冰上进行2小时孵育。然后，在板中添加混合液，并在室温下进行1小时孵育。除去上清，用200μL的清洗用缓冲液(含有0.05％吐温20的10mM PBS、pH6.0)进行3次清洗，最后添加150μL的50mM Tris-HCL(pH7.9)，10分钟后用荧光酶标仪MTP-601Lab(コロナ-日立ハイテクノロジ一ズ公司制造)测定荧光强度。作为此时的带通滤光片，激发光侧使用492nm的滤光片，检测器侧使用530nm的滤光片。

表5

实施例3

[结果和考察：亚砷酸生物传感器]

(1)ArsR-GFP融合蛋白的制作

首先，将在pAcGFP1质粒DNA的Acgfp1基因的上游、以与Acgfp1基因相同的读码框插入有大肠杆菌K12的arsR基因的pAcGFParsR作为模板，进行PCR，扩增含有arsR和Acgfp1的DNA片段arsRgfp。此时使用的引物由与arsR基因的5’末端和Acgfp1基因的3’末端互补的20个碱基构成，进而在其5’侧分别添加了NdeI位点。通过将arsRgfp插入pGEM-T载体质粒DNA并进行克隆，得到pGEMarsRgfp(图4)。对pGEMarsRgfp进行NdeI消化，将由质粒DNA切出的arsRgfp利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收。对pET-3a进行Nde1消化，并与回收的arsRgfp连接，由此得到pETarsRgfp。利用pETarsRgfp转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，由此培育ArsR-GFP融合蛋白生产株。

(2)ArsR-GFP融合蛋白的功能评价

通过凝胶迁移法确认如此得到的重组蛋白是否具有作为ArsR蛋白的功能性。凝胶迁移法中，若蛋白质和核酸通过特异性结合而形成复合体，则与单独核酸或者单独蛋白质的情况相比，电泳时的各分子的移动距离产生差异，因而凝胶上的条带的位置产生差异。由此，能够判断有无蛋白质与核酸的特异性结合。将含有ArsR-GFP蛋白的蛋白粗提液与P_ars-DNA混合，结果如图5所示，确认到推测为P_ars-ArsR-GFP复合体的条带。另外，在不添加P_ars-DNA而使蛋白粗提液的反应液泳动的情况下，没有确认到该条带，由此证明该条带为P_ars-ArsR-GFP复合体的条带。另外，在反应液中添加亚砷酸的情况下，随着所添加的亚砷酸的浓度的增加，确认到P_ars-ArsR-GFP复合体的条带变淡。由以上结果可以确认，ArsR-GFP蛋白与P_ars-DNA特异性结合而形成复合体，且与P_ars-DNA的结合由于亚砷酸的存在而被抑制。此外，这些结果表明，ArsR蛋白的功能不会因GFP荧光修饰而受损。

(3)利用微孔板的亚砷酸检测体系的开发

向固定有P_ars-DNA的孔中添加含有ArsR-GFP蛋白的蛋白粗提液，在孔表面上形成P_ars-ArsR-GFP复合体。然后，除去蛋白粗提液，不进行清洗而用SDS-PAGE用的样品缓冲液使孔上的蛋白质变性并进行回收。利用电泳分析的结果是，在ArsR-GFP蛋白的推定分子量41.8kDa的位置检测到较浓的条带，但除此之外还确认到多个条带(图6泳道2)。对于在孔表面上形成P_ars-ArsR-GFP复合体并进行清洗后回收的样品进行同样的分析时，在ArsR-GFP的位置确认到几乎完全纯化的蛋白质(图6泳道1)。与直接将蛋白粗提液展开的情况(图6泳道3)相比，所有泳道的样品均显示出目标蛋白质纯化的飞跃性进步。由以上结果表明，仅通过在孔表面固定P_ars-DNA并添加蛋白粗提液进行孵育，P_ars-DNA和ArsR-GFP就能够在维持高特异性的同时在孔表面结合。该结果表明，不需要进一步用于蛋白质纯化的烦杂的柱操作，能够降低生物传感器的制作中所花费的成本。

(4)含ArsR-GFP的蛋白粗提液的添加量

接着，对于在孔表面固定P_ars-DNA后，随着所添加的蛋白粗提液量的变化，孔清洗后残存的荧光强度如何变化进行研究。图7的横轴表示孔中的每100mL液量中的蛋白粗提液的液量，纵轴表示在孔上与P_ars-DNA形成复合体的ArsR-GFP的荧光强度。荧光强度随着粗提液液量的增加而增加，但在40mL达到平稳状态。这表明，对于在孔表面固定的几乎全部的P_ars-DNA，为了与ArsR-GFP形成复合体，每100mL液量中蛋白粗提液的液量为40mL就足够了。添加在此以上的量的提取液的情况下，游离ArsR-GFP蛋白在反应体系中过量存在，可以预料到检测亚砷酸时过量存在的游离ArsR-GFP与P_ars-DNA结合，从而导致检测灵敏度的降低。因此，暂定利用与40mL的蛋白粗提液相当的ArsR-GFP的量来进行亚砷酸的检测。

在进行亚砷酸的检测时，制备将相当于上述蛋白粗提液40mL的量浓缩至5mL的粗提液。然后，将蛋白粗提液与亚砷酸以5∶95的比例混合，根据实施例2的[实验材料和方法]中记载的程序在3小时后进行荧光强度的测定。结果，观察到荧光强度因亚砷酸的添加而显著减少，并确认到减少幅度在100μg/L时大于50μg/L时的倾向。由此表明利用微孔板的以DNA作为元件的亚砷酸检测用生物传感器在原理上能够检测50μg/L的亚砷酸(图8)。

(5)清洗条件的研究

如前所述，可以判断出能够在96孔微孔板上构建由作为传感元件的Pars和ArsR-GFP构成的复合体。另外，将剩余的ArsR-GFP蛋白溶液从固定有Pars的孔中除去，并用表6所示的10mM PB-T进行清洗，结果可以确认，随着清洗次数增加，孔内来源于GFP的荧光强度减少。认为该减少的原因在于ArsR-GFP由于清洗操作而从Pars上解离，因而需要一种能够将传感元件复合体保持在基材上、且能够将剩余的ArsR-GFP、杂质蛋白从体系内排除的清洗条件。因此，利用ArsR-GFP，用下述pH不同的两种缓冲液(表6)进行清洗操作，研究荧光强度的减少度。

表6

清洗条件的研究中使用的缓冲液

在一次清洗操作中，将200μL的缓冲液添加到孔中，手持96孔微孔板，轻轻振荡5秒钟后将缓冲液甩落。再次将200μL的缓冲液添加到孔中，进行荧光测定。重复该操作4次，最后将100μL的TBS-T(表6)添加到全部孔中，使pH为7.4，进行荧光强度的测定(图9)。

已知GFP等荧光蛋白具有荧光强度依赖于pH而变化的性质，对于GFP，已知在中性附近随着pH增高而荧光强度增高。用PB-T清洗第1～3次后的荧光强度，由于是在pH6.0的弱酸性条件下进行的测定，因而认为与用TBS-T清洗、在pH7.4的弱碱性条件下测定得到的荧光强度相比更低。两种缓冲液均随清洗次数的增加观察到荧光强度的减少，但在第4次的清洗操作结束后，通过加入pH7.4的TBS-T使pH为7.4而测定荧光强度时，用PB-T清洗时与TBS-T的第1次清洗结束时的荧光强度几乎为相同的值。清洗操作所引起的复合体的减少率是PB-T比TBS-T更小，因而可以判断PB-T更适合作为清洗用缓冲液。在以下的试验中采用PB-T(pH6.0)作为清洗用缓冲液，可以适当改变清洗时的次数、时间等而使用。

(6)砷的还原处理法的研究

已知传感蛋白ArsR对于作为无机砷的三价砷As(III)和五价砷As(V)各自的亲和性不同，对As(III)的亲和性高。但是，饮用水基准值中所示的砷并不区分亚砷酸和砷酸，因而优选利用以ArsR-GFP作为元件的传感器以同等的灵敏度检测As(III)和As(V)的砷。因此，对于能否通过将As(V)还原为As(III)而与As(III)同等地检测As(V)进行了研究。试验中，As(V)使用砷酸钠，As(III)使用亚砷酸钠，还原剂使用硫代硫酸钠。

试样的还原处理按照图10所示的程序进行。在450μL试样中添加20.0μL的2N盐酸溶液，使pH约为1。接着，添加预先制备的250mM硫代硫酸钠水溶液1.0μL，然后在室温下进行10分钟的孵育。10分钟后添加2.5N氢氧化钠溶液16.0μL进行中和。另外，pH的确认利用pH试纸进行。

将As调制为规定浓度且未进行还原处理的试样或进行过还原处理的试样92μL、与含有ArsR-GFP的蛋白粗提液7.5μL、10mg/mL鲑鱼精子DNA 0.5μL混合，在冰上进行30分钟的孵育。然后，将混合液添加到固定有Pars的孔中，并在室温下进行2小时的振荡。2小时后除去孔内的混合液，用200μL的PB-T(表6)进行1次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加150μL的荧光测定用缓冲液(50mM Tris-HClpH7.9、1M NaCl、0.1％(w/v)吐温-20)，进行荧光测定。

在未进行还原处理的、含有规定浓度的As的试样的情况下，对于As(III)，与浓度相关地，荧光强度的减少幅度增加；而对于As(V)，即使在100μg/L时也几乎没有观察到荧光强度的减少(图11)。但是，通过进行还原处理，对于As(V)也确认到与As(III)同等的荧光强度的减少(图12)。另外，以超纯水作为试样时，荧光强度在有无还原处理情况下进行比较时没有确认到显著差异，因而可以判断还原处理本身不会对检测产生影响。

所开发的砷传感器ArsR-GFP，即使对于100μg/L的As(V)也没有显示出荧光强度的变化，因而可以确认ArsR-GFP对于As(V)的应答性极低。但是，通过利用硫代硫酸钠实施还原处理，显示出与As(III)同等的荧光强度的变化，由此表明：通过将As(V)还原为As(III)，传感器能够与As(III)同等地检测As(V)。另外，虽然未给出数据，但可知：还原处理中，如果不使pH达到强酸性区域而进行硫代硫酸钠处理，就无法检测As(V)。因此，认为还原处理中加入盐酸等酸是必不可少的。

(7)还原处理后试样中添加的缓冲液和其pH的最适化

由于所开发的砷传感元件为蛋白质，因而存在在极端的pH条件下元件自身产生变性从而无法作为传感器发挥功能的可能性。因此，需要接近无论对于何种pH的试样均能够作为传感器发挥功能的最适pH。于是，对砷检测试验时的pH的影响进行了确认。检测试验时，在不含亚砷酸的试样和含有100μg/L的As(III)的试样各445μL中，依次加入2N盐酸20.0μL、500mM乙二胺四乙酸(pH8.0)5.0μL、250mM硫代硫酸钠1.0μL、2.5N氢氧化钠16.0μL，从而进行还原处理。然后，添加表7所示的缓冲液25.0μL，研究试样的pH条件的影响。为了提高缓冲液的缓冲能力，将浓度设定为1M(终浓度50mM)。

表7

还原处理后添加的缓冲液

将加入各缓冲液后的试样与含有ArsR-GFP的蛋白粗提液、鲑鱼精子DNA混合，在冰上进行30分钟的孵育。然后，将混合液添加到固定有Pars的孔中，在室温下进行2小时的振荡。除去孔中剩余的ArsR-GFP蛋白溶液，用200μL的PB-T(表6)进行1次5秒钟的清洗。清洗后在孔中添加150μL的荧光测定用缓冲液，进行荧光强度的测定(图13)。

对磷酸缓冲液的三个条件进行比较，随着pH增高，在不添加亚砷酸的条件下Pars-ArsR-GFP复合体的形成量增加，此外与含有As(III)100μg/L的试样产生的荧光强度的减少幅度也增加。但是，对pH为7.4的两个条件进行比较时，可知：在Tris缓冲液的情况下，由于减少幅度减小，因而传感器的信号变弱。该结果说明，如果不使pH保持一定而实施砷检测试验，则即使砷浓度相同，也可能得到不同的结果。认为利用缓冲液等调节试样的pH是必不可少的。由图13和图9的结果可以判断：使试样的pH保持一定时，用约1M的缓冲能力高的磷酸缓冲液，将pH调节为7.4附近、将磷酸缓冲液的终浓度调节为50mM以上来实施砷检测试验是合适的。

(8)砷检测的标准曲线

在之前的试验所得到的清洗以及荧光强度的测定条件下进行亚砷酸的检测试验。通过“(7)还原处理后试样中添加的缓冲液和其pH的最适化”中进行的方法实施试样的还原处理后，加入pH7.4的1M磷酸缓冲液25μL。将这样得到的处理后的试样95μL与4.5μL的ArsR-GFP溶液、0.5μL的10mg/mL鲑鱼精子DNA混合，在冰上进行30分钟的孵育。30分钟后将该混合液添加到固定有Pars的孔中，在室温下进行10分钟的振荡。10分钟后除去剩余的混合液，用200μL的PB-T(表6)进行1次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加150μL pH7.9的50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl，进行荧光测定。As(III)检测中的ArsR-GFP的标准曲线如图14所示。

试验中确认到As(III)的浓度与荧光强度存在负相关。另外，与As(III)浓度为0μg/L时相比，在As(III)浓度为5μg/L时荧光强度显示出显著的减少，在50μg/L时显示出50％的减少。由本次结果表明：通过研究测定条件，所开发的砷传感器能够检测出世界卫生组织制定的饮用水基准值即10μg/L的As(III)。

(9)砷传感器的交叉应答性

确认砷传感器能够检测μg/L级的三价砷。但是，未显示出具有作为传感器的重要要素的选择应答性。因此，研究了砷传感器对砷以外的金属的应答性。作为试样，对1.0μM、10μM、100μM的氯化钙、氯化镉、硫酸铜(II)、硫酸亚铁(II)、氯化铁(III)、硫酸镁、硫酸锰、醋酸铅(II)、硫酸锌进行了试验。同时检测As(III)和As(V)时，需要利用硫代硫酸钠进行试样的还原处理，因此本试验中也在通过“(7)还原处理后试样中添加的缓冲液和其pH的最适化”中进行的方法实施试样的还原处理后，加入pH7.4的1M磷酸缓冲液25μL。然后，与前项同样地混合ArsR-GFP溶液和鲑鱼精子DNA，在冰上进行30分钟的孵育。将混合液添加到固定有Pars的孔中，在室温下进行2小时的振荡后，除去孔内剩余的混合液，用200μL的PB-T(表6)进行1次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加150μL的荧光测定用缓冲液，进行荧光测定(图15)。

由图14的砷检测标准曲线可以预测：传感器对于1μM(＝75μg/L)的As(III)显示出比0μg/L的值减少50％以上的减少幅度。另一方面，本试验结果中对于其100倍浓度的各金属也没有显示出交叉应答。由此确认，砷传感器具有高选择性，与砷产生应答。该结果可以推测出：除了原本ArsR蛋白对砷所具有的特异性以外，在试样的还原处理时加入的乙二胺四乙酸的金属螯合作用也有效发挥了作用。

实施例4

[结果和考察：铅和镉生物传感器]

(1)生产CadC-GFP融合蛋白的大肠杆菌菌株的培育

通过与实施例3中记载的ArsR-GFP融合蛋白的制作同样的方法，制作CadC-GFP融合蛋白。将pGEMarsRgfp用SphI和BamHI消化，除去切出的片段，由此得到pGEMgfp(图16)。以pI258质粒DNA作为模板进行PCR，扩增含有cadC的DNA片段。此时，引物使用在与cadC基因的5’末端互补的20个碱基上添加了SphI和NdeI位点、在与3’末端互补的20个碱基上添加了BamHI位点的引物。将cadC用SphI和BamHI消化，并与pGEMgfp连接，从而得到pGEMcadCgfp。通过将pGEMcadCgfp用NdeI消化，从质粒DNA中切出cadCgfp，将切出的cadCgfp利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收。将pET-3a用NdeI消化，并与回收的cadCgfp连接，从而得到pETcadCgfp。用pETcadCgfp转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，由此培育CadC-GFP融合蛋白生产株。

(2)CadC-GFP融合蛋白的功能评价

与实施例3同样地，通过凝胶迁移法确认CadC-GFP融合蛋白是否具有CadC蛋白的功能。将含有CadC-GFP蛋白的蛋白粗提液与P_cad-DNA混合时，确认到推测为P_cad-CadC-GFP复合体的条带(图17上图)。在不添加P_cad-DNA而使蛋白粗提液的反应液泳动的情况下没有确认到该条带，由此证明该条带为P_cad-CadC-GFP复合体的条带。另外，在反应体系中分别添加作为二价阳离子的铅、钙或镁离子时，所有情况下均确认到Pcad-CadC-GFP复合体的条带变淡(图17下图)。但是，添加二价铅时，与添加钙或镁时相比条带更显著变淡，由此推测CadC-GFP融合蛋白具有一定的选择性，与二价铅结合而改变与P_cad-DNA的结合常数或解离常数。

(3)利用微孔板的铅和镉检测体系的开发

使用含有CadC-GFP融合蛋白的蛋白粗提液和固定有Pcad-DNA的微孔板，构建利用与亚砷酸检测体系同样的原理检测铅化合物和镉化合物的生物传感器。

将具有CadC结合序列的Pcad34-生物素固定于图18所示的E1和E2的孔中。E3的孔中没有固定DNA链。向E1至E3的孔中添加100μL含有CadC-GFP的蛋白粗提液，在室温下进行2小时的振荡。2小时后除去剩余的蛋白粗提液。在E1的孔中添加100μL的蛋白溶解缓冲液(表8)，在室温下进行30分钟的振荡后回收缓冲液，上样于电泳(SDS-PAGE)的泳道3中。与此不同，在E2和E3的孔中加入200μL的PB-T(表6)后取出，重复该操作进行2次清洗。然后，添加100μL的蛋白溶解缓冲液，在室温下进行30分钟的振荡，使孔内残存的蛋白溶解，分别上样于电泳的泳道4和泳道1中。回收的蛋白溶解缓冲液在上样前在98℃下通过5分钟的孵育进行处理。电泳在250V、恒定电流20mA、室温的条件下进行。

表8

1M三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH6.8)	50μl	甘油	100μl
				10％(w/v)十二烷基硫酸钠	200μl	蒸馏水	定容为1ml
β-巯基乙醇	60μl	0.5％(w/v)溴酚蓝	20μl

由电泳的结果可以判断：与图19的泳道2的含有CadC-GFP的蛋白粗提液相比，通过使蛋白粗提液与固定有Pcad34的孔接触，在残存的蛋白质中CadC-GFP被浓缩和纯化(泳道3)。这是根据在由计算求出的CadC-GFP的分子量的位置处确认到作为主要条带的蛋白质而判断的。另外，可以判断出：通过进行孔的清洗，杂质蛋白的条带进一步减少，CadC-GFP被浓缩和纯化(泳道4)。另一方面，在孔中未固定Pcad34的情况下，判断出CadC-GFP通过清洗被洗掉(泳道1)。由该结果可以确认，在固定有Pcad34的96孔微孔板上，能够从蛋白粗提液中使CadC-GFP特异性结合。因此，对于在96孔微孔板上形成作为铅和镉传感元件的Pcad DNA与CadC-GFP传感蛋白的复合体的体系进行了研究。

(4)铅和镉传感器中的Pcad固定量的研究

确认了在Pcad的3’末端标记有生物素的Pcad34-生物素在孔中的结合量，作为构建传感器方面的参考。将Pcad34-生物素的浓度调制为0～50pmol/100μL，用于孔中的固定。含有CadC-GFP的蛋白粗提液通过将如图16所示那样培育的E.coli BL21(DE3)pLysS(pETcadCgfp)的培养液50mL中的细胞悬浮于4mL的TG(50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl pH7.4、15％(v/v)甘油)中，在冰上利用UD-201(トミ一精エ公司)进行超声波破碎(振动输出3、间隔50％、每次5分钟并进行4次)来制备。将99μL的蛋白粗提液与1.0μL的10mg/mL鲑鱼精子DNA混合，添加到固定有Pcad34的孔中，在室温下进行2小时的振荡。2小时后除去剩余的蛋白粗提液，用200μL的PB-T(表6)进行2次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH7.9)150μL，进行荧光测定。结果，到20pmol/100μL为止，随着Pcad34的固定量的增加，观察到CadC-GFP结合量的增加(图20)。与Pars的固定的结果同样地，荧光强度在固定量为20pmol/100μL时达到饱和。本次试验中使用的蛋白粗提液中的CadC-GFP量是充分的，因而认为Pcad34在孔上的固定量为10-20pmol/100μL时达到饱和。结论为：在构建铅和镉传感器方面，Pcad34固定时使用的浓度以20pmol/100μL为上限。

(5)铅和镉传感器中的CadC-GFP添加量的研究

相对于每孔20pmol的Pcad34使用量，对含有CadC-GFP的蛋白粗提液的最适添加量进行了研究。以20pmol/100μL制备Pcad34-生物素，添加到孔中进行固定。制备含有CadC-GFP的蛋白粗提液99μL与10mg/mL鲑鱼精子DNA 1.0μL的混合液。接着，用TG(50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl pH7.4、15％(v/v)甘油)将该混合液进行稀释，使混合液相对于总量的容量比为0-100μL/100μL。然后，将该稀释试样添加到固定有Pcad34的孔中，进行荧光测定(图21上图)。之后在室温下进行1小时的振荡后，除去剩余的稀释试样，用200μL的PB-T(表6)进行2次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加150μL pH7.9的50mMTris-HCl，进行荧光测定(图21下图)。

结果，在孔中添加的溶液的容量比约为80～90μL/100μL时，CadC-GFP与Pcad34的结合量达到饱和。就所使用的蛋白粗提液而言，认为在容量比为80-90μL/100μL以上时，相对于所固定的20pmol的Pcad34，CadC-GFP为过量。即，在检测试验中，若蛋白粗提液浓度高于本次的容量比80～90μL/100μL，则可以预测对于铅、镉的检测灵敏度降低。以本次试验中使用的蛋白粗提液中的CadC-GFP浓度为标准，进行了铅和镉传感器的构建。但是，与ArsR-GFP的情况同样地，由于含有CadC-GFP的蛋白粗提液也是包含杂质蛋白的E.coli细胞破碎液，因而难以准确地计算出CadC-GFP的浓度。因此，基于pH7.4的蛋白粗提液的荧光强度简易地确定了CadC-GFP的浓度。

将CadC-GFP和ArsR-GFP进行比较时较大的不同点可以列举：假如将各蛋白质溶液所具有的荧光强度看作传感蛋白-GFP的浓度，则使其在一定量的启动子区域DNA链上的结合达到饱和所需要的量不同。在CadC-GFP的情况下，需要添加蛋白粗提液使荧光强度与液量的乘积更大。认为其原因在于：各传感蛋白-GFP与启动子区域DNA链的结合常数不同、以及所使用的Pcad34的碱基数不充分等。因此，对于在形成复合体方面Pcad的碱基数的影响和盐浓度的影响进行了研究。

(6)铅和镉传感器构建中的Pcad碱基数和盐浓度的研究

为了研究Pcad的碱基数不同所产生的影响，新设计了双链DNA。该双链DNA是在包含金黄色葡萄球菌所具有的pI258上的cadC的转录起始位点上游的启动子保守序列的-10碱基附近的CadC结合序列的Pcad34的碱基序列上，进一步添加-35附近的CadC结合序列而得到的DNA。为了制备新制作的双链DNA，将表9所示的Pcad50-S-3-B(序列号5表示Pcad50-S的序列)和Pcad50-A(序列号6)等量混合，形成在启动子序列的3’末端标记有生物素的双链寡核苷酸Pcad50-生物素。接着，制备20pmol/100μL的Pcad34-生物素和Pcad50-生物素，用于固定。

表9

下划线表示CadC结合序列。

含有CadC-GFP的蛋白粗提液通过将300mL的培养液中的细胞悬浮于4mL的TG2(200mM三羟甲基氨基甲烷-HCl pH7.4、15％(v/v)甘油)中，在冰上利用UD-201(トミ一精エ公司)进行超声波破碎(振动输出3、间隔50％、每次5分钟并进行4次)来制备。将7.5μL的蛋白粗提液与0.5μL的10mg/mL鲑鱼精子DNA、92μL的超纯水混合使体积为100μL，此时的荧光强度为65.3±0.6。将该混合液添加到固定有Pcad34和固定有Pcad50的孔中，在室温下进行2小时的振荡。2小时后除去孔中的混合液，用200μL的PB-T(表6)进行1次5秒钟的清洗。清洗后，在孔中添加150μL的荧光测定用缓冲液，进行荧光测定。结果，在固定有Pcad34的孔中，荧光强度显示为2.10的值，在固定有Pcad50的孔中显示为2.06的值。即使在固定有增加了另一处CadC结合序列的Pcad50的情况下，也没有确认到CadC-GFP的结合量的变化。

接着，对盐浓度在形成复合体方面所产生的影响进行了研究。在形成复合体的反应时，添加氯化钠，进行盐浓度的调节。制备20pmol/100μL的Pcad50-生物素，并固定于微孔板的孔中。在铅检测试验中，为了研究盐浓度对Pcad-CadC-GFP复合体形成所产生的影响，首先以表10所示的组成制备试样和蛋白粗提液的混合液。此时，在添加氯化钠的条件下，醋酸铅(II)溶液∶4M氯化钠为99∶1(v/v)。然后，与之前的检测试验同样地进行一系列操作，进行荧光强度的测定。

表10

CadC-GFP溶液	10mg/ml鲑鱼精子DNA	4M氯化钠	醋酸铅(II)
				9.5μl	0.5μl	-	90μl
7.5μl	0.5μl	0.92μl	91.08μl

在不添加氯化钠和添加氯化钠的任一条件下，均确认到荧光强度随着Pb(II)浓度的增加而减少(图22)。但是，在添加氯化钠的条件下，Pb(II)浓度为0μg/L时的荧光强度大幅增加。此外，与添加铅时的荧光强度之差也显著增加，在Pb(II)浓度为100μg/L时，与0μg/L相比荧光强度减少至约30％。由该结果可知，盐浓度对CadC-GFP与Pcad的结合有较大影响，因此可以判断出在铅和镉检测试验中将盐浓度调节为40mM来进行是很有效的。

(7)铅和镉检测的标准曲线

在之前的试验所得到的孵育条件下进行铅和镉的检测试验。制备20pmol/100μL的Pcad50-生物素，并固定于微孔板的孔中。作为试样，将0至100μg/L的已知浓度的Pb(II)或Cd(II)溶液376μL与4M的NaCl 4.0μL混合。进而，为了使试样的pH保持一定，加入1M的三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH7.4)20.0μL作为缓冲液，使试样的总量为400μL。将该预处理后的试样92μL与含有CadC-GFP的蛋白粗提液7.5μL、10mg/mL鲑鱼精子DNA 0.5μL混合，与之前的检测试验同样地进行一系列操作，进行荧光强度的测定。

结果，确认到与Pb(II)、Cd(II)的浓度增加相关的荧光强度的减少(图23)。与0μg/L相比，Pb(II)在10μg/L的浓度下确认到荧光强度的显著性差异，Cd(II)在5μg/L的浓度下确认到荧光强度的显著性差异。关于Cd(II)的检测下限，进一步进行了详细的试验，结果可知为1μg/L。另一方面，可知两种重金属在75μg/L以上时均观察不到荧光强度的减少。

世界卫生组织推荐的饮用水的基准值是：Pb(II)为10μg/L，Cd(II)为3μg/L。因此，可知所开发的铅和镉传感器能够分别检测基准值的铅、以及基准值以下的镉。另外，虽然未给出数据，但可知传感器对于1、10、100μM的Ca(II)、Mg(II)、Fe(II)、Mn(II)、Fe(III)、As(III)几乎不显示交叉应答性。

[比较例：FRET法]

为了检测DNA和蛋白质的相互作用介导的复合体分子的高级结构的变化，尝试开发了利用荧光共振能量转移(Fluorescence ResonanceEnergy Transfer；FRET)的体系。FRET是指激发能量从作为供体的能量供给体向作为受体的能量接受体转移的现象。如果在处于激发状态的供体附近存在受体，则在供体尚未产生发光的期间内，该激发能量使受体被激发，从而能够检测到受体的发光。由于距离越近越容易产生FRET，因而可以作为检测分子间的相互作用、分子的结构变化的手段使用。

(1)重组蛋白的表达和提取以及表达的确认

将ZntR蛋白的表达用大肠杆菌转化株在添加有Amp和Cm的培养基5mL中、在37℃下培养过夜，然后接种到添加有Amp和Cm的培养基250mL中，在37℃下振荡培养。当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，在无菌条件下加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside；IPTG)使终浓度为0.5mM，并在37℃下培养3小时。将该培养液以8000rpm离心分离5分钟，收集菌体并弃去上清后，进行3次冻融(在-80℃冷冻30分钟，然后在室温融解30分钟)，重悬浮于适量的Tris缓冲液A(50mM Tris-Cl pH8.0、2mM EDTA、5mM二硫苏糖醇)中，在室温下孵育10分钟。在4℃下以12000rpm离心10分钟，得到ZntR蛋白粗提液，然后利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)展开，进行ZntR蛋白的表达确认。

将ArsR蛋白的表达用大肠杆菌转化株在添加有Amp和Cm的培养基5mL中、在37℃下培养过夜，然后接种到添加有Amp的LB培养基250mL中。将其在37℃下振荡培养，直至OD₆₀₀达到0.8。然后，在无菌条件下加入IPTG使终浓度1mM，并在37℃下培养3小时。将该培养液以8000rpm离心15分钟，收集菌体并弃去上清后，重悬浮于30mL的Tris缓冲液A中，进行超声波破碎，由此得到ArsR蛋白粗提液。将该ArsR蛋白粗提液利用SDS-PAGE展开，进行ArsR蛋白的表达确认。为了分离蛋白质和DNA，进行DNA酶I处理。DNA酶I处理使用不含RNA酶的DNA酶I(TaKaRa公司)，按照产品的操作规程的方法进行。

ArsR-GFP融合蛋白的表达与ArsR蛋白的表达同样进行。不过，培养基中仅添加Amp。

SDS-PAGE的凝胶、电泳缓冲液、样品缓冲液的组成分别示于表11、表12、表13。将蛋白溶液和样品缓冲液各20μL进行混合使体积为40μL，在沸腾的水中煮沸5分钟，将所得物质添加到凝胶中，进行电泳。分子量标志物使用宽范围的预染蛋白分子量标志物(Bio Labs公司)。泳动后的凝胶浸渍于在40％(v/v)甲醇-10％(v/v)醋酸水溶液中溶解有0.2％(w/v)的考马斯亮蓝R-250的染色液中，使其缓慢地振荡30分钟而染色。脱色时，浸渍于20％(v/v)甲醇-5％(v/v)醋酸水溶液(脱色液)中并缓慢振荡。重复更换为新的脱色液而进行脱色，直到凝胶脱色且蛋白质的条带变得鲜明。

表11

表12

表13

(2)ZntR和ArsR-GFP融合蛋白的纯化

所有纯化的步骤均在低温室(6～8℃)中进行。对ZntR或ArsR-GFP融合蛋白的粗提液进行硫酸铵沉淀，然后，进行用于脱盐的凝胶过滤。硫酸铵用碾槌和研钵细致磨碎。然后，一边用搅拌器搅拌，一边以0％→10％→20％→30％→40％→45％的浓度添加到粗提液中，在各个步骤中使其完全溶解。达到45％的浓度后，用搅拌器搅拌过夜。然后，在4℃下以12000rpm离心30分钟并弃去上清，在沉淀中加入粗提液的1/10量的Tris缓冲液A，使其完全溶解。凝胶过滤使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare公司)，按照附带的操作规程的方法进行。此时，柱平衡中所用的缓冲液和洗脱缓冲液使用Tris缓冲液A。

然后，在ZntR蛋白的纯化中进行亲和层析，在ArsR-GFP融合蛋白的纯化中进行亲和层析和离子交换层析。亲和层析使用Hi Prep 16/10Heparin FF(GE Healthcare公司)，离子交换层析使用Hi Trap SP HP(GEHealthcare公司)。按照各自的操作规程的方法进行。各纯化条件如表14、表15所示。

表14

表15

纯化后的ZntR蛋白的定量通过Bradford法(考马斯亮蓝染色后测定595nm的吸光度(A₅₉₅))进行。吸光度测定使用Smart Spec^TMPlus分光光度计(Bio Rad公司制造)。纯化后的ArsR-GFP融合蛋白的定量通过测定A₂₈₀而进行。同时还进行了GFP的荧光测定(518nm)。荧光测定使用F-2500型分光荧光光度计(日立公司制造)。

(3)凝胶迁移法(电泳迁移率变动分析法；EMSA)

EMSA中使用的荧光标记寡核苷酸链示于表16(序列号7表示zntA-Pr-S的序列，序列号8表示zntA-Pr-A的序列)。另外，制作与荧光标记寡核苷酸具有相同碱基序列的非荧光标记的寡核苷酸。另外，启动子DNA与ZntR蛋白的结合反应的组成示于表17。形成双链DNA时，在PCR管中以等量分别混合互补的2条单链DNA(100μM)，在95℃下进行1分钟的热处理。热处理后，在室温下放置1小时以上，促进双链(50μM)的形成。为了促进启动子DNA与ZntR蛋白的结合，制备反应液后，在37℃下进行30分钟的孵育。反应液加入表18所示的非变性PAGE用样品缓冲液，使体积为40μL。然后，使用以表19所示的组成制作的丙烯酰胺凝胶和表20所示的TBE缓冲液，进行非变性PAGE。

表16

表17

表18

表19

表20

EDTA：乙二胺四乙酸

EMSA中的荧光标记DNA的检测通过如下方式进行：在暗条件下，利用数码照相机对照射LED光源VISIRYAS(ATTO公司、AE-6935B(蓝色光源)、AE-6935GL(绿色光源))的凝胶进行拍照。

(4)铅化合物的检测试验

所使用的启动子DNA为与EMSA中使用的DNA同样地在两末端标记了FITC和TAMRA的双链DNA。启动子DNA通过将预先用FITC和TAMRA标记的单链DNA探针混合并用EMSA中使用的方法进行处理而形成双链DNA。关于重金属，分别以10nM的浓度制备醋酸铅(II)：Pb(CH₃COOH)₂(以下记作Pb)和硫酸锌：ZnSO₄(以下记作Zn)。作为比较对象，分别以10nM的浓度制备氯化钠：NaCl(以下记作Na)、钙离子：CaCl₂·2H₂O(以下记作Ca)。在加入1nM Pb、1nM Zn、1nMNa、1nM Ca、以及未加入EDTA的Tris缓冲液A(50mM Tris-Cl pH8.0、5mM二硫苏糖醇)的5个条件对试样进行研究。以表21所示的组成制备反应液，在暗条件下在37℃进行30分钟的孵育。然后，在反应溶液中加入未添加EDTA的Tris缓冲液A 1mL，混合后在表22所示的条件下进行荧光测定。

表21

将上述溶液分别混合后，在37℃孵育。

表22

(5)砷化合物的检测试验

融合有ArsR蛋白的、来源于pAcGFP1质粒的GFP是发出激发波长为475nm、荧光波长为505nm的绿色荧光的荧光蛋白。将三个不同的荧光标记DNA探针分别与ArsR-GFP融合蛋白、亚砷酸钠：NaAsO₂(以下记作As)混合，制备反应溶液。所使用的三个荧光标记DNA探针示于表23。对350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm的激发光进行研究的结果是，使用在不添加As时和添加As时TAMRA和GFP的荧光强度的峰值产生变化的350nm和360nm的波长。除激发波长、荧光开始波长和荧光结束波长以外的荧光测定条件利用表22所示的条件进行。所有孵育均在遮光条件下进行。通过将表23所示的引物“ParsR-S3-5-TAMRA”与“Ec arsR prm ext prm”组合的PCR，对ArsR蛋白所结合的、以基因组DNA上的启动子区域为中心的350bp的DNA片段进行扩增(以下记作ParsR-350探针DNA)(序列号9表示ParsR-S3的序列，序列号10表示Ec arsR prm ext prm的序列，序列号11表示R773-50-S的序列，序列号12表示R773-50-A的序列)。

表23

通过将表23所示的引物ParsR-S3-5-TAMRA与Ec arsR prm extprm组合的PCR，对ArsR蛋白所结合的、以基因组DNA上的启动子区域为中心的350bp的DNA片段进行扩增(以下记作ParsR-350探针DNA)。使用ParsR-350探针DNA的检测试验的反应组成示于表24。按照表24所示的程序进行检测后，测定1mL反应溶液的荧光光谱。荧光的检测对400-650nm分别进行2次。

表24

由表23所示的ParsR-50-S-5-TAMRA和ParsR-50-A形成的双链DNA，是由ArsR蛋白所结合的、基因组DNA上的启动子DNA的50bp的碱基序列构成的(以下记作ParsR-50探针DNA)。

另外，由表23所示的R773-50-S-5-TAMRA和R773-50-A形成的双链DNA，是由ArsR蛋白所结合的、R-773质粒DNA上的启动子DNA的50bp的碱基序列构成的(以下记作R773-50探针DNA)。这两个荧光标记DNA探针通过在80℃下孵育后在室温下孵育，形成双链DNA。

使用ParsR-50探针DNA或R773-50探针DNA的检测试验的反应组成和检测程序示于表25。荧光的检测对480～650nm分别进行3次。

表25

(6)ZntR蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育的结果

ZntR蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育中使用pET3a载体。以前报道过的重组ZntR蛋白在N末端带有His标签，因而无法否定介由His标签与重金属结合的可能性，因此再次培育了表达不带有His标签的ZntR蛋白的大肠杆菌菌株。首先，将保持有图27所示的pET16zntR的JM109株接种到添加有Amp的LB培养基100mL中，在37℃下振荡培养过夜。第二天，回收菌体后，进行质粒抽提。使用限制性内切酶NdeI和BamHI对所得到的质粒溶液进行过夜反应。利用琼脂糖凝胶电泳将限制性内切酶反应液展开，切出作为目标的zntR基因片段的条带并纯化。将其作为插入片段DNA，与pET3a载体在16℃下进行过夜孵育，从而进行连接。使用连接反应液进行大肠杆菌JM109株的转化。将转化后选出的五个菌落作为a、b、c、d、e，分别接种到添加有Amp的LB培养基5mL中，在37℃下振荡培养过夜。接着，使用各培养液进行质粒抽提后，利用NdeI、BamHI在37℃下进行1小时的限制性内切酶反应。进行琼脂糖凝胶电泳，确认有无插入片段，结果在由b和c抽提出的质粒中确认到插入片段。测序的结果，能够确认c的样品是目标pET3zntR，因此利用该质粒转化了BL21(DE3)pLysS。经过这些过程，培育出ZntR蛋白表达用大肠杆菌菌株(图27)。

(7)ZntR蛋白的表达和纯化的结果

将ZntR蛋白表达用大肠杆菌在添加有Amp和Cm的LB培养基5mL中、在37℃下振荡培养过夜，作为种子。重新准备两份添加有Amp和Cm的5mL LB培养基，分别接种种子，在培养的过程中向一份培养基中添加IPTG。在10000rpm、4℃的条件下进行5分钟的离心分离，从所得到的培养液中回收菌体。将得到的菌体悬浮于Tris缓冲液A中，利用超声波破碎机破碎菌体。然后，在12000rpm、4℃的条件下进行10分钟的离心分离，回收上清。将其作为ZntR蛋白粗提液，通过SDS-PAGE确认ZntR蛋白的表达。结果，仅在添加有IPTG的一者中能够确认到认为是ZntR蛋白的条带(图28的箭头的位置)，因而为纯化ZntR蛋白，将培养基增加为250mL进行培养。与5mL的培养规模时同样地，在回收的菌体中加入Tris缓冲液A进行溶解，并利用超声波破碎。然后，移至离心管中，在12000rpm、4℃的条件下进行10分钟离心分离，通过倾析回收上清。将其作为ZntR蛋白粗提液。

作为纯化的初始过程，进行硫酸铵沉淀。然后，为了脱盐继续进行凝胶过滤，并利用肝素柱进行亲和层析。此时，分别以约5mL的方式回收40个级分。分别测定各级分在280nm处的吸光值，结果得到若干个吸光值的峰。但是，对于形成这些峰的级分进行SDS-PAGE的结果是，在图28的箭头所示的位置没有确认到条带。推测ZntR蛋白不含有芳香族氨基酸，因而不显示280nm的光吸收。因此，通过Bradford法对40个级分进行蛋白质染色，分别测定595nm处的吸光值(图29)。到级分5为止所观察到的峰认为是非吸附级分，因而对形成级分5以后观察到的峰的级分9～15利用SDS-PAGE进行展开。

级分10-13中，在箭头的位置能够确认到认为是ZntR蛋白的条带(图30、箭头的位置)。因此，将级分10-13合并并通过超滤进行浓缩，利用Bradford法进行蛋白定量后，为了脱盐而进行凝胶过滤。进而，通过SDS-PAGE进行ZntR蛋白的确认(图31)。结果，在箭头的位置能够确认到认为是ZntR蛋白的条带，因而使用该ZntR蛋白部分纯化液进行以后的实验。

(8)使用ZntR蛋白部分纯化液的EMSA的结果

对部分纯化的ZntR蛋白进行定量，结果为0.53mg/mL。使用ZntR蛋白和各荧光色素标记的DNA所构成的探针DNA，进行EMSA。电泳用凝胶中上样的各试样的一览表如表26所示。在使用FITC标记的探针DNA的情况下，对于FITC标记的情况，照射蓝色激发光并通过SCF515滤光片(ATTO公司制造)进行拍照，对于TAMRA标记的情况，照射绿色激发光并通过R-60滤光片(ATTO公司制造)进行拍照(图32)。泳道1中确认到的条带认为是单链DNA，泳道2和6中确认到的条带认为是双链DNA的条带。在添加有ZntR蛋白部分纯化液的试样中，在更上方确认到认为是ZntR蛋白与探针DNA的复合体的条带的条带的迁移，随着所加入的蛋白的液量的增加，确认到迁移的条带的量的增加。另外，用FITC或TAMRA标记的探针DNA可以作为绿色或红色的荧光检测到。由这些结果可知，所制备的重组ZntR蛋白与所使用的探针DNA特异性结合而形成复合体。

表26

在使用FITC和TAMRA标记的探针DNA的EMSA中，电泳用凝胶中上样的各试样的一览表如表27所示，实验结果如图33所示。对凝胶照射激发FITC的蓝色激发光，并通过橙色薄膜进行拍照。与使用通过1种荧光进行标记的探针DNA的EMSA的结果同样地，在添加有ZntR蛋白部分纯化液的试样中，确认到认为是ZntR蛋白与探针DNA的复合体的、迁移至上方的条带。泳道1中，在由FITC标记的单链DNA的条带处确认到绿色的荧光，另一方面，泳道2的由TAMRA标记的单链DNA中几乎无法确认到红色荧光。但是，在来源于标记有FITC和TAMRA两者的探针DNA的条带处，确认到作为FITC的绿色和TAMRA的红色的中间色的粉红色的荧光。由该结果可以确认，通过FITC发出的绿色荧光，TAMRA被激发，从而发出红色荧光，即由探针DNA上的FITC向TAMRA产生了FRET。

表27

(9)使用ZntR蛋白部分纯化液和荧光标记探针DNA的铅化合物检测结果

测定由FITC和TAMRA双重标记的探针DNA和ZntR蛋白部分纯化液混合得到的反应液的荧光光谱，结果，通过Pb或Zn的添加，与添加缓冲液的对照相比，只是荧光光谱整体向上方移动。对于金属离子Na、Ca，也得到与Pb和Zn时同样的结果(图34)。

预想的荧光光谱的变化为：在存在Pb或Zn的情况下，FITC的518nm处的峰增加，TAMRA的580nm处的峰减少。另外，在Na、Ca、对照中，期待FITC的518nm处的峰和TAMRA的580nm处的峰的比例无变化。但是，对于FITC的荧光峰(518nm)和TAMRA的荧光峰(580nm)的比例，在将加入缓冲液的对照与加入Pb或Zn的试样进行比较时，没有产生变化。

本试验中，作为FITC的荧光峰和TAMRA的荧光峰的比例没有产生变化的原因，推测为：在发生FRET时，ZntR-启动子DNA复合体的高级结构变化所伴随的荧光物质间的距离的变化较小。另外，认为还可能是因为：在进行试验时试样中加入的荧光标记探针DNA、ZntR蛋白的量作为用于产生FRET的添加量不合适。

(10)ArsR蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育结果

为了构建利用FRET的As检测体系，以重组蛋白形式制备针对砷的传感蛋白ArsR蛋白。如果能够制备重组ArsR蛋白，则根据图26所示的原理，即使ArsR不是与GFP形成的融合蛋白的形式，也能够直接用荧光物质进行标记。以大肠杆菌K12株的DNA序列数据为基础，设计表28所示的arsR基因片段扩增用引物E.coli ArsR-S和E.coil ArsR-A(序列号13表示大肠杆菌ArsR-S的序列，序列号14表示大肠杆菌ArsR-A的序列)。以大肠杆菌K12株的基因组DNA作为模板，利用引物大肠杆菌ArsR-S和大肠杆菌ArsR-A，使用Pfx50^TMDNA聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)对arsR基因进行扩增。利用电泳确认扩增后，在PCR反应液中加入带有GC缓冲液的TaKaRa LA TaqTM，在3’末端进行dATP的添加反应。纯化该反应液，与TA克隆载体、pGEM-T载体连接后，转化大肠杆菌JM109株(图35)。由转化株中抽提出pGEMarsR，用XhoI和NdeI消化后，通过电泳进行插入片段的确认。将pGEMarsR和pET16b分别用XhoI和NdeI处理，对于pGEMarsR，在电泳后切出目标arsR基因片段(约360bp)的条带并进行纯化。另外，对于pET16b，将反应液直接纯化，并与arsR基因片段连接。使用连接反应液，转化大肠杆菌JM109株。arsR基因在pET16b中的插入通过如下方法进行确认：由转化株中抽提出质粒，用XhoI和NdeI处理后，通过电泳确认arsR基因片段的条带。对pET16arsR上的arsR基因进行测序，通过与Gen Bank数据库的大肠杆菌K12株DNA序列数据进行比较，确认克隆的arsR基因没有突变。但是，由pET16arsR表达的ArsR蛋白上带有His标签，考虑到通过His标签与重金属结合的可能性，因此决定将arsR基因片段重新与不具有His标签的pET3a载体连接。将pET16arsR和pET3a载体分别用BamHI和NdeI处理，对于pET16arsR，在电泳后切出目标arsR基因片段的条带并进行纯化。将arsR基因片段与pET3a载体连接，制作pET3arsR。与上述同样地进行测序，通过与Gen Bank的大肠杆菌K12株DNA序列数据进行比较，确认pET3arsR上的arsR基因没有突变。接着，使用pET3arsR的质粒溶液，转化蛋白表达用菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，从而培育出ArsR蛋白表达用大肠杆菌菌株(图35)。

表28

(11)重组ArsR蛋白的表达和确认

将ArsR蛋白表达用大肠杆菌菌株培养后，进行超声波破碎，从而得到ArsR蛋白粗提液。将该ArsR蛋白粗提液利用SDS-PAGE展开，从而进行ArsR蛋白的表达确认。但是，无论是否添加IPTG，在预测为ArsR蛋白的条带的位置(约13kDa)均无法确认到条带。在添加IPTG的蛋白粗提液中，条带在凝胶的上部密集，因而认为ArsR蛋白有可能与DNA结合。因此，为了除去与蛋白质结合的DNA，对蛋白粗提液进行DNA酶I处理，然后，再次利用SDS-PAGE进行ArsR蛋白条带的确认。但是，根据是否添加IPTG所预测的位置的条带没有观察到差异。虽然原因没有确定，但没有实现重组ArsR蛋白的制备。因此，决定通过以与GFP形成融合蛋白的形式制备来对ArsR进行荧光标记。

(12)ArsR-GFP融合蛋白表达用大肠杆菌菌株的培育的结果

为了进行arsR基因片段的克隆，以大肠杆菌K12株的DNA序列数据为基础，设计了表29所示的arsR基因扩增用引物Ec-arsR-pAcGFP-S(序列号15)和Ec-arsR-pAcGFP-A(序列号16)。另外，在各引物上添加克隆时所需要的限制性内切酶位点。首先，以大肠杆菌K12株的基因组DNA为模板，使用引物Ec-arsR-pAcGFP-S和Ec-arsR-pAcGFP-A，通过PCR扩增arsR基因片段(图36)。将通过电泳确认扩增后的arsR基因片段和pAcGFP1载体分别用HindIII和PstI处理，对于pAcGFP1，在电泳后切出目标载体部位(约3.3kb)的条带并进行纯化。另外，对于arsR基因片段，将反应液直接纯化。将两个DNA片段连接，用所得到的pAcGFParsR转化大肠杆菌JM109株。arsR基因的插入通过如下方法进行确认：由转化株中抽提出pAcGFParsR，用HindIII和PstI消化后，利用琼脂糖凝胶电泳确认arsR基因片段(约360bp)的条带。进行pAcGFParsR上的测序，通过与Gen Bank的大肠杆菌K12株的arsR的DNA序列数据进行比较，确认pAcGFParsR上的arsR基因没有突变。

表29

(13)ArsR-GFP融合蛋白的表达和确认

培养ArsR-GFP融合蛋白表达用大肠杆菌菌株后，将菌体破碎，从而得到ArsR-GFP融合蛋白粗提液。将该ArsR-GFP融合蛋白粗提液利用SDS-PAGE展开，从而进行ArsR-GFP融合蛋白的表达确认。结果，在预测为ArsR-GFP融合蛋白的位置(约47kDa)确认到条带(图37的箭头的位置)。但是，由于表达量低，因而利用亲和层析法将目标蛋白部分纯化，以提高相对于杂质蛋白的比例。

(14)ArsR-GFP融合蛋白的纯化结果

对ArsR-GFP融合蛋白粗提液进行硫酸铵沉淀，再溶解于缓冲液后，利用凝胶过滤进行脱盐。然后，通过亲和层析法进行纯化，测定所回收的40个级分的A₂₈₀和GFP的荧光(520nm)。结果，以级分19和20为中心确认到A₂₈₀和荧光值的峰(图38)，可知ArsR-GFP融合蛋白主要存在于这些级分中。对于级分19和20，利用SDS-PAGE确认了蛋白质，结果可以确认到认为是ArsR-GFP融合蛋白的条带(图39、箭头的位置)。

但是，由于除目标蛋白以外依然可确认到杂质蛋白，因此为了进一步提高纯化度，使用这些级分进行了离子交换层析。然后，测定回收的40个级分的A₂₈₀和荧光强度(420nm)。结果，以级分19～21为中心确认到A₂₈₀的峰，荧光值主要是级分20和21显示为较高值(图40)。可知ArsR-GFP融合蛋白主要存在于级分20和21中。对于级分20和21，利用SDS-PAGE分离蛋白质，结果可以确认到认为是ArsR-GFP融合蛋白的条带(图41、箭头的位置)。通过利用离子交换层析法进行纯化，能够大幅除去ArsR-GFP融合蛋白以外的杂质蛋白。

(15)使用ArsR-GFP融合蛋白和荧光标记探针DNA的As检测试验

根据图26所示的原理，对于砷化合物(As)的存在是否会通过FRET对荧光光谱带来变化进行了研究。将ArsR-GFP融合蛋白的部分纯化液与用TAMRA标记的ParsR-350混合，在存在As以及不存在As的条件下利用350nm和360nm的激发光测定荧光光谱，结果如图42所示。在任何一种激发光的情况下，对于580nm附近的TAMRA的荧光峰，虽然变化幅度很小但与不添加As时相比在添加As时均确认到荧光强度的减少。另外，对于510nm附近的GFP的荧光峰，虽然变化幅度很小但与不添加As时相比在添加As时确认到峰的增加。该倾向与由图26中所示的检测原理预测的荧光光谱的变化一致。即认为，在不添加As时，由于蛋白质与DNA的复合体形成，TAMRA与GFP的距离缩短，GFP的荧光容易作为TAMRA的激发光被吸收，结果TAMRA的荧光增加，相反地在添加As时，由于蛋白质与DNA的解离，TAMRA与GFP的距离变远，TAMRA所吸收的GFP的荧光的比例减少，结果GFP的荧光增加。但是，对于TAMRA与GFP的荧光强度的比例，没有确认到因添加As而产生的显著的变化，因而使用将DNA链的长度从350bp缩短到50bp的ParsR-50或R773-50探针DNA进行了As的检测试验。结果，在任何一种激发光以及探针DNA的情况下，通过添加As均确认到与使用ParsR-350探针DNA时同样的光谱变化(图43、图44)。另外，对于580nm附近的TAMRA的荧光，通过添加As，与使用ParsR-350探针DNA时相比观察到减少。但是，在任何一种探针DNA的情况下，对于GFP的荧光强度，通过添加As均没有确认到增加的倾向。将ParsR-50和R773-50探针DNA之间进行比较，对于TAMRA的荧光，通过添加As，使用ParsR-50探针DNA时减少幅度更大。

使用三种不同的探针DNA进行了砷检测试验，结果可知，通过将探针DNA链长设定为50bp、且选择基因组上的砷应答型启动子的碱基序列，在添加As时会使TAMRA的荧光强度产生微弱的变化。虽然改变了探针DNA的链长或碱基序列，但未能带来所期待的通过FRET产生的荧光光谱的变化。

(16)总结

使用所制备的两种重组蛋白ZntR或ArsR-GFP进行的Pb或As的检测试验的结果分别归纳如下。

在使用将启动子DNA用FITC和TAMRA进行了双重标记的探针DNA和ZntR蛋白的试验中，通过Pb的添加，FITC和TAMRA的荧光强度的比例没有确认到变化。由凝胶迁移法的分析结果可以确认，所制备的ZntR蛋白和探针DNA形成ZntR-启动子DNA复合体。因此，认为所形成的复合体由于添加Pb而产生的高级结构变化对于引起FRET中的能量转移的变化而言可能过小。难以通过FRET对ZntR-启动子DNA复合体的高级结构的变化进行外部提示。

另一方面，为了检测As而将野生型的ArsR蛋白利用大肠杆菌菌株进行表达是很困难的。因此，以ArsR-GFP融合蛋白的形式进行了表达，结果能够利用GFP对ArsR蛋白进行荧光修饰。通过利用TAMRA在启动子DNA中引入荧光修饰，确认了能否利用FRET将添加As所引起的DNA分子从蛋白质-DNA复合体上的解离以荧光光谱的变化的形式进行外部提示。其结果是，对于GFP和TAMRA的荧光强度的比例，在添加As时确认到微小的变化。另外，由使用三种不同探针DNA的试验结果可知，由于探针DNA的链长或碱基序列的不同，添加As所引起的荧光强度的变动幅度产生了微小的变化。TAMRA的荧光强度变化最大的试验中所使用的探针DNA，是在菌株基因组DNA上的砷应答型启动子DNA的50bp上修饰有TAMRA的ParsR-50。

作为As检测试验中荧光强度的变化微弱的原因，可以列举如下：相互作用的蛋白质和DNA这个两分子在试验时均为溶液状态。由于分子在溶液中自由地运动，因而考虑可能产生了不少与分子的结合和解离的状态无关的背景FRET。因此，为了使荧光强度的变化更显著，可以列举将探针DNA以修饰的形式固定在基材表面的方案。如果通过探针DNA的固定，添加砷所引起的FRET显著减少，则也可以应用于使用微孔板的检测体系等中，还可以期待在将来的高通量As检测体系中的发展。但是，在未固定探针DNA的本方法中，终究没有产生实用水平的FRET的变化即荧光光谱的变化。

产业实用性

根据本发明，能够使用来源于微生物的传感蛋白，简便且快速地检测和测定被测试样中的分析物。

Claims (15)

1.一种在水体系中检测或定量被测试样中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)和步骤(B)：

(A)在被测试样的存在下，使与所述分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸反应的步骤；

(B)检测或测定所固定的核酸上结合的传感蛋白的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，传感蛋白用能够检测的标记物进行了标记。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，传感蛋白是与能够检测的标记蛋白形成的融合蛋白。

4.一种在水体系中检测或定量被测试样中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)和步骤(B)：

(A)在被测试样的存在下，使固定于支撑体上的、与所述分析物特异性结合的传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸反应的步骤；

(B)检测或测定所固定的传感蛋白上结合的核酸的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，核酸用能够检测的标记物进行了标记。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，传感蛋白与核酸的结合被分析物抑制。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，传感蛋白为由金属应答操纵子编码的蛋白质。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，由金属应答操纵子编码的蛋白质为ArsR蛋白或CadC蛋白。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，分析物为重金属化合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，重金属化合物选自砷化合物、镉化合物和铅化合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，预先对五价的砷化合物进行还原处理，使其转变为三价的砷化合物。

12.如权利要求9～11中任一项所述的方法，其特征在于，在pH7.4的50mM以上的磷酸缓冲液中，进行传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸的反应。

13.如权利要求9～11中任一项所述的方法，其特征在于，在40mM以上的氯化钠溶液中，进行传感蛋白和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸的反应。

14.一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：与分析物特异性结合的传感蛋白，和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的、固定于支撑体上的核酸。

15.一种被测试样中的分析物的检测或定量用试剂盒，其特征在于，包括：固定于支撑体上的与分析物特异性结合的传感蛋白、和包含由该传感蛋白特异性识别的序列的核酸。

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