CN110951855B - 缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因序列的芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因序列的芯片及其试剂盒。具体公开了捕获芯片中对应的变异位点，本发明的芯片可以一次性全面捕获缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险相关基因，检测效率高，覆盖性好。

Description

缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因序列的 芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因序列的捕获文库及其构建方法。

背景技术

脑卒中是威胁人类健康的三大疾病之一,有很高的致残率、病死率和复发率,带来巨大的社会负担。最新的调查统计显示，我国目前约有700万脑卒中患者，约200万人/年新发，致死150万人/年，致残率高达75％以上，其中缺血性脑卒中超过80％，为中国成年居民第一死亡或致残原因。

美国食品和药物管理局(FDA)唯一批准用于急性缺血性卒中(acute ischemicstroke,AIS)治疗的药物是重组组织纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogenactivator,rtPA)，其治疗时间窗为在卒中症状出现后3至4.5小时。然而，美国国家神经病与卒中研究所(the National Institute of Neurological Disorders and Stroke,NINDS)研究表明rtPA治疗显著增加脑出血(intracranial hemorrhage,ICH)或出血转化(hemorrhagic transformation,HT)的发生率十倍以上。溶栓后症状性颅内出血(symptomatic intracranial hemorrhage,SICH)可加重神经功能障碍,增加病死率,这大大限制了溶栓治疗的临床应用，导致目前临床溶栓率在5％以下。目前，HT的发病机制尚不清楚，临床上急需合适的生物标志物来更好地预测HT的发生和严重程度。

再灌注早期血脑屏障(BBB)的破坏已被证明是溶栓治疗后导致HT的主要因素。血脑屏障由毛细血管内皮细胞的紧密连接、基底膜和胶质细胞足突组成。其中基底膜及间质内的细胞外基质对维持血脑屏障的完整性最为重要。脑缺血引起的内皮细胞变性坏死,溶栓后再灌注损伤以及二者继发的炎症反应和溶栓药物都能引起血脑屏障结构功能的改变。脑缺血再灌注后产生氧自由基并继发炎性因子及趋化因子释放,引起白细胞向内皮细胞移动和黏附,导致血管完整性破坏。RtPA引起再灌注微血管损伤通过产生活性氧(ROS),基质金属蛋白酶(MMPs),它们共同破坏神经血管单元，导致血脑屏障损伤。此外，rtPA可直接作用于内皮细胞、星形胶质细胞或中性粒细胞，激活PDGF-CC和MMP-2/3/9，从而破坏BBB功能。

目前临床上用于治疗和预防HT的方法还存在相当欠缺。降低ROS、抑制MMPs和调节影响血脑屏障通透性被作为研究的重点。然而，尽管许多化合物已被证明能降低动物体内的HT，但迄今为止还没有一种化合物被成功地转化到人类身上。研究表明，虽然早期抑制MMP-9可以降低动物的HT，但延迟或持续抑制MMP会加重脑损伤并恶化卒中结局。以ROS为靶点来降低HT,虽然初步研究显示有望降低动物体内的HT，但它未能降低卒中患者体内的HT。因此，临床上医生通过患者的临床因素来筛选是否进行溶栓治疗以尽可能减少HT的发生。许多临床因素与卒中患者的HT有关。脑卒中的严重程度和梗死面积是与HT关系最密切的因素之一。其他因素包括年龄增长、血糖升高、房颤、充血性心力衰竭、肾功能损害、抗血小板药物服用史、抗凝药物服用史等。然而，这些临床因素相对主观，并不能有效地减少HT的发生。因此，寻找新的方法来预测出血转化对缺血性脑卒中患者溶栓治疗相当有意义，甚至可以扩大溶栓治疗的时间窗，挽救更多患者的生命和提高他们的生存质量。

基于基因检测的精准医疗正在随着众多科学家的研究而逐步深入，许多单基因突变引起的疾病都已有研究。伴随基因测序技术的突飞猛进，基因检测正引领脑血管疾病进入精准治疗的时代。通过基因诊断，可在病人发病前做到早知道，早预防，尤其是脑血管疾病更需要基因检测的指导及辅助诊断。目前已经证明在胚胎发育和成年期，大脑内皮细胞中经典Wnt信号通路(Wnt/β-catenin通路)对血脑屏障的形成和维持至关重要。在动物模型中，包括Wnt配体Wnt7a/7b和Norrin、受体/共受体Fzd4、Lrp5/6、Gpr124、Reck、或效应蛋白Ctnnb1(β-catenin)在内的典型Wnt信号元件的遗传缺失导致BBB形成或完整性受损，并伴有中枢神经系统范围或局灶性脑出血。不过,Wnt信号通路在人类BBB破坏和HT缺血性中风后仍然是未知的。在目前的研究中，我们通过收集临床病人并检测血液样品确定与经典Wnt信号通路相关的血液基因序列变异与接受静脉溶栓的AIS患者发生HT的关系。

目前基因检测的方法有多种，如Sanger测序、基因分型、高通量测序、Array CGH。Sanger测序作为广泛应用的技术，具有快速、准确、简便等优点，但存在通量低、相对成本高、自动化程度低等问题，难以满足一次性检测多基因多变异的要求。基因分型有多种技术，大多具备快速、准确、低成本的优点，十分适合大规模检测已知变异，但只能检测到SNP等单核苷酸的已知变异。Array CGH是检测拷贝数变异(CNV)的金标准，但不能同时检测SNP、Indel变异。随着测序技术的发展，高通量测序技术的成本、周期和性能都有了极大的改进，全外显子组、全基因组测序已经成了科研发现的常规方法，可同时检测基因组上所有类型的变异，但针对性不强，且数据量大，各项成本比较高。临床应用通常追求快速、经济、简便，选取一组有效基因集合进行高通量测序以降低成本，分析基因的变异和多态性，可成为一种可用于检测脑卒中患者溶栓治疗后预测出血转化的有效方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明一个方面提供了一种缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因捕获探针，其特征在于，所述探针的基因组合包括4个热点基因(表1中序号1-4)及126个热点SNP位点。

本发明一个方面提供了一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针能够特异性识别表1所示基因位点或SNP位点。

本发明另一个方面提供了一种缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估相关基因的捕获文库的构建方法，其特征在于：

1)筛选出4个热点基因(表1中序号1-4)及126个热点SNP位点，其中热点基因以及SNP位点的基因名称和染色体位置如表1所示；

2)设计扩增表1基因的引物序列，并对片段化的待测基因进行PCR扩增；

3)扩增产物与目标区域捕获芯片进行杂交，扩增、纯化后得到目标DNA测序文库。

在本发明的技术方案中，片段化的待测基因为300-400bp的待检测基因片段。

在本发明的技术方案中，其中，步骤2)PCR扩增方法为DNA片段进行纯化、末端修复、加接头并进行PCR扩增。

本发明另一个方面提供了一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针能够特异性识别下表所示SNP位点，

本发明另一个方面提供了一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针能够特异性识别下表所示SNP位点，

本发明另一个方面提供了一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针能够特异性识别下表所示SNP位点，

本发明另一个方面提供了一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的试剂盒，其包括本发明所述的芯片。

在本发明的技术方案中，所述试剂盒中还包括芯片中对应SNP位点的扩增引物。

本发明另一个方面提供了本发明的芯片或试剂盒在检测缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险相关基因中的用途，

本发明再一个方面提供了一种检测缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险基因的方法，所述方法不以诊断为目的，包括：

1)破碎待检测核酸，获得150-200bp的待检测的核酸片段；

2)采用本发明所述的芯片，或者本发明的试剂盒捕获相关基因区域；

3)对步骤2)捕获的相关基因区域进行测定，获得序列信息；

4)基于所述序列信息检测缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险基因相关基因。

在本发明的技术方案中，其中，4)包括基于所述序列信息同时检测所述相关基因的SNP位点变异。

在本发明的技术方案中，所述的方法可以是非诊断和治疗目的的。

有益效果

本发明的芯片可以一次性全面捕获缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险相关基因，检测效率高，覆盖性好。

附图说明

图1为检测流程示意图。

图2为接头序列结构示意图。

图3为不同基因检测结果的脑梗死出血性转化(hemorrhagic transformation,HT)、出血性梗死(hemorrhage infarct,HI)以及脑实质出血(parenchymal hematoma,PH)的病例数。

具体实施方式

实施例1基因筛选

选取特异有效基因集合对疾病易感基因筛查非常关键，漏选会降低检测敏感度，多选则会增加成本和操作难度。

基于上述情况，本专利发明通过查询大量疾病数据库和文献研究中关于Wnt信号通路所有相关基因单核苷酸多态性、序列变异等的研究记录，包括OMIM、ClinVar、CGD、Orphanet、DISEASE、GeneReviews、GWAS database，选取、汇总所有已报道与某些人类疾病或特征有关联的基因/变异(不包含已报道的、与缺血性脑卒中病人溶栓治疗出血转化相关的基因或变异)，这些证据包括基因、蛋白功能研究、家系遗传性研究、人群变异分析等。最终选取了4个包含通路高度关联的热点基因(表1中序号1-4)及相关的126个热点SNP位点(表1中序号5-130)，基因列表见表1。

表1.检测基因及位点列表.

实施例2、panel设计及探针合成

根据上述筛选出的目的基因总计4个基因及126个SNP位点，进行panel设计。设计区域为4个基因外显子区(并允许外显子区两侧各延伸15bp)及126个SNP位点。

探针设计使用艾吉泰康提供的设计网站，依据上述要求提交设计。将设计得到的探针进行比对分析，针对覆盖度低的基因增加探针覆盖度，使得覆盖度达到99.9％以上。

最终调整完成的探针总计28.4K，覆盖度99.97％，设计完成的最终探针包交于艾吉泰康进行合成，合成的探针待捕获使用。

实施例3、预文库构建

(一)样本制备

步骤1.DNA破碎

1.gDNA质检，保证DNA质量合格(无降解；A260/A280在1.8-2.0之间)。用Qubit检测样本gDNA的浓度。

2.设置covaris：

a)在covaris水缸中加入去离子水，水位达到刻度“12”；

b)检查水位是否能没过管子的玻璃部分；

c)将冷却温度设为2-5℃，冷却至5℃；

d)可选。加入乙二醇(ethylene glycol)至总体积的20％，防止结冰。

e)按下控制板上的“Degas”按钮。使用之前Degas至少30min。

3.在1.5ml EP管中，用1X Low TE缓冲液将3ug gDNA稀释到130ul。

4.将Covaris microTube装到covaris上。

5.用锥形枪头小心地吸取130ul DNA样本，加入到Covaris microTube管中。(小心操作，不要使管子底部出现气泡)

6.按照下表设置Covaris参数，进行DNA破碎。破碎产物的主峰在150-200bp。

7.用锥形枪头小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5ml EP管中。

步骤2.Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.让AMPure XP磁珠在室温放置至少30min。

2.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

3.在1.5ml新管中加入180ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和破碎的DNA文库(～130ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

4.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

5.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

6.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。

7.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

8.重复步骤6、7一次。

9.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

注：不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。

10.加入50ul无核酸酶水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

11.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

12.吸取大约50ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

步骤3.末端修复

在冰上配制反应液。

在PCR管(或排管、PCR板)里按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

末端修复反应液配方

在PCR仪上，20℃温浴30min，不要热盖。

步骤4.Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

2.在1.5ml新管中加入180ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和经过末端修复的DNA(～100ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

3.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

5.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。

6.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

7.重复步骤6、7一次。

8.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

9.加入32ul无核酸酶水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

10.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

11.吸取大约32ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

步骤5.DNA片段末端加A

在冰上配制反应液，在PCR管(或排管、PCR板)里按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

末端加A反应液配方

试剂	单位ul
		DNA样品	30
无核酸酶水	11
		10X Klenow聚合酶缓冲液	5ul
dATP	1ul
		Exo(-)Klenow	3ul
总体积	50ul

在PCR仪上，37℃温浴30min。如果使用热盖，确保热盖温度不超过50℃。

步骤6.Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.让AMPure XP磁珠在室温放置至少30min。

2.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

3.在1.5ml新管中加入90ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和末端加了A的DNA(～50ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

4.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

5.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

6.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。

7.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

8.重复步骤6、7一次。

9.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

注：不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。

10.加入15ul无核酸酶水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

11.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

12.吸取大约15ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

步骤7.连接标签化接头(adaptor)

1.在PCR管(或排管、PCR板)里按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

末端加接头(adaptor)反应液配方

试剂	单位ul
		DNA样品	13
无核酸酶水	15.5
		5X T4 DNA连接酶缓冲液	10
标签化接头(adaptor)	10
		T4 DNA连接酶	1.5
总体积	50ul

在PCR仪上，20℃温浴15min。不要使用热盖。

步骤8.用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.让AMPure XP磁珠在室温放置至少30min。

2.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

3.在1.5ml新管中加入90ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和末端加了A的DNA(～50ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

4.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

5.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

6.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。7.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

8.重复步骤6、7一次。

9.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

注：不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。

10.加入32ul无核酸水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

11.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

12.吸取大约32ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

如果不进行后续步骤，将样本保存在-20℃冰箱。

步骤9.PCR富集

在PCR管(或排管、PCR板)里按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

PCR mix配方

放入PCR仪，按下表设置程序进行反应。

注：因为DNA质量不同，不同文库的扩增结果可能会稍有不同。在大多数情况下，5个循环能得到适量的DNA产物用于后续捕获，不会发生扩增的偏好以及产生非特异的扩增产物。如果扩增产物量太低、或者出现大分子量产物，基于剩余的模板量适当调整循环数。

步骤10.用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.让AMPure XP磁珠在室温放置至少30min。

2.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

3.在1.5ml新管中加入90ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和末端加了A的DNA(～50ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

4.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

5.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

6.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。

7.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

8.重复步骤6、7一次。

9.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

注：不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。

10.加入30ul无核酸酶水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

11.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

12.吸取大约30ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

如果不进行后续步骤，将样本保存在-20℃冰箱。

(二)杂交

本部分包含了如下步骤：将制备好的文库与杂交试剂、封闭试剂(blockingagent)及index block和SureSelect捕获探针文库进行混合反应。每个DNA文库必须单独地进行杂交和捕获，然后再通过PCR反应引入index。

步骤1.文库杂交

1.如果文库的浓度小于221ng/ul，用真空抽干机进行浓缩，温度≤45℃。

a)将全部30ul DNA文库吸到一个新的EP管中，用细针在盖子上戳几个洞。也可以将盖子剪掉，裹上封口膜，在膜上扎几个孔。

b)完全地冷冻干燥。用真空抽干机在低热条件下(≤45℃)进行抽干。

c)重新加入无核酸酶水，是终浓度达到221ng/ul(或更高)。沿管壁上下吹吸冲洗，以获得最高的回收量。

d)振荡器充分混匀，离心1min。

2.在室温下按照如下配方配制杂交缓冲液。

杂交缓冲液配方

试剂	单位ul
		SureSelect Hyb#1	25
SureSelect Hyb#2	1
		SureSelect Hyb#3	10
SureSelect Hyb#4	13
		总体积	49(只需40)

3.如果出现沉淀，65℃温浴杂交缓冲液5min。

4.在PCR板上制备用于目标捕获的SureSelect捕获库组合物(Capture librarymix)：

a)保持管子放置在冰上，直到Step 10。

b)参照下表用无核酸酶水稀释SureSelect核糖核酸酶抑制剂(RNase Blockpurple cap)。配制足够所有样本反应的稀释液，要留有富余量。

c)参照下表加入SureSelect核糖核酸酶抑制剂稀释液，用枪吹吸混匀。

SureSelect捕获库组合物配方

5.按下表配方配制样本反应的SureSelect Block Mix。

SureSelect Block Mix配方

试剂	单位ul
		SureSelect Indexing Block#1	2.0
SureSelect Block#2	2.5
		SureSelect Indexing Block#3	0.6
Index block	0.5
		总体积	5.6

6.在另一个PCR板上，处理制备好的文库，以用于目标捕获。

7.65℃温浴的过程中，用105℃热盖。

8.保持PCR板在65℃的条件下，在每个孔中加入40ul杂交缓冲液，

9.加入步骤5配制的捕获库组合物到PCR上，加入7ul捕获库组合物。，保持PCR板在65℃的条件下，吸取13ul杂交缓冲液，加入到的捕获库组合物中。

10.保持PCR板在65℃的条件下，吸取全部的文库混合液，加入到杂交溶液中，上下吹吸8-10次，充分混匀。此时杂交混合液的体积大概是27-29ul，取决于前步温浴时蒸发造成的体积损失大小。

11.用排盖或双层粘膜(double adhesive film)封口，确保所有孔封口严实。

注：使用新的排盖或封口膜，使用过的在加热过程中其完整性会下降。如果使用排管，在第一次使用之前要通过预实验检查蒸发的情况，确保蒸发的体积不要超过3-4ul。

12.杂交混合液在65℃温浴24h，用105℃热盖。

步骤2.准备磁珠

1.在水浴锅或加热块上65℃预热SureSelect Wash 2，在Step 3使用。

2.磁珠在保存的时候会沉降，振荡器剧烈震荡，让Dyna磁珠s MyOneStreptavidin T1重新悬浮。

3.对每个杂交反应，取50ul Dyna磁珠s MyOne Streptavidin T1到1.5ml离心管中。

4.冲洗磁珠：

a)加入200ul SureSelect Binding缓冲液，振荡器震荡5s。

b)将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清。

c)重复步骤a-b两遍，总共冲洗3次。

5.用200ul SureSelect Binding缓冲液重新悬浮磁珠

步骤3.捕获和洗脱

1.经过24小时的温浴之后，估计(用枪估计)并记录剩余的杂交混合液的体积。

2.保持PCR板在65℃的条件下，将杂交混合液直接加到磁珠溶液里，颠倒混匀3-5次。

注：如果在温浴杂交24h之后，发生过度的蒸发，剩下的体积不到20ul，将会影响后续的捕获效果。

3.将混合液放在nutator(摇摆机)上，室温混匀30min。

4.简短离心。

5.把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

6.加入500ul SureSelect Wash 1，振荡器5s让磁珠重新悬浮。

7.室温放置15min，其间用振荡器混匀几次。

8.简短离心。

9.把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

10.冲洗磁珠

a)加入500ul经过65℃预热的SureSelect Wash 2，振荡器5s让磁珠重新悬浮。

b)在水浴锅或加热块上65℃温浴10min，其间用振荡器混匀几次。

c)如果磁珠已经沉降，颠倒几下让其悬浮。

d)简短离心。

e)把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。

f)重复步骤a-e两遍，总共冲洗3次。确保所有的wash缓冲液被吸除。

g)加入30ul无核酸酶水，振荡器5s让磁珠重新悬浮。

(三)杂交后PCR扩增

步骤1.POST-PCR1.在PCR管(或排管、PCR板)里按下表配方配制反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。

2.按下表配方配制反应液mix，振荡器混匀。

a)在每个PCR管(或孔)中加入35ul反应液mix。

Herculase II Master Mix配方

试剂	1rxn
		Captured on-磁珠DNA	14
无核酸酶水	22.5
		5×Herculase II Rxn缓冲液	10
100mM dNTP组合物	0.5
		Herculase II Fusion DNA聚合酶	1
P5/P7	1
		PCR引物Index 1 through Index 16	1
总体积	50

3.将管子放入PCR仪进行扩增，参数设置如下表：

步骤2.Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本

1.让AMPure XP磁珠在室温放置至少30min。

2.充分混匀AMPure XP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。

3.在1.5ml新管中加入90ul混匀的AMPure XP磁珠悬浮液和扩增后的DNA文库(～50ul)。振荡器混匀，室温放置5min。

4.将管子放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清。

5.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。

6.在磁力架上，在每个管中分加500ul 70％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。

7.静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。

8.重复步骤6、7一次。

9.在加热块上37℃加热5min，或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。

注：不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。

10.加入30ul无核酸酶水，在振荡器上混匀，室温放置2min。

11.将管子放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清。

12.吸取大约30ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。

实施例4测序分析

一、上机测序

将上述所得产物使用Aligent 2100及QPCR进行文库检测。

文库2100片段结果在250bp-350bp之间即为合格，qpcr结果大于10nM即为合格。

将合格的文库使用Hiseq X ten PE150进行测序，上机数据量为400Mb。

二、数据分析

测序数据下机后，对下机数据进行生物信息学分析，检测基因上的变异。检测过程中要求测序数据量达到0.6Gb以上，测序深度达到500X，覆盖度高于99.9％.

具体来说：

1.下机数据(Fastq格式)质量控制：对每个样本文库和lane产生的每对原始Fastq序列(raw reads)，使用软件cutAdapt去除测序接头和包含大量‘N’碱基的序列(reads)，得到满足质控的序列(Clean reads)使用软件fastqc统计reads基本信息，包括序列和碱基数量、GC含量和分布、测序错误率和分布、碱基质量分布。

2.比对(Alignment)：使用软件bwa，把Clean reads与人类参考基因组GRCh38比对，得到reads在参考基因组上的比对信息文件BAM。

3.比对文件(BAM)预处理：包括使用picard、GATK软件把同一样本不同文库、lane产生的BAM文件合并一起，按照基因组坐标排序，验证BAM文件，去除PCR过程中产生的重复序列，校正碱基质量值，得到预处理后的比对文件(Clean BAM)。使用picard软件统计CleanBAM，得到质控信息：对目标区域捕获芯片的覆盖度、深度、捕获效率、均一性，可比对序列和碱基的数量，插入片段的长度分布等。

4.变异检测：使用GATK软件检测基因上的小片段变异，包括单核苷酸多态性(SNP)和插入、缺失(Indel)；对检测变异进行过滤，SNP过滤条件为“QD<3.37||FS>31.397||SOR>10.419||MQ<20.0||MQRankSum<-12.49||ReadPosRankSum<-3.721”，Indel过滤条件为“QD<5.2||FS>52.254||SOR>9.044||ReadPosRankSum<-5.504”；对满足过滤条件的变异进行注释，标注出对应的基因、转录本、变异类型、功能、在正常人群中的频率等；统计变异结果，得到变异数量、长度分布、各类型变异数量、人群的比例等。

5.关联分析：使用GATK合并所有样本的GVCF文件，经过变异检测的过滤条件得到合格的变异集合。PLINK1.9对这些变异数据进一步质控,过滤条件为”--biallelic-only--geno 0.2--hwe 0.0001”。将所有样本分为HT cases(出血转化组，包括hemorrhagicinfarction(HI)和parenchymal hematoma(PH)两种亚型)组和non-HT controls(无出血转化组)，使用PLINK1.9中的fisher模式进行case和control关联分析。得到的关联分析结果中OR>1.2和p<0.05的位点为候选结果。筛选到的SNP位点如下表所示：

通过病例对比结果还显示，在发生严重出血转化的病人中，具有GPR124 SNPrs7533600突变的病人比例比在未发生出血转化的病人中的比例明显升高(图3A)。在发生严重出血转化的病人中，具有>4个拷贝WNT7A SNP rs2163910和rs1124480,WNT7B SNPrs67604162,GPR124 SNP rs75336000(2个拷贝/SNP，一共8个拷贝)的病人比例比在未发生出血转化的病人中的比例明显升高(图3B)。这些结果表明，单独利用GPR124 SNPrs7533600或者组合使用WNT7A SNP rs2163910和rs1124480,WNT7B SNP rs67604162,GPR124 SNP rs75336000均可以用于预测脑卒中病人溶栓后发生出血转化的风险。

Claims (5)

1.一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针为特异性识别下表所示SNP位点的组合物，

2.一种用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的试剂盒，其包括权利要求1中的芯片。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，还包括芯片中对应SNP位点的扩增引物。

4.根据权利要求1所述的芯片或者权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险相关基因的试剂的用途。

5.用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片或者包含所述用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片的试剂盒在制备检测缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险相关基因的试剂的用途；

所述用于缺血性脑卒中溶栓治疗后出血转化风险评估的芯片，其包括探针，所述探针为特异性识别下表所示SNP位点，

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