CN110938565B - 一种蜡样芽胞杆菌及其用于稀土离子回收的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蜡样芽胞杆菌,其菌株命名为Bacillus cereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60778。本发明属于生物环保技术领域,本发明提供的蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019对17种稀土离子的去除和回收效果均较理想,对外部环境具有极强的抵抗力,去除率高达80.3%~93.8%,可广泛用于稀土离子的回收和稀土离子污染的修复,利于资源的回收再利用,减少了废液排放和环境污染。

Description

一种蜡样芽胞杆菌及其用于稀土离子回收的方法
技术领域
本发明属于生物环保技术领域,尤其涉及一种蜡样芽胞杆菌及其用于稀土离子回收的方法。
背景技术
稀土金属是元素周期表ⅢB族中钪、钇、镧系等17种金属的总称,具有很强的活性和生物效应,在国防工业、航空、新材料等行业得到广泛的应用。江西赣州的离子型重稀土占中国离子型稀土矿的30%以上,在稀土行业内有着举足轻重的影响力,获得“稀土王国”的美誉。由于前期赣州离子型稀土矿的大量开采,不仅造成离子型稀土资源不断衰竭,而且造成了中重稀土价格不断攀升。稀土,特别是重稀土,作为重要的战略资源和不可再生资源,因此提高稀土的循环利用的技术问题迫在眉睫,而稀土提取回收技术是最关键的环节之一。
已有大量文献报道稀土相关物理和化学回收技术,例如,CN 108285979 A、CN107699715 A分别采用放电后的碳纳米管、非皂化的有机萃取剂萃取进行稀土的回收和富集。这类技术的工艺流程较为复杂,产业化可操作性不强,不仅损失较多稀土资源,而且由于使用大量电能及有机萃取剂等化学物质,导致能耗较高、废液排放和环境污染、回收率不够理想等问题。
微生物由于其特殊的结构特点,通过其细胞表面的官能团可对稀土离子进行吸附作用,其中报道最多的为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。例如,文献(Application ofFreeze-Dried Powders of Genetically Engineered Microbial Strains asAdsorbents for Rare Earth Metal Ions.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,26524-26531)报道了Bacillus subtilis具有吸附稀土离子的能力。芽孢杆菌(Bacillus)对外在环境具有较好的适应能力,广泛存在于土壤等环境中,对部分稀土离子具有较强的吸附性。中国专利申请CN109402390 A公开了一种利用枯草芽孢杆菌芽孢回收稀土离子的方法,利用枯草芽孢杆菌在营养条件不良时形成的芽孢对铽、镝稀土离子具有较强的特异吸附性,从而使稀土离子与溶液/废液中的其他金属离子分离,吸附后于中性条件下加入过量2,6-吡啶二羧酸可实现洗脱,进而实现了芽孢的洗脱和稀土离子的回收,但对钇等稀土离子的去除率和回收率不高。
与枯草芽孢杆菌相比,蜡样芽胞杆菌鲜有用于稀土离子回收的报道,现有技术也缺乏对各种稀土离子具有较强吸附能力的新菌种。因此,提供一种蜡样芽胞杆菌新菌株,并将其用于稀土离子回收具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本发明从离子型稀土矿山土壤筛选出一种新的蜡样芽胞杆菌菌株,丰富了现有技术,其菌株命名为Bacillus cereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),保藏编号为GDMCC No:60778,保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,保藏时间为2019年9月16日。本发明提供的蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus DW019对外部环境具有极强的抵抗力,可广泛用于稀土离子的回收以及稀土离子污染的修复,无需使用昂贵的专业设备,操作较简便,对17种稀土离子的去除和回收效果均较理想,在0℃~45℃、pH4.0~7.4范围内的稀土离子去除率高达80.3%~93.8%,其中对Sc、Yb等的去除率高达90%以上,以初始离子浓度计,对17种稀土离子的回收率高达72.4%~86.2%,利于资源的回收再利用,适用范围广,减少了废液排放和环境污染。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种蜡样芽胞杆菌,其菌株命名为Bacillus cereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60778。
优选地,本发明提供的蜡样芽胞杆菌,其分离鉴定方法包括如下步骤:
1)土壤样品的采集:从稀土矿山采集土壤样品,置于0~5℃的冰盒中,备用;
2)芽孢杆菌菌株的分离:将土壤样品9~11g加入带有玻璃珠并装有89~91mL无菌水的三角瓶中,放入摇床培养6~12min,静置,取上清液0.8~1.2mL于容器中,置于80~90℃水浴8~12min,然后冰浴12~18min,吸取100μL的菌液按梯度10-1~10-5分别稀释涂布到含有浓度为900~1200mg/L铥离子的LB固体培养基上,放入35~38℃恒温培养箱过夜培养,挑取单菌落于LB固体培养基上划线纯化3次,得到芽孢杆菌单菌落;可将得到的芽孢杆菌单菌落分别编号并用质量浓度为30%的甘油无菌溶液于-72~-80℃保存备用;
3)芽孢杆菌菌株的筛选:将步骤2)分离得到的芽孢杆菌单菌落转接到含有铽离子浓度分别为300、600、900和1200mg/L的LB固体培养基中,观察菌株对稀土离子的耐受性,筛选得到耐高浓度稀土离子的蜡样芽胞杆菌;
4)芽孢杆菌菌株的鉴定:将步骤3)将筛选到的耐稀土离子的蜡样芽胞杆菌用LB液体培养基,培养至对数生长期,离心收集菌体,并提取菌体基因组DNA,采用通用引物扩增菌体基因组DNA中16S rRNA基因片段;产物测序后,将所测序列输入到NCBI上进行对比,利用MEGA5.1构建系统发育树,确定菌株为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019。
本发明先用含有浓度为900~1200mg/L铥离子的LB培养基用于初筛,再用含不同浓度铽离子的LB培养基进一步筛选,铥离子和铽离子作为重稀土的代表,经检测,这两种稀土离子筛选得到的蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019,在0℃~45℃、pH4.0~7.4范围内对17种稀土离子都具有较强的吸附和回收能力。
优选地,所述通用引物包括正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:1)、反向引物ACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:2)。
优选地,所述摇床培养的条件为:35~38℃、120~250rpm。
优选地,所述LB液体培养基的制备方法包括如下步骤:向950mL水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0并定容至1L,高压灭菌,即得。
优选地,所述稀土矿山为离子型稀土矿山。
此外,本发明还提供蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019用于稀土离子回收的方法,包括如下步骤:将蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019接入LB液体培养基,过夜培养,离心收集细胞菌体;将细胞菌体与pH4.5~7.4的含有稀土离子的溶液孵育,离心,得到负载稀土离子的细胞菌体;将负载稀土离子的细胞菌体经乙二胺四乙酸溶液洗脱5~10次后,离心所得的上清液即包含回收的稀土离子,而离心所得的沉淀即为细胞菌体;乙二胺四乙酸溶液的浓度优选0.25mol/L;离心后的细菌菌体水洗3-5次后可重复利用。
优选地,所述稀土离子包括钪离子、钇离子、镧离子、铈离子、镨离子、钕离子、钷离子、钐离子、铕离子、钆离子、铽离子、镝离子、钬离子、铒离子、铥离子、镱离子、镥离子。
优选地,所述过夜培养的温度为35~38℃;所述孵育的温度为22~28℃,时间为2~30min;所述离心的速度为12000~15000rmp,时间为10~35min。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:
(1)本发明从离子型稀土矿山土壤筛选出一种新的蜡样芽胞杆菌菌株,丰富了现有技术,其菌株命名为Bacillus cereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),保藏编号为GDMCC No:60778。本发明提供的蜡样芽胞杆菌Bacillus cereusDW019对外部环境具有极强的抵抗力,可广泛用于稀土离子的回收以及稀土离子污染的修复。
(2)本发明还提供了该菌株用于稀土离子回收的方法,无需使用昂贵的专业设备,操作较简便,对17种稀土离子的去除和回收效果均较理想,适用范围广,在0℃~45℃、pH4.0~7.4范围内的稀土离子去除率高达80.3%~93.8%,其中对Sc、Yb等的去除率高达90%以上,以初始离子浓度计,对17种稀土离子的回收率高达72.4%~86.2%,利于资源的回收再利用,减少了废液排放和环境污染。
附图说明
图1蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus DW019菌株耐受铽离子的生长曲线图。
图2基于16S rRNA基因序列分析的系统发育树。
图3蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus DW019菌株对17种稀土离子的去除结果图。
本发明提供的蜡样芽胞杆菌,其菌株名称为Bacillus cereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),保藏编号为GDMCC No:60778,保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,保藏时间为2019年9月16日。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一 Bacillus cereus DW019菌种的分离鉴定
一、菌株的分离
本发明提供的稀土离子吸附菌株Bacillus cereus DW019,分离自江西赣州离子型稀土矿区土壤。菌株的分离步骤具体包括:1)土壤样品的采集:从稀土矿山采集土壤样品,置于2℃的冰盒中,备用;2)芽孢杆菌菌株的分离:将土壤样品10g加入带有玻璃珠并装有90mL无菌水的三角瓶中,放入摇床培养10min,摇床培养的条件为:37℃、150rpm,静置10min,取上清液1mL于EP管中,置于85℃水浴10min,然后冰浴15min,吸取100μL的菌液按梯度10-1~10-5分别稀释涂布到含有浓度为1000mg/L铥离子的LB固体培养基上,放入37℃恒温培养箱过夜培养,挑取单菌落于LB固体培养基上划线纯化3次,得到芽孢杆菌单菌落;3)芽孢杆菌菌株的筛选:将步骤2)分离得到的芽孢杆菌单菌落转接到含有铽离子浓度分别为300、600、900、1200mg/L等浓度的LB固体培养基中,观察菌株对稀土离子的耐受性,筛选得到耐高浓度稀土离子的蜡样芽胞杆菌。
二、菌株的鉴定
将上述筛选得到的耐稀土离子的蜡样芽胞杆菌用LB液体培养基,培养至对数生长期,离心收集菌体,并提取菌体基因组DNA,采用通用引物扩增菌体基因组DNA中16S rRNA基因片段;产物测序后,将所测序列输入到NCBI上进行对比,利用MEGA5.1构建系统发育树如图2所示,确定菌株为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019。
菌落形态特征:白色似蜡烛色、圆形,个头较大,表面稍有光泽,易于挑起、粗糙,扁平,不规则。
显微形态特征:菌体为杆状。
稀土离子耐受性鉴定:Bacillus cereus DW019耐稀土铽离子的生长曲线如图1所示,pH初始值为7.0,菌液OD600初始值为0.02。
分子鉴定结果:16S rDNA序列如下所示:
GAAATGGCGGCCTGCCTATACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCCTGTCGTGAGATG(SEQ ID NO:3)。
三、菌株的的保藏
通过以上鉴定结果,确认DW019属于Bacillus cereus菌种,将其命名为Bacilluscereus DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60778,经检测为存活状态。
实施例二 Bacillus cereus DW019菌种用于稀土离子回收的方法
蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019用于稀土离子回收的方法,包括如下步骤:将蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019接入LB液体培养基,37℃过夜培养,离心收集细胞菌体,离心的速度为13000rmp,时间为5min;将2mg细胞菌体与1L pH7.4的含有稀土离子的溶液孵育30min,17种稀土离子的初始浓度分别为2mg/L,离心,离心的速度为13000rmp,时间为5min,得到负载稀土离子的细胞菌体;离心后测定上清液中稀土离子浓度,计算:稀土离子的去除率%=(初始离子浓度-上清液离子浓度)/初始离子浓度×100%,结果如图3所示。负载稀土离子的细胞菌体经0.25mol/L乙二胺四乙酸溶液洗脱6次后,离心所得的上清液即包含回收的稀土离子,而离心所得的沉淀即为细胞菌体,经水洗4次后可重复利用。从图3可知,本发明提供的蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019对17种稀土离子的去除和回收效果均较理想,对稀土离子去除率高达80.3%~93.8%,其中对Sc、Yb等的去除率高达90%以上,对洗脱后的上清液进行检测,以初始离子浓度计,对17种稀土离子的回收率高达72.4%~86.2%。相比之下,同等条件下,使用枯草芽孢杆菌芽孢对稀土离子的去除率明显更低,对Sc、Yb、Tm的去除率分别为82.1%、84.7%、76.2%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西理工大学
<120> 一种蜡样芽胞杆菌及其用于稀土离子回收的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
acggctacct tgttacgact t 21
<210> 3
<211> 620
<212> DNA
<213> Bacillus cereus DW019
<400> 3
ataagctggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 60
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg 120
tggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg 180
ggagacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa atgcgtagag 240
atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtaactgaca ctgaggcgcg 300
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 360
ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgaagtta acgcattaag cactccgcct 420
ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 480
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga 540
aaaccctaga gatagggctt ctccttcggg agcagagtga caggtggtgc atggttgtcg 600
tcagctcctg tcgtgagatg 620

Claims (4)

1.一株蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),其特征在于:其菌株命名为DW019,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60778。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌用于稀土离子回收的方法,其特征在于:包括如下步骤:将蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus DW019接入LB液体培养基,过夜培养,离心收集细胞菌体;将细胞菌体与pH4.5~7.4的含有稀土离子的溶液孵育,离心,得到负载稀土离子的细胞菌体;将负载稀土离子的细胞菌体经乙二胺四乙酸溶液洗脱5~10次后,离心所得的上清液即包含回收的稀土离子,而离心所得的沉淀即为细胞菌体。
3.根据权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌用于稀土离子回收的方法,其特征在于:所述稀土离子包括钪离子、钇离子、镧离子、铈离子、镨离子、钕离子、钷离子、钐离子、铕离子、钆离子、铽离子、镝离子、钬离子、铒离子、铥离子、镱离子、镥离子。
4. 根据权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌用于稀土离子回收的方法,其特征在于:所述过夜培养的温度为35~38℃;所述孵育的温度为22~28℃,时间为10~35min;所述离心的速度为12000~15000 rpm,时间为2~10min。
CN201911239461.3A 2019-12-06 2019-12-06 一种蜡样芽胞杆菌及其用于稀土离子回收的方法 Active CN110938565B (zh)

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