CN110934131A

CN110934131A - 一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法

Info

Publication number: CN110934131A
Application number: CN201911184214.8A
Authority: CN
Inventors: 马大青; 赵海林; 安德鲁·乔治; 陈倩; 顾健腾; 甯交琳; 鲁开智
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-03-31
Also published as: US20200329698A1

Abstract

本发明专利涉及缺血再灌注后器官移植保存技术领域，公开了一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，用于通过在常规器官移植物保存液中加用右美托咪定和/或氙和/或氩发挥器官移植物的保护作用。在一个特定的实施方案中，本发明专利的作用在于减少氧化应激和抑制相关组织细胞坏死途径的激活。

Description

一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法

技术领域

本发明涉及缺血再灌注后器官移植保存技术领域，具体是一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法。

背景技术

器官移植是终末期脏器衰竭患者的最佳治疗方式，与其他器官替代治疗方式相比，器官移植能明显提高患者的预后和生活质量并能节约治疗成本。尽管器官移植存在明显优势，但由于包括肾脏在内的捐赠器官严重短缺，使这种优势无法获得最大收益[5]。因此，人们正在努力扩大潜在的捐赠者群体，包括使用“扩展标准”(EC)或“边缘供体”捐赠者，以及增加使用非心脏跳动捐赠者(NHBD)的器官。

最理想的供体，如活体供体，移植器官损伤最小。“边缘供体”，如心脏死亡后供体(DCD 供体)和脑死亡供体(DBD供体)，移植器官先由于一段时间的热缺血受到损伤。而当循环停止、组织缺氧时，器官会继续受到渐进性损伤。此外，脑死亡供体被认为是早期和晚期器官同种异体移植物功能障碍的重要危险因素。这种中枢损伤不仅引起儿茶酚胺的激增，导致周围组织血管收缩和缺血，还促进激素和炎症介质的释放，这些激素和炎症介质会直接影响器官功能导致移植后早期移植物损伤，相关的再灌注还可引起移植器官的非特异性炎症改变。而心跳骤停捐赠的移植器官如肾脏常会经历较长时间的热缺血，这表现为术后移植物功能障碍的发生率较高[3]，尤其是移植物功能延迟(DGF)>80％，原发性无功能(PNF)>9％。相比之下，在心脏跳动的捐献者中，移植物功能延迟的比例仅为23％。同样地，来自“边缘供体”和“扩展标准”供体的肾脏质量不佳，更容易遭受缺血损伤，而且在临床移植中，与“非边缘供体” 肾相比，“边缘供体”移植物功能延迟和原发性无功能的发生率都有所增加。因此，如何在临床上利用好“边缘供体”移植物，是目前面临的一个重大挑战。

心脏骤停供体和脑死亡供体器官经常经历长时间的热缺血，可能增加术后移植物功能障碍发生率[15]，特别是移植物功能延迟和原发性无功能。同样，与“非边缘供体”肾脏相比，来自“边缘供体”和“扩展标准”供体的肾脏质量已受损并且更容易发生缺血性损伤，这与移植物功能延迟和原发性无功能的发生率增加有关[11]。移植肾功能延迟本身需要继续透析，急性排斥反应和远期不良预后发生率随之上升[16]。同时，随着“边缘供体”使用的逐渐增加，缺血再灌注损伤对移植物功能延迟和患者长期预后的影响会同步增加。

改善供体肾(及其他器官)移植物局部缺血损伤的有效策略将有助于改善移植后的移植物功能，同时还能扩大“边缘供体器官池”。据报道，2007年英国约有6200名患者在等待肾源，如今这一数字已增加至9000名(http://www.uktransplant.org.uk/)。包括肺移植在内的器官是大多数终末期肺病患者的唯一确定性治疗方法，如慢性阻塞性肺病(COPD)，特发性肺纤维化和囊性纤维化。尽管手术治疗、围手术期护理和免疫抑制治疗等技术不断进步，但肺移植患者的预后仍然是所有实体器官移植中最差的，其中位生存率仅为5.8％。肺移植的长期成功受到继发于缺血再灌注损伤的原发性移植物功能障碍的显着限制。更为复杂的是，肺移植候补名单的新候选人数量每年增加67.7％，导致移植供需之间存在显着差异，且这种情况越来越严重[3]。

因此，供体器官是非常宝贵的资源，因此，任何能够减少移植失败的干预措施都将带来巨大的益处。如果本方案提出的治疗措施能预防缺血再灌注损伤(IRI)从而“拯救”边缘移植物，边缘移植物的存活和功能将因此得到提高。

缺血再灌注损伤(IRI)，定义为“先前存在缺血的组织经血液再灌注后发生的细胞损伤”[12]，是移植期间不可避免的事件。IRI是一个破坏性过程，可导致移植物功能延迟(DGF)并降低移植器官的长期存活率。先天免疫系统的高度复杂机制在IRI的病理生理学中起重要作用。组织缺血损伤引发急性肾小管坏死，从而导致围手术期急性肾衰竭(ARF)。在再灌注阶段，血流的恢复一方面可以修复组织，另一方面也通过血流释放聚集在缺血阶段坏死组织中的损伤相关模式分子(DAMPs)引起器官进一步损伤。一些配体结合模式识别受体，如Toll样受体(TLRs)，启动信号级联反应，包括核因子κB(NF-κB)激活，导致炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-6以及肾小管细胞促凋亡蛋白的转录和翻译。因此，IRI被认为是影响移植物远期存活的主要因素。

保存方法是影响移植物存活和移植后功能的主要因素。目前主要有两种器官保存方法： 1、静态冷藏(CS)和低温机械灌注(RM3灌注设备，

)。静态冷藏法是用保存液 (

BRISTOL MYERS

)冲洗切取后的器官，再置于冰盒中包装运输。这种将器官中的血液冲洗出来，代之以冷保存液的方法依赖于低温抑制细胞代谢从而延长器官体外存活时间。然而，这种保存方法是在器官质量较高的年轻供者时代发展起来的，随着近年来心脏骤停供者的比例逐渐增加，对“边缘供体”器官的依赖越来越大，使用静态冷藏法进行有效保存的局限性便逐渐暴露出来。目前，利用机械灌注优化肾移植物的研究已经进行了多年，并逐渐在世界范围内得到普及，特别是对于一些移植中心使用的“边缘供体”器官，低温机械灌注已作为一种标准的器官保存流程，可以使病人获得更好的转归。

虽然本发明中描述的一些研究集中于肾移植，但该方法的临床应用可以扩展到所有由于缺血再灌注损伤损害移植物功能的器官移植领域。在供体池已接近耗尽及对移植器官需求不断增加的背景下，新型疗法治疗移植器官缺血再灌注损伤的重要性日益明显。因此，目前急需新的治疗进展以预防一直器官缺血再灌注损伤和相关的原发性移植物功能障碍，从而改善移植术后患者预后。

发明内容

本发明意在提供一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，以解决现有技术中器官保存方法存在保存质量低下、保存时间短的问题。

为了达到上述目的，该发明指出一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，包括：用右美托咪定与选自下组的惰性气体组合处理来自哺乳动物供体器官或复合组织移植物：氙和/或氩以足够的浓度和持续时间刺激所述供体器官或复合组织移植物。

氙气

稀有气体氙气作为一种麻醉剂和放射学示踪剂已经在临床上使用超过了半个世纪。特别是自20世纪50年代以来，因其安全性显著，一直被用作麻醉剂。我们在一系列的临床前研究中证实，氙气对重要器官(如脑、肾)缺血再灌注损伤具有保护作用。首先，氙气对肾热缺血损伤有保护作用。采用大鼠肾移植模型，在同基因移植物、弱免疫异体移植物和强免疫异体移植物情况下，无论是在移植物移植前或移植后，应用氙气均可以防止早期移植物损伤，延长移植物存活时间。最为重要的是，在体外移植物(活体供体)保存实验中，氙气组的肾脏被保存在含有70％氙气和5％二氧化碳平衡氧气的冰冷SOLTRANTM保存液中24小时，对照组的肾脏保存在含有70％氮气和5％二氧化碳平衡氧气的SOLTRANTM保存液中24小时。结果显示，相比于对照组，氙气组肾组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和热休克蛋白-70(HSP-70) 的表达明显增加，肾脏的形态学结构保存良好。肾移植手术24小时后，氙气组的肾小管细胞死亡率明显降低，肾组织炎症反应和移植物功能延迟的发生率得到较大改善。术后第8天，氙气组肾组织中巨噬细胞浸润和纤维化程度低于对照组。但是，氙气对体外边缘移植物的影响还尚未评估。

氩气

稀有气体氩气的器官保护作用已经在体内和体外实验得到证实。我们近期实验结果表明，在缺血缺氧性脑损伤的大鼠模型中，70％氩气具有神经保护作用。另外，含氩气的保存液在保存活体供体肾移植物抵抗低温缺血损伤方面具有优越性，但是其保护机制及其在离体边缘移植物的效应尚未评估。

右美托咪定(DEX)

高选择性α2肾上腺能受体激动剂，具有镇静、镇痛的作用常用于手术中。此外，研究表明其还具有潜在的稳定血流动力学、抗炎、抗凋亡作用。新的研究表明右美托咪定对脑损伤有保护作用。随后，多项研究探讨了右美托咪定对肾的保护效应。我们的研究团队发现在热缺血再灌注损伤中，相较于对照组，给予右美托咪定治疗的小鼠其组织中磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)水平和下游效应分子磷酸化信号传导子及转录激活子1(p-STAT1)、信号传导子及转录激活子3(STAT3)表达明显降低。这项研究表明，右美托咪定可以抑制与凋亡相关的JAK/STAT信号通路。在肾缺血损伤模型中，右美托咪定预处理或后处理可通过激活蛋白激酶B(Akt)细胞信号通路保护肾细胞，改善肾小管结构与功能，同时改善长期肾功能并提高生存率。

本方明通过实现发现无论是氙气、氩气或右美托咪定的单独使用，还是氙气或氩气与右美托咪定的联合使用均能预防脑死亡或心脏骤停供体肾脏在移植前组织学和功能上的损伤。

进一步：器官选自且不仅限于任何适用于移植的器官：心脏、肺、肾、肝、肠、胰腺、脉管系统、角膜或皮肤。适合进行保存的器官包括且不仅限于任何适用于移植的器官类型，包括且不仅限于心脏，肺，肾，肝，肠，胰腺，脉管系统，角膜和皮肤等。虽然本文的方法主要适用于移植器官，但是相同或相似的保存和移植方法亦能够实施在复合组织移植物上。复合组织移植物是指由组织构成的复合移植物，包括且不仅限于能够移植到受体上的，来自于供体的皮肤，肌肉，肌腱，神经，骨和血管等。

进一步：将器官或复合组织移植物移植到哺乳动物受体中，哺乳动物受体是用右美托咪定和惰性气体组合处理后与供体不同的个体。

进一步：在移植到哺乳动物受体后，用右美托咪定和惰性气体组合进一步处理器官或复合组织移植物。

进一步：器官或复合组织移植物是边缘供体器官，其选自：心脏死亡(DCD)捐赠的器官或复合组织移植物和脑死亡后(DBD)捐赠的器官或复合组织移植物。

进一步：右美托咪定和惰性气体组合治疗器官或复合组织移植物的保存液来自并不仅限于UW溶液，Soltran溶液和Collins溶液。

进一步：其中用右美托咪定结合氙和氩处理哺乳动物器官或复合组织移植物。

进一步：用右美托咪定、氙、氩和氧的组合处理哺乳动物器官或复合组织移植物。

进一步：组合包含：0.05-0.2nM的右美托咪定，25-35％的氧，30-40％的氩和25-35％的氙。

进一步：组合还包含2-10％的二氧化碳(CO₂)。

进一步：哺乳动物器官或复合组织移植物在从供体移出后和移植到受体之前在离体保存阶段进行处理。

进一步：供体是边缘供体。

进一步：用足够浓度和持续时间的氙和氩处理来自哺乳动物供体器官或复合组织移植物。

进一步：将器官或复合组织移植物移植到哺乳动物受体上，哺乳动物受体在与氙和氩接触后是与器官供体不同的个体。

进一步：在移植到哺乳动物受体后，用氙和氩进一步处理器官或复合组织移植物。

进一步：从供体移除器官之后和移植到受体之前，在离体保存阶段使氙和氩与器官或复合组织移植物接触。

应用右美托咪定治疗方法可以应用在移植器官离体保存阶段和/或在受体接受供体器官之后和/或在供体移除器官之前。

应用于保存的合适器官包括并不仅限于来自活体供体的器官，DCD(心脏死亡后捐赠) 供体，DBD(脑死亡后捐赠)供体，EC(扩展标准)供体。

应用右美托咪定治疗方法可以应用于包括在离体保存阶段用商业市场上任何合适的或当前可用的保存溶液处理器官，包括UW溶液，soltran溶液和Collins溶液。在进一步的实施方案中，右美托咪定可以应用于静态冷藏和机器灌注方法。

器官移植的成功很大程度上取决于供体器官的质量，而供体器官的质量又取决于一系列因素，包括器官采集前的供体管理和移植器官保存的质量。随着“边缘供体”器官使用的增加，提高器官保存质量的新策略仍然是器官移植研究的重点，有利于提高移植物质量和存活时间。

附图说明

图1A是右美托咪定(Dex)和惰性气体治疗大鼠肾移植的模型灌注系统。

图1B显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷保存24小时后的苏木精和依红染色。

图1C显示了基于图1B苏木精和伊红染色的肾损伤评分统计图。

图2A显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色。

图2B显示了基于图2A的TUNEL阳性细胞统计图。

图2C显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL) 染色。

图2D显示了基于图2C的MLKL染色荧光强度统计图。

图3A显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的血红素氧合酶-1(HO-1)染色。

图3B显示了基于图3A的HO-1染色荧光强度统计图。

图3C显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的细胞核相关因子-2(Nrf-2)染色。

图3D显示了基于图3C的小时后的细胞核相关因子-2(Nrf-2)荧光强度统计图。

图4A显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的肌酐表达统计图。

图4B显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的尿素氮表达统计图。

图4C显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷雪雀24小时后的白细胞介素-1β(IL-1β)表达统计图。

图4D显示对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达统计图。

图4E显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色。

图4F显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的CD68+细胞染色。

图4G显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的MTS细胞增殖染色。

图4H显示了在基于图4E的对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色统计图。

图4I显示了在基于图4F的对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的CD68+巨噬细胞统计图。

图4J显示了在基于图4G的对照和右美托咪定(Dex)处理的“边缘供体”(即心脏死亡后捐赠供体和脑死亡捐赠供体)的大鼠移植肾组织冷缺血24小时后的MTS细胞增殖统计图。

图5A显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的苏木精和伊红染色。

图5B显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色。

图5C显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达统计图。

图5D显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的白细胞介素-1β(IL-1β)表达统计图。

图5E显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达统计图。

图5F显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后肺损伤评分统计图。

图5G显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色统计图。

图6A显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白1/高迁移率族蛋白B1(Rip1/HMGB1)荧光染色。

图6B显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白3/高迁移率族蛋白B1(Rip3/HMGB1)荧光染色。

图6C显示未经处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白3/Toll样受体-4(Rip3/TLR-4)荧光染色。

图6D显示了基于图6A的受体相互作用蛋白1(Rip1)荧光强度统计图。

图6E显示了基于图6B的受体相互作用蛋白3(Rip3)荧光强度统计图。

图6F显示了基于图6C的Toll样受体-4(TLR-4)荧光强度统计图。

图7A显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的苏木精和伊红染色。

图7B显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的肺损伤评分统计图。

图7C显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色和相应的TUNEL阳性细胞统计图。

图7D显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后高迁移率族蛋白B1/受体相互作用蛋白1(HMGB-1/Rip1)荧光染色。

图7E显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后高迁移率族蛋白B1/受体相互作用蛋白3(HMGB-1/Rip3)荧光染色。

图7F显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后Toll样受体-4/受体相互作用蛋白3(TLR-4/Rip3)荧光染色。

图7G显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白1(Rip1)荧光强度统计图。

图7H显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白3(Rip3)荧光强度统计图。

图7I显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后Toll样受体-4(TLR-4)荧光强度统计图。

图7J显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后高迁移率族蛋白B1(HMGB1)荧光强度统计图。

图7K显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达统计图。

图7L显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后白细胞介素-1β(IL-1β)表达统计图。

图8A显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后细胞核相关因子-2/醌过氧化物还原酶-1(Nrf-2/NQO-1)荧光染色。

图8B显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后细胞核相关因子-2/血清超氧化物歧化酶-1(Nrf-2/SOD-1)荧光染色。

图8C显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后细胞核相关因子-2(Nrf-2)荧光强度统计图。

图8D显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后醌过氧化物还原酶-1(NQO-1)荧光强度统计图。

图8E显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后血清超氧化物歧化酶-1(SOD-1)荧光强度统计图。

图8F显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后3-硝基酪氨酸/4-羟基壬醛(3-nitrotyrosine/4-hydroxynonenal)荧光染色图。

图8G显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)荧光强度统计图。

图8H显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后4-羟基壬醛(4-hydroxynonenal)荧光强度统计图。

图8I显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后谷胱甘肽(GSH)表达统计图。

图8J显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后氧化型谷胱甘肽(GSSG)表达统计图。

图8K显示对照和右美托咪定(Dex)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)表达统计图。

图9A显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后Toll样受体-4/受体相互作用蛋白3(TLR-4/Rip3)荧光染色。

图9B显示用右美托咪定(Dex)单独/联合阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后Toll样受体-4/受体相互作用蛋白3(TLR-4/Rip3) 荧光染色。

图9C显示联合应用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA)或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后受体相互作用蛋白3(Rip3)荧光强度统计图。

图9D显示联合应用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA)或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后Toll样受体-4(TLR-4)荧光强度统计图。

图9E显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后3-硝基酪氨酸/4-羟基壬醛(3-nitrotyrosine/4-hydroxynonenal)荧光染色。

图9F显示用右美托咪定(Dex)单独/联合阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后3-硝基酪氨酸/4-羟基壬醛 (3-nitrotyrosine/4-hydroxynonenal)荧光染色。

图9G显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后3- 硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)荧光强度统计图。

图9H显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后4- 羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal)荧光强度统计图。

图9I显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后苏木精和伊红染色。

图9J显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)表达的统计图。

图9K显示用右美托咪定(Dex)单独/联合细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA) 或阿替美唑(Atip)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肺组织冷缺血16小时后肺损伤评分的图。

图10A显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织的苏木精和伊红染色。

图10B显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织损伤评分图。

图10C显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色。

图10D显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织原位末端转移酶标记技术(TUNEL)统计图。

图11A显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织白细胞介素-1β(IL-1β)表达统计图。

图11B显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达统计图。

图11C显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)表达统计图。

图11D显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织肌酐表达统计图。

图11E显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织尿素氮表达统计图。

图12A显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织CD68+荧光染色。

图12B显示基于图12A的右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织CD68+巨噬细胞表达统计图。

图12C显示在显示用右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织MTS细胞增殖染色。

图12D显示了基于图12C的右美托咪定(Dex)单独/联合氮气(N2)或氙气(Xe)或氩气(Ar)处理的心脏死亡后捐赠供体(DCD)大鼠移植肾组织MTS细胞增殖统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

采用大鼠低温机器灌注模型，我们发现无论是氙气、氩气或右美托咪定的单独使用，还是氙气或氩气与右美托咪定的联合使用均能预防脑死亡或心脏骤停供体肾脏在移植前组织学和功能上的损伤。

通常氙气的成本高于氩成，因此氩气被认为是氙气的有效替代品。然而在灌注边缘供体移植物的机器中，即使不使用氙气回收/再循环技术进行体外灌注，每个移植器官的氙气使用量也不会不超过50升，成本约785美元。同时，氩气的成本仅为氙的10％。因此这项技术将只占肾移植总费用的一小部分。在欧洲，右美托咪定已被批准在临床上使用，用来补充氙气或氩气保存液是提高保存效果的一种低成本、高效率的方式。

右美托咪定的保护作用与它的安全性相辅相成。右美托咪定在临床上用做麻醉剂，具有激动α2肾上腺素能受体的特性，包括稳定血流动力学，心脏保护和轻度利尿作用，其安全性已得到充分证实。

综上所述，右美托咪定联合氙气和/或氩气治疗以减少器官移植在冷藏期间的损伤可能是一种理想的、经济有效的干预措施。如该发明所述，术语“边缘”是指包括在该发明中描述或没有描述的，合适的老年、患病、心脏死亡(DCD)后和/或脑死亡(DBD)后供体等。

以下所描述的化合物，剂量和治疗方案可单独使用或组合使用以保存器官。这些化合物、使用方法和它们的组合可以与任何合适的器官保存溶液一起使用，包括并不仅限于：UW溶液， SOLTRAN溶液和COLLINS溶液。

该发明中所述的方法可以在供体或受体的离体器官和/或体内使用。在体内使用时，无论是移植前的供体还是移植后的受体，都可以通过任何合适的方式给药，例如在供体/受体手术部位直接应用于器官，或口服给药等使用方法。该发明中所述的离体使用可与任何合适的保存溶液合用，包括并不仅限于：UW溶液，SOLTRAN溶液和COLLINS溶液。

该发明所述的用于保存器官的化合物优先选择组合使用，但也可以联合在短时间内，例如1-4小时内单独轮流给药。这里的术语“联合”包含上述两个方案。溶液中优选的化合物范围如下。右美托咪定优选使用0.05-0.2nM，更优选使用0.1nM。氧气优选使用约25 -35％，更优选使用约30％。当使用氧气时，一种或多种稀有气体可以以约55–75％，更优选65％的比例组合。当使用两种惰性气体时，其范围优选为35-45％氩(更优选40％) 和25-35％氙(更优选30％)。二氧化碳约2-10％(更优选5％)可与上述组合。

在某些实施方案中，器官处理组合药物可以处于气相，并可排除右美托咪定。例如，这种气体组合可用于眼角膜保存。该组合可以包括且不仅限于约25-35％氧，35–45％氩和25–35％氙。

例证

心死亡供体(DCD)与离体移植器官保存模型

近交成年路易斯大鼠(LEW,RT1)来源于英国哈兰，225-250g，健康雄性，清洁级，饲养于伦敦帝国理工学院切尔西·威斯敏斯特校区特定无菌、恒温恒湿环境中。所有动物进行的处理均符合1986年《联合王国动物(科学程序)法》。对于麻醉大鼠心脏死亡(DCD供体)模型，通过阴茎静脉注射含250U肝素的1mL生理盐水进行抗凝。肝素化5分钟后，通过腹中线切口行剖腹手术。开胸后经胸内心脏压迫诱导心脏骤停5分钟。在诱导心脏骤停后，用血管夹从心脏边缘夹闭主动脉。开胸伤口用0.9％生理盐水润湿的纱布覆盖。心脏骤停40分钟后，将供体大鼠的肺和肾取出。通过肺主动脉冲洗供体肺脏，并存储在UW溶液(对照)和含右美托咪定(0.1nM)的UW溶液中4℃16小时。

大鼠肾移植手术

实施大鼠肾移植手术。采用标准微血管技术将大鼠供体肾脏原位移植到受者体内。简述如下，仔细暴露供体左肾、腹主动脉和下腔静脉，提取出移植肾组织，冲洗后存储在4℃ 肝素化SOLTRANTM保存液中(英国巴克斯特，纽伯里，英国)。在指定缺血时间后，取下受者左肾，将供体肾的肾静脉与受体下腔静脉端吻合，供体肾主动脉通过侧端相连的方式吻合连接受体腹主动脉。尿道重建采用输尿管膀胱吻合术。手术总缺血时间限制在45分钟内，移植后立即切除对侧肾脏。

离体气体暴露

将气体(70％氙气或70％氮气，5％氮气与氧气混合)在无菌容器中以2L/分钟泵入SOLTRANTM保存液中20分钟。通过氙检测仪(型号439Xe，Air ProductsTM，英国布拉德福德)和DATEXTM监测仪(

英国布拉德福德)持续监测氙气和氧气的浓度。气体达到指定浓度后将移植肾放入容器中，密封容器。将移植肾置于气体饱和溶液中4℃ 保存24或48小时。

阿替美唑和细胞核相关因子-2小干扰RNA(Nrf-2siRNA)处理供体动物

将Nrf-2siRNA或乱序siRNA(阴性对照)

溶解于siRNA悬浮缓冲液中，使用前在不含核糖核酸酶(RNase)的磷酸盐缓冲液(PBS)中进一步稀释。大鼠麻醉后，通过尾静脉快速注射(30秒内)大鼠靶向Nrf-2siRNA(sc-37030，SANTA CRUZ

美国)或Nrf-2或乱序siRNA(200mg用10mL PBS稀释)，大鼠苏醒24小时后进行实验。大鼠给予阿替美唑(α2肾上腺素能受体拮抗剂，

路易斯，密苏里州，美国，250μg/kg，腹腔注射)10分钟后，提取移植物。

苏木精-伊红染色

4％多聚甲醛石蜡固定和包埋肺或肾组织。将标本切成5μm厚度切片并进行苏木精-伊红(HE)染色。每个切片的肺细胞形态(放大倍数x 20，10个区域)由对实验分组不知情的观察者使用OLYMPUSTM(沃特福德，美国)BX4显微镜观察评估。每个区域的得分由随机选择的10个区域的总分计算得出。对于肺切片，损伤分为0级：外观正常，损伤可忽略不计；1级：轻度中度间质充血和中性粒细胞白细胞浸润；2级：血管周围水肿形成，肺结构部分破坏和中度细胞浸润；3级：中度肺泡损伤和大量细胞浸润；4级：严重细胞浸润和肺组织结构严重破坏。

对于肾脏标本，每个苏木精-伊红(HE)染色切片(每个肾切10个切片)分析10个皮质小管，计算平均得分：0，无损伤；1，轻度损伤：圆形上皮细胞和扩张的管腔；2，中度损伤：扁平上皮细胞，核染色丧失和高度扩张的管腔；3，严重损伤：破坏的小管，上皮细胞无核染色；4，肾结构完全丧失。

免疫染色

对于在体荧光染色或二氨基联苯胺(DAB)染色，制备移植肺组织25μm厚的新鲜冰冻切片，孵育下述一抗：兔抗-受体相互作用蛋白1(Rabbit anti-Rip1)(1:200，SANTACRUZ

)，兔抗-受体相互作用蛋白3(Rabbit anti-Rip3)(1:200，SANTACRUZ

)，鼠抗-高迁移率族蛋白B1(mouse anti-HMGB1)(1:200，Abcam)，羊抗-Toll 样受体-4(Goat anti-TLR-4)(1:200，SANTA CRUZ

)，兔抗-细胞核相关因子-2(rabbit anti-Nrf-2)(1:200，SANTA CRUZ

)，鼠抗-超氧化物歧化酶-1(mouse anti-SOD-1)(1:200，Abcam)，鼠抗-人醌过氧化物还原酶-1(mouseanti-NQO-1) (1:200，Abcam)，兔抗-3-硝基酪氨酸(rabbit anti-3-nitrotyrosine)(1:200，Abcam) 和兔抗-4-羟基壬醛(rabbit anti-4-hydroxynonenal)(1:200，Abcam)4℃过夜。含吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗后，孵育以相应二抗(MILLIPORETM，英国)。对于双染的免疫荧光，肺组织样本孵育第一种一抗过夜，继之以相应的第二种一抗，然后同样的方法再孵育第一种二抗与相应的第二种二抗。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核后，

防荧光萃灭封片剂(Vector labTM，美国)封片。使用

(沃特福德，UK)BX4显微镜在恒定曝光条件下观察。免疫荧光结果使用ImageJ(National Institutesof Health，马里兰，美国)消除背景及分析。由对实验分组不知情的研究者随机选择每张切片的十个视野(在体或离体)进行计算，结果以与对照组荧光强度的百分比表示。

原位末端转移酶标记(TUNEL)染色

肺泡细胞死亡采用TUNEL试剂盒(MILLIPORETM)，按照使用说明书操作。绿色FITC荧光显示TUNEL阳性细胞。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA(TNF-αELISA试剂盒，

英国)检测培养基中人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，ELISA(大鼠TNF-αELISA试剂盒，

英国)检测大鼠肺组织和血清中TNF-α水平。

检测谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)

使用谷胱甘肽测定试剂盒(

英国)检测谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 (GSH/GSSG)含量。

Masson三色染色法(MTS)

按生产商说明书对石蜡包埋组织进行MTS检测(MTS试剂盒，

英国)。胶原沉积量(MTS染色区域占百分比)用ImageJ软件(U.S.National Institutes ofHealth，马里兰，美国)定量。

肾功能

动物安乐死后，采集血液样本。离心后用AU2700分析仪(OLYMPUSTM)测定血清尿素和肌酐浓度。

统计分析

实验数据用均数±标准差(SD)表示。数据分析采用t检验，或方差分析，然后用Kruskal-Wallis非参数(评分)或Newman-Keuls(测量)检验进行比较。动物生存分析采用Kaplan-Meier法，统计学差异用对数秩检验(GRAPHPAD PRISM

软件) 分析。p值<0.05表示差异有统计学意义。

实验一，右美托咪定减轻体外移植肾组织缺血再灌注相关性损伤。

机器灌注已被视为标准器官保存方式。建立大鼠肾移植机器灌注模型(图1A)，模拟移植肾的保存过程。课题组使用Fischer-to-Lewis同种异体肾移植模型进行了一系列实验。采用脑死亡(DBD)或心脏死亡(DCD)供体移植物，UW保存液加入0.1nM右美托咪定。将移植物切取出来后，用UW溶液4℃，1.5-2mL/分钟机器灌注4小时，然后置于含0.1nM右美托咪定的保存液中24小时。随后，取出移植物立即移植到受体大鼠体内(冷缺血0小时)，或者继续置于保存液中24小时(冷缺血24小时)再行肾移植手术，并在手术结束时切除对侧肾脏。受体大鼠接受环孢霉素A(肌注5毫克/千克/天)治疗10天预防急性免疫排斥反应。

数据显示，右美托咪定在体外冷保存过程中保护了移植肾的组织结构(图1B和C)。图 1A显示了专利申请人实验室中的UP-100灌注系统。该系统从哈佛仪器(肯特，英国)购买，包含了所有需要的元件(泵，管道和玻璃容器)，用来灌注来自心脏死亡(DCD)供体的移植肾。玻璃容器配备有连接到水浴的管道，可维持所需温度。右美托咪定(Dex)可减少肾皮质损伤，并在冷藏期间保持肾脏形态。图1B和1C显示分别来自脑死亡供体(DBD)捐赠或心脏死亡供体(DCD)捐赠的保存在用含有右美托咪定的UW防腐剂溶液中24小时(冷缺血 24小时)的移植肾检测结果，冷缺血0小时供体肾组织用作对照。图C和D显示苏木精-伊红(HE)染色评估肾形态和肾损伤评分。n＝8，比例尺＝50μm。数据表示为平均值±标准差。***P<0.001。CI：冷缺血，Vh：生理盐水，Dex：右美托咪定。

图2A-D显示右美托咪定(Dex)减轻肾皮质损伤并在冷藏期间抑制程序性坏死。图2A-2B 显示原位末端转移酶标记(TUNEL)的死亡细胞，以及混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)：程序性坏死的标志物。将脑死亡供体(DBD)或心脏死亡供体(DCD)肾组织保存在用含有右美托咪定的UW防腐剂溶液中24小时(冷缺血CI 24小时)，冷缺血0小时供体肾组织用作对照。通过TUNEL染色评估细胞死亡(图2A和2B，绿色荧光指示TUNEL阳性细胞)。N＝8。图C和D通过MLKL的表达评估程序性坏死(图2C和2D，绿色荧光)。细胞核用DAPI复染。 N＝6，比例尺＝50μm。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05，**P<0.01。***P <0.001。CI：冷缺血，Vh：生理盐水，Dex：右美托咪定。

右美托咪定通过显著增加血红素加氧酶-1(HO-1)和细胞核相关因子-2(Nrf-2)含量发挥保护作用。图3A-D显示右美托咪定(Dex)减少肾皮质损伤并且在冷藏期间保持肾形态。显示分别来自脑死亡供体(DBD)捐赠或心脏死亡供体(DCD)捐赠的保存在用含有右美托咪定的UW防腐剂溶液中24小时(冷缺血24小时)的移植肾检测结果，冷缺血0小时供体肾组织用作对照。通过免疫荧光染色评估HO-1(绿色荧光A和B)和Nrf-2(红色荧光，C和D) 的表达。细胞核用DAPI复染。N＝6。比例尺＝50μm。数据表示为平均值±标准差。*P< 0.05，***P<0.001。CI：冷缺血，Vh：生理盐水，Dex：右美托咪定。

术后第1天，右美托咪定处理组可迅速恢复器官功能。图4A和B显示右美托咪定可以保护肾功能，降低移植肾细胞死亡，减轻炎症和移植肾纤维化。图4A-4J显示分别来自脑死亡供体(DBD)捐赠或心脏死亡供体(DCD)捐赠的保存在用含有右美托咪定的UW防腐剂溶液中24小时(冷缺血24小时)的移植肾检测结果，冷缺血0小时供体肾组织用作对照。(A 和B)肾移植24小时后肌酐和年尿素氮检测(n＝6)(C和D)ELISA检测组织细胞因子IL-1β 和TNF-α水平。(E)TUNEL染色检测肾移植24小时后肾皮质内肾小管坏死程度。比例尺＝50 μm。在心脏死亡供体(DCD)捐献肾移植术后8天评估CD68+巨噬细胞浸润(红色荧光；F) 和肾纤维化(蓝色MTS染色；G)。在心脏死亡供体(DCD)和脑死亡供体(DBD)捐献肾组织中，分析肾皮质内肾小管TUNEL+细胞(H)，CD68+巨噬细胞浸润程度(I)和MTS染色区域(J 数据表示为平均值±标准差。*P<0.05，**P<0.01。***P<0.001。CI：冷缺血， Vh：生理盐水，Dex：右美托咪定。

右美托咪定减轻炎症反应(图4C和4D)，包括降低细胞因子IL-1β和TNF-α水平。同时减少细胞死亡(TUNEL+细胞数)(图4E和4H)。在手术后第16天，减少巨噬细胞浸润(CD68 +细胞数)和肾纤维化(MTS染色)(图4F，4J，4I和4J)。初步结果提供了参与肾移植潜在治疗靶点的程序性坏死的独特分子机制。同时，右美托咪定对来自心脏骤停供体肾脏的体外保存环节具有明显的保护作用。

实验二，右美托咪定减轻体外移植肺组织缺血再灌注相关性损伤。

长时间冷保存引起移植肺组织程序性坏死，促进HMGB-1释放

为确定移植肾缺血是否会引起急性肺损伤，我们对移植肺组织进行了组织学分析(图5A 和5B)。实验结果显示，长时间冷保存可导致严重的肺损伤，表现为肺实质损伤、核碎片化、肺损伤评分升高。TUNEL检测(图5B和G)表明冷保存后肺泡细胞凋亡增多。采用ELISA法测定对照组，未进行冷保存组(冷缺血0小时，CI 0hr)和冷保存16小时(CI 16hr)组的肺组织细胞因子浓度，结果证明冷缺血引起包括TNF-α(图5C)、IL-1β(图5D)和HMGB-1 (图5E)在内的肺组织细胞因子增加。(图5F)肺损伤评分系统评估肺形态。(图5G)TUNEL +细胞数量。比例尺：50μm。数据表示为平均值±标准差(n＝6)，**p<0.01，***p <0.001。NC：对照，CI：冷缺血。HE，苏木精和伊红；TNF，肿瘤坏死因子；IL，白细胞介素；HMGB，高迁移率族蛋白B1；ELISA，酶联免疫吸附试验；TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶标记。

程序性坏死标志物RIPK1和PIPK3的表达显著增加(图6A-6E)。程序性坏死标志物与 HMGB-1和TLR-4双标染色(图6F和6C)，表明HMGB-1释放并随后激活坏死细胞中TLR-4途径。如图6A-6F所示，在心脏死亡后提取Lewis大鼠肺并在4℃UW溶液中储存0或16小时(肺移植冷缺血CI 0或CI 16hr)。正常肺组织做为空白对照(NC)。荧光染色双标记(图 6A)Rip-1(红色)和HMGB-1(绿色)，(图6B)Rip-3(红色)和HMGB-1(绿色)，(图6C) Rip-3(红色)和TLR-4(绿色)，(图6D)RIPK1，(图6E)RIPK3和(图6F)TLR-4的荧光强度。细胞核用DAPI复染。比例尺：50μm。数据表示为平均值±标准差(n＝6)，*p< 0.05，**p<0.01和***p<0.001)。HMGB1，高迁移率族蛋白B1；CI，冷缺血；NC，空白对照；TLR-4，Toll样受体-4。

右美托咪定抑制移植肺组织程序性坏死和HMGB-1释放

保存在4℃含右美托咪定的UW保存液中的肺组织，其组织形态结构明显优于不含右美托咪定的UW保存液(图7A和B)。同时右美托咪定减少了细胞死亡(TUNEL染色评估，图7C)。降低程序性坏死标志物RIPK1和PIPK3表达(图7D，E，G和H)。并减少HMGB-1释放和TLR-4 的激活(图7F和I)。组织炎症细胞因子HMGB-1、TNF-α和IL-1β水平亦显著降低(图7J-L)。如图7A-7L所示，在心脏死亡后提取Lewis大鼠肺组织并储存在含有或不含有用右美托咪定(0.1nM)的4℃UW保存液中0或16小时(移植肺冷缺血CI 0or 16小时)。(图7A)HE 染色评估肺形态，(图7B)通过肺损伤评分系统评估肺形态。(图7C)TUNEL检测肺组织细胞死亡。免疫荧光双标记(图7D)Rip-1(红色)和HMGB-1(绿色)，(图7E)Rip-3(红色) 和HMGB-1(绿色)，(图7F)Rip-3(红色)和TLR-4(绿色)。肺组织中(图7G)RIPK1，(图 7H)RIPK3和(图7I)TLR-4荧光染色。细胞核用DAPI复染。ELISA评估肺组织中(图7J) HMGB-1，(图7K)TNF-α和(图7L)IL-1β的浓度。比例尺：50μm。数据表示为平均值

右美托咪定激活Nrf-2和下游效应分子NQO-1及SOD-1

Nrf-2及其下游效应分子NQO-1和SOD-1是关键的抗氧化酶，在缺血再灌注损伤过程中起抗炎作用。将正常大鼠肺组织置于含有/不含有右美托咪定的UW保存液中冷保存16小时 (CI 16hr)，然后取肺组织进行免疫荧光标记。(图8A)示Nrf-2(红)和NQO-1(绿)，(图8B)示Nrf-2(红)和SOD-1(绿)在冷保存16小时后，保存于含右美托咪定的UW保存液的肺组织中Nrf-2、NQO-1和SOD-1水平显著增加(图8C、D、E)，该结果表明储存在含右美托咪定的UW溶液中肺移植物抗氧化作用增强。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)是氮自由基种类的标志物，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal)是细胞内脂质过氧化产生的不饱和羟基烯烃，两者都是细胞氧化应激的重要标志物。保存于含右美托咪定的UW保存液的肺组织中3-硝基酪氨酸(图8F和8H，p＜0.001)和4-羟基壬烯醛(图8F和8I，p＜0.05)表达显著降低。该结果表明含右美托咪定的UW溶液降低肺组织氧化应激反应。还原谷胱甘肽(GSH) 是活性氧的重要清除剂，还原谷胱甘肽与氧化性谷胱甘肽(GSSG)的比值是氧化应激的常用指标。保存于含右美托咪定的UW保存液中冷保存16小时(CI 16hr)的肺组织GSH表达增加(图8I，p＜0.05)，GSSG表达减少(图8J，p＜0.01)，GSH/GSSG比例显著增加(图8K， p＜0.001)。综上所述，这些结果表明，右美托咪定处理可改善移植物的氧化还原状态，使抗氧化活性增加。如图8A-8K所示，在心脏死亡后提取Lewis大鼠肺组织并储存在含有/不含有右美托咪定的UW保存液中冷保存16小时(即冷缺血16小时，CI 16hr)。正常肺组织用做对照(NC)。肺组织免疫荧光双标记(图8A)Nrf-2(红色)和NQO-1(绿色)，(图8B) Nrf-2(红色)和SOD-1(绿色)。肺组织中(图8C)Nrf-2，(图8D)NQO-1和(图8E)SOD-1 的荧光强度统计。(图8F)免疫荧光评估3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛表达。(图8G)3-硝基酪氨酸和(图8H)4-羟基壬烯醛荧光强度统计。细胞核用DAPI复染。(图8I)肺组织GSH 水平，(图8J)肺组织GSSG水平。(图8K)肺组织GSH与GSSG百分比。比例尺：50μm。数据表示为平均值±标准差(n＝6)，(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。NC：对照，rCI：肾移植物冷缺血。HMGB1，高迁移率族蛋白B1；CI，冷缺血；TLR-4，Toll样受体-4。Nrf-2，核因子红细胞2相关因子2；NQO-1：醌受体氧化还原酶1；SOD-1：超氧化物歧化酶-1；GSH：谷胱甘肽；GSSG：氧化型谷胱甘肽；CI：冷缺血。

阿替美唑或抑制Nrf-2减弱右美托咪定介导的肺保护作用

为进一步探究右美托咪定对肺移植物的保护效应及潜在机制，使用Nrf-2小干扰RNA (Nrf-2siRNA)或阿替美唑(α2肾上腺素能受体抑制剂)在移植物切取前处理供体大鼠。待取出肺组织后储存于含有右美托咪定的UW保存液中冷保存16小时(CI 16hr)，然后取肺组织进行免疫荧光标记使用/不使用Nrf-2siRNA(图9A)或使用/不使用阿替美唑(图9B) 处理的肺组织中的TLR-4和RIP3。结果显示Nrf-2siRNA和阿替美唑均增强RIP3(图9C，分别是p＜0.01和p＜0.05)和TLR-4(图9D，p＜0.01)表达。肺组织冷缺血16小时后，免疫荧光标记使用/不使用Nrf-2siRNA(图9A)或使用/不使用阿替美唑的肺组织中的3- 硝基酪氨酸和4-羟基壬烯酸。结果表明使用Nrf-2siRNA或阿替美唑均能显著增加3-硝基酪氨酸(图9G，分别是p＜0.05和p＜0.001)和4-羟基壬烯酸(图9H，分别是p＜0.05和 p＜0.001)的表达。Nrf-2siRNA和阿替美唑处理后，肺组织形态也发生了明显的破坏，肺损伤评分显著增强(图9I和9K，分别是p＜0.01和p＜0.05)。综上所述，这些发现表明， Nrf-2和α2肾上腺素能信号通路激活在右美托咪定对肺移植物的保护效应中起重要作用。同时用Nrf-2siRNA或阿替美唑处理含右美托咪定的UW保存液后，肺组织中HMGB-1表达明显增加(图9J)，表明右美托咪定介导的抗炎通路下调后，促炎DAMP通路上调。如图9A-9K 所示，使用Nrf-2siRNA或阿替美唑在移植物切取前处理供体大鼠，在大鼠心脏死亡后提取肺组织并储存在含有/不含有右美托咪定(0.1nM)的UW保存液中冷保存16小时(即冷缺血 16小时，CI 16hr)。(图9A)Nrf-2siRNA处理或(图9B)阿替美唑处理后，肺组织免疫荧光标记Rip-3(红色)、TLR-4(绿色)。肺组织中(图9C)RIPK3、(图9D)TLR-4荧光强度统计。以及(图9E)Nrf-2siRNA处理或(图9F)阿替美唑处理后，3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛的表达。(图9G)3-硝基酪氨酸和(图9H)4-羟基壬烯醛的荧光强度。细胞核用DAPI 复染。(图9I和9K)肺组织学(苏木精和伊红染色)和肺损伤评分。(图9J)ELISA评估肺移植组织中的HMGB-1。比例尺：50μm。数据表示为平均值±标准差(n＝6)，*p<0.05， **p<0.01和***p<0.001)。HMGB1，高迁移率族蛋白B1；CI，冷缺血；NC，空白对照； TLR-4，Toll样受体-4。

实验三，右美托咪定联合氙气或氩气治疗减少与缺血再灌注相关的移植物损伤。

2％异氟烷吸入麻醉后，经阴茎静脉注射含肝素300U的1ml生理盐水，开胸后经胸内心脏压迫诱导心脏骤停5分钟。将动物置于37℃的电热毯上40分钟。切取供体大鼠的移植器官，用4℃，流速每分钟1.5-2mL的UW保存液机械灌洗移植器官4小时(流速为大鼠10％的心输出量/肾血流量)(图1B)。灌洗完后将移植器官置于保存液中保存16或24小时后进行移植手术。

该方案来源于我们的试验研究，并指出移植器官的损伤和药物治疗窗。保存液中溶解 70％氮气、氙气或氩气，加入或不加入0.1nM右美托咪定。2％异氟烷麻醉状态下实施受体原位肾移植，保证无菌条件，并在手术最后切除对侧肾脏。术后每天按5mg/kg的剂量肌内注射环孢素A一次，连续十天以预防急性免疫排斥反应。我们的数据表明，在长时间冷保存的情况下，暴露在氙气或氩气中能保护肾组织结构。保存液中加入右美托咪定，在移植术后第8天，肾组织保护作用更为显著(图10A-10D)。包括抑制炎症反应(图11A-11C)，促进肾功能的快速恢复(图11D和11E)，以及减轻术后16天巨噬细胞浸润和肾纤维化(图12A-12D)。

关于图10A-10D，来自心脏骤停的Fischer大鼠肾移植物储存于含氮气或氙气或氩气 (70％氮气或氙气或氩气与5％二氧化碳与25％氧气)和右美托咪定的UW保存液中。保存液机械灌洗移植器官4小时，灌洗完后将移植器官置于保存液中保存24小时。正常肾组织做为对照(NC)，用保存液保存24小时的肾组织做为假手术(Sham)，实验组将保存后的肾组织移植入受体大鼠并在术后第8天取出移植肾用于检测(图10A)。(图10B)评估肾损伤HE染色(n＝4-6)和肾形态。(图10C)肾皮质中肾小管TUNEL染色。(图10D)肾皮质中肾小管TUNEL+细胞百分比。数据表示为平均值±标准差(n＝4-6)。*p<0.05，**p<0.01 和***p<0.001。Xe：氙，Ar：氩，Dex：右美托咪定。

关于图11A-11E，来自心脏骤停的Fischer大鼠肾移植物储存于含氮气或氙气或氩气 (70％氮气或氙气或氩气与5％二氧化碳与25％氧气)和右美托咪定的UW保存液中。保存液机械灌洗移植器官4小时，灌洗完后将移植器官置于保存液中保存24小时。正常肾组织做为对照(NC)，用保存液保存24小时的肾组织做为假手术(Sham)，实验组将保存后的肾组织移植入受体大鼠并在术后第8天取出移植肾用于检测(图11A-C)血清IL-1β，TNF-α 和HMGB-1浓度，(图11D和11E)血清肌酐和尿素氮浓度。数据表示为平均值±标准差(n＝4-6)。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。Xe：氙，Ar：氩，Dex：右美托咪定。

关于图12A-12D，来自心脏骤停的Fischer大鼠肾移植物储存于含氮气或氙气或氩气 (70％氮气或氙气或氩气与5％二氧化碳与25％氧气)和右美托咪定的UW保存液中。保存液机械灌洗移植器官4小时，灌洗完后将移植器官置于保存液中保存24小时。正常肾组织做为对照(NC)，用保存液保存24小时的肾组织做为假手术(Sham)，实验组将保存后的肾组织移植入受体大鼠并在术后第16天取出移植肾用于检测(图12A)CD68+巨噬细胞和 (图12B)CD68+细胞数和(图12C)肾纤维化(蓝色MTS染色)和(图12D)肾纤维化程度，蓝色MTS染色百分比。数据表示为平均值±标准差(n＝4-6)。*p<0.05，**p<0.01和*** p<0.001。Xe：氙，Ar：氩，Dex：右美托咪定。

综上所述，我们的创新性实验结果表明，在心脏骤停供体肾脏的体外保存环节，氙气或氩气联合右美托咪定处理具有明显的保护效应。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

参考文献

1.Laubach,V.E.and A.K.Sharma,Mechanisms of lung ischemia-reperfusioninjury. Curr Opin Organ Transplant,2016.21(3):p.246-52.

2.Thabut,G.and H.Mal,Outcomes after lung transplantation.J ThoracDis,2017. 9(8):p.2684-2691.

3.Introduction.Am J Transplant,2016.16Suppl 2:p.8-10.

4.Ferrari,R.S.and C.F.Andrade,Oxidative Stress and Lung Ischemia-Reperfusion Injury.Oxid Med Cell Longev,2015.2015:p.590987.

5.Buchanan,P.M.,et al.,Association of lower costs of pulsatilemachine perfusion in renal transplantation from expanded criteria donors.Am JTransplant,2008.8(11):p. 2391-401.

6.van der Hoeven,J.A.,et al.,Relationship between duration of braindeath and hemodynamic(in)stability on progressive dysfunction and increasedimmunologic activation of donor kidneys.Kidney Int,2003.64(5):p.1874-82.

7.de Vries,D.K.,et al.,Donor brain death predisposes human kidneygrafts to a proinflammatory reaction after transplantation.Am J Transplant,2011.11(5):p.1064-70.

8.van Der Hoeven,J.A.,et al.,Effects of brain death and hemodynamicstatus on function and immunologic activation of the potential donor liver inthe rat.Ann Surg,2000. 232(6):p.804-13.

9.Herijgers,P.,et al.,Changes in organ perfusion after brain death inthe rat and its relation to circulating catecholamines.Transplantation,1996.62(3):p.330-5.31

10.Nicholson,M.L.,et al.,A comparison of the results of renaltransplantation from non-heart-beating,conventional cadaveric,and livingdonors.Kidney Int,2000.58(6):p. 2585-91.

11.Pascual,J.,J.Zamora,and J.D.Pirsch,A systematic review of kidneytransplantation from expanded criteria donors.Am J Kidney Dis,2008.52(3):p.553-86.

12.Carden,D.L.and D.N.Granger,Pathophysiology of ischemia-reperfusioninjury. J Pathol,2000.190(3):p.255-66.

13.Schrier,R.W.,et al.,Acute renal failure:definitions,diagnosis,pathogenesis,and therapy.J Clin Invest,2004.114(1):p.5-14.

14.Wu,H.,et al.,TLR4 activation mediates kidney ischemia/reperfusioninjury.J Clin Invest,2007.117(10):p.2847-59.

15.Sanni,A.O.,et al.,Non-heart-beating kidney transplantation:6-yearoutcomes. Transplant Proc,2006.38(10):p.3396-7.

16.Maathuis,M.H.,H.G.Leuvenink,and R.J.Ploeg,Perspectives in organpreservation.Transplantation,2007.83(10):p.1289-98.

17.Fuller,B.J.and C.Y.Lee,Hypothermic perfusion preservation:thefuture of organ preservation revisited？Cryobiology,2007.54(2):p.129-45.

18.Moers,C.,et al.,Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.N Engl J Med,2009.360(1):p.7-19.

19.Endre,Z.H.,Renal ischemic preconditioning:finally some good newsfor prevention of acute kidney injury.Kidney Int,2011.80(8):p.796-8.

20.Ma,D.,et al.,Xenon preconditioning protects against renalischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.J Am Soc Nephrol,2009.20(4):p.713-20.

21.Zhao,H.,et al.,Xenon Treatment Protects Against Cold IschemiaAssociated Delayed Graft Function and Prolongs Graft Survival in Rats.Am JTransplant,2013.

22.Zhao,H.,et al.,Xenon treatment attenuates early renal allograftinjury associated with prolonged hypothermic storage in rats.FASEB J,2013.27(10):p.4076-88.

23.Zhao,H.,et al.,Early treatment with xenon protects against thecold ischemia associated with chronic allograft nephropathy in rats.KidneyInt,2013.

24.Zhao,H.,et al.,A novel strategy for preserving renal grafts in anex vivo setting: potential for enhancing the marginal donor pool.FASEB J,2013.

25.Loetscher,P.D.,et al.,Argon:neuroprotection in in vitro models ofcerebral ischemia and traumatic brain injury.Crit Care,2009.13(6):p.R206.

26.Ryang,Y.M.,et al.,Neuroprotective effects of argon in an in vivomodel of transient middle cerebral artery occlusion in rats.Crit Care Med,2011.39(6):p.1448-53.

27.Zhuang,L.,et al.,The protective profile of argon,helium,and xenonin a model of neonatal asphyxia in rats.Crit Care Med,2012.40(6):p.1724-30.

28.Irani,Y.,et al.,Noble gas(argon and xenon)-saturated cold storagesolutions reduce ischemia-reperfusion injury in a rat model of renaltransplantation.Nephron Extra, 2011.1(1):p.272-82.

29.Hall,J.E.,et al.,Sedative,amnestic,and analgesic properties ofsmall-dose dexmedetomidine infusions.Anesth Analg,2000.90(3):p.699-705.

30.Ma,D.,et al.,Dexmedetomidine produces its neuroprotective effectvia the alpha 2A-adrenoceptor subtype.Eur J Pharmacol,2004.502(1-2):p.87-97.

31.Si,Y.,et al.,Dexmedetomidine protects against renal ischemia andreperfusion injury by inhibiting the JAK/STAT signaling activation.J TranslMed,2013.11(1):p.141.

32.Gu,J.,et al.,Dexmedetomidine provides renoprotection againstischemia-reperfusion injury in mice.Crit Care,2011.15(3):p.R153.

33.Gallego-Ligorit,L.,et al.,Use of Dexmedetomidine in Cardiothoracicand Vascular Anesthesia.J Cardiothorac Vasc Anesth,2017.

34.van den Eijnden,M.M.,et al.,Effect of brain death and non-heart-beating kidney donation on renal function and injury:an assessment in theisolated perfused rat kidney. Exp Clin Transplant,2003.1(2):p.85-95.

35.Chen,Q.,et al.,alpha2-adrenoreceptor modulated FAK pathway inducedby dexmedetomidine attenuates pulmonary microvascular hyper-permeabilityfollowing kidney injury.Oncotarget,2016.7(35):p.55990-56001.

36.Koksel,O.,et al.,Inhibition of poly(ADP-ribose)polymeraseattenuates lung tissue damage after hind limb ischemia-reperfusion inrats.Pharmacol Res,2005.51(5):p. 453-62.

37.Hamar,P.,et al.,Small interfering RNA targeting Fas protects miceagainst renal ischemia-reperfusion injury.Proc Natl Acad Sci U S A,2004.101(41):p.14883-8.

38.Ozaki,K.S.,et al.,Carbon monoxide inhibits apoptosis during coldstorage and protects kidney grafts donated after cardiac death.Transpl Int,2012.25(1):p.107-17.

39.Slama,M.,et al.,Echocardiographic measurement of cardiac output inrats.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003.284(2):p.H691-7

Claims

1.一种提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：包括：用右美托咪定与选自下组的惰性气体组合处理来自哺乳动物供体器官或复合组织移植物：氙和/或氩以足够的浓度和持续时间刺激所述哺乳动物供体器官或复合组织移植物。

2.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：所述器官选自且不仅限于任何适用于移植的器官：心脏、肺、肾、肝、肠、胰腺、脉管系统、角膜或皮肤。

3.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：将器官或复合组织移植物移植到哺乳动物受体中，所述哺乳动物受体是用右美托咪定和惰性气体组合处理后与供体不同的个体。

4.根据权利要求3所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：在移植到哺乳动物受体后，用右美托咪定和惰性气体组合进一步处理器官或复合组织移植物。

5.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：所述器官或复合组织移植物是边缘供体器官，其选自：心脏死亡(DCD)捐赠的器官或复合组织移植物和脑死亡后(DBD)捐赠的器官或复合组织移植物。

6.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：右美托咪定和惰性气体组合治疗器官或复合组织移植物的保存液来自并不仅限于UW溶液，Soltran溶液和Collins溶液。

7.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：其中用右美托咪定结合氙和氩处理哺乳动物器官或复合组织移植物。

8.根据权利要求7所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：用右美托咪定、氙、氩和氧的组合处理哺乳动物器官或复合组织移植物。

9.根据权利要求8所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：所述组合包含：0.05-0.2nM的右美托咪定，25-35％的氧，30-40％的氩和25-35％的氙。

10.根据权利要求9所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：所述组合还包含2-10％的二氧化碳(CO₂)。

11.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：哺乳动物器官或复合组织移植物在从供体移出后和移植到受体之前在离体保存阶段进行处理。

12.根据权利要求11所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：供体是边缘供体。

13.根据权利要求1所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：供体是边缘供体。

14.一种诱导器官或复合组织移植物中促进缺血再灌注后细胞存活的的方法，包括：用足够浓度和持续时间的氙和氩处理来自哺乳动物供体器官或复合组织移植物。

15.根据权利要求14所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：将器官或复合组织移植物移植到哺乳动物受体上，所述哺乳动物受体在与氙和氩接触后是与器官供体不同的个体。

16.根据权利要求15所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：在移植到哺乳动物受体后，用氙和氩进一步处理器官或复合组织移植物。

17.根据权利要求15所述提高缺血再灌注后器官或复合组织移植物保存质量的方法，其特征在于：从供体移除器官之后和移植到受体之前，在离体保存阶段使氙和氩与器官或复合组织移植物接触。