CN110917347B - PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用 - Google Patents

PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体涉及PPARδ拮抗剂联合PD‑1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用。本发明提供了一种PPARδ拮抗剂联合抗体药物PD‑1在肿瘤免疫治疗药物中的新用途。本发明通过大量实验证实PPARδ拮抗剂能够显著降低PD‑L1蛋白水平及抑制PD‑L1的基因表达，进而联合应用PD‑1抗体药物时可以增加PD‑1抗体的肿瘤免疫治疗效果，更好地抑制肿瘤生长。与单一PD‑1抗体治疗相比，本发明中公开的PPARδ拮抗剂联合PD‑1抗体能显著抑制小鼠中肿瘤的生长水平，明显高于单纯使用常用的抗体药物。在肿瘤免疫治疗效果方面具有显著的作用。

Description

PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用。
背景技术
癌症发生主要与基因突变及人体免疫力下降而失去对肿瘤细胞的监控有关。因此，如何提高机体免疫力才能有效抑制癌症发生显得尤为重要，美国FDA批准的作用于免疫检查点（immune checkpoint）的抗体药物PD-1能有效治疗25种类型以上的癌症。PD-1（Programmed death-1）抗体/PD-L1抗体属于免疫检查点阻断药物。PD-1是表达在T细胞表面的另一种重要的免疫印制跨膜蛋白，为CD28超家族成员，其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1有两个配体，PD-L1和PD-L2，PD-L1比PD-L2表达更为广谱，在肿瘤的微环境中，肿瘤细胞能够表达PD-L1或者PD-L2。尽管针对PD-1的抗体阻断治疗具有显著性的临床疗效，但癌症病人对该抗体药物的响应率却低于40%。
PPARδ作为过氧化酶体增殖物激活受体（Peroxisome-Proliferator-ActivatedReceptors，PPARs）家族的成员之一，在调节炎症、肿瘤、代谢方面发挥重要的作用。PPARδ在大多数组织中表达，在上皮细胞中表达水平尤其高，特别是皮肤和肠的细胞。然而，PPARδ拮抗剂是否可以增强PD-1抗体肿瘤免疫治疗，目前依然未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。本发明通过研究发现PPARδ拮抗剂对PD-L1基因的表达具有显著地抑制作用，PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体可以明显地抑制肿瘤细胞生长，增强PD-1抗体在肿瘤免疫治疗中的应用。
本发明提供了PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用，与单一PD-1抗体药物相比，PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体能显著抑制肿瘤生长。
进一步地，所述的PPARδ拮抗剂是GSK0660或GSK3787。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中包含有效剂量的PPARδ拮抗剂和PD-1抗体药物。PPARδ拮抗剂在肿瘤免疫治疗的应用中，所述的PPARδ拮抗剂是GSK0660或GSK3787。
所述的抗体药物是抗人PD-1单克隆抗体。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体药物在肿瘤免疫治疗药物中的新用途。本发明通过大量实验证实PPARδ拮抗剂能够显著降低PD-L1蛋白水平及抑制PD-L1的基因表达，进而联合应用PD-1抗体药物时可以增加PD-1抗体的肿瘤免疫治疗效果，更好地抑制肿瘤生长。与单一PD-1抗体治疗相比，本发明中公开的PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体能显著抑制小鼠中肿瘤的生长水平，明显高于单纯使用常用的抗体药物。在肿瘤免疫治疗效果方面具有显著的作用。
附图说明
图1是PPARδ拮抗剂对PD-L1蛋白的Western blot分析结果；图中，（A）是SW480细胞，（B）是HCT-116细胞，（C）是CT-26细胞；
图2是PPARδ拮抗剂对PD-L1蛋白的流式细胞术结果分析结果；
图3是PPARδ 拮抗剂对PD-L1的基因表达水平分析结果；图中，A是qPCR分析结果图，B是双荧光报告分析结果图；
图4是PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体对肿瘤生长影响结果；图中，A是肿瘤体积对照图；B是 Western blot 分析肿瘤组织中PD-L1蛋白表达水平结果，其中Actin是内参蛋白。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
进一步需要说明的是，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。所术语“拮抗剂”是指能抑制PPARδ转录活力的物质。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实验试剂：
SW480、HCT-116、CT-26结肠癌细胞购买于美国ATCC，PPARδ拮抗剂GSK0660、GSK3787购买于CSNpharm（中国）；0.25%胰酶购买于Gibco公司（含EDTA）。 Actin、 PD-L1、PPARδ抗体购买于上海生物工程有限公司。胎牛血清Fetal Bovine Serum（FBS）和DMEM完全培养基皆为本领域技术人员常用的药品，配制和使用方法皆为本领域公知常识。总RNA 提取试剂盒购买于上海生工，qPCR 反应试剂盒购买于TaKaRa。
本发明中所用PD-L1与Actin引物序列如下：
PD-L1的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，即：TGGCATTTGCTGAACGCATTT，其下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，即：TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT；
Actin的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，即：GGTGGGCATGGGTCAGAAGGAT，其下游引物序列如SEQ ID NO:4所示，即：CACACGCAGCTCATTGTAGAAGGT。
实施例1： PPARδ拮抗剂降低PD-L1的蛋白水平
本实施例中验证PPARδ拮抗剂GSK0660和GSK3787对PD-L1的蛋白水平的影响。分别将SW480、HCT-116、CT-26细胞以含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜检达80%融合度时，用0.25%胰酶消化，细胞接种于12孔板中，并置于37ºC、5% CO2培养箱中过夜且密度长至孔的70%-90%时，以二甲基亚砜（DMSO）为对照组，GSK0660和GSK3787为试验组，分别进行细胞处理12h。
（1）细胞裂解、Western blot分析PD-L1蛋白表达；
（2）收集细胞离心，细胞利用 40 μm 滤器过滤，2x105 细胞孵育荧光标记的PD-L1抗体，室温孵育30 分钟，细胞利用PBS洗几次，利用流式细胞仪分析 PPARδ拮抗剂GSK0660和GSK3787对PD-L1 膜蛋白的表达水平影响。
图1是PPARδ拮抗剂对PD-L1蛋白的Western blot分析图；图中，（A）是SW480细胞，（B）是HCT-116细胞，（C）是CT-26细胞。其中 PPARδ是内源性 PPARδ 蛋白；Actin是内参蛋白。由图1可见，PPARδ拮抗剂GSK0660和GSK3787对SW480细胞、HCT-116细胞、以及CT-26细胞中的PD-L1蛋白表达均有抑制作用。
图2是PPARδ拮抗剂对PD-L1蛋白的流式细胞术分析图；结果用均值±SEM表示（n=3），*P<0.05。如图2所示，与对照组DMSO相比，PPARδ拮抗剂GSK0660 (5 μM)和GSK378(5 μM)的荧光强度显著降低，表明PPARδ抑制子显著降低SW480，HCT-116以及CT-26细胞中PD-L1蛋白水平。
实施例2： PPARδ拮抗剂抑制PD-L1基因表达
本实施例中验证PPARδ拮抗剂GSK0660和GSK3787对PD-L1基因表达的影响。将SW480, HCT-116，CT-26癌细胞以含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜检达80%融合度时，用0.25%胰酶消化，细胞接种于12孔板中，并置于37ºC、5% CO2培养箱中过夜且密度长至孔的70%-90%时，以DMSO (5μM)为对照组，GSK0660(5μM)和GSK3787(5μM)为试验组，分别进行细胞处理。
（1）细胞处理12h后细胞裂解，qPCR分析PD-L1基因表达；
（2）细胞转染PD-L1报告基因质粒，30 小时后细胞裂解，双荧光报告分析PD-L1 基因转录活力。图3是PPARδ 拮抗剂对PD-L1的基因表达水平图；图中，A是qPCR分析结果图，B是双荧光报告分析结果图；结果用均值±SEM表示（n=3），*P<0.05。由图3可知， PPARδ 抑制子显著性降低SW480、 HCT-116、CT-26细胞中PD-L1 基因表达的水平。此外双荧光报告分析表明PPARδ 抑制子显著性降低SW480、HCT-116以及CT-26细胞中PD-L1 基因转录活力。
实施例3：PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体显著抑制肿瘤生长
本实施例中验证PPARδ拮抗剂GSK0660联合PD-1抗体对肿瘤生长的影响。CT-26细胞（2×105）接种到裸鼠皮下，接种后的小鼠随机分成四组：IgG (对照组)、PD-1、GSK0660以及PD-1+GSK0660；每三天皮下注射IgG/PD-1抗体 (200 μg/小鼠)，每天灌胃GSK0660(20mg/kg/day)。每周测量肿瘤体积，共4周，最后断颈法处死小鼠。肿瘤体积计算公式 = 1/2(长×宽2)。并使用Western blot分析肿瘤组织裂解物中PD-L1蛋白的表达水平，其中Actin是内参蛋白。
图4是PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体对肿瘤生长影响图；图中，A是肿瘤体积对照图；B是 Western blot 分析肿瘤组织中PD-L1蛋白表达水平图，其中Actin是内参蛋白。
由图4可见，PPARδ 抑制子GSK0660 与抗体药物PD-1联合应用可以显著抑制肿瘤生长，其与降低肿瘤组织中PD-L1 蛋白表达有关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcatttgc tgaacgcatt t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcagccagg tctaattgtt tt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgggcatg ggtcagaagg at 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacacgcagc tcattgtaga aggt 24

Claims (2)

1. PPARδ拮抗剂联合PD-1抗体在制备结肠癌治疗药物中的应用；所述的PPARδ拮抗剂是GSK0660和/或GSK3787。
2.一种治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，包含有效剂量的PPARδ拮抗剂和PD-1抗体；所述的PPARδ拮抗剂是GSK0660和/或GSK3787。
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Adipose PD-L1 Modulates PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade Immunotherapy Efficacy in Breast Cancer;Bogang Wu等;《OncoImmunology》;20180823;第7卷(第11期);第e1500107篇，1-15 *

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