CN110892080A - 用于检测与暴露于吸入致癌物有关的疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测与疾病相关的蛋白质的组合物和方法，所述疾病与暴露于吸入致癌物有关。这类标志物可用于允许易感于与暴露于吸入致癌物相关的疾病的个体控制其生活方式并减少疾病的进一步进展。

Description

用于检测与暴露于吸入致癌物有关的疾病的组合物和方法
【相关申请】
本申请要求2017年5月12日提交的美国临时专利申请号62/505,536和2017年6月22日提交的美国临时专利申请号62/523,382的优先权。美国临时专利申请号62/505,536和62/523,382的内容在此通过提述全文引入。
【发明领域】
本公开涉及用于诊断肺癌和相关疾病的方法和组合物。
【发明背景】
疾病背后的生物学机制潜在地与暴露于吸入的致癌物有关。此类疾病可能包括肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和心血管疾病(CVD)。尽管是高度流行的疾病，但即使有也很少有生物标志物可以提供这些状况的可靠指示。对于暴露于危险因素的个体来调整其生活方式，以避免触发症状发作和/或促进疾病的进一步发展将是有帮助的。因此，需要开发和评估此类疾病的生物标志物。
【发明概述】
本公开可以以多种方式来体现。
在一个实施方式中，公开了检测与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中的至少一种有关的生物标志物并将这些生物标志物的水平和/或变化与暴露于吸入的致癌物相关联的方法和组合物。
在一个实施方式中，公开了一种检测与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种相关的至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从个体获得样品；以及测量标志物的量，并且任选地，将这样的生物标志物的水平和/或变化与暴露于吸入致癌物相关联。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与至少一种肺癌(LC)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白(tensin)同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族A成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶(sirtuin)1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；并测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量和/或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白(pentraxin)相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病(von Willebrand)因子(VWF)。
另外和/或备选地，该方法可以包括测量至少一种标准化(例如，持家基因)。或者，可以执行这些标志物的各种组合的测量。
在随后的详细描述、附图和权利要求书中，本公开的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应该理解的是，详细说明、附图和权利要求虽然指示了所公开的方法、组成和系统的实施方式，但是仅以例示而非限制的方式给出。对于本领域技术人员而言，在本发明范围内的各种改变和修改将变得显而易见。
【附图说明】
鉴于以下非限制性附图，可以更好地理解本公开。
图1示出了多节点相互作用网络的示例，该多节点相互作用网络鉴定与疾病(COPD)相关的标志物，该疾病可能与吸入致癌物相关。
图2示出了维恩图的示例，其描绘与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和心血管疾病(CVD)有关的标志物。
【发明详述】
【术语和定义】
为了使本公开更容易理解，首先定义某些术语。以下术语和其他术语的附加定义在通篇说明书中阐述。
尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体示例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值都固有地包含必然由其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，规定的范围“1到10”应视为包括最小值1和最大值10之间(且包括该最小值和最大值)的任何和所有子范围；也就是说，所有子范围均以最小值1或更大的值开始，例如1至6.1，并且以最大值10或更小，例如5.5至10结束。另外，任何被称为“结合在/并入本文中”的参考文献应理解为完整结合/并入。
还应注意的是，如在本说明书中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数个指示物，除非明确地限于一个指示物。术语“和/或”通常用于指代至少一个或另一个。在某些情况下，术语“和/或”与术语“或”可互换使用。术语“包括”在本文中是指短语“包括但不限于”并与其互换使用。术语“例如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”并与其互换使用。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。对于本领域的定义和术语，从业者特别地可参照分子生物学的当前规程(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel)。
还有，如本文所使用的，“至少一个”涵盖从1到整个组的任何数字。例如，对于四种标志物的列出，“至少一个”的短语应理解为表示1、2、3或4种标志物。
还有，如本文所使用的，“包括/包含”涵盖使用术语“由...组成”更具体地定义的实施方式。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一条或多条多肽组成的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链通常分为κ或λ。重链通常被分类为γ，μ，α，δ或ε，它们依次分别定义了免疫球蛋白类别，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端定义了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。抗体可以对特定抗原具有特异性。抗体或其抗原可以是分析物或结合伴侣。抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或以各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下方消化抗体以产生F(ab)’2，这是Fab的二聚体，它本身是轻链通过二硫键与VH-CH1连接。F(ab)’2可以在温和条件下还原，以破坏铰链区的二硫键，从而将(Fab’)2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology，W.E.Paul编，Raven Press，N.Y.(1993)以获得其他抗体片段的更详细描述)。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域普通技术人员将理解，可以通过化学或利用重组DNA方法从头合成此类Fab’片段。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法从头合成产生的抗体片段。在一些实施方式中，抗体是单链抗体，例如单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起以形成连续多肽。单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以从包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH和VL编码序列的核酸表达。(参见，例如休斯顿(Huston)等人，(1988)美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)，85：5879-5883，其全部内容通过引用并入本文)。存在将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻链和重链多肽转化到scFv分子中的许多结构，该scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本相似的三维结构。参见，例如美国专利号5,091,513和5,132,405和4,956,778。
术语“抗体”包括例如通过组合诱变和噬菌体展示产生的单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体和嵌合抗体。术语“抗体”还包括抗体的模拟物或拟肽。拟肽是基于或衍生自肽和蛋白质的化合物。本公开的拟肽通常可以通过使用非天然氨基酸、构象限制、电子等排置换等通过对已知肽序列进行结构修饰来获得。
等位基因：如本文所用，术语“等位基因”是指相同遗传基因座(例如，基因)的核苷酸序列的不同版本。
等位基因特异性引物延伸(ASPE)：如本文所用，术语“等位基因特异性引物延伸(ASPE)”是指利用与相应DNA序列杂交并依赖于这类引物的3’末端核苷酸的成功杂交而延伸的引物的突变检测方法。通常，将具有与靶序列形成完美匹配的3'末端核苷酸的延伸引物延伸以形成延伸产物。可以将修饰的核苷酸掺入延伸产物中，这样的核苷酸有效地标记延伸产物以用于检测目的。或者相反，延伸引物可包含与靶序列形成错配的3'末端核苷酸。在这种情况下，除非用于延伸的聚合酶无意中具有核酸外切酶活性，否则不会发生引物延伸。
扩增：如本文所用，术语“扩增”是指本领域已知的用于复制靶核酸，从而增加所选核酸序列的拷贝数的任何方法。扩增可以是指数的或线性的。靶核酸可以是DNA或RNA。通常，以这种方式扩增的序列形成“扩增子”。扩增可用多种方法完成，包括但不限于，聚合酶链反应(“PCR”)，基于转录的扩增，等温扩增，滚环扩增等。可以用引物对的相对相似量的每种引物进行扩增，以产生双链扩增子。然而，如本领域中众所周知的，不对称PCR可用于主要地或专门地扩增单链产物(例如，Poddar,Molec.And Cell.Probes 14:25-32(2000))。这可以使用每对引物通过显著降低一个引物相对于该对中的另一引物的浓度(例如，相差100倍)来实现。通过不对称PCR的扩增通常是线性的。本领域技术人员将理解可以一起使用不同的扩增方法。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方式中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方式中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、家兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆。
约：如本文所用，术语“约”或“大约”应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方式中，术语“约”或“大约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或更少的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中可以明显看出(除非此类数字超过可能值的100％)。同样，在整个申请中，术语“约”用于表示一个值包括该设备、用于确定该值的方法或样本之间存在的变异的固有误差变化。
与感兴趣的综合征或疾病相关：如本文所用，“与感兴趣的综合征或疾病相关”是指与非综合征或非疾病对照相比，在具有感兴趣的综合征或疾病的患者中发现更多的变体。通常，可以通过测定多个患者来确定这种关联的统计显著性。
生物样品和样品：如本文所用，术语“生物样品”涵盖从生物来源获得的任何样品。作为非限制性实例，生物样品可包括血液，血浆，血清，液体或组织活检，尿液，粪便，表皮样品，皮肤样品，颊拭子，精子，羊水，培养细胞，骨髓样品和/或绒毛膜绒毛。方便的生物样品可以通过例如从颊腔表面刮下细胞而获得。术语生物样品包括已经被处理以释放或以其他方式使核酸或蛋白质可用于本文所述的检测的样品。还包括无细胞核酸(例如DNA或RNA)，例如在血浆、羊水等中发现的核酸。例如，生物样品可以包括通过从生物样品中的细胞逆转录RNA获得的cDNA。所述生物样品可以从生命阶段例如胎儿、年轻成年人、成年人等获得。还可以使用固定或冷冻的组织。
生物标志物：如本文所用，术语“生物标志物”或“标志物”是指一种或多种核酸、多肽和/或其他生物分子(例如胆固醇、脂质)，其可用于诊断或帮助诊断感兴趣的疾病或综合征或预后的(单独或与其他生物标志物组合)；监测感兴趣的疾病或综合征的进展；和/或监测感兴趣的综合征或疾病的治疗效果。
结合剂：如本文所用，术语“结合剂”是指可以特异性地和选择性地结合至第二(即不同)目的分子的分子。该相互作用可以是非共价的，例如由氢键、范德华相互作用或静电或疏水性相互作用所致，或者可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物联合(即，共价或非共价结合)的结合剂。
携带者：术语“携带者”是指无症状但携带可以传递给他/她的孩子的突变的人。通常，对于常染色体隐性遗传疾病，携带者具有一个包含引起疾病的突变的等位基因，和正常的或与疾病无关的第二等位基因。
编码序列对非编码序列：如本文所用，术语“编码序列”是指可被转录和/或翻译以产生用于其多肽或其片段的mRNA的核酸或其互补序列或其一部分的序列。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的外显子，它们通过细胞的生化机制连接在一起以提供成熟的mRNA。反义链是这种核酸的互补物，并且可以从其推导编码序列。如本文所用，术语“非编码序列”是指在体内不转录成氨基酸或tRNA不相互作用以放置或试图放置氨基酸的核酸或其互补序列或其一部分的序列。非编码序列既包括基因组DNA的内含子序列或未成熟的初级RNA转录本，也包括与基因关联的序列，例如启动子、增强子、沉默子等。
互补体：如本文所用，术语“互补体”、“互补”和“互补性”是指根据Watson/Crick配对规则的核苷酸序列配对。例如，序列5'-GCGGTCCCA-3'具有5'-TGGGACCGC-3'的互补序列。互补序列也可以是与DNA序列互补的RNA序列。天然核酸中不常见的某些碱基可包括在互补核酸中，包括但不限于，肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补不一定是完美的；稳定的双链体可能包含错误匹配的碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以考虑以下许多变量根据经验确定双链体稳定性，包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。
保守的：如本文所用，术语“保守的残基”是指在具有相同结构和/或功能的多种蛋白质中相同的氨基酸。保守残基的区域对于蛋白质结构或功能可能是重要的。因此，在三维蛋白质中鉴定出的连续保守残基对于蛋白质结构或功能可能很重要。为了找到3-D结构的保守残基或保守区域，可以对来自不同物种或相同物种的个体的相同或相似蛋白质的序列进行比较。
对照：如本文所用，术语“对照”具有其本领域理解的含义，即与结果进行比较的标准。通常，使用对照来增加实验的完整性，其通过分离变量以便得出有关此类变量的结论。在一些实施方式中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较物的反应或测定。在一个实验中，应用了“测试”(即正在测试的变量)。在第二个实验中，“对照”未应用要测试的变量。在一些实施方式中，对照是历史对照(即，先前实施的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施例中，对照是或包括打印的或以其他方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
生物标志物的“对照”或“预定标准”是指健康受试者中生物标志物的表达水平或所述生物标志物在来自同一受试者的未患病或无症状的组织中的表达水平。给定生物标志物的对照或预定标准表达水平或蛋白质量可以通过仅使用常规实验的前瞻性和/或回顾性统计研究来确定。这样的预定标准表达水平和/或蛋白质水平(量)可以由本领域普通技术人员使用熟知的方法来确定。
粗制品：如本文所用，术语“粗制品”在与生物样品结合使用时是指处于基本上未精制状态的样品。例如，粗制样品可以是细胞裂解物或活检组织样品。粗制样品可能以溶液形式存在或以干制剂形式存在。
缺失：如本文所用，术语“缺失”涵盖从天然存在的核酸中去除一个或多个核苷酸的突变。
感兴趣的疾病或综合征：如本文所用，感兴趣的疾病或综合征是与吸入致癌物暴露相关的疾病。
检测：如本文所用，术语“检测”或“检测到”包括“测量”或“已测量”，反之亦然。
可检测的部分：如本文所用，术语“可检测的部分”或“可检测的生物分子”或“报道分子”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，可检测的部分可包含可用于将底物转化为可测量的产物(例如，可见产物)的酶。或者，可检测部分可以是可以定量的放射性同位素。或者，可检测的部分可以是荧光团。或者，可检测部分可以是发光分子。或者，可以使用其他可检测的分子。
表观遗传：如本文所用，表观遗传元件可以通过不同于基础DNA序列变化的机制改变基因表达。这样的元件可以包括调节副突变、印记、基因沉默、X染色体失活、位置效应、重编程、基因转应(transvection)、母体效应、组蛋白修饰和异染色质的元件。
表位：如本文所用，术语“表位”是指与特定抗体或抗体样蛋白质接触的分子或分子化合物(例如，多肽或蛋白质复合物)的片段或部分。
外显子：如本文所用，外显子是在RNA的其他部分(例如，称为内含子的中间区域)已通过RNA剪接除去后在成熟或加工的RNA中发现的核酸序列。这样，外显子序列通常编码蛋白质或蛋白质的一部分。内含子是通过RNA剪接从外显子周围的序列中除去的RNA部分。
表达和表达的RNA：如本文所用，表达的RNA是编码蛋白质或多肽的RNA(“编码RNA”)，以及转录但未翻译的任何其他RNA(“非编码RNA”)。本文所用的术语“表达”是指从DNA产生多肽的过程。该过程涉及基因转录成mRNA和该mRNA翻译成多肽。取决于使用的上下文，“表达”可以指RNA、蛋白质或两者的产生。
可以通过用于检测转录分子或其相应蛋白质表达的多种众所周知的方法中的任一种来评估本公开的蛋白质的量和/或生物标志物的表达的测量。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌的蛋白质的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定，核酸杂交方法，核酸逆转录方法和核酸扩增方法。在某些实施方式中，使用抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白质-配体对(例如生物素-链霉亲和素)的蛋白或配体缀合的抗体)、或与对应于标志物基因的蛋白质(例如由对应于标志物基因的开放阅读框编码的蛋白质或例如已经历其正常翻译后修饰的全部或部分的蛋白质)特异性结合的抗体片段(例如单链抗体、分离的抗体高变域等)。在某些实施方式中，试剂可以直接或间接地用可检测物质标记。可检测的物质可以例如选自由放射性同位素、荧光化合物、酶和酶辅因子组成的组。标记抗体的方法是本领域众所周知的。
在另一个实施方式中，通过从样品中的细胞制备mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)，并且通过使mRNA/cDNA与参考多核苷酸(其为包含标志物基因的多核苷酸的互补物)及其片段杂交来评估标志物基因的表达。在与参考多核苷酸杂交之前，任选地可以使用多种聚合酶链反应方法中的任一种来扩增cDNA；优选地，不将其扩增。
家族史：如本文所用，术语“家族病史”通常是指与包括父母和兄弟姐妹在内的个人直系亲属有关的事件(例如疾病相关的病症或突变携带者)的发生。家族史也可以包括祖父母和其他亲戚。
侧翼：如本文所用，术语“侧翼”是指引物与靶核酸杂交，该靶核酸邻接想要在靶上扩增的感兴趣区域。本领域技术人员将理解，优选的引物是从感兴趣区域(各在靶双链DNA分子的一条链上)3'杂交的引物对，使得核苷酸可以通过合适的DNA聚合酶加到引物的3'端。例如，在突变序列侧翼的引物实际上不与突变序列退火，而是与邻接突变序列的序列退火。在某些情况下，通常将外显子侧翼的引物设计为不与外显子序列退火，而是与邻接外显子的序列(例如内含子序列)退火。但是，在某些情况下，扩增引物可设计为与外显子序列退火。
基因：如本文所用，基因是遗传单位。通常，基因是编码蛋白质或功能性RNA的DNA的一部分。基因是对应于遗传单位的基因组序列的可定位区域。基因可以与调节区、转录区和/或其他功能序列区相关。
基因型：如本文所用，术语“基因型”是指生物的遗传组成。更具体地说，该术语是指个体中存在的等位基因的身份。个体或DNA样品的“基因分型”是指鉴定个体在已知多态性位点处拥有的两个等位基因的性质(根据核苷酸碱基)。
基因调控元件：如本文所用，基因调控元件或调控序列是DNA的片段，其中诸如转录因子的调控蛋白在该处结合以调控基因表达。这样的调节区通常在被调节基因的上游。
健康个体：如本文所用，术语“健康个体”或“对照”是指尚未被诊断患有目标综合征和/或疾病的受试者。
杂合：如本文所用，术语“杂合”或“HET”是指具有相同基因的两个不同等位基因的个体。如本文所用，术语“杂合”包括“复合杂合”或“复合杂合突变体”。如本文所用，术语“复合杂合”是指具有两个不同等位基因的个体。如本文所用，术语“复合杂合突变体”是指具有等位基因的两个不同拷贝的个体，这类等位基因被表征为基因的突变体形式。
纯合：如本文所用，术语“纯合”是指具有相同等位基因的两个拷贝的个体。如本文所用，术语“纯合突变体”是指具有相同等位基因的两个拷贝的个体，这类等位基因被表征为基因的突变体形式。
杂交：如本文所用，术语“杂交”是指两个互补核酸链在适当严格的条件下彼此退火的过程。适用于杂交的寡核苷酸或探针通常长度含有10～100个核苷酸(例如长度为18～50、12～70、10～30、10～24、18～36个核苷酸)。核酸杂交技术是本领域众所周知的。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所需水平的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的例子，参见例如，Sambrook等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel，F.M.等,1994,Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。
同一性或百分比同一性：如本文所用，术语“同一性”或“百分比同一性”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。百分比同一性可以通过比对两个序列来确定，并且是指被比较序列共有的位置上相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数目。序列比对和比较可以使用本领域标准的算法(例如Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2444)或通过这些算法的计算机版本(Wisconsin Genetics软件包7.0版，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，WI)公开发行为BLAST和FASTA进行。另外，可通过美国国立卫生研究院(Bethesda MD)获得的ENTREZ可用于序列比较。在其他情况下，可以使用商用软件(例如GenomeQuest)确定同一性百分比。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如，BLASTN；可在国家生物技术信息中心的网站上获得)。在一个实施方式中，可以使用缺口权重为1的GCG确定两个序列的同一性百分比，使得每个氨基酸缺口被加权为如同它是两个序列之间的单个氨基酸错配一样。或者，可以使用ALIGN程序(2.0版)，该程序是GCG(Accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚)序列比对软件包的一部分。
如本文所使用的，术语与其至少90％相同包括与所指示序列具有90-100％同一性的序列，并且包括其间的所有范围。因此，术语与其至少90％相同包括与指示的序列91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％相同的序列。类似地，术语“至少70％相同包括范围在70至100％相同的序列，且包括其间的所有范围。使用本文描述的算法确定百分比同一性。
插入或添加：如本文所用，术语“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列的变化，与天然存在的分子相比分别导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的添加。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物例如人类或非人类动物内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)已与其最初生产时(无论是在自然界和/或在实验设置中)相关联的至少某些组分分离，和/或(2)由人手生产、准备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与至少约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约98％，约99％，基本上100％或100％的最初与它们关联的其他组分分离。在一些实施方式中，分离的试剂是大于约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，基本上100％或100％纯的。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。如本文所用，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物中的细胞。
标记的：术语“标记的”和“用可检测的试剂或部分标记的”在本文中可互换使用，以指定可通过检测标记(例如，可视化的、检测放射性等)来测量的实体(例如，核酸探针、抗体等)，例如在结合至另一实体(例如核酸、多肽等)之后。可以选择可检测的试剂或部分，使得其产生可以被测量并且其强度与结合实体的量有关(例如成比例)的信号。用于标记和/或检测蛋白质和肽的各种各样的系统是本领域已知的。标记的蛋白质和肽可通过掺入或缀合于可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学、化学或其他方式检测的标记来制备。标记或标记部分可以直接检测(即不需要任何进一步的反应或操作即可检测，例如荧光团可直接检测)或间接检测(即通过与另一种可检测的实体反应或结合使其可检测，例如半抗原可通过与包含报道分子(例如荧光团)的适当抗体反应后进行免疫染色来检测)。合适的可检测试剂包括但不限于放射性核苷酸、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标、适体信标等。
微RNA：如本文所用，微RNA(miRNA)是短的(20-24个核苷酸)非编码RNA，其参与基因表达的转录后调节。微RNA可以影响mRNA的稳定性和翻译。例如，微RNA可以结合靶mRNA的3'UTR中的互补序列，并导致基因沉默。miRNA被RNA聚合酶II转录为带帽的和聚腺苷酸化的初级转录本(pri-miRNA)的一部分，该转录本可以是编码蛋白质的也可以是非编码的。初级转录物可以被Drosha核糖核酸酶III酶切割以产生约70个核苷酸的茎环前体miRNA(pre-miRNA)，然后可以被细胞质Dicer核糖核酸酶切割以产生成熟的miRNA和反义miRNA星(miRNA*)产物。可以将成熟的miRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物可以通过与miRNA的不完美碱基配对来识别靶mRNA，并且最常见的是导致靶mRNA的翻译抑制或不稳定。
多重PCR：如本文所用，术语“多重PCR”是指同时扩增两个或更多个区域，每个区域使用不同的引物对引发。
多重ASPE：如本文所用，术语“多重ASPE”是指组合多重PCR和等位基因特异性引物延伸(ASPE)以检测多态性的测定。通常，使用多重PCR首先扩增将充当ASPE引物的靶序列的DNA区域。参见等位基因特异性引物延伸的定义。
突变和/或变体：如本文所用，术语突变和变体可互换使用，以描述核酸或蛋白质序列的变化。如本文所用，术语“突变体”是指基因的突变的或潜在的无功能形式。该术语包括使基因无功能的任何突变(从点突变到大的染色体重排)，如本领域已知的。
核酸：如本文所用，“核酸”是多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。该术语用于包括单链核酸、双链核酸以及由核苷酸或核苷类似物制备的RNA和DNA。
多肽或蛋白质：如本文所用，术语“多肽”和/或“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，没有特定的长度。因此，在多肽和/或蛋白质的定义内包括肽、寡肽和蛋白质。“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以描述可包含部分或全长蛋白质的蛋白质分子。除非上下文另外指出，否则术语“肽”用于表示小于全长的蛋白质或非常短的蛋白质。
如本领域已知，“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是氨基酸(通常为L-氨基酸)的链，其α碳经由肽键连接，该肽键通过一个氨基酸的α碳的羧基基团与另一个氨基酸的α碳的氨基集团之间的缩合反应形成。通常，构成蛋白质的氨基酸按顺序编号，从氨基末端残基开始，并朝着蛋白质的羧基末端残基的方向增加。氨基酸残基的缩写是本领域中用来指20种常见L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母编码。
如本文所用，多肽或蛋白质“域/结构域”包括沿着多肽或蛋白质的区域，该区域包含独立的单元。可以根据结构、序列和/或生物学活性来定义域。在一个实施方式中，多肽结构域可包含蛋白质区域，该区域以基本上独立于其余蛋白质的方式折叠。可以使用域数据库来鉴定域，例如但不限于PFAM，PRODOM，PROSITE，BLOCKS，PRINT，SBASE，ISREC PROFILES，SAMRT和PROCLASS。
引物：如本文所用，术语“引物”是指能够与核酸样品中的互补序列杂交的短的单链寡核苷酸。通常，引物用作模板依赖性DNA合成的起始点。脱氧核糖核苷酸可以通过DNA聚合酶添加至引物。在一些实施方式中，将此类脱氧核糖核苷酸添加至引物也称为引物延伸。如本文所用，术语引物包括可以合成的所有形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。用于PCR反应的“引物对”或“引物组”通常是指一般包括“正向引物”和“反向引物”的引物组。如本文所用，“正向引物”是指与dsDNA的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链退火。
多态性：如本文所用，术语“多态性”是指一种以上形式的基因或其部分并存。
部分和片段：如本文所用，术语“部分”和“片段”可互换使用，是指多肽、核酸或其他分子构建体的部分。
有义链对反义链：如本文所用，术语“有义链”是指双链DNA(dsDNA)的包含功能性蛋白质的编码序列的至少一部分的链。如本文所用，术语“反义链”是指dsDNA的链，其是有义链的反向互补序列。
显著差异：如本文所用，术语“显著差异”完全在本领域技术人员的知识范围内，并且将参照每个特定的生物标志物凭经验确定。例如，与健康受试者相比，在具有感兴趣的疾病或综合征的受试者中生物标志物表达的显著差异是蛋白量上的任何统计学显著的差异。
相似或同源物：如本文所用，术语“相似”或“同源物”在指氨基酸或核苷酸序列时是指与野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性的多肽。同源性比较可以通过肉眼进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的百分比同源性(例如，Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730)。例如，同源序列可以被认为包括以下氨基酸序列，其在备选的实施方式中为彼此至少70％相同，75％相同，80％相同，85％相同，90％相同，95％相同，97％相同或98％相同。
特异性：如本文所用，术语”特异/特异性”当与寡核苷酸引物一起使用时，是指寡核苷酸或引物，其在适当的杂交或洗涤条件下能够与感兴趣的靶标杂交而基本上不与不感兴趣的核酸杂交。优选较高水平的序列同一性，并且包括至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，特异性寡核苷酸或引物包含至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更多个当寡核苷酸和核酸比对时与待杂交或扩增的核酸的部分具有序列同一性的碱基。
如本领域中已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以描述为从低到高严格性。通常，高度严格的杂交条件是指在高温下在低盐缓冲液中洗涤杂交体。杂交可以使用本领域标准的杂交溶液(例如0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS))在65℃过滤结合的DNA，然后在0.25M NaHPO4、3.5％SDS中洗涤，接着在从室温到68℃的温度范围(取决于探针的长度)0.1×SSC/0.1％SDS洗涤(参见例如Ausubel，F.M.等人，Short Protocols in MolecularBiology，第4版，第2章，John Wiley&Sons，N.Y)。例如，高严格度洗涤包括在37℃用6×SSC/0.05％焦磷酸钠洗涤14个碱基的寡核苷酸探针，或在48℃洗涤17个碱基的寡核苷酸探针，或在55℃洗涤20个碱基的寡核苷酸探针，或在60℃洗涤25个碱基的寡核苷酸探针，或在65℃洗涤长约250个核苷酸的核苷酸探针。核酸探针可以用放射性核苷酸标记，其通过例如用[γ-32P]ATP末端标记或通过随机引物标记掺入放射性标记的核苷酸，例如[α-32P]dCTP。或者，可以通过掺入生物素化的或荧光素标记的核苷酸来标记探针，并使用链霉亲和素或抗荧光素抗体检测探针。
siRNA：如本文所用，siRNA(小抑制性RNA)基本上是由约20个互补核苷酸组成的双链RNA分子。siRNA是由较大的双链(ds)RNA分子分解产生的。siRNA可以通过siRNA与mRNA的相互作用将其对应的mRNA固有地分为两部分来抑制基因表达，从而导致mRNA降解。siRNA也可以与DNA相互作用，以促进染色质沉默和异染色质的扩张。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物。受试者可以是患者，其是指向医疗提供者寻求诊断或治疗疾病的人。人类包括产前和产后形式。同样，如本文所用，术语“个体”，“受试者”或“患者”包括所有温血动物。在一个实施方式中，受试者是人。在一个实施方式中，个体是患有与暴露于吸入致癌物相关的疾病或具有增加的形成与吸入致癌物暴露相关疾病的风险的受试者。
基本上/实质上：如本文所用，术语“基本上”是指展现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完全达到和/或进展到完全达到或实现或避免绝对的结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来涵盖许多生物学和化学现象中固有的潜在的完全性缺失。
基本上互补：如本文所用，术语“基本上互补”是指可以在严格杂交条件下杂交的两个序列。本领域技术人员将理解，基本上互补的序列不需要沿其整个长度杂交。在一些实施方式中，“严格杂交条件”是指至少如下严格的杂交条件：在50％甲酰胺，5×SSC，50mMNaH2PO4，pH 6.8，0.5％SDS，0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5×Denhart溶液在42℃过夜杂交；在45℃用2×SSC，0.1％SDS洗涤；并在45℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤。在一些实施方式中，严格的杂交条件不应允许在一段20个连续核苷酸之间的差异超过两个碱基的两个核酸的杂交。
取代：如本文所用，术语“取代”是指与天然分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸代替。
患有：患有“疾病”、“病症”和/或“状况”的个体已被诊断出患有或表现出该疾病、病症和/或状况的一种或多种症状。
易感于：“易感于”某疾病、病症和/或状况的个体尚未被诊断出患有该疾病、病症和/或状况。在一些实施方式中，易感于某疾病、病症和/或状况的个体可能不表现出该疾病、病症和/或状况的症状。在一些实施方式中，易感于某疾病、病症和/或状况的个体将形成该疾病、病症和/或状况。在一些实施方式中，易感于某疾病、病症和/或状况的个体将不会形成该疾病、病症和/或状况。
固体支持物：术语“固体支持物”或”支持物”是指提供可结合生物分子的基底的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即例如，微量滴定板)，或者固体支持物可以是阵列上的位置，或者可以是移动性支持物，例如珠子。
上游和下游：如本文所用，术语“上游”是指在分子是蛋白质的情况下，残基在第二个残基的N-末端，或在分子是核酸的情况下，残基在第二个残基的5′。同样如本文所用，术语“下游”是指在分子是蛋白质的情况下，残基在第二残基的C-末端，或在分子是核酸的情况下，残基在第二残基的3′。本文公开的蛋白质、多肽和肽序列均从N末端氨基酸至C末端氨基酸列出，本文公开的核酸序列均从分子5'端至分子3'端列出。
【概述】
本文公开内容提供了在感兴趣的疾病和/或综合征基因中鉴定的新突变，其可用于更准确地诊断与感兴趣的基因和/或综合征相关的疾病。
在一些实施方式中，样品包含蛋白质。在一些实施方式中，测试步骤包括氨基酸测序。在一些实施方式中，测试步骤包括使用一种或多种特异性识别感兴趣的生物标志物的抗体进行免疫测定。在一些实施方式中，测试步骤包括蛋白酶消化(例如，胰蛋白酶消化)。在一些实施方式中，测试步骤还包括进行2D凝胶电泳。
在一些实施方式中，样品包含核酸。在一些实施方式中，测试步骤包括核酸测序。在一些实施方式中，测试步骤包括杂交。在一些实施方式中，使用对感兴趣的生物标志物中的区域具有特异性的一种或多种寡核苷酸探针进行杂交。在一些实施方式中，为了检测突变，在足够严格以不允许单核苷酸错配的条件下进行杂交。在一些实施方式中，用微阵列进行杂交。在一些实施方式中，测试步骤包括限制酶消化。在一些实施方式中，测试步骤包括PCR扩增。在一些实施方式中，PCR扩增是数字PCR扩增。在一些实施方式中，测试步骤包括引物延伸。在一些实施方式中，引物延伸是单碱基引物延伸。在一些实施方式中，测试步骤包括进行多重等位基因特异性引物延伸(ASPE)。
在一些实施方式中，测试步骤包括使用质谱测定一种或多种生物标志物的存在。在一些实施方式中，质谱形式选自矩阵辅助激光解吸/电离、飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾(ES)、IR-MALDI、离子回旋共振(ICR)、傅立叶变换、及其组合。
在一些实施方式中，样品获自细胞，组织(例如组织或液体活检)，全血，液体或组织活检，无细胞核酸(例如DNA或RNA)，漱口液，血浆，血清，尿液，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品，绒毛膜绒毛样品培养物，羊水，羊水培养物，经宫颈灌洗液或其组合。在进一步的实施方式中，样品获自孕妇的血液或血液制品(例如血浆或血清)和/或胎儿DNA。在某些实施方式中，样品是来自血浆、羊水等的无细胞核酸(例如，DNA或RNA)。
在一些实施方式中，测试步骤包括测定生物标志物中预定位置处核苷酸和/或氨基酸的身份。在一些实施方式中，通过将预定位置处的核苷酸和/或氨基酸的身份与对照进行比较来确定突变的存在。
在实施方式中，该方法可以包括在多个个体中进行测定(例如测序)以确定该关联的统计学显著性。
在另一方面，本公开提供了用于检测感兴趣的生物标志物的试剂，例如但不限于，与生物标志物(例如，DNA序列中的突变)特异性结合的核酸探针，或包含一个或多个特异性结合生物标志物的探针的阵列。在一些实施方式中，本公开提供了与生物标志物特异性结合的抗体。在一些实施方式中，本公开提供了包含一种或多种这类试剂的试剂盒。在一些实施方式中，所述一种或多种试剂以微阵列的形式提供。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含用于引物延伸的试剂。在一些实施方式中，试剂盒还包含指示健康个体的对照。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含关于如何基于感兴趣的标志物确定个体是否患有感兴趣的综合征或疾病的说明书。
在一些情况下，在某些实施方式中，可以通过以下方法检测一种或多种生物标志物的量：(a)检测由所述一种或多种生物标志物调节的多肽或蛋白质的量；(b)检测调节所述生物标志物的多肽或蛋白质的量；或(c)检测生物标志物代谢物的量。
在又一方面，本文中的公开提供了一种计算机可读介质，其编码对应于生物标志物检测的信息。
【用于诊断与暴露于吸入致癌物有关的疾病的方法和组合物】
本公开的实施方式包含用于诊断与致癌物的吸入和/或暴露于吸入致癌物有关的一种或多种疾病的存在或增加的形成该疾病风险的组合物和方法。本公开的方法和组合物可以用于从受试者获得或提供遗传信息，以便客观地诊断该受试者中的存在或增加的风险，或其他受试者形成这类疾病。该方法和组合物可以以多种方式体现。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与至少一种肺癌(LC)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
在一个实施方式中，公开了一种在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的生物标志物的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得样品；并测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量和/或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
另外和/或备选地，该方法可以包括测量至少一种标准化(例如持家)基因。在一个非限制性实施方式中，持家基因可以是甘油醛3-磷酸脱氢酶。或者，可以使用其他持家基因。或者，可以执行这些标志物的各种组合的测量。
另外和/或备选地，可以测量其他生物标志物。
如本文所公开的，可以使用多种方法来测量感兴趣的生物标志物。在一个实施方式中，所述测量包括测量肽或多肽生物标志物。例如，在一个实施方式中，所述测量包括免疫测定。或者，该测量可以包括流式细胞术。或者，如本文详细讨论的，可以使用核酸方法。
可以使用多种样品类型。在某些实施方式中，样品包括血液，血清，血浆，无细胞核酸(例如DNA或RNA)，或液体或组织活检。
在某些实施方式中，本公开提供了一种鉴定与个体暴露于吸入致癌物有关的标志物的方法。该方法可以包括以下步骤：鉴定在与吸入致癌物有关的疾病中与对照个体或群体相比表达增加或减少的至少一种标志物，所述疾病例如但不限于肺癌(LC)，慢性阻塞性肺病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)。在一个实施方式中，对照是没有检测到或没有可检测到的肺或心血管病理的健康个体。在一些实施方式中，对照是疾病对照。这类疾病对照可以包括患有与暴露于吸入致癌物无关的肺或心脏病的个体。
在其他实施方式中，本公开提供了一种在个体中检测与暴露于吸入致癌物相关的疾病的存在或对其易感性的方法，包括：从个体获得样品；测量样品中与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种相关的至少一种标志物的量；并将样品中肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种的基因的表达和/或突变的存在与每个标志物的对照值比较。在一个实施方式中，从健康个体或没有检测到或没有可检测到的肺或心血管病理的个体确定对照值。在一些实施方式中，对照是疾病对照。这类疾病对照可以包括患有与暴露于吸入致癌物无关的肺或心脏病的个体。
该方法可以包括在个体中检测与至少一种肺癌(LC)有关的生物标志物，包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
另外和/或备选地，该方法可以包括在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的生物标志物，包括以下步骤：从所述个体获得样品；以及测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
另外和/或备选地，该方法可以包括在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的生物标志物，包括以下步骤：从所述个体获得样品；并测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量和/或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
另外和/或备选地，可以测量其他生物标志物。
如本文所公开的，可以使用多种方法来测量感兴趣的生物标志物。在一个实施方式中，所述测量包括测量肽或多肽生物标志物。例如，在一个实施方式中，所述测量包括免疫测定。或者，该测量可以包括流式细胞术。或者，如本文详细讨论的，可以使用核酸方法。
可以使用多种样品类型。在某些实施方式中，样品包括血液，血清，血浆，液体或组织活检，或无细胞的核酸(例如DNA或RNA)。
其他另外的实施方式包括用于检测与疾病相关的生物标志物的组合物，该疾病与个体暴露于吸入的致癌物相关。在某些实施方式中，该组合物包含试剂，该试剂量化标志物的量，和/或编码以下至少一种标志物的基因或调节其表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变，该标志物与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中的至少一种相关。
所述组合物可包含用于在个体中检测与肺癌(LC)有关的生物标志物的试剂，该检测通过测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
另外和/或备选地，组合物可以包含用于在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的生物标志物的试剂，该检测通过测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
另外和/或备选地，组合物可以包含用于在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的生物标志物的试剂，该检测通过测量标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
另外和/或备选地，该组合物可以包含用于测量至少一种标准化(例如持家)基因的试剂。在一个非限制性实施方式中，持家基因可以是甘油醛3-磷酸脱氢酶。或者，可以使用其他持家基因。或者，可以执行这些标志物的各种组合的测量。在一个实施方式中，该组合物可以包含用于在对照中测量感兴趣的标志物的值的试剂。对照值是从健康个体或没有检测到或没有可检测到的肺部或心血管疾病的个体中确定的。在一些实施方式中，对照是疾病对照。这类疾病对照可以包括患有与暴露于吸入致癌物无关的肺或心脏病的个体。
例如，如本文中详细描述的，所述组合物可包含用于测量肽或多肽生物标志物的试剂。在一个实施方式中，该组合物包含进行免疫测定的试剂。或者，该组合物可以包含进行流式细胞术的试剂。或者，如本文中详细讨论的，所述组合物可以包含用于确定核酸的特定序列和/或表达水平的存在的试剂。
其他实施方式包括含有至少一些本文公开的组合物和/或用于执行本文公开的方法的试剂的试剂盒。这类试剂盒可以包括计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于执行该方法的说明和/或其他信息。在一个实施方式中，试剂盒可包含用于测量对照中感兴趣的标志物的值或感兴趣的标志物的对照值的试剂。可以从健康个体或没有检测到或没有可检测到的肺或心血管病理的个体中确定对照值。在一些实施方式中，对照是疾病对照。这类疾病对照可以包括患有与暴露于吸入致癌物无关的肺或心脏病的个体。
其他实施方式包括说明或其他信息和/或计算机可读介质，该计算机可读介质包含用于执行(独立于其中的试剂盒或试剂)所述方法的说明和/或其他信息。
【肽、多肽和蛋白质测定】
在某些实施方式中，在蛋白质(或肽或多肽水平)检测感兴趣的生物标志物，即分析基因产物。例如，可以通过氨基酸测序方法，或使用一种或多种特异性识别感兴趣的生物标志物上存在的一个或多个表位、或在某些情况下对感兴趣突变具有特异性的抗体的免疫分析法对蛋白质或其片段进行分析。还可以通过蛋白酶消化(例如，胰蛋白酶消化)来分析蛋白质，并且在一些实施方式中，可以通过2D凝胶电泳来进一步分析消化的蛋白质产物。
【抗体检测】
可将结合感兴趣的生物标志物的特异性抗体用于本领域已知的多种方法中的任一种中。可以使用本领域中多种已知方法中的任一种来产生针对特定表位、多肽和/或蛋白质的抗体。例如，可以产生期望针对的表位、多肽或蛋白质的抗体，将其注射入动物，通常是哺乳动物(例如驴，小鼠，兔，马，鸡等)，以及可以从动物收集由该动物产生的抗体。单克隆抗体也可以通过产生杂交瘤来产生，所述杂交瘤用永生细胞系表达感兴趣的抗体。
在一些实施方式中，抗体用本文所述的可检测部分标记。
抗体检测方法是本领域众所周知的，包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹。一些这类方法适合于以阵列形式执行。
例如，在一些实施方式中，使用特异性识别生物标志物的第一抗体(或抗体片段)来检测目的生物标志物。抗体可以用可检测部分(例如化学发光分子)、酶或第二结合剂(例如链霉亲和素)标记。或者，如本领域中已知的，可以使用二抗来检测一抗。
在某些实施方式中，该方法可以进一步包括添加捕获支持物，该捕获支持物包含至少一种捕获支持物结合剂，该结合剂识别并结合生物标志物以将该生物标志物固定在捕获支持物上。在某些实施方式中，该方法可以进一步包括添加第二结合剂，其可以特异性地识别并结合捕获支持物上的多个结合剂分子中的至少一些。在一个实施方式中，可以特异性识别并结合在捕获支持物上的多个结合剂分子中的至少一些的结合剂是可溶性结合剂(例如，二抗)。第二结合剂可以被标记(例如，用酶)，从而通过添加酶的底物并量化形成的产物的量来测量感兴趣的生物标志物的结合。
在一个实施方式中，捕获固体支持物可以是测定孔(即，例如微量滴定板)。或者，捕获固体支持物可以是阵列上的位置，也可以是可移动的支持物，例如珠子。或者，捕获支持物可以是滤器。
在一些情况下，可以使生物标志物与第一结合剂(例如，对生物标志物具有特异性并用可检测部分标记的一抗)和第二结合剂(例如，识别一抗的第二抗体或二抗)复合，其中第二结合剂与第三结合剂(例如生物素)复合，然后可以与捕获支持物(例如磁珠)相互作用，该捕获支持物具有识别连接于捕获支持物的第三结合剂的试剂(例如链霉亲和素)。然后可以使用磁体(例如，磁性探针)捕获复合物(标记的一抗:生物标志物:二抗-生物素:链霉亲和素-珠子)以测量复合物的量。
在本公开的方法中可以使用多种结合剂。例如，附着于捕获支持物或二抗的结合剂可以是识别生物标志物的抗体或抗体片段。或者，结合剂可包含结合非蛋白的靶的蛋白质(即，诸如特异性结合小分子生物标志物的蛋白质或结合蛋白质的受体)。
在某些实施方式中，固体支持物可以用钝化剂处理。例如，在某些实施方式中，感兴趣的生物标志物可以被捕获在钝化的表面(即，已经被处理以减少非特异性结合的表面)上。一种这样的钝化剂是BSA。另外和/或备选地，在使用的结合剂是抗体的情况下，固体支持物可以用蛋白A，蛋白G，蛋白A/G，蛋白L或与结合剂高亲和力结合的另一种试剂(例如，抗体)包被。这些蛋白质结合抗体的Fc结构域，因此可以确定识别感兴趣的一种或多种蛋白质的抗体结合的方向。
【核酸测定】
在某些实施方式中，本文公开的生物标志物在核酸水平检测。在一个实施方式中，本公开包括用于诊断受试者中感兴趣的综合征或疾病(例如，与暴露于吸入致癌物相关的疾病)的存在或增加的形成风险的方法。该方法可以包括以下步骤：从受试者的组织或体液样品中获得核酸，并进行测定以鉴定受试者的核酸中是否存在变体序列(即，突变)。在某些实施方式中，该方法可以包括将变体与与感兴趣的综合征或疾病相关的已知变体进行比较，并确定该变体是否是先前已被鉴定为与感兴趣的综合征或疾病相关的变体。或者，该方法可以包括将变体鉴定为新的、先前未表征的变体。如果变体是新的变体，则该方法可以进一步包括进行分析以确定该突变是否预期对该基因的表达和/或该基因编码的蛋白质的功能有害。该方法可以进一步包括使用变异概况(即，在受试者中鉴定的突变的汇编)来诊断感兴趣的综合征或疾病的存在或感兴趣的综合征或疾病的形成风险增加。
可以对基因组DNA、无细胞核酸(例如DNA或RNA)、信使RNA和/或cDNA进行核酸分析。还有，在各种实施方式中，核酸包含基因、RNA、外显子、内含子、基因调节元件、表达的RNA、siRNA或表观遗传元件。而且，可以评估包括剪接位点、转录因子结合、A-I编辑位点、微RNA结合位点和功能性RNA结构位点在内的调控元件的突变(即变体)。因此，对于本公开的每种方法和组合物，所述变体可包含涵盖以下至少一项的核酸序列：(1)A至I编辑位点；(2)剪接位点；(3)保守的功能性RNA结构；(4)经验证的转录因子结合位点(TFBS)；(5)微RNA(miRNA)结合位点；(6)聚腺苷酸化位点；(7)已知的调控元件；(8)miRNA基因；(9)在ROI中编码的小核仁RNA基因；和/或(10)胎盘哺乳动物中的超保守元件。
在许多实施方式中，核酸是从生物样品中提取的。或者，核酸可以包含无细胞核酸(DNA或RNA)。在一些实施方式中，在没有扩增的情况下分析核酸。在一些实施方式中，使用本领域已知的技术(例如聚合酶链反应(PCR))扩增核酸，并且在随后的分析中使用扩增的核酸。可以使用多重PCR，其中使用多组引物对一次扩增几个扩增子(例如，来自不同基因组区域)。例如，可以通过测序、杂交、PCR扩增、限制酶消化、引物延伸(例如单碱基引物延伸或多重等位基因特异性引物延伸(ASPE))或DNA测序来分析核酸。在一些实施方式中，以使得野生型等位基因的扩增产物的大小与突变等位基因的大小不同的方式扩增核酸。因此，可以通过检测扩增产物的大小差异(例如在电泳凝胶上)来确定是否存在特定突变等位基因。例如，基因区域的缺失或插入可能特别适合于使用基于大小的方法。
某些示例性核酸分析方法在下面详细描述。
【等位基因特异性扩增】
在一些实施方式中，例如，在针对感兴趣的疾病和/或综合征的生物标志物是突变的情况下，使用等位基因特异性扩增测定法检测生物标志物。该方法被不同地称为特异性等位基因的PCR扩增(PASA)(Sarkar等，1990Anal.Biochem.186:64-68)，等位基因特异性扩增(ASA)(Okayama等，1989，J.Lab.Clin.Med.114:105-113)，等位基因特异性PCR(ASPCR)(Wu等，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:2757-2760)和扩增受阻突变系统(ARMS)(Newton等，1989Nucleic Acids Res.17:2503-2516)。这些参考文献中每一个的全部内容都并入本文。该方法适用于单碱基取代以及微缺失/插入。
例如，对于基于PCR的扩增方法，可以设计扩增引物，使得它们可以区分不同的等位基因(例如，在野生型等位基因和突变等位基因之间)。因此，扩增产物的存在或不存在可用于确定给定核酸样品中是否存在基因突变。在一些实施方式中，可以设计等位基因特异性引物，使得扩增产物的存在指示基因突变。在一些实施方式中，可以设计等位基因特异性引物，使得扩增产物的不存在指示基因突变。
在一些实施方式中，使用两个互补反应。一个反应采用对野生型等位基因具有特异性的引物(“野生型特异性反应”)，另一反应使用对突变型等位基因具有特异性的引物(“突变体特异性反应”)。这两个反应可以使用共同的第二引物。对特定等位基因(例如野生型等位基因或突变型等位基因)具有特异性的PCR引物通常完美匹配靶标的一个等位基因变体，但与其他等位基因变体(例如突变型等位基因或野生型等位基因)错配。错配可能位于引物的3'末端/附近，从而导致完美匹配的等位基因的优先扩增。是否可以从一个或两个反应中检测到扩增产物指示了突变型等位基因的存在或不存在。仅从野生型特异性反应中检测到扩增产物表明仅存在野生型等位基因(例如，野生型等位基因的纯合性)。仅在突变体特异性反应中检测到扩增产物表明仅存在突变型等位基因(例如，突变型等位基因的纯合性)。在两个反应中均检测到扩增产物指示(例如，杂合子)。如本文所使用的，该方法将被称为“等位基因特异性扩增(ASA)”。
通过使用跨连接处部分杂交的引物，还可以将等位基因特异性扩增用于检测重复、插入或倒位。可以改变连接处重叠的程度以允许特异性扩增。
扩增产物可以通过本领域已知的方法来检查，包括通过可视化(例如，用一种或多种染料)核酸的条带，该条带为已经由凝胶迁移(例如，通过电泳)按大小分离的核酸。
【等位基因特异性引物延伸】
在一些实施方式中，使用等位基因特异性引物延伸(ASPE)方法来检测基因突变。ASPE使用等位基因特异性引物，可以在延伸反应中区分等位基因(例如，突变型等位基因和野生型等位基因)，从而仅在特定等位基因(例如，突变型等位基因或野生型等位基因)的存在下获得延伸产物。延伸产物可以是可检测的或变为可检测的，例如通过在延伸反应中使用标记的脱氧核苷酸。多种标记中的任何一种均可相容地用于这些方法，包括但不限于，放射性标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记等。在一些实施方式中，将核苷酸用一种实体标记，该实体随后可以被可检测的标记结合(直接或间接)，例如生物素分子可以被缀合有链霉亲和素的荧光染料结合。在一些实施方式中，反应以多重方式进行，例如在同一延伸反应中使用许多等位基因特异性引物。
在一些实施方式中，延伸产物与固体或半固体支持物杂交，例如珠子、基质、凝胶等。例如，延伸产物可以用特定的核酸序列标记(例如，作为等位基因特异性引物的一部分包括在内)，并且固体支持物可以附接于“抗标签”(例如，延伸产物中与标签互补的核酸序列)。延伸产物可以在固体支持物上捕获和检测。例如，可以分选和检测珠子。可以以这种方式使用的此类系统之一是LUM1NEXTM MAP系统，该系统可适用于TM Bioscience进行的囊性纤维化突变检测，并作为通用珠阵列(TAG-ITTM)商售。
【单核苷酸引物延伸】
在一些实施方式中，使用单核苷酸引物延伸(SNuPE)测定，其中将引物设计为仅延伸一个核苷酸。在这类方法中，已知刚好在引物3'末端下游的核苷酸的身份，且在突变型等位基因中与野生型等位基因相比不同。SNuPE可以使用其中只有一种特定种类的脱氧核苷酸被标记的延伸反应来进行(例如标记的dATP、标记的dCTP、标记的dGTP或标记的dTTP)。因此，可检测到的延伸产物的存在可以用作在目的位置(例如，刚好在引物的3'末端下游的位置)处核苷酸的身份的指示，并且因此可以作为在目的位置处突变存在与否的指示。SNuPE可以如以下中描述的进行：美国专利号5,888,819；美国专利号5,846,710；美国专利号6,280,947；美国专利号6,482,595；美国专利号6,503,718；美国专利号6,919,174；Piggee,C等,Journal of Chromatography A 781(1997),p.367-375(“Capillary Electrophoresisfor the Detection of Known Point Mutations by Single-Nucleotide PrimerExtension and Laser-Induced Fluorescence Detection”)；Hoogendoorn,B.等,HumanGenetics(1999)104:89-93,(“Genotyping Single Nucleotide Polymorphism by PrimerExtension and High Performance Liquid Chromatography”)，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，引物延伸可以与质谱法组合以准确和快速地检测突变的存在或不存在。参见Haff等人的美国专利号5,885,775(通过质谱分析单核苷酸多态性)；Koster的美国专利号7,501,251(基于质谱的DNA诊断)；两者的教导均通过引用并入本文。合适的质谱形式包括但不限于，基质辅助激光解吸/电离、飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾(ES)、IR-MALDI、离子回旋共振(ICR)、傅里叶变换、及其组合。
【寡核苷酸连接测定】
在一些实施方式中，使用寡核苷酸连接测定法(“OLA”或“OL”)。OLA使用了两种寡核苷酸，该寡核苷酸设计成能够与靶分子单链的邻接序列杂交。通常，寡核苷酸之一被生物素化，而另一寡核苷酸被可检测地标记，例如，用缀合有链霉亲和素的荧光部分。如果在靶分子中找到精确的互补序列，则寡核苷酸将杂交使其末端邻接，并创建可被捕获和检测的连接底物。参见例如，Nickerson等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8923-8927,Landegren,U.等(1988)Science241:1077-1080和美国专利号4,998,617，其全部内容通过引用整体并入本文。
【杂交方法】
在一些实施方式中，通过杂交来分析核酸，其使用一种或多种对感兴趣的生物标志物具有特异性的寡核苷酸探针，并在足够严格以不允许单核苷酸错配的条件下进行。在某些实施方式中，合适的核酸探针可以区分正常基因和突变基因。因此，例如，本领域普通技术人员能够使用本发明的探针来确定个体对于特定等位基因是纯合的还是杂合的。
核酸杂交技术是本领域众所周知的。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所需水平的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的例子，参见例如，Sambrook等，1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等1994,Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。
在一些实施方式中，与突变或野生型序列杂交的探针分子可用于检测扩增产物中的此类序列，其通过溶液相或更优选地固相杂交。固相杂交可以例如通过将探针附接至微芯片来实现。
核酸探针可以包含核糖核酸和/或脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，提供的核酸探针是寡核苷酸(即“寡核苷酸探针”)。通常，寡核苷酸探针足够长以与目标基因的同源区域特异性结合，但是足够短以至于探针和被测试的核酸样品之间一个核苷酸的差异就破坏杂交。通常，寡核苷酸探针的大小在大约10～100个核苷酸之间变化。在一些实施方式中，寡核苷酸探针长度为15～90、15～80、15～70、15～60、15～50、15～40、15～35、15～30、18～30、或18～26个核苷酸。如本领域普通技术人员所理解的，寡核苷酸探针的最佳长度可以取决于可以使用该寡核苷酸探针的特定方法和/或条件。
在一些实施方式中，核酸探针可用作引物，例如用于核酸扩增和/或延伸反应。例如，在某些实施方式中，评估变体的基因序列包含外显子序列。在某些实施方式中，在测定中分析外显子序列和另外的侧翼序列(例如，UTR和/或内含子序列的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或更多个核苷酸)。或者，可以评估内含子序列或其他非编码区的潜在有害突变。或者，可以使用这些序列的一部分。此类变体基因序列可包括具有如本文所述的至少一种突变的序列。
本公开的其他实施方式提供了分离的基因序列，其包含与感兴趣的综合征和/或疾病有关的突变。此类基因序列可用于客观地诊断受试者中与暴露于吸入致癌物相关的疾病的存在或形成风险增加。在某些实施方式中，分离的核酸可以包含非变体序列或其任一种的变体序列或其组合。例如，在某些实施方式中，基因序列包含外显子序列。在某些实施方式中，在测定中分析外显子序列和另外的侧翼序列(例如，UTR和/或内含子序列的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或更多个核苷酸)。或者，可以使用内含子序列或其他非编码区。或者，可以使用这些序列的一部分。在某些实施方式中，基因序列包含来自本文公开的至少一种生物标志物基因的外显子序列。
在一些实施方式中，核酸探针用本文所述的可检测部分标记。
【阵列】
本文提及的多种方法可适于与允许在单个实验中分析和/或检测生物标志物组的阵列一起使用。例如，可以同时分析包含生物标志物的多个突变。特别地，涉及使用核酸试剂(例如，探针、引物、寡核苷酸等)的方法特别适合于适应基于阵列的平台(例如，微阵列)。在一些实施方式中，一种阵列，其包含一种或多种特异性用于检测感兴趣的生物标志物中的突变的探针。
【DNA测序】
在某些实施方式中，通过检测核酸或一组核酸的序列、基因组位置或排列和/或基因组拷贝数的变化(通过核酸测序)来进行感兴趣的生物标志物的诊断。
在一些实施方式中，该方法可以包括从受试者的组织或体液样品中获得核酸，并对至少一部分核酸进行测序，以获得至少一个基因的样品核酸序列。在某些实施方式中，该方法可以包括将变体与疾病相关的已知变体(该疾病与暴露于吸入致癌物相关)进行比较，并确定所述变体是否为先前已被鉴定为与疾病(该疾病与暴露于吸入致癌物相关)相关的变体。或者，该方法可以包括将变体识别为新的、先前未表征的变体。如果变体是新的变体，或者在某些情况下是先前表征的(即，已鉴定的)变体，则该方法可以进一步包括进行分析以确定该突变是否预期对基因表达和/或基因编码的蛋白质的功能有害。该方法可以进一步包括使用变体概况(即，在受试者中鉴定的变体的汇编)来诊断与暴露于吸入致癌物相关的疾病的存在或形成这类疾病的风险增加。
例如，在某些实施方式中，可以使用下一代(大规模并行测序)。或者，可以使用Sanger测序。或者，可以组合使用下一代(大规模并行测序)和Sanger测序。另外和/或备选地，测序包括通过单分子合成测序的至少一种。因此，在某些实施方式中，在池中分析多个DNA样品以鉴定显示变化的样品。另外地或备选地，在某些实施方式中，在多个池中分析多个DNA样品以鉴定在至少两个池中显示相同变化的单个样品。
一种进行测序的常规方法是通过链终止和凝胶分离，如Sanger等，1977,ProcNatl Acad Sci U S A,74:5463-67所述。另一种常规测序方法涉及核酸片段的化学降解。参见Maxam等,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.,74:560-564。另外，已经基于通过杂交测序开发了方法。参见例如Harris等人，美国专利申请公开号20090156412。这些参考文献的每一个通过引用整体并入本文。
在其他实施方式中，核酸的测序通过单分子或自单分子衍生(通过诸如PCR的方法扩增)的大体上相同的分子组的大规模平行测序(也称为“下一代测序”)来完成。大规模平行测序显示在例如Lapidus等人的美国专利号7,169,560，Quake等人的美国专利号6,818,395，Harris美国专利号7,282,337和Braslavsky等人,PNAS(USA),100:3960-3964(2003)，其每一个的内容通过引用在此并入。
在下一代测序中，可以对核酸进行PCR或全基因组扩增，以获得足够量的核酸用于分析。在下一代测序的某些形式中，不需要扩增，因为该方法能够从未扩增的DNA评估DNA序列。一旦确定，就将来自测试样品的核酸的序列和/或基因组排列和/或基因组拷贝数与标准参考进行比较，该标准参考衍生自一个或多个在从其采样时不知道患有与暴露于吸入性致癌物相关疾病的个体。来自测试样品和标准参考的核酸的序列和/或基因组排列和/或基因组排列和/或拷贝数之间的所有差异均视为变体。
在下一代(大规模并行测序)中，所有目标区域都被一起测序，并且通过与参考序列进行比较(比对)来确定每个序列读段的来源。感兴趣的区域可以在一个反应中一起富集，或者可以分别富集然后在测序前合并。在某些实施方式中，并且如本文实例中更详细地描述地，通过随机片段化的基因组DNA与特定RNA探针的大量杂交来富集测定中所包括的衍生于基因编码外显子的DNA序列。将相同的衔接子序列附接到所有片段的末端，从而允许通过PCR在一个反应中使用一对引物富集所有杂交捕获的片段。用特异性引物通过PCR扩增通过杂交捕获效率较低的区域。另外，具有特异性引物的PCR可用于扩增基因组中其他地方存在相似序列(“伪外显子”)的外显子。
在使用大规模平行测序的某些实施方式中，将PCR产物连接以形成长的DNA区段，将其剪切成短片段(例如，通过声能)。该步骤确保片段末端分布在整个感兴趣区域中。随后，将一段dA核苷酸添加到每个片段的3'末端，这使片段能够结合涂有寡聚体(dT)引物的平坦表面(“流动池”)。然后可以通过用荧光标记的核苷酸延伸寡聚体(dT)引物来对每个片段进行测序。在每个测序循环中，仅添加一种类型的核苷酸(A，G，T或C)，并且仅允许使用链终止核苷酸掺入一种核苷酸。例如，在第一个测序循环中，可以添加荧光标记的dCTP。该核苷酸将仅掺入需要C作为下一个核苷酸的那些正在生长的互补DNA链中。在每个测序循环后，对流动池成像以确定哪个片段已延伸。掺入C的DNA链会发光，而未掺入C的DNA链会显示为黑暗。将链终止逆转以使生长中的DNA链再次可延伸，并且重复该过程共120个循环。
将图像转换为通常称为“读段”的碱基字符串，其汇总了每个片段3'末端的25至60个碱基。然后将读段与所分析DNA的参考序列进行比较。由于任何给定的25个碱基的字符串通常在人类基因组中仅出现一次，因此大多数读段可与人类基因组中的一个特定位置“对齐”。最后，可以从可获得的读段中建立每个基因组区域的共有序列，并将其与该位置处的确切参考序列进行比较。共有序列和参考之间的任何差异称为序列变体。
【可检测部分】
在某些实施方式中，根据本发明和/或由本发明提供的某些分子(例如，核酸探针、抗体等)包含一个或多个可检测的实体或部分，即，将这类分子用这类实体或分子或部分“标记”。
在本公开的实践中可以使用很多种可检测试剂中的任何一种。合适的可检测试剂包括但不限于：各种配体、放射性核素；荧光染料；化学发光剂(如例如吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)；生物发光剂；光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即量子点)；微粒；金属纳米粒子(例如金、银、铜、铂等)；纳米团簇；顺磁性金属离子；酶；比色标签(例如染料、胶体金等)；生物素；地高辛；半抗原；以及可针对其获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质。
在一些实施方式中，可检测部分是生物素。生物素可与亲和素(例如链霉亲和素)结合，该亲和素通常(直接或间接)缀合至自身可检测的其他部分(例如，荧光部分)。
下面描述了可以使用的一些可检测部分的一些非限制性实例。
【荧光染料】
在某些实施方式中，可检测的部分是荧光染料。具有多种化学结构和物理特性的多种已知荧光染料适用于本公开的实践。荧光可检测部分可被激光激发，而发射的光被检测器捕获。检测器可以是电荷耦合器件(CCD)或共焦显微镜，可以记录其强度。
合适的荧光染料包括但不限于，荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫氰酸或FITC、萘基荧光素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)，六氯荧光素(HEX)，碳花青，部花青(merocyanine)，苯乙烯基染料，氧喏(oxonol)染料，藻红蛋白，赤藓红，曙红，罗丹明染料(例如，羧基四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)，香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)，Q-DOTS，俄勒冈绿(Oregon Green)染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)，德克萨斯红，德克萨斯红X，光谱红，光谱绿，花青染料(例如CY-3、CY-5、CY-3.5、CY5.5等)，ALEXA FLUOR染料(例如ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR660、ALEXA FLUOR 680等)，BODIPY染料(例如BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY R、BODIPYTR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)，IRDye(例如IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。有关合适的荧光染料和将荧光染料偶联至其他化学实体(例如蛋白质和肽)的方法的更多示例，参见例如，“The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products”,第9版,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记剂的有利特性包括高摩尔吸收系数、高荧光量子产率和光稳定性。在一些实施方式中，标记荧光团在可见光(即在400和750nm之间)而不是在光谱的紫外范围(即低于400nm)中显示吸收和发射波长。
可检测部分可以包括超过一种化学实体，例如在荧光共振能量转移(FRET)中。共振转移导致发射强度的整体增强。例如，参见Ju等(1995)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)92:4347，其全部内容通过引用并入本文。为了实现共振能量转移，第一荧光分子(“供体”萤石(fluor))吸收光，并通过激发电子的共振将其转移到第二荧光分子(“受体”萤石)。在一种方法中，供体和受体染料都可以连接在一起并附接到寡聚体引物。将供体和受体染料连接至核酸的方法已在例如Lee等人的美国专利号5,945,526中描述，其全部内容通过引用并入本文。可以使用的染料的供体/受体对包括，例如，荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL、荧光素/荧光素、BODIPY FL/BODIPY FL和荧光素/QSY 7染料。参见，例如Lee等人的美国专利号5,945,526。这些染料中的许多也可以从例如Molecular Probes Inc.(Eugene,Oreg.)获得。合适的供体荧光团包括6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、2’-氯-7’-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)等。
【酶】
在某些实施方式中，可检测的部分是酶。合适的酶的例子包括但不限于，ELISA中使用的那些酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其他例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等。可以使用诸如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等的接头基团将酶缀合到分子上。
【放射性同位素】
在某些实施方式中，可检测部分是放射性同位素。例如，分子可以是用同位素标记的(即，可以包含一个或多个原子，这些原子已被原子质量或质量数不同于自然界通常发现的原子质量或质量数的原子取代)或同位素可以附接在分子上。可掺入分子中的同位素的非限制性实例包括氢、碳、氟、磷、铜、镓、钇、锝、铟、碘、铼、铊、铋、砹、钐和镥的同位素(即3H、13C、14C、18F、19F、32P、35S、64Cu、67Cu、67Ga、90Y、99mTc、111In、125I、123I、129I、131I、135I、186Re、187Re、201Tl、212Bi、213Bi、211At、153Sm和177Lu)。
在一些实施方式中，使用标记的树状体作为可检测部分来实现信号放大(参见，例如Physiol Genomics 3:93-99,2000)，其全部内容通过引用完整并入本文。荧光标记的树状体可从Genisphere(Montvale,N.J.)获得。这些可以通过本领域已知的方法化学缀合至寡核苷酸引物。
【试剂盒】
在某些实施方式中，本公开提供了用于根据本文公开的方法和组合物的试剂盒。通常，试剂盒包含一种或多种检测目的生物标志物的试剂。合适的试剂可以包括核酸探针和/或抗体或其片段。在一些实施方式中，以阵列例如微阵列或突变板(panel)的形式提供合适的试剂。
在一些实施方式中，提供的试剂盒还包含用于实施本文所述的各种检测方法(例如，测序、杂交、引物延伸、多重ASPE、免疫测定等)的试剂。例如，试剂盒可任选地包含用于本文所述方法的缓冲液、酶和/或试剂，例如，用于通过引物指导的扩增来扩增核酸，用于进行ELISA实验等。
在一些实施方式中，提供的试剂盒进一步包含指示健康个体的对照，例如，来自不患有感兴趣的疾病和/或综合征的个体的核酸和/或蛋白质样品。在一个实施方式中，从健康个体或没有检测到或没有可检测到的肺或心血管病理的个体确定对照值。在一些实施方式中，对照是疾病对照。这类疾病对照可以包括患有与暴露于吸入致癌物无关的肺或心脏病的个体。
试剂盒还可以包含关于如何确定个体是否患有感兴趣的疾病和/或综合征，或有形成感兴趣的疾病和/或综合征的风险的说明书。
在一些实施方式中，提供了一种计算机可读介质，其编码与感兴趣的生物标志物相对应的信息。这类计算机可读介质可以包含在本发明的试剂盒中。
【鉴定与暴露于吸入致癌物相关疾病有关的标志物的方法】
【数据挖掘】
在本公开的某些实施方式中，使用数据挖掘方法来鉴定生物标志物。例如，在一些情况下，可以在公共数据库(例如PubMed)中搜索已显示与某种疾病(直接或间接)关联的基因。然后可以将此类基因评估为生物标志物。图1示出了鉴定与疾病相关的标志物的多节点相互作用网络的示例，所述疾病可能与吸入致癌物相关，如在2017年5月12日提交的美国临时专利申请号62/505,536和2017年6月22日提交的美国临时专利申请62/523,382中所详细描述的，其全部内容通过引用并入本文。在该图中，带圆圈的标志物包括更相关的疾病标志物。图2示出了维恩图的例子，其描绘与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和心血管疾病(CVD)有关的标志物。许多标志物是图1中显示与疾病相关的那些标志物(带圆圈)。
【分子】
在某些实施方式中，本公开包括鉴定感兴趣的综合征或疾病的生物标志物的方法(即以统计学显著的方式与疾病相关的核酸序列的变体，该疾病与暴露于吸入致癌物相关)。可以基于其在生物化学途径中的重要性选择对新标志物测定的基因和/或基因组区域，所述生物化学途径显示出与感兴趣的综合征和/或疾病的遗传联系和/或生物学因果关系。或者，可以基于与DNA区域的遗传关联来选择对标志物测定的基因和/或基因组区域，所述DNA区域与以下疾病的家庭中遗传基因关联，该疾病与暴露于吸入致癌物相关。或者，可以系统地评估针对标志物测定的基因和/或基因组区域，以覆盖尚未评估的染色体的某些区域。
在其他实施方式中，针对新标志物评估的基因或基因组区域可以是生物化学途径的一部分，该生物化学途径可以与感兴趣的综合征和/或疾病(例如，与暴露于吸入致癌物相关的疾病)的形成关联。可以基于以下一种或多种方法评估变体和/或变体组合的临床意义。如果报道了或已知变体或变体组合在患有感兴趣的综合征和/或疾病的受试者中比在没有感兴趣的综合征和/或疾病的受试者的核酸中更频繁地出现，则认为其至少潜在地偏向于所述感兴趣的综合征和/或疾病。如果报道了或已知变体或变体组合被排他地或优先地传播给患有感兴趣的综合征和/或疾病的个体，则认为其至少潜在地倾向于所述感兴趣的综合征和/或疾病。相反，如果在两个群体中以相似的频率发现变体，则该变体不太可能与感兴趣的综合征和/或疾病的形成相关。
如果报道了或已知某个变体或变异体组合在适用于测量蛋白质或生物系统功能的实验模型系统中对该蛋白质或该生物系统的功能具有总体有害的影响，并且如果该变体或变体组合影响已知与感兴趣的综合征和/或疾病相关的一种或多种基因，则认为它至少潜在地偏向于引起感兴趣的综合征和/或疾病。例如，如果基于对蛋白质或核酸的序列和/或结构的预测影响预测变体或变体组合对蛋白质或基因表达具有总体有害作用(即导致无义突变、移码突变或剪接位点突变，或甚至错义突变)，并且如果该变体或变体组合影响已知与感兴趣的综合征和/或疾病相关的一种或多种基因，则认为其至少潜在地偏向于所述感兴趣的综合征和/或疾病。
还有，在某些实施方式中，变体的总数目可能很重要。如果在测试样品中检测到的一个变体或几个变体被单独或组合地评估为至少可能与感兴趣的综合征和/或疾病有关，那么在其遗传物质中检测到该变体或这些变体的个体可以被诊断为患有或有较高的风险形成所述感兴趣的综合征和/或疾病。
例如，本文公开提供了用于诊断受试者中相关的疾病的存在或增加的风险的方法。这类方法可以包括从组织或体液的样品中获得核酸。该方法可以进一步包括对核酸测序或测定核酸的基因组排列或拷贝数，以检测核酸序列或基因组排列或拷贝数中是否存在一个或多个变体。该方法可以进一步包括评估一个或多个变体的临床意义的步骤。此类分析可包括评估受影响人群(即患有该疾病的受试者)中变体序列的关联程度。这类分析还可以包括分析突变可能对基因表达和/或蛋白质功能的影响程度。该方法还可以包括基于评估诊断与暴露于吸入致癌物有关的疾病的存在或形成的风险增加。
以下实施例用于说明本公开的某些方面。这些实施例决不是限制性的。
【实施例】
可以使用上文讨论的任何教导或在一些情况下通过以下公开的非限制性测定之一来测量本文公开的生物标志物。
【EGFR】
EGFR表达水平是使用4-5微米FFPE组织切片通过荧光原位杂交(FISH)测量的。或者，可以在血清、血浆、尿、骨髓、血液、脑脊髓液、FNA或骨髓中测量表达。使用实时PCR、单碱基延伸和/或DNA测序进行基因突变分析。可以在例如组织、血清，血浆或尿中测定基因突变。
【白介素1β(IL1B)】
白介素1β(IL1β)是一种细胞因子蛋白，在人类中是由IL1B基因编码的。白介素1(IL-1)有两个基因：IL-1α和IL-1β。IL-1β前体被胞浆胱天蛋白酶1(白介素1β转化酶)裂解形成成熟的IL-1β。IL-1β是细胞因子的白介素1家族的成员。该细胞因子是由活化的巨噬细胞以原蛋白形式产生的，其被胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)蛋白水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎症反应的重要介导物，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。IL-1β产生的增加导致许多不同的自身炎性综合征。
【CXC基序趋化因子配体8(CXCL8)】
白介素8(IL8或趋化因子(C-X-C基序)配体8，CXCL8)是由巨噬细胞和其他细胞类型(如上皮细胞、气道平滑肌细胞和内皮细胞)产生的趋化因子。在人类中，白介素8蛋白由CXCL8基因编码。IL-8最初是作为99个氨基酸的前体肽产生的，随后进行裂解以产生几种活性IL-8同工型。在培养中，一个72个氨基酸的肽是巨噬细胞分泌的主要形式，IL-8，也称为嗜中性粒细胞趋化因子，具有两个主要功能。它在靶细胞(主要是嗜中性粒细胞，但也包括其他粒细胞)中诱导趋化性，导致它们向感染部位迁移。一旦IL-8到达后也就会诱导吞噬作用。还已知IL-8是血管生成的有效促进者。在靶细胞中，IL-8诱导了迁移和吞噬作用所需的一系列生理反应，例如细胞内Ca2+的增加、胞吐作用(例如组胺释放)和呼吸爆发。
【肿瘤坏死因子α(TNF-α)】
肿瘤坏死因子α(TNF-α)，也称为恶病质素和TNFSF1A，是TNF超家族的原型配体。TNF-α在炎症、免疫系统发育、细胞凋亡和脂质代谢中起着核心作用。TNF-α还与多种病理状况有关，包括哮喘、克罗恩病、类风湿性关节炎、神经性疼痛、肥胖、2型糖尿病、败血性休克\自身免疫性疾病和癌症。
TNF-α可以使用Quantikine测定法测量。Quantikine TNF-α免疫测定法是一项4.0小时的固相ELISA，设计为测量血清和血浆中的人TNF-α。该测定法包含大肠埃希氏菌(E.coli)衍生的重组人TNF-α和针对该重组因子的抗体，并采用定量夹心酶免疫测定技术。将对人TNF-α特异的单克隆抗体预包被到微孔板上。将标准品和样品移入孔中，并且存在的TNF-α与固定的抗体结合。洗去任何未结合的物质后，将对人TNF-α特异的生物素化多克隆抗体添加到孔中，洗涤孔以去除未结合的抗体-生物素试剂，然后将酶联的链霉亲和素添加到孔中。洗涤后，将底物溶液(过氧化氢和四甲基联苯胺)添加至孔中，并且显色与初始步骤中结合的TNF-α的量成比例。停止显色，并在450nm处测量颜色强度，减去540nm和570nm处的读数。
样品可以是血清或血浆。对于血清，使用血清分离管(SST)，允许样品在室温凝结30分钟，然后以1000×g离心15分钟。移出血清并测定。立即使用样品或将样品等分并保存在≤-20℃。使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。样品在收集后的30分钟内以1000×g离心15分钟，并立即分析样品或等分并保存在≤-20℃。对于血清和血浆样品，均应避免重复冻融循环。通常，不应使用大致溶血的样品、高白蛋白样品和柠檬酸盐血浆。
【干扰素γ(INFG)】
干扰素γ(IFNγ)是一种二聚化的可溶性细胞因子，是II类干扰素IFNγ或II型干扰素的唯一成员，它是一种对先天免疫和适应性免疫关键性的细胞因子，可抵抗病毒、一些细菌和原生动物感染。IFNγ是巨噬细胞的重要激活剂，是II类主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。IFNγ的异常表达与多种自身炎症和自身免疫性疾病有关。IFNγ主要由天然杀伤(NK)细胞和天然杀伤T(NKT)细胞作为先天免疫应答的一部分产生，并且一旦抗原特异性免疫产生，CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞也会产生IFNγ。
【钙粘蛋白(CDH1)、SMAD家族成员4(SMAD4)】
通过下一代测序分析检查与遗传性癌症相关的一组基因的整个编码区。另外，还检查了侧翼非编码区的部分。使用20个基因的微阵列CGH以及CHEK2和PMS2基因的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)，进行全面的缺失/重复测试。在该组中测试的基因包括APC、ATM、AXIN2、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、CDH1、CDKN2A、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、SMAD4、STK11和TP53。通过Sanger测序或qPCR证实了临床上重要的发现。使用ACMG指南和人类基因组变异学会(HGVS)推荐的命名法报告结果。
【丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族E成员1(SERPINE1)】
纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)也称为内皮纤溶酶原激活物抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂E1，是一种在人体中由SERPINE1基因编码的蛋白质。PAI-1升高是血栓形成和动脉粥样硬化的危险因素。PAI-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，其充当组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶(uPA)的主要抑制剂，组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶(uPA)是纤溶酶原和纤维蛋白溶解的激活剂。它是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)蛋白(SERPINE1)。PAI-1基因是SERPINE1，位于7号染色体(7q21.3-q22)上。在启动子区域存在一种常见的多态性，称为4G/5G。5G等位基因的转录活性略低于4G。
【信号转导子和转录激活子3(STAT3)】
通过对STAT3基因的所有编码核苷酸，加上每个编码外显子上游和下游的至少两个、通常为20个的侧翼内含子核苷酸(覆盖保守的供体和受体剪接位点)以及5'和3'UTR中通常为20个的侧翼核苷酸进行DNA测序，来检测STAT3中的突变。
【细胞间粘附分子1(ICAM1)】
ICAM-1(细胞间粘附分子1)也称为CD54(分化簇54)，是一种在人体内由ICAM1基因编码的蛋白质。ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成员。该细胞表面糖蛋白通常在内皮细胞和免疫系统细胞上表达，并与CD11a/CD18或CD11b/CD18型的整联蛋白结合。
【白介素6(IL6)】
白介素6(IL-6)是一种白细胞介素，既可作为促炎性细胞因子，又可作为抗炎性肌细胞因子。在人类中，它是由IL6基因编码的。白细胞介素6由T细胞和巨噬细胞分泌以刺激免疫反应，例如在感染过程中以及组织损伤后，从而导致炎症。IL-6在抵抗感染方面也发挥着作用。另外，成骨细胞分泌IL-6以刺激破骨细胞形成。许多血管的中膜中的平滑肌细胞也产生IL-6作为促炎性细胞因子。IL-6作为抗炎细胞因子的作用是通过其对TNF-α和IL-1的抑制作用以及对IL-1ra和IL-10的激活而介导的。
IL-6是发烧和急性期反应的重要介导物。它能够穿越血脑屏障，启动下丘脑中PGE2的合成，并改变人体的温度设定点。在肌肉和脂肪组织中，IL-6刺激能量动员，导致体温升高。IL-6可以由巨噬细胞响应特定的微生物分子分泌，称为病原体相关分子模式(PAMP)，也被认为是肌细胞因子(由肌肉产生的细胞因子)，其在响应肌肉收缩时升高。
【血管内皮生长因子A(VEGFA)】
血管内皮生长因子(VEGF)，也称为血管通透性因子(VPF)，是34至45千道尔顿的同型二聚体型的结合肝素的糖蛋白。VEGF具有有效的血管生成、促有丝分裂和血管通透性增强活性(对内皮细胞特异性)。VEGF被认为在几个生理过程中起着重要作用，包括伤口愈合、排卵、月经、维持血压和怀孕。VEGF还与许多涉及血管生成的病理过程有关，包括关节炎、银屑病、黄斑变性和糖尿病性视网膜病变。同样，包括VEGF在内的促血管生成因子的肿瘤表达与许多人类癌症中的晚期肿瘤进展有关。VEGF可以使用酶免疫测定法(EIA)在血清中测量。
【白介素1β(IL1B)】
白介素1β(IL1β)是一种细胞因子蛋白，在人类中是由IL1B基因编码的。白介素1(IL-1)有两种基因：IL-1α和IL-1β。IL-1β前体被胞浆胱天蛋白酶1(白介素1β转化酶)裂解形成成熟的IL-1β。IL-1β是细胞因子的白介素1家族的成员。该细胞因子是由活化的巨噬细胞以原蛋白形式产生的，其被胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)蛋白水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎症反应的重要介导物，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。IL-1β产生的增加导致许多不同的自身炎性综合征。
【C-C基序趋化因子配体2(CCL2)】
趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)也称为单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和小诱导型细胞因子A2。CCL2是一种小细胞因子，属于CC趋化因子家族。CCL2将单核细胞、记忆T细胞和树突细胞募集到由组织损伤或感染产生的炎症部位。在肾小球性肾炎模型中施用抗CCL2抗体可减少巨噬细胞和T细胞的渗透，减少新月体形成、以及疤痕和肾损伤。CCL2启动子区域内CpG位点的低甲基化受到高水平的血糖和TG的影响，这会增加血清中CCL2的水平。后者在2型糖尿病的血管并发症中起重要作用。
【连环蛋白β1(CTNNB1)】
Wnt信号传导途径牵涉到正常发育和肿瘤发生两者中。该途径的激活导致β-连环蛋白的稳定和核易位。β-连环蛋白的核定位已被用于鉴定APC或β-连环蛋白中的突变激活Wnt信号传导的肿瘤。
【磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)】
使用
Figure BDA0002268839170000521
DNA样品制备试剂盒从提供的肿瘤样本中分离基因组DNA。突变检测是通过使用
Figure BDA0002268839170000522
PIK3CA突变测试试剂盒在
Figure BDA0002268839170000523
z480分析仪上进行实时PCR分析实现的。样品包括福尔马林固定、石蜡包埋的组织(FFPE)块或玻片。
【CXC基序趋化因子配体8(CXCL8)】
白介素8(IL8或趋化因子(C-X-C基序)配体8，CXCL8)是由巨噬细胞和其他细胞类型(如上皮细胞、气道平滑肌细胞和内皮细胞)产生的趋化因子。在人类中，白介素8蛋白由CXCL8基因编码。IL-8最初是作为99个氨基酸的前体肽产生的，随后进行裂解以产生几种活性IL-8同工型。在培养中，一个72个氨基酸的肽是巨噬细胞分泌的主要形式，IL-8，也称为嗜中性粒细胞趋化因子，具有两个主要功能。它在靶细胞(主要是嗜中性粒细胞，但也包括其他粒细胞)中诱导趋化性，导致它们向感染部位迁移。一旦IL-8到达后就也会诱导吞噬作用。还已知IL-8是血管生成的有效促进者。在靶细胞中，IL-8诱导了迁移和吞噬作用所需的一系列生理反应，例如细胞内Ca2+的增加、胞吐作用(例如组胺释放)和呼吸爆发。
在本公开通篇内容中，已经提述和引用其他文件，例如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网页内容。出于所有目的，所有这些文件据此全文通过引用并入本文。本文描述的那些的各种修改和等同形式从本文的全部内容，包括对本文引用的科学和专利文献的提述，对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含适于在其各种实施方式及等同形式中实践本公开的信息、示例和指导。

Claims (20)

1.检测至少一种与暴露于吸入致癌物有关的生物标志物的方法，其包括：
从个体获取样品；和
测量与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种相关的至少一种标志物的量。
2.权利要求1的方法，其中在个体中检测与肺癌(LC)有关的至少一种生物标志物包括测量：
所述标志物的量，和/或
编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白(tensin)同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
3.权利要求1的方法，其中在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的至少一种生物标志物包括测量所述标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族A成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶(sirtuin)1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
4.权利要求1的方法，其中在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的至少一种生物标志物包括测量所述标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸的量和/或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白(pentraxin)相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
5.前述权利要求之任一项的方法，其中所述测量包括对蛋白质的测量。
6.前述权利要求之任一项的方法，其中所述测量包括对核酸序列或表达的分析。
7.前述权利要求之任一项的方法，其中所述样品包括液体或组织活检、无细胞核酸、血液、尿、血清或血浆。
8.在个体中鉴定与暴露于吸入致癌物有关的疾病有关的标志物的方法，该方法包括：鉴定在编码关于以下疾病的基因或调节关于以下疾病的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)中具有相比于对照值增加或降低的表达或具有突变的至少一种标志物：肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)。
9.在个体中检测与暴露于吸入致癌物有关的疾病的存在或易感性的方法，其包括：
从个体获取样品；
测量样品中与肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种相关的至少一种标志物的量；和
将样本中针对肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)中至少一种的基因的表达和/或其中的突变存在与每种所述标志物的对照值比较。
10.权利要求9的方法，其中在个体中检测与肺癌(LC)有关的至少一种生物标志物包括测量所述标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸的量或所述核酸中的突变：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
11.权利要求9的方法，其中在个体中检测与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的至少一种生物标志物包括测量所述标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸的量或所述核酸中的突变：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
12.权利要求9的方法，其中在个体中检测与心血管疾病(CVD)有关的至少一种生物标志物包括测量所述标志物的量，和/或编码以下至少一种物质的基因或调节以下至少一种物质的基因的表达的核酸(例如基因组DNA或mRNA)的量和/或所述核酸中的突变：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
13.权利要求9～12之任一项的方法，其中所述测量包括对蛋白质的测量。
14.权利要求9～12之任一项的方法，其中所述测量包括对核酸序列或表达的分析。
15.权利要求9～12之任一项的方法，其中所述样品包括组织或液体活检、无细胞核酸、血液、尿、血清或血浆。
16.在个体中检测与疾病相关的生物标志物的组合物，所述疾病与暴露于吸入致癌物相关，所述组合物包含量化核酸水平和/或检测该核酸中突变的存在的试剂，所述核酸编码关于以下至少一种疾病的基因或调节关于以下至少一种疾病的基因的表达：肺癌(LC)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或心血管疾病(CVD)。
17.权利要求16的组合物，其中所述至少一种与肺癌(LC)有关的生物标志物包含：间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(ALK)，B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)，包含5的杆状病毒IAP重复序列(BIRC5)，B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)，CD274分子(CD274)，钙粘蛋白1(CDH1)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)，癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，几丁质酶3样1(CHI3L1)，胆碱能受体烟碱性α5亚基(CHRNA5)，CLPTM1样(CLPTM1L)，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，连环蛋白β1(CTNNB1)，C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，细胞色素P450家族1亚家族B成员1(CYP1B1)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化物水解酶1(EPHX1)，erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)，果糖双磷酸酶1(FBP1)，fascin肌动蛋白成束蛋白1(FSCN1)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，白介素10(IL10)，整联蛋白亚基α11(ITGA11)，KRAS原癌基因，GTP酶(KRAS)，角蛋白19(KRT19)，亮氨酸氨肽酶3(LAP3)，MDM2原癌基因(MDM2)，v-myc禽骨髓瘤病病毒癌基因同源物(MYC)，p21(RAC1)活化激酶1(PAK1)，聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基α(PIK3CA)，蛋白激酶N1(PKN1)，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，信号转导子和转录激活子3(STAT3)，丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)，肿瘤蛋白p53(TP53)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，血管内皮生长因子C(VEGFC)，γ干扰素(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或X射线修复交叉互补1(XRCC1)。
18.权利要求16的组合物，其中所述至少一种与慢性阻塞性肺疾病(COPD)相关的生物标志物包含：脂联素(含C1Q和胶原蛋白域)(ADIPOQ)，肾上腺素受体β2(ADRB2)，晚期糖基化终产物特异性受体(AGER)，CD4分子(CD4)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，胆碱能受体烟碱性α3亚基(CHRNA3)，胱抑素C(CST3)，C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，细胞色素P450家族1亚家族A成员1(CYP1A1)，结合D盒的PAR bZIP转录因子(DBP)，表皮生长因子受体(EGFR)，弹性蛋白(ELN)，促红细胞生成素(EPO)，谷胱甘肽S-转移酶π1(GSTP1)，组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)，高迁移率族框1(HMGB1)，5-羟色胺受体4(HTR4)，免疫球蛋白重恒定ε(IGHE)，白介素10(IL10)，白介素13(IL13)，白介素1β(IL1B)，层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)，瘦素(LEP)，膜金属内肽酶(MME)，基质金属肽酶12(MMP12)，基质金属肽酶25(MMP25)，丝氨酸蛋白酶抑制剂A家族成员1(SERPINA1)，去乙酰化酶1(SIRT1)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管内皮生长因子A(VEGFA)。
19.权利要求16的组合物，其中所述至少一种与心血管疾病(CVD)有关的生物标志物包含：ABO血型(转移酶A，α1-3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶；转移酶B，α1-3-半乳糖基转移酶)(ABO)，血管紧张素I转化酶2(ACE2)，血管紧张素原(AGT)，白蛋白(ALB)，apelin(APLN)，载脂蛋白A1(APOA1)，载脂蛋白A2(APOA2)，载脂蛋白B(APOB)，载脂蛋白E(APOE)，胱天蛋白酶1(CASP1)，CD36分子(CD36)，五聚体蛋白相关的C反应蛋白(CRP)，用于RNA聚合酶II的延伸因子(ELL)，凝血因子II，凝血酶(F2)，细胞间粘附分子1(ICAM1)，白介素1β(IL1B)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，瘦素(LEP)，髓过氧化物酶(MPO)，一氧化氮合酶3(NOS3)，昼夜节律时钟1(PER1)，催乳激素(PRL)，肿瘤坏死因子(TNF)，肌钙蛋白C1慢速骨骼和心脏型(TNNC1)，肌钙蛋白I3心脏型(TNNI3)，肌钙蛋白T2心脏型(TNNT2)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，干扰素γ(INFG)，白介素2(IL2)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素4(IL4)或血管性血友病因子(VWF)。
20.试剂盒，其包含权利要求16～19的组合物。
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