CN110872550A - 生成大小均一的液滴的方法及数字pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生成大小均一的液滴的方法及数字PCR检测方法，该方法利用微管道向第一液体中加入与第一液体不混溶的第二液体以形成微液滴，该方法包括从储存有第二液体的样本容器中吸取第二液体的取液步骤和将吸取的第二液体推送到第一液体中的推液步骤，在取液步骤中，在吸取第二液体之前和吸取第二液体之后分别还吸取第三液体和第四液体，第三液体、第四液体分别与第二液体不混溶或反应。该方法在微管道推液时分别利用第四液体和第三液体建立流量和结束流量，保证了第二液体流量的稳定，可以获得更为大小均一的微液滴。

Description

生成大小均一的液滴的方法及数字PCR检测方法

技术领域

本发明涉及液滴制备领域和数字PCR检测领域，具体涉及一种数字PCR液滴的生成方法和数字PCR检测检测方法。

背景技术

随着医疗模式的转变和个体化用药的不断发展，医学检验界迫切需要快速、精确的检测手段，分子检测则发挥出独特的优势。

目前，分子检测技术主要有核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）和生物芯片技术等。分子检测产品主要应用在肿瘤、感染、遗传、产前筛查等临床各科的检测，以及体检中心、技术服务中心、第三方检测机构及微生物快速检测市场等方面。

作为分子检测的重要技术手段，PCR能够定性和定量地检测目标核酸分子，在低丰度检测、稀有突变检测等日益增大的应用需求背景下，数字PCR作为一种核酸分子绝对定量技术，它将一个荧光定量PCR反应体系分配到大量微小的反应器中，在每个微反应器中包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过对阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数，数字PCR无须依赖对照品和标准曲线就可进行精确地绝对定量检测。

目前数字PCR微液滴生成方法主要有微流控方式和微管道振动方式。微流控方式主要采用微流控芯片形成微反应体系，微流控芯片上的液滴的生成需要满足特定的流速、油水界面张力以及通道构型和通道表面修饰等条件，液滴体积调节的范围也受到以上因素的制约。微管道振动方式是利用毛细管等微通道注射或喷射微量液体，并将液体注入微坑或油相中，形成液滴（相关报道例如CN104324769B、CN104450891B）。与微流控方式生成微液滴相比，微管道振动方式具有操作更加简便、成本低以及液滴大小可控等优势。

然而，在实际操作中，在微管道中样本液体的首段和末段的接触介质分别是空气与管路驱动油（如中国专利CN 104450891B），由于这两种介质粘度与样本相差很大，使得样本推液从开始过渡到稳定、再从稳定过渡到结束时低耗时较长，样本流量存在较长时间波动，使得液滴体积的精确定量受到影响，不利于获得大小均一的液滴。

此外，现有技术中数字PCR检测时，样本量通常是非常少（10ul～20ul），采用现有的进样针插入样本中直接吸取的方式进行取液，由于不能将吸样针插到管底（会撞针或堵针），而会不可避免地造成样本残留，同时在吸取液本结束时还很容易吸进一部分空气从而对下一步生成数字液滴造成不良影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的液滴的生成方法，该方法可以获得更为大小均一的微液滴，尤其适于数字PCR液滴的制备。

为实现上述目的，本发明采用的一种技术方案是：

一种液滴生成方法，利用微管道向第一液体中加入与第一液体不混溶的第二液体以形成微液滴，该方法包括从储存有第二液体的样本容器中吸取第二液体的取液步骤和将吸取的第二液体推送到第一液体中的推液步骤，在取液步骤中，在吸取第二液体之前和吸取第二液体之后分别还吸取第三液体和第四液体，第三液体、第四液体分别与第二液体不混溶或反应。

根据本发明的一个典型实施方式，第一液体为油相体系，第二液体为水相体系，第三液体、第四液体分别为油相体系。

在根据本发明的一个优选实施方式中，液滴为适于数字PCR检测的油包水型微液滴，此时，第一液体通常包含油和表面活性剂，第二液体为包含待测核酸模板的水溶液，第三液体、第四液体分别包含油。

优选地，在同一样本容器内设置第三液体、第二液体和第四液体，第三液体、第二液体之间形成第一液液相界面，第四液体、第二液体之间形成第二液液相界面，第二液体位于的第一液液相界面、第二液液相界面之间。

进一步优选地，样本容器为顶部开口的容器，样本容器内，第三液体、第二液体、第四液体自下而上依次设置。

根据本发明的一个优选实施方式，样本容器内的第三液体与第二液体的体积比为0.1~1：1，优选0.3~0.8：1。

根据本发明的一个优选实施方式，样本容器内的第四液体与第二液体的体积比为0.1~1：1，优选0.3~0.8：1。

根据本发明的一个优选实施方式，取液步骤中，微管道的取样端穿过第四液体和第二液体、插入到第三液体中。

根据本发明的一个优选实施方式，微管道的取样端插入第三液体的高度为第三液体高度的1/4~3/4。

优选地，取液步骤中，取液时，保持微管道的位置不变，先吸取部分第三液体，然后将全部的第二液体吸入到微管道中，最后将部分第四液体吸入到微管道中。

优选地，取液完毕后，微管道中的第三液体与第二液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1；取液完毕后，微管道中的第四液体与第二液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1。

优选地，将吸取的第二液体推送到第一液体的过程中，以恒定的液体推送速度推送微管道内的第四液体、第二液体、第三液体。

优选地，在将吸取的第二液体推送到第一液体的过程中，振动微管道，其中振动频率根据要形成的液滴的大小等来调控。

优选地，第三液体、第四液体分别与第二液体的粘度基本相同。

优选地，第三液体、的第四液体分别包含选自氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油中的一种或多种。

本发明还涉及一种数字PCR检测方法，其包括采取如上所述的液滴生成方法生成微液滴的步骤。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明方法在推送液体时分别利用第四液体和第三液体建立流量和结束流量，保证了形成液滴的液体流量的稳定，进而可以获得更为大小均一的微液滴。

附图说明

附图1是本发明实施例中微管道的取样端穿过第四液体和第二液体插入到第三液体中的示意图；

附图2是本发明实施例中吸样后微管道内的第三液体-第二液体-第四液体的夹心结构的液-液相液体的图；

1、微管道；11、取样端；2、第二液体；31、第三液体；32、第四液体；4、样本容器。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。

本发明提供了一种液滴生成方法，该方法基于的液滴的生成机理是已知的，即利用微管道向第一液体中加入与第一液体不混溶的第二液体以形成微液滴，其中通入第二液体的过程中，使微管道相对于第一液体进行相对往复振动，振动可以是往复上下振动、往复左右振动，往复旋转振动等。基于该液滴生成原理，需要首先从存储有第二液体的样本容器中吸取第二液体，再借助驱动机构将第二液体推送到第一液体中。

本发明主要针对现有技术中第二液体推送起始和结束时流量不稳定的问题。为解决该问题，本发明提出在吸取第二液体之前和吸取第二液体之后分别还吸取第三液体和第四液体，由第四液体、第三液体分别建立流量和结束流量，从而确保第二液体的推送流量是稳定的，从而确保获得大小均一的液滴。

第三液体、第四液体的具体选择与第一液体、第二液体相关，至少满足：第三液体、第四液体不与第二液体发生反应、相融、萃取以及其它影响第二液体原有化学、物理性质，当同处于吸样管中，第三液体与第二液体之间，第四液体与第二液体之间分别可以形成稳定的液-液相界面。作为本发明的优选方案，第三液体、第四液体是能够与第一液体混溶的液体，当混合第三液体、第四液体与第一液体后，可以形成均相体系。此外，还优选的，第三液体、第四液体具有与第二液体基本相同的粘度。优选地，当第三液体、第四液体、第二液体的粘度差的绝对值与第二液体的比值在20%以内即认为具有基本相同的粘度，基本相同的粘度保证了三种液体具有基本相同的流动性。此外，在某些场合例如液滴是数字PCR液滴时，第三液体、第四液体应能够不影响所生成的液滴的稳定性或干扰检测。通常，第三液体、第四液体可以选择与第一液体相同或相类似。

根据本发明的一个具体实施方式，液滴为适于数字PCR检测的油包水型微液滴，此时，第一液体、第二液体、第三液体、第四液体可以分别是如下所描述的：

1.第一液体

第一液体通常包含油和表面活性剂，对于油和表面活性剂没有特别限制，可以是现有技术所报道的任何合适的油和表面活性剂。具体地，油可以是例如氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油中的一种或多种的组合。表面活性剂一般具有3~6的亲水亲脂平衡值（HLB）。表面活性剂在油相中的含量一般为0.1wt%~20wt%，优选为0.1%~10%。适于产生油包水的液滴的表面活性剂在现有技术中已有大量报道，它们均适用于此处。

在一些实施例中，当油是氟碳油时，表面活性剂是含氟表面活性剂，具体例如全氟辛醇、全氟癸醇、全氟十四酸、全氟聚醚羧酸及其衍生物等。

在另一些实施例中，当油是硅油时，表面活性剂可以为非离子表面活性剂如聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、硅氧链非离子表面活性剂如ABIL EM90，阴离子表面活性剂如SDS等。

在还一些实施例中，当油是烃油时，表面活性剂可以为非离子表面活性剂如吐温20、吐温80、硅氧链非离子表面活性剂如ABIL EM90，阴离子表面活性剂如SDS，磷脂等。

2.第二液体

第二液体为包含待测核酸模板的水溶液。进一步地，所述水溶液通常还包含参与PCR反应的其他试剂和选择性地包含用于促进试剂溶解的有机溶剂等。所述参与PCR反应的其他试剂通常包括荧光染料和/或荧光标记的探针。所述的有机溶剂优选是与水在室温下混合时形成稳定的单相溶液的有机溶剂。此类有机溶剂包括但不限于DMF、DMSO、甲醇、乙醇等。进一步地，所述的水相还可包含一些盐类等，以构建更易于进行PCR反应或使试剂更稳定的环境，所述的盐例如氯化钾、氯化镁、氯化钙等，还可以是将生物学上常用的缓冲体系例如TRIS缓冲体系来代替水相中的水。

在某些实施方案中，水溶液还可包括一种或更多种添加剂，包括但不限于非特异性背景/阻断核酸(例如，鲑鱼精子DNA)、生物防腐剂(例如叠氮化钠)、PCR增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等)和抑制剂(如RNA酶抑制剂)。在一些具体实施方式中，添加选自2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、NN-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、NN-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、牛血清白蛋白(BSA)、T4基因32蛋白或甘油中的一种或多种添加剂。添加剂的含量优选为0~10wt%，优选为0.01wt%~5wt%，更优选为为0.05wt%~2wt%。

3.第三液体、第四液体

第三液体、第四液体通常包含油，具体的油可以是上述第二液体中描述的那些。

4.数字PCR液滴

可制备的液滴的直径可以为约1~500微米，优选为5~300微米，更优选为10~200微米，进一步优选为30~200微米，更进一步优选为50~150微米。在一些实施方式中，液滴的直径为30~80微米。在另一些实施方式中，液滴的直径为70~120微米。在还有的一些实施方式中，液滴的直径为100~150微米。

根据本发明，样本容器可以有多种样式，可以是上端开口容器，侧面开口容器，上端、侧面同时开口的容器等，作为一种可选的实施方式，选用上端开口的容器作为样本容器。

根据本发明，在取液步骤中，第三液体、第二液体、第四液体可以有不同设置方式，它们可以设置在不同样本容器中，也可以设置在同一个样本容器中。当第三液体、第二液体、第四液体被设置在不同样本容器中，通过微管道先在盛有第三液体的样本容器中吸取第三液体，然后在另一个盛有第二液体的样本容器中吸取第二液体，再在另一个盛有的第四液体的样本容器中吸取第四液体。

作为本发明的一个优选方案，将第三液体、第二液体、第四液体设置在同一个样本容器内，并使第三液体处于比第二液体更靠近样本容器底部的位置，使第四液体处于样本容器内的最外层，第三液体、第二液体之间形成第一液液相界面，第四液体、第二液体之间形成第二液液相界面，第二液体位于第一液液相界面、第二液液相界面之间，第三液体、第二液体、第四液体自下而上依次设置，形成夹心结构的液-液相液体，这种夹心结构的液-液相液体不仅在吸样时能减少第二液体残留，同时也使得第二液体和其他介质隔离，避免第二液体被污染。该种实施方式下，将微管道的取样端穿过第四液体和第二液体插入到第三液体中，微管道取样时，需要避免微管道晃动和保持微管道的位置不变，以保证取液的精确性和稳定性，先吸取部分第三液体，随着微管道取样端处的第三液体被吸入微管道，第三液体上方的第二液体在重力作用下不断下降直至到微管道的取样端处，微管道继续吸取直至第二液体全部被吸入微管道内，最后再吸取部分第四液体，完成液体吸取；在样本容器中，第二液体可以是一层或多层，每层第二液体都相邻有第三液体或第四液体。

根据本发明，对于第三液体、第二液体、第四液体的相对密度大小没有特别限制，但作为优选，第三液体密度大于第二液体密度，第四液体密度小于第二液体密度，目的是为了降低液体重力的影响。

为尽可能减少样本吸取残留，在样本容器中，优选地，第三液体与第二液体的体积比为0.1～1：1，为避免资源浪费，更优选的体积比为0.3～0.8：1，第四液体与第二液体的体积比为0.1～1：1，优选的体积比为0.3～0.8：1；

为了保证微管道能够吸取适量的第三液体，根据加入到样本容器中的第二液体和第三液体的体积的不同，需要调整微管道的取样端在第三液体中的高度位置，优选地，微管道的取样端插入第三液体的高度为第三液体高度的1/4～3/4。

在本发明中，为保证在后续推液中第二液体流量稳定，优选地，微管道中的第三液体与第二液体的体积比应控制在0.1～0.9：1，为达到更好地效果，优选为0.2～0.5：1，更优选0.2～0.4：1，第四液体与第二液体的体积比也应控制在0.1～0.9：1，优选为0.2～0.5：1，更优选0.2～0.4：1。

根据本发明，为防止实验过程中温度波动对液体驱动精度的影响，在吸取第三液体前，液体驱动机构和微管道中可以先充满低膨胀系数的液体作为载流，作为一种可选的实施方式，载流的热膨胀系数范围可以为0.00001/摄氏度至0.0005/摄氏度。

根据本发明，为防止微管道液体在驱动过程中产生气泡，影响推液时的流量稳定性，可以对载流和第三液体、第四液体进行真空脱气或者超声脱气处理。

根据本发明，为实现纳升级的液体吸取以及降低液体在微管道取样端的残留，可以对微管道的取样端进行拉尖处理来降低取样端尖端的直径和横截面积；优选地，对微管道的内壁和取样端外壁进行疏水化处理，防止第二、三、四液体在其表面的吸附，作为一种可选的实施方式，微管道可选用毛细管。

根据本发明，为实现皮升级的液体量取以及降低液体在微管道取样端的残留，可以对微管道管的取样端进行拉尖处理来降低取样端尖端的直径和横截面积，同时对微管道的内壁和取样端外壁进行疏水化处理，微管道可选用毛细管等。

根据本发明，用于吸取和推出液体的液体驱动机构是已知的，没有特别限制，可以是本领域常用的那些，例如注射泵。根据本发明，用于驱动微管道振动的振动设备也是已知的，优选能够实现微管道短行程高速往复振动的振动设备，所述的往复运动可以是上下运动、左右运动或旋转运动。振动设备具体例如电磁铁式、压电陶瓷式或机械偏心轮式、摆动气缸、旋转电磁铁等设备，作为一种可选的实施方式，振动设备的振动频率或旋转频率是1Hz-1000Hz；可以通过调节输入电压控制振动设备的振幅，对输入电压的控制可选用电磁振动器、直线电机、伺服电机或步进电机。

作为一种适于数字PCR液滴生成的可选实施方式，液体驱动机构的推液速度范围是10纳升/分钟到10微升/分钟。

在微管道推液时，完整的推液过程涉及流量建立、流量保持、流量结束（即流量降低至零）三个阶段，其中流量建立和流量降低至零是两个不可避免的流量波动阶段，也就是说不可避免地在这两个阶段产生不均一液滴，这两个阶段所需时间越长对实验结果越不利；本发明中，微管道吸取第三液体、第二液体和第四液体后，开始向第一液体内推液，位于微管道首段的且与样本液体粘度基本相同的第四液体先建立好流量并以恒定的流量值F输出，待第四液体体被推完后平稳的过度为第二液体流量，第二液体被推完后，液路系统保持原流量值F推动与样本液体粘度基本相同的第三液体，在此过程中由于分别利用第四液体和第三液体建立流量和结束流量，第二液体流量始终以恒定的流量值F输出，在推液的同时，通过振动设备使微管道以一定的振动频率振动，在微管道喷口处生成的微滴大小均一。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本实施例提供了一种数字PCR检测方法，利用上述液滴生成方法生成微液滴，附图1是微管道的取样端穿过第四液体和第二液体插入到第三液体中的图，本实施例中，第二液体2为数字PCR待检测对象，微管道1（选用毛细管）连接具有吸取和推出液体驱动能力的液体驱动机构（未示出）以及使微管道1产生左右往复振动的振动设备（本实施例选用压电陶瓷，未示出）；

在样本容器4（选用200ul的离心管）中先加入10ul的第三液体31（3M氟化油HFE7500），再在第三液体31上加入20ul第二液体2（包含待测核算模板、缓冲水溶液、产物标记物质等的水相体系），再在第二液体2上加入10ul的第四液体32（3M氟化油HFE7500），样本容器4中第三液体31、第二液体2、第四液体32的比例为1:2:1；将微管道1的取样端11插入到离心管4中的第三液体31中，微管道1先吸取第三液体31，随着第三液体31不断被吸入微管道1中，第二液体2在不断下降，当微管道1吸取5ul的第三液体31时，第二液体2下降到微管道1取样端11，微管道1开始吸取第二液体2，当微管道1吸取完20ul第二液体2，再吸取5ul的第四液体32，完成液体吸取，此时，微管道1中的第三液体31、第二液体2、第四液体32的比例为1:4:1；

如图2所示是吸样后微管道1内的第三液体-第二液体-第四液体的夹心结构的液-液相液体对的图；通过微管道1在盛有油相的储液池（未示出）中推液，包括：将微管道1插入到油相中，液体的推送速度为2.7ul\min，振动频率100Hz，微管道1振幅为5mm，液体驱动机构先将第四液体32推出微管道1，建立起稳定的流量，待第四液体32被推完后平稳的过度为第二液体2流量，第二液体2被推完后，液路系统保持原流量推动第三液体31，从而使第二液体2流量在推出的时候始终保持平稳，第二液体2在推出的时候，由于微管道1以固定的振幅作左右往复运动，使得第二液体2在油相产生大小均一的液滴，将生成有微液滴的储液池放于PCR仪（未示出）中，调节温度至63℃，进行大量液滴的同步扩增反应，反应1小时后取出，可以将储液池倒置光学显微成像系统(未示出)上，调节物镜倍数并在明场下观察孔中液滴的状态。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种液滴生成方法，利用微管道向第一液体中加入与所述第一液体不混溶的第二液体以形成微液滴，所述方法包括从储存有第二液体的样本容器中吸取所述第二液体的取液步骤和将吸取的所述第二液体推送到所述第一液体中的推液步骤，其特征在于：在所述取液步骤中，在吸取所述第二液体之前和吸取所述第二液体之后分别还吸取第三液体和第四液体，所述第三液体、所述第四液体分别与所述第二液体不混溶或反应。

2.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第一液体为油相体系，所述第二液体为水相体系，所述第三液体、第四液体分别为油相体系。

3.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴为适于数字PCR检测的油包水型微液滴，所述第一液体包含油和表面活性剂，所述第二液体为包含待测核酸模板的水溶液，所述第三液体、第四液体分别包含油。

4.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：在同一所述样本容器内设置所述第三液体、所述第二液体和所述第四液体，所述第三液体、所述第二液体之间形成第一液液相界面，所述第四液体、所述第二液体之间形成第二液液相界面，所述第二液体位于所述第一液液相界面、所述第二液液相界面之间。

5.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于：所述样本容器为顶部开口的容器，所述样本容器内，所述第三液体、所述第二液体、所述第四液体自下而上依次设置。

6.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于：所述样本容器内的第三液体与第二液体的体积比为0.1~1：1，优选0.3~0.8：1。

7.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于：所述样本容器内的第四液体与第二液体的体积比为0.1~1：1，优选0.3~0.8：1。

8.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于：所述取液步骤中，所述微管道的取样端穿过所述第四液体和所述第二液体、插入到所述第三液体中。

9.根据权利要求8所述的液滴生成方法，其特征在于：所述微管道的取样端插入所述第三液体的高度为所述第三液体高度的1/4~3/4。

10.根据权利要求8所述的液滴生成方法，其特征在于：所述取液步骤中，取液时，保持所述微管道的位置不变，先吸取部分所述第三液体，然后将全部的所述第二液体吸入到所述微管道中，最后将部分所述第四液体吸入到所述微管道中。

11.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于：取液完毕后，所述微管道中的所述第三液体与所述第二液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1；取液完毕后，所述微管道中的所述第四液体与所述第二液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1。

12.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的液滴生成方法，其特征在于：将吸取的所述第二液体推送到所述第一液体的过程中，以恒定的液体推送速度推送所述微管道内的所述第四液体、所述第二液体、所述第三液体。

13.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的液滴生成方法，其特征在于：在将吸取的所述第二液体推送到所述第一液体的过程中，振动所述微管道。

14.根据权利要求1至4中任一项权利要求中所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第三液体、所述第四液体分别与所述第二液体的粘度基本相同。

15.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第三液体、所述第四液体分别包含选自氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油中的一种或多种。

16.一种数字PCR检测方法，其特征在于：包括采取如权利要求1至15中任一项权利要求所述的液滴生成方法生成微液滴的步骤。

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