CN110872352A - 一种新型靶向axl的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向AXL的抗体，通过筛选天然噬菌体抗体库获得新型靶向AXL功能抗体DAXL‑88。本发明还公开了上述抗体的可变区序列及制备方法。通过分子生物学等技术获得上述抗体后，鉴定了该抗体与抗原的结合特异性和亲和力。结果显示，DAXL‑88能够特异性识别hAXL‑ECD和mAXL‑ECD，与hAXL‑ECD和mAXL‑ECD的结合呈剂量依赖性；DAXL‑88能够阻断AXL‑Gas6相互作用；同时，BIAcore法测定DAXL‑88结合hAXL‑ECD的亲和力为3.70×10‑10M。本发明还公开了上述抗体在阻断AXL‑Gas6相互作用中的应用。

Description

一种新型靶向AXL的抗体
技术领域
本发明通过对天然噬菌体抗体库进行筛选并获得靶向AXL抗体，应用分子生物学技术进行抗体基因的获得和抗体制备，并通过生物学实验对抗体生物学功能进行评价。
背景技术
受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)是细胞表面的跨膜受体，由胞外段、跨膜区和胞内域组成，其中胞内域具有激酶活性，在正常细胞和肿瘤细胞的多种细胞信号转导中均发挥着重要作用。TAM(Tyro-3、AXL、Mer 蛋白)受体酪氨酸激酶亚家族于1991年在慢性髓细胞白血病中被发现，其成员包括Tyro-3、AXL和Mer蛋白，TAM家族蛋白的配体均为生长停滞特异性基因 6(growth arrest-specific 6，Gas6)所编码的蛋白分子。AXL作为TAM受体家族的成员之一目前已经成为潜在的肿瘤靶标，其在多种恶性肿瘤中高表达，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和卵巢癌等，而Gas6作为AXL的唯一配体在多种恶性肿瘤中也呈高表达。AXL蛋白的相对分子质量约为1.4×105，由AXL原癌基因编码，AXL蛋白由胞外区、胞内区和跨膜区3部分组成，其中胞外区与神经细胞黏附分子(NCAM)结构相似，包括2个免疫球蛋白样区(Ig) 和2个纤连蛋白III(FroIII)样区，其中Ig样区为与配体结合的区域，而FroIII 区在AXL与配体结合的过程中起调节作用。AXL的胞内区为酪氨酸激酶样区，具有激酶活性。
AXL蛋白分子广泛表达于人体正常组织，如海马和小脑、单核/巨噬细胞、血小板、内皮细胞、心肌、结肠黏膜、肝、甲状腺、肾、睾丸、骨骼肌等，其中心肌和骨骼肌表达最高，在骨髓CD34+细胞和基质细胞中也有较高的表达，而在正常淋巴组织中表达较低。Gas6与AXL的胞外区域结合后，AXL发生二聚化，从而导致自身磷酸化。在AXL的胞内结构域有3个磷酸化位点，分别为 Y779、Y821和Y866，这些磷酸化位点可与磷脂酰肌醇3激酶亚基(PI3K)、磷脂酶C(PLC)和生长因子受体结合蛋白2(Grb2)结合，激活多种AXL相关信号通路，如RAS/ERK和PI3K/Akt信号通路等，从而产生相应的生物学效应，包括促进细胞的生长、生存和增殖等。目前发现，AXL蛋白的高表达促进肿瘤的转移、侵袭以及肿瘤耐药性的形成，特异性阻断AXL-Gas6的相互作用可有效地抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭以及耐药性。目前研究者们尝试通过抑制 AXL/Gas6信号通路的活化来治疗肿瘤，并取得了良好进展。其中以小分子抑制剂和抗体类药物的研究为主。目前，已经报道了多种针对AXL通路的小分子抑制剂，其中R428、s49076、LY2801653以及MP-470、SKI-606、MGCD265、 ASP2215、XL184等已经进入了临床试验阶段，NA80x1、LDC1267、NPS-1034、 MGCD516等尚处于临床前的研究。Li等已经获得了几株有活性的抗体3g9、8b5、 12a11和YW327.6S2，其中YW327.6S2与3g9、8b5和12a11不同，它与人和鼠的AXL都有较高的亲和力。体外实验表明，YW327.6S2可以下调AXL的表达，阻断AXL与配体Gas6的结合，抑制AXL及下游信号的活化。
本发明利用天然噬菌体抗体库筛选获得了一株靶向AXL的抗体DAXL-88，该抗体能够特异性识别人源AXL(hAXL)蛋白，且亲和力为3.70×10-10M，具有潜在阻断AXL-Gas6相互作用的功能。
发明内容
为了提供新的靶向AXL抗体分子，本发明公开了一种靶向AXL的抗体 DAXL-88，该抗体的重链可变区氨基酸序列为序列表中序列1，轻链可变区氨基酸序列为序列表中序列2。
本发明还公开了上述靶向AXL的抗体DAXL-88可变区基因，其中重链可变区基因序列为序列表中序列3，轻链可变区基因序列为序列表中序列4。
本发明通过试验进行了靶向AXL抗体的功能鉴定，结果显示DAXL-88能够特异性识别人源AXL胞外段(hAXL-ECD)和鼠源AXL胞外段(mAXL-ECD)，与hAXL-ECD和mAXL-ECD的结合呈剂量依赖性，与hAXL-ECD结合的亲和力为3.70×10-10M，可以阻断AXL-Gas6的相互作用。
本发明公开的靶向AXL的抗体DAXL-88是通过筛选天然噬菌体抗体库获得的新型靶向AXL的抗体。
具体实施过程如下：
1)通过对天然噬菌体抗体库进行筛选获得一株新型的靶向AXL抗体 DAXL-88；
2)抗体DAXL-88的表达及纯化；
3)靶向AXL的抗体DAXL-88体外生物学活性的鉴定。
下面参照上述步骤详细描述靶向AXL抗体的筛选及制备过程。筛选及制备本发明抗体的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
本发明利用天然噬菌体抗体库进行筛选，通过包被hAXL-ECD蛋白，特异性富集AXL抗体，最后获得一株高亲和力的AXL抗体DAXL-88。
实验结果显示，DAXL-88具有良好的生物学效应，能够识别hAXL-ECD蛋白，且亲和力为3.70×10-10M，具有潜在的阻断AXL-Gas6相互作用的功能，可以制备用于靶向AXL高表达疾病的治疗药物。
1)利用PCR技术获得靶向AXL抗体的基因
通过对天然噬菌体抗体库进行筛选获得一株新型的靶向AXL抗体 DAXL-88，根据测序结果信息，结合本实验室保存的全抗真核表达载体，设计相应的引物，通过PCR的方法获得抗体DAXL-88轻重链可变区基因序列，并进行测序确认。
2)抗体DAXL-88的表达及纯化
将抗体DAXL-88基因构建至全抗真核表达载体中，通过转染真核表达细胞，培养足够长时间后收获上清，上清中含有目的抗体。利用双夹心ELISA法鉴定目的抗体，并通过绘制标准曲线计算抗体的表达量。利用Protein A亲和层析柱纯化抗体，用于抗体功能鉴定。
3)靶向AXL抗体DAXL-88体外生物学活性的鉴定
a)抗原hAXL-ECD结合试验：包被hAXL-ECD蛋白，封闭，加入倍比稀释的DAXL-88抗体，37℃孵育1～2h，洗板后加入HRP标记的抗人二抗孵育， TMB显色并测定吸光度值。
b)抗原mAXL-ECD结合试验：包被mAXL-ECD蛋白，封闭，加入倍比稀释的DAXL-88抗体，37℃孵育1～2h，洗板后加入HRP标记的抗人二抗孵育， TMB显色并测定吸光度值。
c)特异性阻断AXL-Gas6试验：包被Gas6蛋白，依次与梯度稀释的DAXL-88 和Biontin-hAXL-ECD预混一抗进行孵育1～2h，洗板后使用特异性HRP标记抗人二抗孵育，TMB法显色并测值。
d)BIAcore测定抗体DAXL-88的亲和力：利用抗Fc抗体的Chip结合 DAXL-88抗体作为固定相，梯度稀释hAXL-ECD抗原作为流动相，上机检测，每个样品重复测定2次，拟合并分析数据，计算抗体亲和力。
附图说明
图1 ELISA筛选克隆上清与抗原hAXL-ECD的结合。结果显示，其中4 个克隆可与hAXL-ECD特异性结合，其中88号克隆亲和力最高，选择88号克隆进行实验，并命名为DAXL-88。
图2 ELISA检测DAXL-88与抗原hAXL-ECD的结合。结果显示，DAXL-88 能够特异性识别hAXL-ECD，呈剂量依赖性。
图3 ELISA检测DAXL-88与抗原mAXL-ECD的结合。结果显示， DAXL-88能够特异性识别mAXL-ECD，呈剂量依赖性。
图4竞争ELISA检测DAXL-88阻断AXL-Gas6的结合。结果显示， DAXL-88能够阻断AXL-Gas6的结合，且呈剂量依赖性。
图5 BIAcore法测定DAXL-88结合hAXL-ECD的亲和力。经计算， DAXL-88的亲和力为3.70×10-10M。
具体实施方式
实施例一 天然噬菌体抗体库筛选靶向AXL抗体
一、材料：
试剂：氨苄青霉素、卡纳青霉素、酵母膏、葡萄糖、吐温20、TMB、PBS、PEG 等为常规试剂，anti-M13 HRP二抗购置于Amersham公司，hAXL-ECD蛋白购自义翘神州生物技术有限公司。
菌株、噬菌粒：TG1大肠杆菌菌株及辅助噬菌体VCSM13均为商业化产品。
二、方法结果
1、抗原特异性噬菌体展示抗体筛选
(1)无菌PBS稀释的相应hAXL-ECD抗原至10μg/ml，以500μl每管加入到免疫管中，4℃包被过夜。
(2)弃去抗原溶液，加入无菌PBST配置的4％牛奶，室温封闭一小时。弃去牛奶，在免疫管中加入500μl封闭后的噬菌体溶液，室温孵育一小时 PBST洗管15次，然后用PBS洗管10次。
(3)500μl 0.1M TEA洗脱噬菌体，室温洗脱十分钟。加入500μl 1M Tris-HClpH7.5以调整洗脱液pH值至pH 7.5。
(4)再次使用500μl 0.1M TEA洗脱噬菌体，室温十分钟，将二次洗脱液加入第一次洗脱液和Tris-HCl混合溶液中。
2、噬菌体再生与扩增
(1)接种200μl TG1至50ml 2YT中，培养至OD600约为0.6-0.8。
(2)将500μl噬菌体加入10ml对数生长期的TG1中，37℃静置培养0.5小时.4000rpm 20℃离心15min。
(3)弃去上清，将所有沉淀涂布于2YTAG(2YT+Amp 100μg/ml+2％葡萄糖) 平板(150mm*250mm平板)上，37℃培养过夜。
(4)将所有TG1菌株从平板上刮下后加入至50ml 2YTAG(2YT+Amp 100ug/ml +2％葡萄糖)培养基中使OD600值达到约0.1，37℃ 220rpm培养2.5小时。
(5)菌株生长到达对数期后取10ml，在其中加入20～200μl M13ko7辅助噬菌体，37℃静置培养0.5小时；4000rpm 20℃离心15分钟，弃去上清，使用50ml 2YTAK(2YT+Amp100ug/ml+Kana 70ug/ml)培养基重悬，28℃震荡培养过夜。
如上所述沉淀噬菌体进行下一轮淘洗。
3、筛选后噬菌体抗原特异性分析
(1)ELISA板条中包被相应的hAXL-ECD抗原，4℃包被过夜。
(2)每孔加入200μl PBSM(PBS配置的4％脱脂牛奶)室温封闭0.5小时。
通过比较噬菌体上清吸光值调整噬菌体上清至同一起始浓度，同时将噬菌体上清按照5倍、25倍、125倍进行梯度稀释，获得三个浓度梯度。
(3)弃去孔内溶液后每孔加入100μl噬菌体，室温孵育一小时。
(4)0.1％Tween-20去离子水配置洗液洗板五次。
每孔加入100μl anti-M13/HRP抗体(1∶5000稀释于PBSM中)，室温孵育一小时后洗板8次。
(5)每孔加入100ul TMB显色。
加入终止液后酶联仪测OD450nm。
将阳性孔克隆送测序，获得候选抗体序列。
4、结果：三轮筛选后挑选5个克隆进行ELISA鉴定。图1显示其中4个克隆均与hAXL-ECD抗原具有特异性识别。其中克隆号为88具有良好的结合活性，故挑选88号克隆进行进一步功能验证，将88号克隆命名为DAXL-88。(图1)
实施例二 靶向AXL人源抗体DAXL-88基因的获取
一、材料：
引物由上海生工生物技术有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase为 TAKARA公司产品；dNTP为TAKARA公司产品；pGEM-T Easy vector system 为Invitrogen公司产品；T4DNA连接酶为NEB公司产品；基因测序由上海生工生物技术有限公司完成；其它相关试剂均为市购。
二、方法结果
1、引物设计
通过测序分析DAXL-88克隆的序列信息，根据本实验室保存的全抗真核表达载体的酶切位点图谱，在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入HindIII 和Bsiw I酶切位点；在抗体重链可变区基因5’端及3’端分别引入ClaI和NheI 酶切位点。设计引物获得DAXL-88抗体轻重链可变区序列。利用计算机辅助设计软件，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数，分别设计 VH的3条引物和VL的3条引物，分别编号为VH-P1、P2、P3以及VL-P1、P2、 P3，用于抗体重链可变区和轻链可变区的扩增。
2、PCR钓取抗体轻重链基因
(1)引物合成后以无菌水稀释，方法如下：
a)引物管12000rpm离心2分钟，配制为100μM的储存浓度，-20℃保存；
b)第一轮VH扩增：
取少量引物P2、P3，引物终浓度为10μM，即使用液；
第一轮VL扩增：
取少量引物P2、P3，引物终浓度为10μM，即使用液；
c)第二轮VH扩增：
P1、P3引物终浓度为10μM，即使用液；
第二轮VL扩增：
P1、P3引物终浓度为10μM，即使用液；
(2)扩增DAXL-88(即88号克隆)轻重链，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：
a)第一轮VH扩增：各取1μL P2、P3引物，配制如下PCR体系，扩增VH的片段；
Figure BSA0000169961040000081
b)将以上PCR体系进行如下反应：
Figure BSA0000169961040000082
c)第二轮PCR扩增VH：各取1μL P1、P3引物，配制如下PCR体系，扩增VH片段：
第二轮PCR扩增VL：各取1μL P1、P3引物，配制如下PCR体系，扩增 VL片段：
Figure BSA0000169961040000083
Figure BSA0000169961040000091
Figure BSA0000169961040000092
反应结束后，降到室温。
c)1～2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，抗体重链基因回收约410bp大小的片段，轻链基因回收约404bp大小的片段。
d)回收加尾(Pyrobest DNA polymerase不能在PCR产物3’端加A尾，所以不能直接连接T载体)，作如下10μL体系：
Figure BSA0000169961040000093
反应条件如下：72℃ 20mins。反应结束后，降到室温。
e)取加尾产物，连接pGEM-T Easy载体：
Figure BSA0000169961040000094
室温连接2h或者4℃连接过夜，连接产物转化于大肠杆菌TOP10，涂布在含有100μg/mL氨卞青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨卞青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(天根生物)提取质粒，获得的质粒进行核酸测序鉴定。
PCR扩增后经过琼脂糖凝胶电泳分析，获得特异大小的目的条带；产物经过回收、加尾、克隆等分子生物学技术，成功克隆入pGEM-T Easy载体；经过测序鉴定，扩增获得的基因为抗体轻重链可变区序列。
实施例三 靶向AXL抗体DAXL-88的表达及抗原结合功能评价
一、材料
全抗真核表达载体pFRT-HIgG1K由本室保存；引物由上海生工生物技术有限公司合成；羊抗人IgG、辣根酶标记亲和素及辣根酶标记的羊抗人IgG购自 Thermo；hAXL-ECD、mAXL-ECD蛋白购自义翘神州生物技术有限公司；Gas6 (R&D)蛋白购自北京中原公司；内切酶为NEB公司产品；CHO-S细胞转染试剂盒购自Thermo；其他试剂为市购产品。
二、方法
1、抗体的表达
1.1抗体真核表达载体的构建
pFRT-HIgG1K是含有人IgG1抗体恒定区基因的高效表达载体。将实施例二所述获得的抗体轻重链可变区基因克隆载体用相应的内切酶消化(重链可变区基因用NheI和ClaI消化，轻链可变区基因用HindIII和BsiwI消化)后，依次与经相同内切酶消化的载体连接，获得全抗的真核表达载体。具体实施如下：
a)如实施例二所述，获得的抗体DAXL-88轻重链可变区基因构建到 pGEM-T Easy载体中，获得的载体分别命名为pGEM-T-DAXL-88；
b)取pGEM-T-DAXL-88分别用NheI、ClaI消化，HindIII、BsiwI消化，分别获得DAXL-88-VH、DAXL-88-VL；
c)取1μg pFRT-HIgG1K载体，用HindIII和NheI消化，随后回收片段使用 BsiwI和ClaI消化。用DNA连接酶T4连接所得的经NheI、ClaI、HindIII及BsiwI 消化的pFRT-HIgG1K载体与用NheI和ClaI消化的抗体DAXL-88重链可变区基因及DAXL-88轻链可变区片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌TOP10，涂布在含有100μg/mL氨卞青霉素(终浓度)的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100μg/mL氨卞青霉素(终浓度)的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒(天根生物)提取质粒。所提取的质粒分别使用轻重链可变区引物进行菌落 PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体DAXL-88轻链和重链可变区基因的质粒pFRT-HIgG1K-DAXL-88。
1.2抗体DAXL-88的表达
将获得的真核表达载体，使用CHO-S转染试剂盒转染至CHO-S细胞内，按照说明书转染8天后收获上清，利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG 进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量。实验结果显示，上清中目的蛋白可以被羊抗人IgG抗体识别，含有人IgG抗体的恒定区，具有人IgG抗体特征。抗体表达量为～100μg/mL，利用Protein A亲和层析柱纯化抗体。
2、抗体DAXL-88的功能鉴定
2.1 ELISA检测DAXL-88与hAXL-ECD、mAXL-ECD的结合
分别将hAXL-ECD、mAXL-ECD蛋白包被后，依次与梯度稀释的DAXL-88 结合，使用特异性HRP标记抗人二抗孵育，利用TMB法显色并测值。结果显示，DAXL-88能够特异性识别hAXL-ECD、mAXL-ECD，与hAXL-ECD、 mAXL-ECD的结合呈剂量依赖性。(图2、图3)
2.2 ELISA检测DAXL-88阻断AXL-Gas6相互作用
将Gas6蛋白包被后，依次与梯度稀释的DAXL-88和终浓度1μg/mL的 Biontin-hAXL-ECD预混一抗进行孵育，使用特异性HRP标记亲和素二抗孵育，利用TMB法显色并测值。结果显示，DAXL-88能够特异性阻断AXL-Gas6相互作用，且呈剂量依赖性。(图4)
2.3 BIAcore测定DAXL-88结合hAXL-ECD的亲和力
利用交联抗Fc抗体的Chip捕捉DAXL-88抗体作为固定相，梯度稀释 hAXL-ECD抗原作为流动相，上机检测，每个样品检测循环包括平衡、结合、解离、洗涤等步骤，重复测定2次，收集并拟合、分析数据。经计算，DAXL-88 的亲和力为3.70×10-10M(图5)。
Figure 1
Figure ISA0000169961060000021
Figure ISA0000169961060000031
Figure ISA0000169961060000041

Claims (3)

1.一种新型靶向AXL的抗体，其特征在于该抗体重链可变区氨基酸序列为序列表中序列1，轻链可变区氨基酸序列为序列表中序列2。
2.根据权利要求1所述抗体，其重链可变区编码基因序列为序列表中序列3，轻链可变区编码基因序列为序列表中序列4。
3.一种真核表达载体pFRT-HIgG1K-DAXL-88，其特征在于包含权利要求2所述抗体的重链和轻链可变区编码基因。
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