CN110846286A - 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法 - Google Patents

利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110846286A
CN110846286A CN201910862035.9A CN201910862035A CN110846286A CN 110846286 A CN110846286 A CN 110846286A CN 201910862035 A CN201910862035 A CN 201910862035A CN 110846286 A CN110846286 A CN 110846286A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rare earth
fluorescent particles
sendai virus
bira
gpi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910862035.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110846286B (zh
Inventor
王汉杰
潘惠卓
常津
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201910862035.9A priority Critical patent/CN110846286B/zh
Publication of CN110846286A publication Critical patent/CN110846286A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110846286B publication Critical patent/CN110846286B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，包括如下步骤：包含生物素连接酶(BirA)、生物素结合位点(APtag)及糖基化磷酯酰肌醇细胞膜锚定序列(GPI)的高效表达质粒pCDH‑BirA‑AP‑GPI的构建；链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒的合成；包膜生物素化的仙台病毒的制备；利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒。本发明的病毒包膜标记技术，可实现40％～60％的病毒标记效率，在980nm近红外光激发下，所用稀土上转换荧光颗粒能发射波长540nm的绿色荧光，可在共聚焦显微镜下观察。

Description

利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法
技术领域
本发明属于生物技术和材料技术领域，具体涉及一种稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法。
背景技术
目前的病毒单颗粒标记方法主要包括应用荧光素、荧光蛋白及量子点纳米颗粒分别或同时标记病毒的包膜、衣壳及核酸结构。但这种方法仍存在一定局限性：将荧光蛋白与病毒颗粒融合表达周期较长、操作步骤繁琐、对病毒粒子活性影响较大，且荧光蛋白自身荧光偏弱、易光漂，不利于长期地病毒示踪；与荧光蛋白相比，有机荧光染料作为病毒标记物标记过程相对简单、对病毒活性影响小，但其发射光谱宽、光稳定性较差，长时间实时荧光监测相对困难，在一定程度上限制了其在单颗粒示踪领域的应用；量子点虽解决了部分荧光淬灭的问题，如果应用于活体病毒示踪，仍存在可见光穿透性差、荧光寿命短及背景噪音高等局限，对研究病毒的活体侵染造成限制。上转换发光材料是一种吸收长波长光而发射出短波长光的一种材料，因其激发光波长较长(980nm)，具有良好的组织穿透性，因此被广泛运用于活体的疾病治疗、信号通路调控等。与传统的生物荧光探针相比，稀土离子掺杂的上转换纳米粒子作为生物荧光探针具有发光亮度高、荧光寿命长(毫秒量级)、光稳定性好、抗漂白性强、穿透深度深、无背景荧光干扰等优点，应用于病毒单颗粒标记，会有广大的应用前景及实用价值。仙台病毒因其粒径较大，是研究单病毒标记的良好模型。因此，我们以仙台病毒为例，研发一种操作方法简单的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，这种方法具备良好的标记效率，更方便应用于后续活体的病毒侵染机制探讨等研究。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，提出了一种具有标记效率高等优势的一种利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法。
本发明的技术方案如下：利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，包括如下步骤：
1)包含生物素连接酶(BirA)、生物素结合位点(APtag)及糖基化磷酯酰肌醇细胞膜锚定序列(GPI)的高效表达质粒pCDH-BirA-AP-GPI的构建；
2)链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒的合成；
3)包膜生物素化的仙台病毒的制备；
4)利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒。
所述步骤1)中质粒pCDH-BirA-AP-GPI构建的具体步骤：
(1)公司合成BirA-AP-GPI序列：
ATGCATCATCACCATCACCATGGCGGAGGAGGCTCTATGAAGGATAACACCGTGCCACT GAAATTGATTGCCCTGTTAGCGAACGGTGAATTTCACTCTGGCGAGCAGTTGGGTGAAA CGCTGGGAATGAGCCGGGCGGCTATTAATAAACACATTCAGACACTGCGTGACTGGGGC GTTGATGTCTTTACCGTTCCGGGTAAAGGATACAGCCTGCCTGAGCCTATCCAGTTACTT AATGCTAAACAGATATTGGGTCAGCTGGATGGCGGTAGTGTAGCCGTGCTGCCAGTGATT GACTCCACGAATCAGTACCTTCTTGATCGTATCGGAGAGCTTAAATCGGGCGATGCTTGC ATTGCAGAATACCAGCAGGCTGGCCGTGGTCGCCGGGGTCGGAAATGGTTTTCGCCTTT TGGCGCAAACTTATATTTGTCGATGTTCTGGCGTCTGGAACAAGGCCCGGCGGCGGCGA TTGGTTTAAGTCTGGTTATCGGTATCGTGATGGCGGAAGTATTACGCAAGCTGGGTGCAG ATAAAGTTCGTGTTAAATGGCCTAATGACCTCTATCTGCAGGATCGCAAGCTGGCAGGCA TTCTGGTGGAGCTGACTGGCAAAACTGGCGATGCGGCGCAAATAGTCATTGGAGCCGG GATCAACATGGCAATGCGCCGTGTTGAAGAGAGTGTCGTTAATCAGGGGTGGATCACGC TGCAGGAAGCGGGGATCAATCTCGATCGTAATACGTTGGCGGCCATGCTAATACGTGAAT TACGTGCTGCGTTGGAACTCTTCGAACAAGAAGGATTGGCACCTTATCTGTCGCGCTGG GAAAAGCTGGATAATTTTATTAATCGCCCAGTGAAACTTATCATTGGTGATAAAGAAATAT TTGGCATTTCACGCGGAATAGACAAACAGGGGGCTTTATTACTTGAGCAGGATGGAATA ATAAAACCCTGGATGGGCGGTGAAATATCCCTGCGTAGTGCAGAAAAAGGCGGAGGAG GCTCTGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGCGGAGG AGGCTCTATGTACACCGCCTGCGACCTGGCGCCCCCCGCCGGCACCACCGACGCCGCGC ACCCGGGGCGGTCCGTGGTCCCCGCGTTGCTTCCTCTGCTGGCCGGGACCCTGCTGCTGCTGGAGACGGCCACTGCTCCCTGATAA
(2)设计引物PCR扩增目的片段BirA-AP-GPI，并使其5'端及3'端分别带有酶切位点XbaI 及BamHI，引物设计如下(下划线为酶切位点及保护碱基)：
Forward：GCTCTAGAATGCATCATCACCATCACC
Reversed：CGGCCACTGCTCCCTGATAAGGATCCCG
PCR反应条件如下：94℃×5min，94℃×1min，55℃×1min，72℃×5min，共33个循环。
将该片段的PCR纯化产物与载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP)双酶切(XbaI与BamHI)，利用T4连接酶连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态，涂布含有氨苄抗生素的 LB固体培养基。
(3)隔日将生长出的单菌落送至公司sanger测序，将序列匹配的菌落扩大培养并提取质粒，即为pCDH-BirA-AP-GPI质粒。
所述步骤2)中链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒合成的具体步骤：
(1)利用高温油相法合成稀土上转换荧光颗粒：步骤如下：按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铒＝＝78:20:5～78:20:2将原料加入到圆底烧瓶中，加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；水蒸干后，冷却至60℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2:1加入圆底烧瓶等中使白色固体完全溶解；按照质量数比为氢氧化钠：氟化铵＝1：3将二者加入，并加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120℃，抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换荧光颗粒。
(2)利用柠檬酸法将合成的稀土上转换荧光颗粒表面羧基化改性：具体步骤如下：取上述制备的稀土上转换荧光颗粒10mg溶解至1.25ml的二氯苯中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺混匀，再称取150mg的无水柠檬酸溶解至1.25ml的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯混匀；将上述两种溶液混匀，于120℃磁力搅拌条件下反应4h，最后以12000rpm 离心10min，并用去离子水洗涤沉淀3遍，真空干燥处理后即制得表面羧基化的稀土上转换荧光颗粒。
(3)配置10mg/ml的链霉亲和素溶液，将羧基化的稀土上转换荧光颗粒按照质量体积比1:3～5 重悬至1ml链霉亲和素溶液中，4℃孵育16～24h,4℃下8000～12000rpm离心10～20min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒(SA-UCNs)。
所述步骤3)中包膜生物素化的仙台病毒的制备的具体步骤：
(1)在6孔板中传代培养293T细胞，按照105细胞/孔的密度接种。当细胞密度生长至60％时，按照8μg～12μg/孔转染pCDH-BirA-AP-GPI质粒，37℃放置24～48h，使蛋白充分表达；
(2)感染前将上述293T细胞旧的培养液舍弃，将子代仙台病毒与DMEM培养基共混(105～107仙台病毒/ml)，上述混合液加入孔内，37℃放置8～20h，收集上清。过0.45μm滤膜以去除细胞碎片，按照体积比1:3～6将40％PEG4000与上清共混，4℃孵育16～24h，4℃下1500～2500rpm 离心45～90min，将上清中的子代病毒浓缩，根据后续用量利用PBS重悬，获得包膜表面带有 BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒；
(3)向浓缩液中加入25～50nM ATP及50～100nM生物素，4℃孵育2～4h，4℃下8000～12000rpm 离心15～30min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得包膜生物素化的仙台病毒。
所述步骤4)中利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒的具体步骤：
(1)按照0.1～1mg/ml的比例，向病毒浓缩液中加入SA-UCNs，4℃孵育16～24h；
(2)4℃下8000～12000rpm离心15～30min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得稀土上转换荧光颗粒标记包膜的仙台病毒。
构建的质粒pCDH-BirA-AP-GPI，可在293T细胞膜表面表达BirA-AP-GPI蛋白，其中BirA 为生物素连接酶，在生物素及ATP存在时能够识别生物素，并将其转移至生物素结合位点 AP中，使整个系统带有生物素，GPI为糖基化磷酯酰肌醇细胞膜锚定序列，可使整个系统牢固锚定于磷酸双分子层。
合成链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒，稀土上转换荧光颗粒表面带有链霉亲和素 (SA-UCNs)，在980nm激发下可发出540nm的荧光。
制备出的仙台病毒表面带有BirA-AP-GPI蛋白，在生物素及ATP存在情况下，仙台病毒包膜可被生物素标记。
利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒与SA-UCNs共孵育后，利用生物素-亲和素共价结合原理，能够实现稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜，标记效率40％～60％。
有益效果
1.本发明的病毒包膜标记技术，可实现40％～60％的病毒标记效率，在980nm近红外光激发下，所用稀土上转换荧光颗粒能发射波长540nm的绿色荧光，可在共聚焦显微镜下观察。
2.构建的质粒pCDH-BirA-AP-GPI能够实现在哺乳动物细胞293T中的高效表达。
3.制备的稀土上转换荧光颗粒直径25～35μm，980nm波长近红外光激发下发射波长为540nm。
4.利用本发明的方法，可制得包膜生物素化的仙台病毒。
5.制备的羧基化稀土上转换荧光颗粒可与包膜生物素化的仙台病毒结合，实现病毒的单颗粒标记，共聚焦显微镜980nm激发下可观察到相应绿色荧光。
6.本发明研制出一种利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，利用生物素-亲和素共价结合原理，使生物素化的仙台病毒包膜标记上链霉亲和素化的稀土上转换荧光颗粒，在生物技术如病毒学等领域具有较高的科研应用前景。
附图说明
图1是构建的pCDH-BirA-AP-GPI质粒图谱。
图2是制备的链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒低倍透射电镜照片。
图3是制备的稀土上转换荧光颗粒的发光光谱。
图4是对仙台病毒BirA-AP-GPI蛋白标记的验证：
1为表达BirA-AP-GPI蛋白的293T细胞样本；
2为正常仙台病毒样本；
3为标记BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒样本。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
利用高温油相法合成稀土上转换荧光颗粒
按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铒＝＝78:20:5将原料加入到圆底烧瓶中，加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；水蒸干后，冷却至60℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2:1加入圆底烧瓶等中使白色固体完全溶解；按照质量数比为氢氧化钠：氟化铵＝1：3将二者加入，并加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120℃，抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换荧光颗粒，980nm激发下发射560nm绿光(图1)。
实施例2
利用高温油相法合成稀土上转换荧光颗粒
按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铒＝＝78:20:4将原料加入到圆底烧瓶中，加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；水蒸干后，冷却至60℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2:1加入圆底烧瓶等中使白色固体完全溶解；按照质量数比为氢氧化钠：氟化铵＝1：3将二者加入，并加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120℃，抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换荧光颗粒。
实施例3
利用高温油相法合成稀土上转换荧光颗粒
按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铒＝＝78:20:2将原料加入到圆底烧瓶中，加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；水蒸干后，冷却至60℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2:1加入圆底烧瓶等中使白色固体完全溶解；按照质量数比为氢氧化钠：氟化铵＝1：3将二者加入，并加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120℃，抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换荧光颗粒。
实施例4
链霉亲和素化的稀土上转换荧光颗粒制备
配置10mg/ml的链霉亲和素溶液，将羧基化的稀土上转换荧光颗粒按照质量体积比1:5 重悬至1ml链霉亲和素溶液中，4℃孵育16h,4℃下8000rpm离心20min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒。
实施例5
链霉亲和素化的稀土上转换荧光颗粒制备
配置10mg/ml的链霉亲和素溶液，将羧基化的稀土上转换荧光颗粒按照质量体积比1:4 重悬至1ml链霉亲和素溶液中，4℃孵育20h,4℃下8000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒。
实施例6
链霉亲和素化的稀土上转换荧光颗粒制备
配置10mg/ml的链霉亲和素溶液，将羧基化的稀土上转换荧光颗粒按照质量体积比1:3 重悬至1ml链霉亲和素溶液中，4℃孵育24h,4℃下8000rpm离心10min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒 (图2)。
实施例7
包膜生物素化的仙台病毒的制备
在6孔板中传代培养293T细胞，按照105细胞/孔的密度接种。当细胞密度生长至60％时，按照8μg/孔转染pCDH-BirA-AP-GPI质粒，37℃放置48h，使蛋白充分表达；感染前将上述293T细胞旧的培养液舍弃，将子代仙台病毒与DMEM培养基共混(105仙台病毒/ml)，上述混合液加入孔内，37℃放置12h，收集上清。过0.45μm滤膜以去除细胞碎片，按照体积比1:3～6将40％PEG4000与上清共混，4℃孵育24h，4℃下1500rpm离心45min，将上清中的子代病毒浓缩，根据后续用量利用PBS重悬，获得包膜表面带有BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒，向浓缩液中加入50nM ATP及50nM生物素，4℃孵育2h，4℃下8000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得包膜生物素化的仙台病毒。
实施例8
包膜生物素化的仙台病毒的制备
在6孔板中传代培养293T细胞，按照105细胞/孔的密度接种。当细胞密度生长至60％时，按照10μg/孔转染pCDH-BirA-AP-GPI质粒，37℃放置48h，使蛋白充分表达；感染前将上述293T细胞旧的培养液舍弃，将子代仙台病毒与DMEM培养基共混(105仙台病毒/ml)，上述混合液加入孔内，37℃放置12h，收集上清。过0.45μm滤膜以去除细胞碎片，按照体积比1:3～6将40％PEG4000与上清共混，4℃孵育24h，4℃下1500rpm离心45min，将上清中的子代病毒浓缩，根据后续用量利用PBS重悬，获得包膜表面带有BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒，向浓缩液中加入50nM ATP及50nM生物素，4℃孵育2h，4℃下8000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得包膜生物素化的仙台病毒(图3)。
实施例9
包膜生物素化的仙台病毒的制备
在6孔板中传代培养293T细胞，按照105细胞/孔的密度接种。当细胞密度生长至60％时，按照12μg/孔转染pCDH-BirA-AP-GPI质粒，37℃放置48h，使蛋白充分表达；感染前将上述293T细胞旧的培养液舍弃，将子代仙台病毒与DMEM培养基共混(105仙台病毒/ml)，上述混合液加入孔内，37℃放置12h，收集上清。过0.45μm滤膜以去除细胞碎片，按照体积比1:3～6将40％PEG4000与上清共混，4℃孵育24h，4℃下1500rpm离心45min，将上清中的子代病毒浓缩，根据后续用量利用PBS重悬，获得包膜表面带有BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒，向浓缩液中加入50nM ATP及50nM生物素，4℃孵育2h，4℃下8000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得包膜生物素化的仙台病毒。
实施例10
链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒
按照0.1mg/ml的比例，向病毒浓缩液中加入SA-UCNs，4℃孵育24h；4℃下12000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得稀土上转换荧光颗粒标记包膜的仙台病毒。
实施例11
链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒
按照0.5mg/ml的比例，向病毒浓缩液中加入SA-UCNs，4℃孵育24h；4℃下12000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得稀土上转换荧光颗粒标记包膜的仙台病毒(图4)。
实施例12
链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒
按照1mg/ml的比例，向病毒浓缩液中加入SA-UCNs，4℃孵育24h；4℃下12000rpm离心15min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得稀土上转换荧光颗粒标记包膜的仙台病毒。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcatcatc accatcacca tggcggagga ggctctatga aggataacac cgtgccactg 60
aaattgattg ccctgttagc gaacggtgaa tttcactctg gcgagcagtt gggtgaaacg 120
ctgggaatga gccgggcggc tattaataaa cacattcaga cactgcgtga ctggggcgtt 180
gatgtcttta ccgttccggg taaaggatac agcctgcctg agcctatcca gttacttaat 240
gctaaacaga tattgggtca gctggatggc ggtagtgtag ccgtgctgcc agtgattgac 300
tccacgaatc agtaccttct tgatcgtatc ggagagctta aatcgggcga tgcttgcatt 360
gcagaatacc agcaggctgg ccgtggtcgc cggggtcgga aatggttttc gccttttggc 420
gcaaacttat atttgtcgat gttctggcgt ctggaacaag gcccggcggc ggcgattggt 480
ttaagtctgg ttatcggtat cgtgatggcg gaagtattac gcaagctggg tgcagataaa 540
gttcgtgtta aatggcctaa tgacctctat ctgcaggatc gcaagctggc aggcattctg 600
gtggagctga ctggcaaaac tggcgatgcg gcgcaaatag tcattggagc cgggatcaac 660
atggcaatgc gccgtgttga agagagtgtc gttaatcagg ggtggatcac gctgcaggaa 720
gcggggatca atctcgatcg taatacgttg gcggccatgc taatacgtga attacgtgct 780
gcgttggaac tcttcgaaca agaaggattg gcaccttatc tgtcgcgctg ggaaaagctg 840
gataatttta ttaatcgccc agtgaaactt atcattggtg ataaagaaat atttggcatt 900
tcacgcggaa tagacaaaca gggggcttta ttacttgagc aggatggaat aataaaaccc 960
tggatgggcg gtgaaatatc cctgcgtagt gcagaaaaag gcggaggagg ctctggtctg 1020
aacgatatct tcgaagctca gaaaatcgaa tggcacgaag gcggaggagg ctctatgtac 1080
accgcctgcg acctggcgcc ccccgccggc accaccgacg ccgcgcaccc ggggcggtcc 1140
gtggtccccg cgttgcttcc tctgctggcc gggaccctgc tgctgctgga gacggccact 1200
gctccctgat aa 1212
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctagaat gcatcatcac catcacc 27
<210> 3
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3

Claims (9)

1.利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)包含生物素连接酶(BirA)、生物素结合位点(APtag)及糖基化磷酯酰肌醇细胞膜锚定序列(GPI)的高效表达质粒pCDH-BirA-AP-GPI的构建；
2)链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒的合成；
3)包膜生物素化的仙台病毒的制备；
4)利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒。
2.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，所述步骤1)中pCDH-BirA-AP-GPI构建的步骤：
(1)公司合成BirA-AP-GPI序列；
(2)设计引物扩增目的片段BirA-AP-GPI，并使其5'端及3’端分别带有酶切位点XbaI及BamHI，将该片段纯化产物与载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP)双酶切及T4连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态；
(3)选取sanger测序正确的菌落扩大培养并提取质粒，获得pCDH-BirA-AP-GPI。
3.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，所述步骤2)中链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒的合成步骤：
(1)利用高温油相法合成稀土上转换荧光颗粒:按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铒＝78:20:5～78:20:2将原料加入到圆底烧瓶中，加入水至完全溶解，在磁力搅拌下加热直至溶液变为白色固体，冷却至60℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2:1加入圆底烧瓶等中使白色固体完全溶解，按照质量比为氢氧化钠：氟化铵＝1：3将二者混合并加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120℃，抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应1h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换荧光颗粒；
(2)利用柠檬酸法将合成的稀土上转换荧光颗粒表面羧基化改性:取上述制备的稀土上转换荧光颗粒10mg溶解至1.25ml的二氯苯中，然后加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺混匀，再称取150mg的无水柠檬酸溶解至1.25ml的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等体积的二氯苯混匀；将上述两种溶液混匀，于120℃磁力搅拌条件下反应4h，最后以12000rpm离心10min，并用去离子水洗涤沉淀3遍，真空干燥处理后即制得表面羧基化的稀土上转换荧光颗粒；
(3)配置10mg/ml的链霉亲和素溶液，将羧基化的稀土上转换荧光颗粒按照质量体积比1:3～5重悬至1ml链霉亲和素溶液中，4℃孵育16～24h,4℃下8000～12000rpm离心10～20min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒(SA-UCNs)。
4.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，所述步骤3)中包膜生物素化的仙台病毒的制备步骤：
(1)将293T细胞中转染pCDH-BirA-AP-GPI质粒，37℃放置24-48h等待蛋白表达；
(2)将子代仙台病毒与DMEM培养基共混(105～107仙台病毒/ml)，感染上述293T细胞，37℃放置8～20h后，收集上清，过0.45μm滤膜去除细胞碎片，按照体积比1:3～1:6将40％PEG4000与上清共混，4℃孵育16-24h，4℃下1500～2500rpm离心45～90min，将上清中的子代病毒浓缩，根据用量利用PBS重悬，获得包膜表面带有BirA-AP-GPI蛋白的仙台病毒；
(3)向浓缩液中加入25～50nM ATP及50～100nM生物素，4℃孵育2～4h，4℃下8000～12000rpm离心15～30min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得包膜生物素化的仙台病毒。
5.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，所述步骤4)中利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒步骤：
(1)按照0.1～1mg/ml的比例，向病毒浓缩液中加入SA-UCNs，4℃孵育16-24h；
(2)4℃下8000～12000rpm离心15～30min，相同条件下PBS清洗5次以去除多余的杂质，最后沉淀用PBS重悬，即获得稀土上转换荧光颗粒标记包膜的仙台病毒。
6.根据权利要求1或2所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，构建的质粒pCDH-BirA-AP-GPI，可在293T细胞膜表面表达BirA-AP-GPI蛋白，其中BirA为生物素连接酶，在生物素及ATP存在时能够识别生物素，并将其转移至生物素结合位点AP中，使整个系统带有生物素，GPI为糖基化磷酯酰肌醇细胞膜锚定序列，可使整个系统牢固锚定于磷酸双分子层。
7.根据权利要求1或3的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，合成链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒，稀土上转换荧光颗粒表面带有链霉亲和素(SA-UCNs)，在980nm激发下可发出540nm的荧光。
8.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，制备出的仙台病毒表面带有BirA-AP-GPI蛋白，在生物素及ATP存在情况下，仙台病毒包膜可被生物素标记。
9.根据权利要求1所述的利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法，其特征在于，
利用链霉亲和素化稀土上转换荧光颗粒标记包膜生物素化的仙台病毒与SA-UCNs共孵育后，利用生物素-亲和素共价结合原理，能够实现稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜，标记效率40％～60％。
CN201910862035.9A 2019-09-12 2019-09-12 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法 Active CN110846286B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910862035.9A CN110846286B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910862035.9A CN110846286B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110846286A true CN110846286A (zh) 2020-02-28
CN110846286B CN110846286B (zh) 2022-11-22

Family

ID=69594980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910862035.9A Active CN110846286B (zh) 2019-09-12 2019-09-12 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110846286B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363725A (zh) * 2020-03-26 2020-07-03 天津大学 一种稀土上转换纳米探针标记病毒的构建方法
CN113092766A (zh) * 2021-03-30 2021-07-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用
CN114085925A (zh) * 2021-10-28 2022-02-25 天津大学 一种基于稀土上转换纳米探针的甲型流感病毒核酸标记方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191710A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-01 Hanrahan John W. Method for labeling a membrane-localized protein
US20090275081A1 (en) * 2008-02-01 2009-11-05 The Regents Of The University Of California Biotin-ligase system for secretion of biotinylated protein
CN103667205A (zh) * 2013-12-10 2014-03-26 潍坊医学院 生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶
CN104458685A (zh) * 2014-11-27 2015-03-25 东南大学 一种基于荧光纳米颗粒的细胞膜成像试剂及其制备方法
CN106086173A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 西安交通大学 一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050191710A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-01 Hanrahan John W. Method for labeling a membrane-localized protein
US20090275081A1 (en) * 2008-02-01 2009-11-05 The Regents Of The University Of California Biotin-ligase system for secretion of biotinylated protein
CN103667205A (zh) * 2013-12-10 2014-03-26 潍坊医学院 生物标记的双分子定点生物素化重组碱性磷酸酶
CN104458685A (zh) * 2014-11-27 2015-03-25 东南大学 一种基于荧光纳米颗粒的细胞膜成像试剂及其制备方法
CN106086173A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 西安交通大学 一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何凤屏等: "量子点荧光标志结肠癌细胞及在其组织芯片的应用价值", 《国际检验医学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363725A (zh) * 2020-03-26 2020-07-03 天津大学 一种稀土上转换纳米探针标记病毒的构建方法
CN113092766A (zh) * 2021-03-30 2021-07-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用
CN114085925A (zh) * 2021-10-28 2022-02-25 天津大学 一种基于稀土上转换纳米探针的甲型流感病毒核酸标记方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110846286B (zh) 2022-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110846286B (zh) 利用稀土上转换荧光颗粒标记仙台病毒包膜的方法
Wu et al. High performance photosensitizers with aggregation-induced emission for image-guided photodynamic anticancer therapy
Shi et al. Fluorescent carbon dots for bioimaging and biosensing applications
Choi et al. Tailoring silver nanodots for intracellular staining
Li et al. Multifunctional carbon dots for highly luminescent orange-emissive cellulose based composite phosphor construction and plant tissue imaging
CN109385276B (zh) 高性能红光碳量子点材料及其制备方法和生物成像应用
Yu et al. Luminescence enhancement of CaF 2: Nd 3+ nanoparticles in the second near-infrared window for in vivo imaging through Y 3+ doping
Miyatake et al. Self‐Assembly of Synthetic Zinc Chlorins in Aqueous Microheterogeneous Media to an Artificial Supramolecular Light‐Harvesting Device
CN104789225B (zh) 一种量子点-丝素凝胶荧光纳米防伪材料及其制备方法
CN103224787B (zh) 稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料及其制备与应用
CN104231502B (zh) 双靶向近红外上转换纳米材料及其制备方法及应用
Zhang et al. Oxygen and sulfur-based pure n-electron dendrimeric systems: generation-dependent clusteroluminescence towards multicolor cell imaging and molecular ruler
CN105694888B (zh) 一种Mg2+掺杂NaREF4上转换荧光材料及其制备方法
CN110567924A (zh) 一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法及其在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用
Jiang et al. Integrating photon up-and down-conversion to produce efficient light-harvesting materials for enhancing natural photosynthesis
NL2026426B1 (en) Fluorine-containing graphene quantum dots, preparation method and application thereof as photosensitiser for photodanamic therapy
Xiaofeng et al. Upconversion nanoparticles for differential imaging of plant cells and detection of fluorescent dyes
CN107033908A (zh) 一种GdF3:Yb3+,Er3+上转换荧光纳米材料的制备方法
Li et al. Single‐Component Photochemical Afterglow Near‐Infrared Luminescent Nano‐Photosensitizers: Bioimaging and Photodynamic Therapy
Hu et al. Enhanced upconversion luminescence through core/shell structures and its application for detecting organic dyes in opaque fishes
Huang et al. A new stable and reliable method for labeling nucleic acids of fully replicative viruses
CN102604637A (zh) 生物素修饰稀土掺杂无机荧光纳米颗粒的制备方法
US20200347392A1 (en) Next generation of light-emitting plant longer duration and brighter
CN108148012A (zh) 近红外第二窗口发射小分子稀土配合物荧光探针及其制备方法
Wang et al. In situ synthesis of dicarboxylic acid functionalized upconversion nanoparticles for bioimaging applications

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant