CN110846204A - 一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统 - Google Patents

一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统。本发明所述光纤光镊为前端为平端结构的抛物线型光纤探针。本发明所述光纤光镊能够实现白血病细胞的三维非接触操控，并实现混合血溶液中白血病细胞的可控筛选。

Description

一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方 法和光纤光镊系统
技术领域
本发明涉及细胞筛选技术领域，具体涉及一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统。
背景技术
在单细胞尺度上实现混合溶液中目标细胞的可控筛选，尤其是从血溶液中萃取单个白血病细胞并用于进一步的生物医疗分析，在单细胞分析、药物开发和癌症治疗等生物技术应用领域有着潜在的重大应用。因为，比起测量整体细胞的平均响应，单细胞分析将极大利于研究人员表征单细胞的行为及不同细胞间的特异性差异。现存的筛选机制基于机理不同可分为两大类：一类利用生物荧光标记，代表为荧光激发的细胞分离技术；另一类无需特异性标记，代表为微流控技术。
然而，荧光激发的细胞分离技术，需要针对细胞进行较长时间的荧光标记，且针对不同细胞所选择的标记蛋白和生物处理不同，实验要求高，技术难度大，易对细胞产生难以避免的生理损伤。因而，研究人员的关注点日益集中在使用特定的微流控技术来实现细胞的高精度定向驱动，并基于不同细胞的特性实现对混合细胞溶液的有效分离和收集。然而，微流控技术通常适用于大量细胞的集中处理，进而测量细胞群体的整体参数和生理特征。当在单细胞尺度上实现特定细胞的精准操控时，仍面临着严峻挑战。众所周知，光纤探针易于在单细胞尺度上实现针对生物细胞的三维操控，然而已报道的方案大多只能实现针对生物细胞捕获或推离的单一功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统。本发明所述光纤光镊能够实现白血病细胞的三维非接触操控，并实现混合血溶液中白血病细胞的可控筛选。
本发明提供了一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊，所述光纤光镊为前端为平端结构的抛物线型光纤探针。
优选的是，所述光纤探针的直径为13.2μm。
优选的是，所述光纤探针前端直径在26μm的长度内由13.2μm减小至10μm，然后在6μm的长度内由10μm减小至5.6μm，前端为直径5.6μm的圆形平面。
本发明还提供了上述技术方案所述光纤光镊的制备方法，包括以下步骤：
去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，将光纤直径拉伸至13.2μm，沿轴向进行第二拉伸并拉断，得到前端为平端结构的抛物线型光纤探针；
所述第二拉伸的速度为3.5mm/s以上。
优选的是，所述第一拉伸的速度为1mm/s。
优选的是，所述第二拉伸的速度为4mm/s。
本发明还提供了一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊系统，所述光纤光镊系统包括上述技术方案所述光纤光镊。
优选的是，所述光纤光镊系统还包括激光器、六轴微调节架、二维位移台、载玻片、显微镜、电荷耦合元件和电脑。
本发明还提供了上述技术方案所述光纤光镊系统非诊断目的的捕获白血病细胞或推离红细胞的方法，包括以下步骤：
将所述光纤光镊中通入980nm的激光，置于含白血病细胞的溶液中进行捕获，或在含红细胞的溶液中进行推离，或在同时含白血病细胞和红细胞的溶液中进行捕获和推离。
优选的是，所述白血病细胞包括K562细胞。
本发明提供了一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊。在特定细胞筛选过程中，目标细胞需要被稳定的捕获并用以进一步的表征分析，而与此同时，其余细胞应被可控的推离光纤探针末端以避免潜在的微扰。也即，针对不同的细胞应同时集成捕获及传送的功能，以实现针对目标细胞的特异性筛选。本发明所述光纤光镊利用平端光纤探针，实现了从混合血溶液中对人体白血病细胞(K562细胞)的精准筛选。该方案仅使用一根光纤探针，避免了复杂的材料制备和系统集成，且有望在人体血管内实现对白血病细胞的直接筛选分离，并应用于进一步的生物医疗分析。本发明所述光纤光镊具有以下优点：仅使用一根具有平端结构的的抛物线型光纤探针即可筛选白血病细胞，避免了其余筛选方案对细胞的特异性荧光标记，避免了潜在的生物损伤，可操作性和推广性强；可实现单细胞尺度上对特定白血病细胞的三维精准操控，在单细胞分析及表征不同细胞间的特异性差异时具有潜在的应用；所述光纤光镊体积轻便，易于和其他表征手段进行深入集成，在操控白血病细胞的基础上可实现进一步的生物医疗分析，在临床诊断领域具有潜在的重大应用。
附图说明
图1为本发明提供的实验原理图、光纤光镊系统装置图及前端为平端结构的抛物线型光纤探针和血细胞的光学显微图片；
图2为本发明提供的使用前端为平端结构的抛物线型光纤探针捕获并在x-y平面迁移K562白血病细胞的光学显微图片；
图3为本发明提供的使用前端为平端结构的抛物线型光纤探针在z方向迁移K562白血病细胞的光学显微图片；
图4为本发明提供的使用前端为平端结构的抛物线型光纤探针沿光纤轴向推离红细胞的光学显微图片；
图5为本发明提供的使用前端为平端结构的抛物线型光纤探针在混合溶液中捕获K562白血病细胞同时推离多个红细胞的光学显微图片；
图6为本发明提供的使用前端为平端结构的抛物线型光纤探针同时操控多个白血病细胞及从混合溶液中筛选两个白血病细胞的光学显微图片。
具体实施方式
本发明提供了一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊，所述光纤光镊为前端为平端结构的抛物线型光纤探针。
在本发明中，所述光纤探针的直径优选为13.2μm。
在本发明中，所述光纤探针前端直径优选在26μm的长度内由13.2μm减小至10μm，然后在6μm的长度内由10μm减小至5.6μm，前端为直径5.6μm的圆形平面。
本发明还提供了上述技术方案所述光纤光镊的制备方法，包括以下步骤：
去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，将光纤直径拉伸至13.2μm，沿轴向进行第二拉伸并拉断，得到前端为平端结构的抛物线型光纤探针；
所述第二拉伸的速度为3.5mm/s以上。
本发明优选使用单模光纤(芯径：9μm，涂覆层：125μm，连接类型：FC/PC)。本发明优选使用光纤剥线钳去除光纤表面的缓冲层和涂覆层，并套上玻璃毛细管对其进行物理保护，防止断裂及弯曲。在本发明中，所述加热优选采用酒精灯进行。在所述加热开始后，优选加热1min即达到光纤的熔点。在本发明中，所述第一拉伸的速度优选为1mm/s，光纤直径将在2.5mm的长度内从125μm减小至13.2μm。本发明优选立即进行第二拉伸，所述第二拉伸的速度优选为3.5mm/s以上，更优选为4mm/s。本发明通过第二拉伸来将探针拉断，此时将形成一个具有平端的抛物线型探针结构。为保证探针末端是平端而不是渐变的锥形，需要在光纤探针达到熔点后立即进行拉伸，且最后的拉伸速度应大于3.5mm/s。
本发明还提供了一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊系统，所述光纤光镊系统包括上述技术方案所述光纤光镊。
在本发明中，所述光纤光镊系统还包括激光器、六轴微调节架、二维位移台、载玻片、显微镜、电荷耦合元件和电脑。
本发明还提供了上述技术方案所述光纤光镊系统非诊断目的的捕获白血病细胞或推离红细胞的方法，包括以下步骤：
将所述光纤光镊中通入980nm的激光，置于含白血病细胞的溶液中进行捕获，或在含红细胞的溶液中进行推离，或在同时含白血病细胞和红细胞的溶液中进行捕获和推离。
在本发明中，所述白血病细胞包括K562细胞。
本发明根据光纤光镊原理，当微纳颗粒或细胞位于光纤探针前端时，垂直光轴方向的径向光梯度力将捕获微粒至光轴，此时在光轴方向上颗粒将受到沿光传播方向的光散射力和指向焦点处的轴向光梯度力；不同大小及折射率的颗粒或细胞所受到两力的大小不同，进而将会对不同颗粒分别产生捕获及推离效果，实现二者可控分离。基于以上原理，本发明提出一种实现白血病细胞可控筛选的光纤光镊技术，如图1a所示：将具有平端结构的光纤探针置于血细胞的混合溶液中，并向其通入波长为980nm的激光。此时混合溶液中的红细胞和白血病K562细胞由于大小及光学特性的差异，所受到的光力也有所不同。对于白血病细胞K562而言，其在光轴方向上所受到的梯度力(指向探针尖端，即-x方向)大于散射力(远离探针尖端，即+x方向)，此时合力沿-x方向，因而细胞将被稳定捕获至光纤探针尖端；而对于红细胞而言，其在光轴方向上所受合力将沿光传播方向(即+x方向)，因而将沿光纤轴向被推离至远处。也即，此时的光纤探针如同一台光风扇，将红细胞“吹走”并将白血病细胞捕获在探针前端，实现血细胞的可控分离和动态筛选。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊及其制备方法和光纤光镊系统做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
实验装置如图1b所示，制备完毕的具有平端结构的光纤探针置于六轴微调节架(KOHZU FH9-10,步进精度:50nm))上，末端连接一台波长为980nm的光纤激光器(型号：Laserwave公司LWIRL-980-SMF)，探针前端置于血细胞混合溶液之中。血细胞溶液通过一根微注射器滴在放置于二维位移台上的载玻片上，整个实验装置可在显微镜下(型号：HiROX数字显微镜RH-2000)进行实时观察，并通过电荷耦合元件(CCD)与电脑相连，实现实验图片的实时截取和视频录制。
实验操控的关键在于制备一个的光纤探针，分别针对白血病细胞和红细胞实现稳定捕获和动态传送的功能，前端为一个平端结构而不是渐变的锥形尖端。具体结构见图1c中的光学显微图片：光纤探针直径从13.2μm在26μm的尺度内减小至10μm，接着在6μm的长度内减至5.6μm，并在末端为一个直径为5.6μm的圆形平面。图1d和图1e展示了白血病K562细胞和红细胞的光学显微图片：白血病细胞K562是直径为14.5μm的球形，而红细胞直径为7μm，呈中间凹的圆饼状。值得说明的是，相对于通常的光纤光镊结构，平端结构的存在将导致光场梯度的下降，因而针对更小的红细胞，梯度力将不足以克服较大的光散射力而被推离光纤探针；但对于直径更大的白血病细胞，其所受梯度力的增加将足以克服所受到的光散射力，进而被稳定捕获在探针尖端。
实施例2
本发明具有平端端面的光纤探针制备方案如下：
选用单模光纤(芯径：9μm，涂覆层：125μm，连接类型：FC/PC)，首先使用光纤剥线钳去除光纤表面的缓冲层和涂覆层，并套上玻璃毛细管对其进行物理保护，防止断裂及弯曲。使用镊子夹住光纤的一端并置于酒精灯外焰上方加热，约1min后到达光纤的熔点，此时以1mm/s的速度沿光轴方向拉伸，与此同时，光纤直径将在2.5mm的长度内从125μm减小至13.2μm，然后立即施加一个约4mm/s的拉伸速度来将其拉断，此时将形成一个具有平端的抛物线型探针结构。
实施例3
本发明所述具有平端结构的光纤探针能够实现对人体白血病K562细胞的三维操控。如图2所示，当向光纤探针中通入波长为980nm的激光后，单个K562细胞将捕获在光纤探针前端(图2a)，且二者未直接接触。此时沿二维方向移动光纤探针，例如前3秒内光纤探针沿-x方向移动了33μm(图2b)，接着分别沿+x方向移动了60μm(图2c)，沿-y方向移动了45μm(图2d)，沿+y方向移动了23μm(图2e)，在此过程中K562细胞始终稳定捕获在光纤探针尖端。证明了本发明前端为平端结构的抛物线型光纤探针可实现对K562细胞的非接触二维操控。进一步，为表征K562细胞的二维迁移由光纤探针引起，在时间为18秒时关闭激光(图2f)，K562细胞立即脱离激光的束缚而重新流动在细胞悬浮液之中。进一步，本发明表征了该光纤光镊在z方向操控K562细胞的表现，以证明其三维操控的性能。如图3所示，时间为0秒时光纤探针前端捕获一个K562细胞(图3a)，此时操控微调节架，将光纤探针沿+z方向于4秒内向上移动7μm(图3b)，并接着在8秒时返回原来的位置(图3c)，在此过程中细胞稳定捕获在光纤探针前端。进一步，将光纤探针沿-z方向于4秒内向下移动15μm(图3d)，并维持在此深度约4秒(图3e)，最后将光纤探针调整至初始位置(图3f)。而在以上调节过程中，K562细胞始终维持在光纤探针前端，证明了使用提出的平端光纤光镊技术可实现对K562细胞在z方向上的灵活操控。
实施例4
本发明光纤光镊对于红细胞的操控表现。如图4所示，调节光纤探针靠近悬浮液中的红细胞并向其内部通入波长为980nm的激光(图4a)，此时红细胞将被拉至光轴(图4b)并在较大的轴向散射力作用下沿光轴被推离光纤探针末端(图4c)，也即沿-x方向进行传输，并在未来10秒内共计传输了55μm(图4d-f)。表明在同样的光纤光镊下，红细胞将受到指向+x方向的合力，此时的光纤光镊对于红细胞而言如同一台光风扇，将其推离光纤探针末端。
实施例5
将制备的平端光纤光镊放置于红细胞与白血病细胞的混合溶液中，如图5所示：在0秒时刻向光纤探针内通入激光，将在探针前端捕获一个白血病K562细胞，此时探针前端分散着三个红细胞(图5a)。接着在时间为1秒的时候，两个红细胞被捕获至光轴并立即沿+x方向进行传送(图5b)，在4秒时间内共计传输了57μm(图5c-e)。在时间为5秒时(图5f)，第三个红细胞也被捕获至光轴并与另外两个红细胞一起同时沿+x方向进行传送(图5g,h)；而在红细胞传输过程中，K562细胞始终稳定捕获在光纤探针尖端，证明了提出的光纤光镊技术可以在混合血溶液中特异性筛选白血病细胞而不会受到周围血细胞的干扰。更重要的是，本发明能够在单细胞尺度上对白血病细胞实现非接触的无损伤操控，并进一步应用于细胞分析和疾病诊断的临床研究。
对多个白血病细胞的操控及筛选性能研究。如图6所示：当向光纤探针中通入波长为980nm的激光时，可同时捕获五个K562细胞(图6a1)并在二维方向上分别沿-y(图6a2)，+y(图6a3),-y(图6a4)，-x方向(图6a5)及+y(图6a6)方向移动，证明了本发明良好的操控灵活性。此外，本发明还采用该光纤光镊来从数百个红细胞中筛选白血病细胞，研究其在实际场景中的潜在应用。如图6b所示，两个K562细胞被捕获在光纤探针前端(图6b1)，与此同时大量的红细胞沿着光轴被吹离(图6b2)；通过在y方向上移动光纤探针(图6b3)，可将不同位置的红细胞移除，从而筛选出目标白血病细胞(图6b4)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊，其特征在于，所述光纤光镊为前端为平端结构的抛物线型光纤探针。
2.根据权利要求1所述的光纤光镊，其特征在于，所述光纤探针的直径为13.2μm。
3.根据权利要求1所述的光纤光镊，其特征在于，所述光纤探针前端直径在26μm的长度内由13.2μm减小至10μm，然后在6μm的长度内由10μm减小至5.6μm，前端为直径5.6μm的圆形平面。
4.权利要求1～3任一项所述光纤光镊的制备方法，包括以下步骤：
去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，将光纤直径拉伸至13.2μm，沿轴向进行第二拉伸并拉断，得到前端为平端结构的抛物线型光纤探针；
所述第二拉伸的速度为3.5mm/s以上。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一拉伸的速度为1mm/s。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二拉伸的速度为4mm/s。
7.一种实现血液中白血病细胞可控筛选的光纤光镊系统，其特征在于，所述光纤光镊系统包括权利要求1～3任一项所述光纤光镊。
8.根据权利要求7所述的光纤光镊系统，其特征在于，所述光纤光镊系统还包括激光器、六轴微调节架、二维位移台、载玻片、显微镜、电荷耦合元件和电脑。
9.权利要求7或8所述光纤光镊系统非诊断目的的捕获白血病细胞或推离红细胞的方法，包括以下步骤：
将所述光纤光镊中通入980nm的激光，置于含白血病细胞的溶液中进行捕获，或在含红细胞的溶液中进行推离，或在同时含白血病细胞和红细胞的溶液中进行捕获和推离。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白血病细胞包括K562细胞。
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