CN109182087A - 基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法 - Google Patents

基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，具体包括以下步骤：制作微流通道、制作骤变锥形光纤、配备细胞悬浮液、安装实验装置及检测；本发明利用骤变的锥形光纤实现在微流通道中捕获活的单个细菌，并操控捕获的细菌在有流速的流体中灵活、靶向移动，实验设备简单、易控制，实验条件简单，对样品的依赖程度低，工作距离可调，适用广泛。

Description

基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法
技术领域
本发明属于单细胞操控技术领域，特别是涉及一种基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法。
背景技术
在微流环境中对微生物和活细胞等进行稳定捕获以及靶向运输，对单细胞生化分析、生物物理分析等领域有着非常重要的作用；基于单束聚焦光束的传统光镊系统被广泛应用于捕获单细胞或单颗粒中，传统光镊和全息光镊也被用于捕获细菌，但是，传统光镊和全息光镊系统用到的聚焦光束和一系列光学元件大大限制了操控的灵活性，特别是聚光镜头对样品有很大限制，虽然抛物线形锥形光纤被应用于捕获酵母菌等较大尺寸的生物样品，但是对于像大肠杆菌这种细菌却很难实现稳定捕获，一方面是因为这种细菌本身有鞭毛、会运动，增加了捕获难度；另一方面细菌尺寸更小增加了捕获难度，特别是在流体环境中，这种捕获更加困难，而细菌的很多生存条件都是微流环境中，所以在微流环境中对单个细菌等生物体进行捕获，对研究单细菌的生化过程以及生物物理特性都非常重要；为了解决这些问题，研发了一种利用骤变锥形光纤在微流中捕获与操控单个单细菌的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，以实现在流体环境中对单个活细菌或者细胞进行稳定捕获和靶向操控，本方法操作灵活、实施条件简单。
本发明所采用的技术方案是，基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，具体包括以下步骤：
步骤1：微流通道的制作
掩模版制作、光刻、PDMS浇筑微流通道，通道I的宽度为140μm，通道II的宽度为170μm；
步骤2：骤变锥形光纤的制作
首先用光纤剥线钳去除光纤跳线的缓冲层和塑料外套，去除部位长度20～50cm，然后将去除外套的光纤穿过毛细玻璃管中，将去除外套的光纤伸出部分用酒精灯外焰进行加热100～150s后，先用0.2～0.5mm/s的速度拉光纤，在2mm的长度范围内光纤直径从125μm下降至10μm，然后使用3～10mm/s的速度将光纤迅速拉断，拉断的光纤末端将形成一个骤变锥形；
步骤3：细胞悬浮液配备
将实验细胞在L-B培养基中37℃培养12h，然后用磷酸盐酸缓冲液进行清洗与稀释，稀释后细胞的浓度为1.0×105～6.0×105个/mL，备用；
步骤4：实验装置安放
将制作好的骤变锥形光纤安装在六轴微调节架上，微流通道放置于显微镜移位平台上，细胞悬浮液通过微流泵导入微流通道中，光纤未拉制端连接在输出激光波长为980nm的激光器上，骤变锥形端伸入微流通道中；实验检测信息通过载有CCD的显微镜以及连接的电脑获取显示。
进一步的，步骤2中骤变锥形光纤臂端尺寸在48.5μm的长度范围内宽度从9.4μm下降至5.2μm，末端尺寸在长度为4μm的范围内宽度先从5.2μm下降至3.63μm，然后在3.45μm的长度范围内宽度从3.63μm下降至380nm。
进一步的，步骤2中骤变锥形光纤末端锥角为30°～60°。
进一步的，步骤2中骤变锥形光纤末端锥角为45°。
进一步的，步骤4中激光器发出的入射激光功率为10～70mW。
本发明的有益效果是：在微流环境中利用骤变锥形光纤实现了对单个活细菌的稳定捕获和靶向操控，操作过程简单、灵活准确；本发明使用的装置简单，成本低廉；骤变锥形光纤可以从任意角度伸入样品中，对样品依赖性低，工作距离可调，适用面广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是微流通道的结构示意图。
图2是本发明所使用的微流通道和骤变锥形光纤图。
图3是骤变锥形光纤捕获单个活的大肠杆菌的过程图。
图4是在微流通道中对捕获的单个大肠杆菌进行靶向移动的示意图。
图5是捕获能力与流体流速、激光功率的关系图。
图6是本发明对不同种类细胞进行捕获的观察图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，具体包括以下步骤：
步骤1：微流通道的制作
掩模版制作、光刻、PDMS浇筑微流通道，得到的微流通道结构如图1所示，微流通道的通道尺寸如图2(a)所示，通道I的宽度为140μm，通道II的宽度为170μm，通道深度为150μm；
步骤2：骤变锥形光纤的制作
骤变锥形光纤是将商用单模光纤跳线进行火焰加热拉制而成；首先用光纤剥线钳去除光纤跳线的缓冲层和塑料外套，去除部位长度20～50cm，然后将去除外套的光纤穿过毛细玻璃管中，将去除外套的光纤伸出部分用酒精灯外焰进行加热100～150s后，先用0.2～0.5mm/s的速度拉光纤，在2mm的长度范围内光纤直径从125μm下降至10μm，然后使用3～10mm/s的速度将光纤迅速拉断，拉断的光纤末端将形成一个骤变锥形；
骤变锥形光纤在光学显微镜下显示如图2b和图2c所示，臂端尺寸在48.5μm的长度范围内从宽度9.4μm下降至宽度5.2μm，在长度为4μm的范围内末端尺寸先从宽度5.2μm下降至宽度3.63μm，然后在3.45μm的长度范围内从宽度3.63μm下降至宽度380nm，末端为一个骤变锥角；
骤变锥形光纤的形状与尺寸会直接影响出射光场的分布，进而影响捕获能力；骤变锥形光纤末端锥角太大，出射光不能聚焦，捕获能力差；骤变锥形光纤末端锥角在30°～60°时产生聚焦效果较好，捕获能力强，锥角的角度优选为45°；锥角小于30°时，出射光过于集中，作用的细胞数量变少，捕获能力降低；
步骤3：细胞悬浮液配备
将实验细胞在L-B培养基中37℃培养12h，然后用磷酸盐酸缓冲液(PBS)进行清洗、稀释，备用，稀释后细胞的浓度为1.0×105～6.0×105个/mL；
步骤4：实验装置安放
实验装置如图所示，将制作好的骤变锥形光纤安装在六轴微调节架上，微流通道放置于显微镜移位平台上，细胞悬浮液通过微流泵导入微流通道中，光纤未拉制端连接在输出激光波长为980nm的激光器上，骤变锥形光纤伸入微流通道中；实验检测信息通过载有CCD的显微镜以及连接的电脑获取和显示；
六轴微调节架的分辨率为50nm；
入射激光功率为10～70mW，随着功率增加，捕获更稳定；
在实验中，骤变锥形光纤可以从任意角度伸入悬浮液中，测试对细菌悬浮液的要求不高，适用范围广泛；
显微镜的物镜参数分别为100倍，NA：0.73，WD：1.0mm，其中NA为镜头数值孔径，WD为工作距离。
在微流通道中，使用骤变锥形光纤，实现了光流体对单个活细菌的捕获与灵活靶向三维操控，本方法操作灵活、易与实施，能够实现单个细菌的稳定捕获与操控，本方法还适用于对其他不同种类的细菌、真菌与人体细胞的捕获与操控；对细胞进行捕获时，捕获力与激光功率，激光功率与稳定捕获时的临界流速均呈线性关系。
实施例1
步骤1：微流通道的制作
掩模版制作、光刻、PDMS浇筑微流通道，得到的微流通道结构如图1所示，微流通道的通道尺寸如图2(a)所示，通道I的宽度为140μm，通道II的宽度为170μm，通道深度为150μm；
步骤2：骤变锥形光纤的制作
首先用光纤剥线钳去除光纤跳线的缓冲层和塑料外套，去除部位长度20～50cm，然后将去除外套的光纤穿过毛细玻璃管中，将去除外套的光纤伸出部分用酒精灯外焰加热100～150s后，先使用0.2～0.5mm/s的速度拉光纤，在2mm的长度范围内光纤直径从125μm下降至10μm，然后使用3～10mm/s的速度将光纤迅速拉断，拉断的光纤末端将形成一个骤变锥形，锥角的角度为45°；
步骤3：大肠杆菌悬浮液配备
使用前将大肠杆菌DH5α在L-B培养基中37℃培养12h，然后用磷酸盐酸缓冲液(PBS)进行清洗、稀释，备用，稀释后的浓度为1.0×105～6.0×105个/mL；
步骤4：实验装置安放
微流通道放置于显微镜移位平台上，将制作好的骤变锥形光纤安装在六轴微调节架2上，骤变锥形光纤尖端通过六轴微调节架调节至微流通道的十字口区域，光纤未拉制端连接在输出激光的激光器上；实验动态图片通过载有CCD的显微镜以及连接的电脑获取显示；
如图1所示，通过微流泵往通道I中-x方向导入步骤3配备的大肠杆菌悬浮液，流速20μm/s，通道II中保持没有液体，打开激光器往骤变锥形光纤中通入30mW、波长980nm的激光，骤变锥形光纤附近的单个大肠杆菌被稳定捕获，捕获过程如图3所示，大肠杆菌在激光输入后被影响，在1.8s时被稳定捕获。
实施例2
单细菌的精准灵活靶向三维操控
实施例1中的大肠杆菌被稳定捕获后，通过调节六轴微调节架，实现对捕获大肠杆菌的精准、灵活靶向操控，对大肠杆菌的三维靶向操控如图4a所示，在0到3.5s，细菌沿+y方向移动了16.2μm，平均移动速度为4.6μm/s；在3.5到8s，细菌沿-y方向被移动了15.8μm，平均移动速度为3.5μm/s；如图4b所示，在0到4s，细菌沿+x方向移动了19.3μm；在4到8s，细菌沿-x方向移动了19.3μm，平均移动速度为4.8μm/s；还能实现在z方向以及任意方向的移动。
实施例3
光流体捕获稳定性展示
实验结果显示在骤变锥形光纤的激光功率不小于10mW、流体流速为0的情况下，能实现对单个细菌的稳定捕获；
为了展示光流体捕获的稳定性，往通道I和通道II中引入不同流速的大肠杆菌悬浮液，探究能够捕获大肠杆菌的临界流体流速；
图5aI显示了在骤变锥形光纤的捕获激光功率为20mW，+x方向流体流速为135μm/s时捕获的细菌稳定存在于锥形光纤末端，当流速超过150μm/s时，细菌离开捕获区域，如图5aII所示；如图5bI，y方向上在骤变锥形光纤的捕获激光功率为55mW，流体流速为130μm/s，捕获稳定，如图5bII所示，骤变锥形光纤捕获激光功率不变，流体流速为155μm/s，细菌逃离；图5c显示了+y和+x方向细菌逃离捕获的临界速度V0与捕获功率P的关系；图5c中的线性方程为：+x方向，V0＝66.7+5P，+y方向，V0＝-14.9+3.2P，其中V0为临界速度，P为捕获光功率，在图5c中，(P，V0)位于线性方程右下时，大肠杆菌能稳定捕获，位于左上时大肠杆菌则会逃离捕获。
实施例4
将实施例1中步骤3中大肠杆菌悬浮液换做其他细胞悬浮液，利用显微镜对其捕获情况进行观察；观察结果如图6所示；图6a是入射激光功率为30mW，+x方向流体流量为20μm/s时，本发明用于对酵母菌悬浮液中酵母菌细胞的捕获情况，图6b是入射激光功率为30mW，+x方向流体流量为20μm/s时，本发明对小球藻的捕获情况，图6c是在入射激光功率为40mW时，本发明对人体白血病K562细胞的捕获情况；由图6a、图6b和图6c可知，本发明能够实现对不同细菌和细胞的稳定捕获。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1：微流通道的制作
掩模版制作、光刻、PDMS浇筑微流通道，通道I的宽度为140μm，通道II的宽度为170μm；
步骤2：骤变锥形光纤的制作
首先用光纤剥线钳去除光纤跳线的缓冲层和塑料外套，去除部位长度20～50cm，然后将去除外套的光纤穿过毛细玻璃管中，将去除外套的光纤伸出部分用酒精灯外焰进行加热100～150s后，先用0.2～0.5mm/s的速度拉光纤，在2mm的长度范围内光纤直径从125μm下降至10μm，然后使用3～10mm/s的速度将光纤迅速拉断，拉断的光纤末端将形成一个骤变锥形；
步骤3：细胞悬浮液配备
将实验细胞在L-B培养基中37℃培养12h，然后用磷酸盐酸缓冲液进行清洗与稀释，稀释后细胞的浓度为1.0×105～6.0×105个/mL，备用；
步骤4：实验装置安放
将制作好的骤变锥形光纤安装在六轴微调节架上，微流通道放置于显微镜移位平台上，细胞悬浮液通过微流泵导入微流通道中，光纤未拉制端连接在输出激光波长为980nm的激光器上，骤变锥形端伸入微流通道中；实验检测信息通过载有CCD的显微镜以及连接的电脑获取显示。
2.根据权利要求1所述的基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，其特征在于，所述步骤2中骤变锥形光纤臂端尺寸在48.5μm的长度范围内宽度从9.4μm下降至5.2μm，末端尺寸在长度为4μm的范围内宽度先从5.2μm下降至3.63μm，然后在3.45μm的长度范围内宽度从3.63μm下降至380nm。
3.根据权利要求1所述的基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，其特征在于，所述步骤2中骤变锥形光纤末端锥角为30°～60°。
4.根据权利要求1所述的基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，其特征在于，所述步骤2中骤变锥形光纤末端锥角为45°。
5.根据权利要求1所述的基于骤变锥形光纤的在微流中捕获与操控单细菌的方法，其特征在于，所述步骤4中激光器发出的入射激光功率为10～70mW。
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