CN107245431A - 一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置及其操作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学研究技术领域，涉及一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置及其操作方法，左升降台上固定安装三维高精密的左位移台，右升降台上固定安装三维高精密的右位移台，左升降台的外侧固定安装光源发射装置，左升降台上固定安装光镊，右升降台的外侧设置注射器，右升降台上固定安装光纤微针，左升降台和右升降台之间安装载物台，载物台的上方安装显微镜，工作时通过位移台控制光镊与光纤微针，从而实现光镊捕获细胞后，光纤微针对细胞的精准注射，本发明涉及的细胞精准药物注射装置具有捕获控制单细胞，对单细胞进行精准药物注射功能，其精准度高、可调性强，在肿瘤细胞精准医疗实验研究、单细胞显微注射药物方面应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学研究技术领域，涉及一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置及其操作方法。
背景技术
肿瘤是危害人们健康的最重要问题之一，目前世界上有1/3的人患有癌肿，然而有1/4的人死于癌肿。肿瘤疾病容易在它的病发区造成堵塞和压迫，这些是由于肿瘤细胞过度增长所引起的，这一点不管是良性的肿瘤还是恶性的肿瘤都很相似。常见的有堵塞食管、堵塞血管和压迫神经等。它会影响相邻器官肿瘤疾病所在的器官或者组织，都会因肿瘤细胞破坏所在的结构和功能：如肝癌由于肝细胞破坏和肝内胆管阻塞，可经起全身性黄疸，如果长期的持续性的感染其他的疾病，会导致肿瘤细胞迅速恶化、扩散，引起全身各器官都含有肿瘤细胞，此时，只要去刺激肿瘤细胞生长，就会容易导致人死亡。然而，现在的外科手术的费用高且具有侵袭性，也会带来很多复杂的并发症；并且，此类手术的成功率比较低这些就限制了手术的治疗。对肿瘤细胞进行精准药物注射研究成为医学实验上亟需进行的实验研究。
细胞显微注射技术又称显微注射或细胞注射技术。细胞注射一般可直接对细胞质和细胞核两部分进行注射。其操作过程是在显微镜下通过显微注射工具将玻璃微针刺入细胞质或细胞核，以注射药物的方式将药物、DNA、细胞核或蛋白质等外源物质注入细胞，并进一步研究分析。细胞注射是显微操作中最直接有效的研究方法，也是其他有待深入研究技术中的关键步骤。在肿瘤细胞分析、蛋白质分析、药物药性分析、疾病诊断及免疫学等领域中有着广泛的应用。
细胞注射主要有以下四个特点：一是注射时只需要微量的注射样品，不需要制备大量高纯度的外源注射物，而电穿孔、脂质体转染等方法需要大量的原代培养物，代价较高。二是细胞注射样品多样化，不受培养基或原代培养物的限制，可直接向细胞注射抗体、DNA、酶及大分子合成物等。三是可以对细胞核或细胞质进行定量注射，直接地改变细胞个体的内环境。四是相比于电融合、电穿孔等方法，细胞注射操作更安全简便，不需要额外的设备。
申请号为200410065016.7的发明专利公开了一种细胞显微注射仪，它包括细胞输送器、细胞注射器、细胞吸持器以及数字化控制驱动系统，在细胞注射时利用细胞输送器，采用微流体输送方法，以自动送料的形式将细胞输送到细胞输送器、细胞注射器、细胞吸持器出口的汇聚区域。在注射过程中，细胞的输送、吸持定位、注射针进针进行细胞膜穿刺、细胞内药液定量注射、注射针退出细胞、细胞释放等显微操作过程完全实现在计算机的同一操作界面上的计算机数字化控制，细胞吸持时吸持针保持固定，注射针以固定参数的单自由度伸缩运动完成细胞穿刺过程，操作简单、注射成功率高、可实现已注射和未注射的细胞自动分离和自动计数。该细胞显微注射仪，全部使用机械方式控制及注射细胞，其存在的问题有：细胞输送器输送微管道直径固定，对于不同大小的细胞，较难保证细胞在输送管道中会排列成直线向前输送；细胞捕获夹持采取机械控制，不能灵活移动细胞，机械控制的方法极易损伤细胞，机械控制对于不同直径的细胞存在无法稳定夹持的问题，设计的夹持装置只能针对某一直径的细胞夹持效果最好；该专利没有说明注射针的制作方法，对单细胞进行微量注射，注射液控制精读要达到飞升量级，这对于常规的机械加工手段加工几微米的针尖，精密的做出高精密的超细针尖是十分困难的；此外，该专利将细胞紧密装在在细胞输送器里面也存在困难。
发明内容
有鉴于此，本发明为了解决上述问题，提供一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置及其操作方法。
为达到上述目的，本发明一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置，包括左升降台和右升降台，左升降台上固定安装有三维高精密的左位移台，右升降台上固定安装有三维高精密的右位移台，左升降台的外侧固定安装有光源发射装置，左升降台上固定安装有光镊，右升降台的外侧设置注射器，右升降台上固定安装有光纤微针，左升降台和右升降台之间安装有载物台，载物台的上方安装有显微镜。
进一步，左升降台和右升降台均为剪式折叠实验升降台，左升降台和右升降台上分别固定安装有左固定柱和右固定柱，左固定柱和右固定柱的中部开设有与左位移台和右位移台相匹配的凹槽。
进一步，左位移台和右位移台为电控三维高精密位移台或者手动液压控制三维高精密位移台，左位移台和右位移台的移动控制光镊与光纤微针的上下、左右、前后精密移动。
进一步，光纤微针为空心光纤微针。
进一步，注射器为螺纹口注射器，前面连接螺纹座平头针头，针头为25G，内径0.25mm，针头插入空心光纤微针尾端，注射器上安装微量注射泵，推动控制注射器的微量注射。
进一步，光镊为物镜构成的空间光镊或者尖端腐蚀的单模光纤光镊，光镊中耦合入径向偏振光。
进一步，光镊为单模光纤与环形光纤焊接后在焊点拉锥而成的光镊，环形光纤纤芯内径为20μm，外径为23.2～26μm，仅有LP01模和LP11模两种简并模传输，环形光纤纤芯端面研磨制成光束汇聚的环形光纤光镊，环形光纤光镊中耦合入径向偏振光。
一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置的操作方法，包括如下步骤：
A、将培养液中的细胞滴加在载玻片上，载玻片固定在载物台上，调节显微镜目镜和物镜的倍数，使显微镜能清晰看到细胞结构。
B、取1米环形光纤，环形光纤纤芯内径20μm，外径25μm，单模光纤与环形光纤焊接后，在焊点拉锥，环形光纤中耦合入径向偏振光，环形光纤芯端面利用裸光纤研磨技术，研磨制成光束汇聚的环形光纤径向偏振光光镊，将光镊远离左位移台的一端放置在载玻片上，细胞在载玻片上的培养液中处于悬浮状态，开启光源发射装置，当载玻片接入光镊后，游动的细胞接近光镊捕获点时，会被光镊控制住。
C、将精密实验升降台调到与显微镜下边缘的高度，使用微调调节旋钮，使显微镜达到与载物台等高的高度。
D、取涂覆层250μm，纤芯外径125μm，内径62.5μm空心光纤1米，在空心光纤中部用刀片剥除涂覆层后，在氢氧焰光纤拉锥机上进行旋转拉锥，用0745数码显微镜在线测量锥区直径，当锥区直径拉至15-20μm时停止一次拉锥，采用短时补拉方式将锥区二次拉锥至10μm，利用超声波光纤切割法将锥区最细区域平整切断，得到空心光纤微针。注射器中提前吸取药物，旋上螺纹平头针头，将空心光纤微针插在注射针头平口后，用紫外固化胶密封。
E、通过显微镜观察，微调左右手动液压控制高精密三维位移台，使得光纤微针刺入细胞。
F、设置微量注射泵参数，推动注射器，使药物注入细胞内。
本发明的有益效果在于：
1、本发明用于细胞药物精准注射的显微注射装置，具有光镊方法捕获控制单细胞，对单细胞进行精准药物注射功能，其精准度高、可调性强，在肿瘤细胞精准医疗实验研究、单细胞显微注射药物实验方法方面应用前景广阔。
2、本发明用于细胞药物精准注射的显微注射装置，是用光阱力捕获控制悬浮细胞，对细胞无损伤，细胞可进行三维移动，控制灵活，精度高；采用氢氧焰光纤拉锥机对空心光纤拉锥后的锥区直径可以达到几个微米，且各个尺寸都有，我们可以在锥区的不同位置进行切割，得到不同直径的空心光纤微针，增加了光纤微针的适用性；采用氢氧焰拉锥与超声波联合切割法制作的光纤微针具有精度高，尺寸可小至几微米量级，是常用金属微针的千分之一以上，注射液体控制可达飞升量级，其药物注射效果是其他微针无法比拟的。在肿瘤细胞分析、蛋白质分析、药物药性分析、疾病诊断及免疫学等领域中有着广泛的应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明用于细胞药物精准注射的显微注射装置的结构示意图；
图2为本发明光镊与光纤微针联合工作示意图；
图3为本发明光纤微针直径与液滴注射体积示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
说明书附图中的附图标记包括：
升降台1、三维高精密位移台2、左位移台2-1、右位移台2-2、光纤微针3、注射器4、载物台5、光镊6、肿瘤细胞7、显微镜8、光源9。
如图1、图2所示的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，左升降台1和右升降台1均为剪式折叠实验升降台1，左升降台1通过螺栓固定安装左固定柱，右升降台1通过螺栓固定安装右固定柱，左固定柱和右固定柱的中部开设与左位移台2-1和右位移台2-2相匹配的凹槽。手动液压控制三维高精密的左位移台2-1和右位移台2-2通过螺栓固定穿设在左固定柱和右固定柱中部的凹槽中，左升降台1的左侧固定安装光源9发射装置，左升降台1上固定安装光镊6，光镊6为单模光纤与环形光纤焊接后在焊点拉锥而成的环形光纤光镊，环形光纤纤芯内径为20μm，外径为23.2～26μm，仅有LP01模和LP11模两种简并模传输，环形光纤纤芯端面研磨制成光束汇聚的环形光纤光镊6，环形光纤光镊6中耦合入径向偏振光，径向偏振光环形光纤光镊6的捕获力很强，可以达到单独抓细胞的能力。右升降台1的右侧设置注射器4，注射器4为螺纹口注射器4，前面连接螺纹座平头针头，针头为25G，内径0.25mm，针头插入空心光纤微针3尾端，注射器4上安装微量注射泵，推动控制注射器4的微量注射。右升降台1上固定安装光纤微针3，光纤微针3为空心光纤微针3。左位移台2-1和右位移台2-2的移动控制光镊6与光纤微针3的上下、左右、前后精密移动。左升降台1和右升降台1之间安装有载物台5，载物台5的上方安装有显微镜8。
该用于细胞药物精准注射的显微注射装置工作时，通过左右位移台2-2来调整光镊6与光纤微针3的位置，实现光镊6捕获肿瘤细胞7后，与注射器4上平头针头连接的光纤微针3对细胞的精准注射。
一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置的操作方法，包括如下步骤：
A、将处于培养液中的肿瘤细胞7滴加在载玻片上，载玻片固定在载物台5上。调节显微镜8目镜和物镜的倍数，使之能清晰的看到肿瘤细胞7的结构。
B、取1米环形芯光纤，环形芯光纤纤芯内径20μm，外径25μm，单模光纤与环形光纤焊接后，在焊点拉锥，环形芯光纤中耦合入径向偏振光，仅LP01模和LP11模可在环形芯光纤中传输，环形芯端面利用裸光纤研磨技术，研磨制成光束汇聚的环形芯光纤径向偏振光光镊6。再将光镊6端放置在载玻片上，细胞在载玻片上培养液中处于悬浮状态，将光镊6右端放置在载玻片上，细胞在载玻片上的培养液中处于悬浮状态，开启光源9发射装置，当载玻片接入光镊6后，游动的细胞接近光镊6捕获点时，会被光镊6控制住。
C、将精密实验升降台1调到与显微镜8下边缘的高度，使用微调调节旋钮，使显微镜8达到与载物台5等高的高度。
D、取涂覆层250μm，纤芯外径125μm，内径62.5μm空心光纤1米，在空心光纤中部用刀片剥除涂覆层后，在氢氧焰光纤拉锥机上进行旋转拉锥，用0745数码显微镜8在线测量锥区直径，当锥区直径拉至15-20μm时停止一次拉锥，采用短时补拉方式将锥区二次拉锥至10μm，利用超声波光纤切割法将锥区最细区域平整切断，得到空心光纤微针3。注射器4中提前吸取药物，旋上螺纹平头针头，将空心光纤微针3插在注射针头平口后，用紫外固化胶密封。
E、通过显微镜8观察，微调左右手动液压控制高精密三维位移台，使得光纤微针3刺入细胞。
F、设置微量注射泵参数，推动注射器4，使药物注入肿瘤细胞7内。
图3为光纤微针3直径与液滴注射体积示意图，采用氢氧焰光纤拉锥机对空心光纤拉锥后，在锥区的不同位置进行切割，得到不同直径的空心光纤微针3，随着空心光纤微针3直径的增大，单位时间药物液滴的注射量也在增加。因此，可以根据不同使用者的单位时间药物量需求以及肿瘤细胞7的多少来调整空心光纤微针3的直径。
通过本发明用于细胞药物精准注射的显微注射装置操作方法制备的光纤微针3，空心光纤微针3的直径尺寸可小至几微米量级，是常用金属微针的千分之一以上，注射液体控制可达飞升量级，其药物注射效果是其他微针无法比拟的。并且通过在环形光纤光镊6中耦合入径向偏振光，径向偏振光环形光纤光镊6的定位和捕获力很强，基本可以达到单独抓细胞的能力。通过径向偏振光环形光纤光镊6的定位和光纤微针3的配合，能够将药物精准的注射到肿瘤细胞7中，并且能够降低药物的使用量。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，包括左升降台和右升降台，所述左升降台上固定安装有三维高精密的左位移台，右升降台上固定安装有三维高精密的右位移台，所述左升降台的外侧固定安装有光源发射装置，所述左升降台上固定安装有光镊，所述右升降台的外侧设置注射器，所述右升降台上固定安装有光纤微针，左升降台和右升降台之间安装有载物台，载物台的上方安装有显微镜。
2.如权利要求1所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述左升降台和右升降台均为剪式折叠实验升降台，左升降台和右升降台上分别固定安装有左固定柱和右固定柱，左固定柱和右固定柱的中部开设有与左位移台和右位移台相匹配的凹槽。
3.如权利要求2所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述左位移台和右位移台为电控三维高精密位移台或者手动液压控制三维高精密位移台，左位移台和右位移台的移动控制光镊与光纤微针的上下、左右、前后精密移动。
4.如权利要求3所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述光纤微针为空心光纤微针。
5.如权利要求4所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述注射器为螺纹口注射器，前面连接螺纹座平头针头，针头为25G，内径0.25mm，针头插入空心光纤微针尾端，注射器上安装微量注射泵，推动控制注射器的微量注射。
6.如权利要求5所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述光镊为物镜构成的空间光镊或者尖端腐蚀的单模光纤光镊，光镊中耦合入径向偏振光。
7.如权利要求5所述的用于细胞药物精准注射的显微注射装置，其特征在于，所述光镊为单模光纤与环形光纤焊接后在焊点拉锥而成的光镊，环形光纤纤芯内径为20μm，外径为23.2～26μm，仅有LP01模和LP11模两种简并模传输，环形光纤纤芯端面研磨制成光束汇聚的环形光纤光镊，环形光纤光镊中耦合入径向偏振光。
8.一种如权利要求1～7任一所述用于细胞药物精准注射的显微注射装置的操作方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将培养液中的细胞滴加在载玻片上，载玻片固定在载物台上，调节显微镜目镜和物镜的倍数，使显微镜能清晰看到细胞结构。
B、取1米环形光纤，环形光纤纤芯内径20μm，外径25μm，单模光纤与环形光纤焊接后，在焊点拉锥，环形光纤中耦合入径向偏振光，环形光纤芯端面利用裸光纤研磨技术，研磨制成光束汇聚的环形光纤径向偏振光光镊，将光镊远离左位移台的一端放置在载玻片上，细胞在载玻片上的培养液中处于悬浮状态，开启光源发射装置，当载玻片接入光镊后，游动的细胞接近光镊捕获点时，会被光镊控制住。
C、将精密实验升降台调到与显微镜下边缘的高度，使用微调调节旋钮，使显微镜达到与载物台等高的高度。
D、取涂覆层250μm，纤芯外径125μm，内径62.5μm空心光纤1米，在空心光纤中部用刀片剥除涂覆层后，在氢氧焰光纤拉锥机上进行旋转拉锥，用0745数码显微镜在线测量锥区直径，当锥区直径拉至15-20μm时停止一次拉锥，采用短时补拉方式将锥区二次拉锥至10μm，利用超声波光纤切割法将锥区最细区域平整切断，得到空心光纤微针。注射器中提前吸取药物，旋上螺纹平头针头，将空心光纤微针插在注射针头平口后，用紫外固化胶密封。
E、通过显微镜观察，微调左右手动液压控制高精密三维位移台，使得光纤微针刺入细胞。
F、设置微量注射泵参数，推动注射器，使药物注入细胞内。
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