CN110832085A - 用于鉴定微生物感染的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本公开内容总体上涉及利用基因组序列识别的微生物病原体检测和鉴定领域。

Description

用于鉴定微生物感染的方法和装置
政府支持
本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的合同号R43OD016466和R44AI109913的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及利用基因组序列识别的微生物病原体检测和鉴定领域。
背景技术
血流感染(bloodstream infection，BSI)在美国已经上升成为第六位致死原因和最昂贵的医院治疗病症，每年超过300亿美元。BSI在美国占所有ICU使用量的25％和所有医院死亡的约50％。BSI通常由细菌或真菌引起，并且有效的疾病管理需要对其进行及早且准确的鉴定。BSI通常通过一系列血液培养来鉴定，这需要耗费多至数天以鉴定潜在的病原体。血液培养被广泛认为是假设驱动的一线抗微生物干预的障碍。
现代分子方法可为这一领域带来革命，然而包括缺乏灵敏度、性能不准确、覆盖范围窄和诊断详细信息不足在内的限制阻碍了这些方法产生影响。事实上，与许多感染性疾病相比，尽管有巨大的临床需求，但仍存在明显的能力缺口。存在着以下挑战的组合：极低的病原体负荷(1至100CFU/ml)、要求以高详细水平的广泛覆盖(20种病原体导致大约90％的病例，其中在临床上需要物种水平信息)、难以处理的样品基质(血液)、以及对快速周转的需求；当所有这些组合起来时，确实难以克服。
发明概述
本公开内容总体上涉及利用基因组序列识别的微生物(例如微生物病原体)检测和鉴定领域。特别地，所要求保护的方法、装置和试剂盒提供于鉴定和评价样品中(例如血液中)的微生物，而无需培养样品或者对样品进行可引起对任一种微生物物种的代表性过度或不足的其他操作。
在一些方面，本文提供了鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DNAInvading Artificial Nucleic Acid，DIANA)接触，其中所述多种DIANA包含选自SEQ IDNO：20至571的一个或更多个序列；以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在另一些方面，本文提供了鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育少于10分钟，以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育在约20℃至约65℃的温度下进行。在一些实施方案中，温度为约20℃至约64℃。在一些实施方案中，温度为约30℃至约64℃。在一些实施方案中，温度为约37℃至约64℃。在一些实施方案中，温度为约40℃至约64℃。在一些实施方案中，温度为约50℃至约64℃。在一些实施方案中，温度为约37℃至约60℃。在一些实施方案中，温度为约40℃至约60℃。在一些实施方案中，温度为约50℃至约60℃。
在一些实施方案中，在包含一价盐的孵育溶液中将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育。在一些实施方案中，一价盐以高于50mM的浓度存在。
在一些实施方案中，在包含二价盐的孵育溶液中将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育。在一些实施方案中，二价盐以高于5mM的浓度存在。
在一些实施方案中，在包含三价盐的孵育溶液中将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育。在一些实施方案中，三价盐以高于0.1mM的浓度存在。
在一些实施方案中，在pH为约10.2至约12.2的孵育溶液中将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)一起孵育。
在另一些方面，本文提供了监测对象中一种或更多种特定微生物物种随时间的病原体负荷的方法。该方法包括：在第一时间测量从对象获得的第一样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷，以及在第二时间测量从对象获得的第二样品中的病原体负荷，其中第二样品在从对象获得第一样品之后至少约1小时的时间从对象获得，其中从第一样品和第二样品中耗尽真核生物DNA，裂解第一样品和第二样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质，分离多种微生物遗传物质，扩增多种微生物遗传物质，使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，第二生物样品在从对象获得第一生物样品之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时从对象获得。
在另一些方面，本文提供了确定对象中一种或更多种特定微生物物种对一种或更多种抗微生物剂的易感性的方法。该方法包括：从对象获得一份或更多份样品，任选地将一份或更多份样品中的任意一份或更多份分成多份样品；测量从对象获得的一份或更多份样品中的一份中或者多份样品中的一份中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷；将从对象获得的一份或更多份样品中的至少一份或者将多份样品中的至少一份与一种或更多种抗微生物剂一起孵育至少1小时以获得用一种或更多种抗微生物剂处理的样品；以及测量用一种或更多种抗微生物剂处理的样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷，其中使用与一种或更多种抗微生物剂一起孵育的样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷来确定病原体的抗微生物剂易感性。
在一些实施方案中，多份样品等于2、3、4、5或6个或更多份样品。
在一些实施方案中，一种或更多种抗微生物剂选自氨苄西林、阿莫西林、金霉素(aureomicin)、杆菌肽、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢克洛(cephachlor)、头孢氨苄、头孢拉定、环丙沙星、克拉维酸、氯唑西林、双氯西林(dicloxacillan)、红霉素、氟氯西林(flucloxacillan)、庆大霉素、短杆菌肽、甲氧西林(methicillan)、新霉素、苯唑西林(oxacillan)、青霉素、万古霉素、卡泊芬净(capsofungin)、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和咪康唑。
在一些实施方案中，所选抗微生物剂是抗生素。在一些实施方案中，所选抗生素可以是与选自以下的抗生素种类有关的化合物：青霉素、四环素、头孢菌素、喹诺酮、林可霉素、大环内酯(macroslide)、磺酰胺(sulfomide)、糖肽、氨基糖苷和/或碳青霉烯(carapenem)。在一些实施方案中，所选抗生素可选自替代的抗生素种类。
在一些实施方案中，所选抗微生物剂是抗真菌剂。在一些实施方案中，所选抗真菌剂可以是与选自以下的抗真菌剂种类有关的化合物：唑类、烯丙胺类、棘球白素类、核苷类似物和/或多烯类。在一些实施方案中，所选抗真菌剂可选自替代的抗真菌剂种类。
在另一些方面，本文提供了鉴定来自患有感染的对象的样品中的微生物物种组群中的哪些微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：1至4和20至31的序列；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：141至493的序列；
检测和量化多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，并检测多种DIANA中的一种或更多种与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质的结合；以及确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的化学计量；其中所述化学计量用于确定哪些微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质。
在另一些方面，本文提供了鉴定与对象中的心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：20至131的一个或更多个序列；以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在与心内膜炎和/或脓毒症相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在另一些方面，本文提供了鉴定与对象中的新生儿脓毒症(neonatalsepticemia)相关的单一微生物物种或微生物组群的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：132至140的一个或更多个序列；以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在与新生儿脓毒症相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，样品的体积为0.1至1ml。在一些实施方案中，样品的体积为0.5至2.0ml。
在另一些方面，本文提供了鉴定在对象的病原体中赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：141至493的一个或更多个序列；以及检测多种DIANA中的一种或更多种与微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中的病原体中存在赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质。
在另一些方面，本文提供了鉴定对象中的真菌物种或真菌组群的方法。该方法包括：从样品中耗尽真核生物DNA；裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；分离多种微生物遗传物质；扩增多种微生物遗传物质；使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：494至571的一个或更多个序列；以及检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一真菌物种或真菌组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在一种或更多种特定真菌物种或真菌组群。
在另一方面，本文还提供了包含一种或更多种DIANA的组合物，所述DIANA包含选自SEQ ID NO：20至571的序列。
在另一方面，本文还提供了包含一种或更多种DIANA的试剂盒，其中所述DIANA包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种被修饰成包含一个或更多个结合部分。在一些实施方案中，一个或更多个结合部分是非共价结合部分。在一些实施方案中，一个或更多个结合部分是共价结合部分。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种包含接头。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种还包含间隔区。
在一些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，血液样品是全血样品。
在另一些方面，本文提供了用于鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法。该方法包括：将样品施加至流体装置，该流体装置包含：样品入口；与样品入口流体连通的流体通道，其中流体通道的长度为至少1cm且通道长宽比为至少5∶1；与流体通道流体连通的第一裂解区；与第一裂解区流体连通的第一分离区；与第一分离区流体连通的第二裂解区；与第二裂解区流体连通的第二分离区；与第二分离区流体连通的至少一个反应区；与至少一个反应区流体连通的扩增区；多个处理室，其各自与至少一个反应区和/或扩增区流体连通；和一个或更多个检测区，其中所述检测区包含一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)，所述DNA侵入人工核酸(DIANA)包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列。
在一些实施方案中，该方法包括与每个处理室流体连通的检测区。
在一些实施方案中，流体装置具有n个检测区并且能够鉴定n+x种特定微生物物种，并且其中x大于或等于1。
在另一些方面，本文提供了用于鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法。该方法包括：将样品施加至流体装置，该流体装置包含：流体贮存器；与流体贮存器流体连通的气体室；与流体贮存器流体连通的流体通道；和一个或更多个检测区，其中所述检测区包含一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)，所述DNA侵入人工核酸(DIANA)包含选自SEQ ID NO：20至571的一种或更多种序列，其中所述流体贮存器的纵向轴线与所述流体通道的纵向轴线基本上垂直，进行以下步骤：将第一流体引入流体贮存器，其中第一流体是液体；将第二流体引入气体室，其中第二流体是气体；以及向第二流体施加压力，使得第二流体从气体室流至流体贮存器，并推动第一流体从流体柱进入流体通道中，其中所述一种或更多种DIANA与样品的结合指示所述样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，该方法包括使体积为至少0.1ml的第一流体经由流体通道流入流体贮存器中。
在一些实施方案中，该方法包括在所述流体贮存器中引入气体的流或泡以使得第一流体与试剂混合，其中气体从流体通道输送。
在一些实施方案中，该方法包括使气体从流体贮存器流入气体室中，并基本上阻止第一流体和/或试剂流入气体室中。
在一些实施方案中，流体装置具有n个检测区并且能够鉴定n+x种特定微生物物种，并且其中x大于或等于1。
在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，对象被怀疑患有感染，例如细菌或真菌感染。
在另一方面，本文提供了包含一个或更多个处理室和一个或更多个检测区的流体装置，其中包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列的一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)包含在至少一个检测区内。
在一些实施方案中，每个流体贮存器的容积为至少0.1ml。
在一些实施方案中，每个气体室与流体贮存器流体连通。
在一些实施方案中，每个气体室的容积为至少0.1ml。
在一些实施方案中，每个流体通道与一个或更多个流体贮存器流体连通。
在一些实施方案中，每个流体通道的容积小于2000μL。
在一些实施方案中，至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
在一些实施方案中，流体通道的长度为至少1cm。
在一些实施方案中，流体通道的通道长宽比为至少5∶1。
在一些实施方案中，本文中所述的流体装置包含至少10个从流体枢纽(fluidichub)分支的分支通道。
在一些实施方案中，本文中所述的流体装置包含多个阀，每个阀定位在分支通道与流体枢纽之间。
在一些实施方案中，本文中所述的流体装置包含多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种被修饰成包含一个或更多个结合部分。在一些实施方案中，一个或更多个结合部分是非共价结合部分。在一些实施方案中，一个或更多个结合部分是共价结合部分。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种包含接头。
在一些实施方案中，多种DIANA中的一种或更多种还包含间隔区。
在一些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，血液样品是全血样品。
在另一方面，提供了试剂盒，其包含用于在不事先富集的情况下检测和/或鉴定和/或评估来自样品的一种或更多种微生物的试剂和方案。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于以下过程的试剂和方案：(i)从样品中耗尽真核生物DNA；(ii)裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；(iii)分离多种微生物遗传物质；(iv)扩增多种微生物遗传物质；和(v)使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)和与血流感染相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列；以及(vi)检测多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在与血流感染相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，如果样品中存在多于一种微生物，则试剂盒可能能够提供样品的负荷(相对和/或绝对)和微生物组成(在本文中定义为“微生物谱”)。
当结合附图考虑时，从多个非限制性实施方案的以下详细描述中，本文中所述的方法、装置和试剂盒的其他优点和新颖特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文件包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。
附图简述
将参照附图通过示例的方式来描述本发明的一些非限制性实施方案，附图为示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或近似相同的组件通常用单一附图标记表示。为了清楚起见，在不需要举例说明来使本领域普通技术人员理解本发明的情况下，没有在每幅图中标注出每个组件，也没有示出本发明各实施方案的每个组件。在附图中：
图1是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图2是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图3是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图4是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图5是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图6A是根据一组实施方案的一种示例性流体装置的示意图；
图6B是根据一组实施方案的一种示例性流体装置的示意图；
图7是示出用于对复杂的多种微生物感染进行去卷积(deconvolve)的作为病原体负荷的函数的信号的图；并且
图8是示出未经处理的大肠杆菌(E.coli)(从顶部起的第二个)以及用氨苄西林(底部)、万古霉素(顶部)和庆大霉素(从底部起的第二个)处理的大肠杆菌随时间的信号的图。
图9是示出了如何可以对多种微生物感染或混合感染进行去卷积，以鉴定两种病原体中的哪一种并入有可赋予对抗微生物剂之抗性或降低的易感性的遗传物质的两张图。实施例1中进一步描述了对多种微生物感染进行去卷积。
发明详述
本文描述了用于通过检测微生物的遗传物质来检测、鉴定、监测和评价来自对象的样品中的微生物(例如病原体)的方法、装置和试剂盒。这些方法、装置和试剂盒采用DNA侵入人工核酸(DIANA)，并且本文中公开了新的DIANA。尽管本领域已知的方法依靠杂交来检测微生物DNA，这些方法难以以高置信度在高度相似的序列之间进行区分，但是DIANA具有低至单个碱基对分辨率的特异性，使得能够区分高度同源的序列。
这些方法、装置和试剂盒特别可用于评价在样品中以低水平存在的微生物。本领域中的方法通常使用培养来提高微生物水平。培养的主要缺点是微生物生长到足够的浓度需要时间，并且种群中不同的微生物物种可能具有不同的生长速率，使得有关种群中不同微生物物种的相对频率的信息可能丢失。事实上，一些微生物是不可培养的，并且在使用培养的技术中可能无法检测到。
要求保护的方法、装置和试剂盒不仅允许鉴定以低水平存在的微生物，而且其还允许鉴定微生物谱——样品中存在的不同微生物的类型、相对数量或负荷。而且，这种鉴定可以是高度详细的，并且可以包括同时鉴定来自大范围物种的微生物及其赋予抗性的基因。此外，所述方法可快速提供该信息。
所述方法、装置和试剂盒特别可用于评价血液样品和评价对象的血流感染(BSI)例如脓毒症、感染性心内膜炎和新生儿脓毒症的存在或进展的情况。全血是复杂的溶液，其包含多种细胞类型，例如白细胞、红细胞和血小板，以及天然存在的有机和无机组分。血液组分可阻碍(甚至可完全阻止)DNA和/或RNA的另外或下游处理，例如如酶促PCR或等温扩增。另外，在体液样品收集过程中通常使用的抗凝剂和防腐剂可进一步干扰酶促过程或其他过程。由于BSI中微生物的低频率(低负荷)，因此血液测定也可能需要大的量。本文中所述的方法、装置和试剂盒提供了对血液样品中微生物的灵敏和准确的评价。如本文中所述，所述方法、装置和试剂盒特别可用于鉴定与一般血流感染相关的微生物，并且特别是与感染性心内膜炎和/或新生儿脓毒症和/或血液中的真菌感染相关的微生物。
本文中所述的方法、试剂盒和装置可以用于例如临床目的(例如，通过特定病原体的存在来诊断疾病或饮食(aliment))或用于研究目的(例如，用于监测由于添加和/或施用化合物引起的样品内微生物谱随时间的变化)。由于本文中所述的方法尤其可以完全集成(即，为样品进入/结果输出的)，不需要培养并且使用DIANA，因此与现有技术相比，它提供了显著的性能优势，包括例如改进的动力学、灵敏度、特异性、动态范围以及检测不同微生物的相对数量的能力。
以上介绍并且在以下更详细讨论的本技术的多个方面和实施方案可以以任何数量的方式来实现，并且如本文中所述，不限于任何特定的实现方式。提供具体实施和应用的实例主要是为了说明性目的。
除非内容清楚地另外指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，提及“细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
本文中使用的“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且将根据其使用的上下文有某种程度的变化。如果在使用它的上下文中，该术语的使用对本领域普通技术人员来说不清楚，那么“约”将意指达到特定项的加或减10％。
如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述并启用了相同范围。
DNA侵入人工核酸(DIANA)
在一些实施方案中，DNA侵入人工核酸(DIANA)用于检测微生物遗传物质。
基于DIANA的侵入可以很快并且可以只需要数分钟。这与使用DNA或RNA杂交探针的技术相反，后者可能需要数小时才能达到高严格性。DIANA还可具有无与伦比的特异性，低至单碱基对分辨率，实现比DNA或RNA杂交更精确的过程。不希望受理论束缚，这种特异性背后的物理原理如下。在侵入过程中，双链体DNA内形成局部化的“泡”，使得DIANA寡聚体沿着两条DNA链中的一条与特定序列结合。在整个过程中，该序列的DNA互补序列保持在相反的链上，因为DNA未变性。因此，如果DNA与DIANA探针之间的单一错配是明显的，则相反的链可以将DIANA“快速回折(snap-back)”并“踢出”。正是DIANA寡聚体与DNA互补序列之间的这种一致的和局部化的能量战，使得侵入过程极为具体。
本文中使用的术语“侵入”是指DIANA与微生物基因组物质(例如，RNA或DNA)的结合。与分子生物学领域中常见的类似，序列识别通过沃森-克里克碱基配对法则(Watson-Crick basepairing rule)进行，而不排除替代机制，例如但不限于胡斯坦碱基配对法则(Hoogstein base-pairing rule)和反-胡斯坦碱基配对法则。在一些实施方案中，DIANA结合至双链DNA或RNA。在一些实施方案中，DIANA与主要是单链DNA或RNA结合。应当理解的是，尽管由于二级结构(例如但不限于发夹)的存在而使DNA和/或RNA主要是单链的，但DIANA侵入DNA或RNA分子的过程仍可能发生。应当理解的是，“侵入”的过程是局部化的，并且局部条件是决定该过程是固有杂交还是基于侵入的那些条件。
在一些实施方案中，DIANA采用特化类型或类别的肽核酸(Peptide NucleicAcid，PNA)的形式。在一些实施方案中，DIANA不限于特定类别的PNA。在一些实施方案中，DIANA采用特化类型或类别的锁核酸或桥接核酸(Locked Nucleic Acid，LNA；和/或Bridged Nucleic Acid，BNA)的形式。在一些实施方案中，局部侵入双链体DNA的DIANA具有在本文中所公开的方法中使用的所需亲和力和序列特异性。
在一些实施方案中，基于PNA寡聚体的DIANA在骨架的γ-位置具有手性立体中心(也称为γPNA)。γPNA是寡聚体，由构成该寡聚体的序列组成的单体构成。作为实例，但不作为限制，具有序列AGTCAG的γPNA寡聚体将由两个“A”单体、两个“G”单体、单个“T”单体和单个“C”单体构成。γPNA寡聚体是特定类别的PNA寡聚体，其中至少一个单体在单体骨架的γ-位置处包含一个手性立体中心(本文中为“γ修饰的单体”)。在结构上预先定向成右手旋螺旋的PNA寡聚体在能量上有利于进行双链体DNA侵入。在一些实施方案中，如WO 2013/176992(其内容通过引用整体并入)中所教导的使用γPNA检测微生物DNA。在一些实施方案中，对于长扩增子(例如，约400至4000bp的扩增子)，使用DIANA是有利的。应当理解的是，在一些实施方案中，DIANA可以用于DNA/RNA杂交过程。但是，当实验条件是有利于原位侵入杂交的那些条件时，我们确定了性能的提高。
在一些实施方案中，寡聚体包含大于5％的γ-修饰单体，大于10％的γ-修饰单体，大于25％的γ-修饰单体，大于50％的γ-修饰单体，大于75％的γ-修饰单体或100％的γ-修饰单体。γ位的合适修饰是本领域技术人员公知的并且包括，作为实例，但不作为限制的非极性基团例如甲基、乙基等，或者极性基团例如基于乙二醇的基团，或者半极性基团例如基于酯的那些基团。
在一些实施方案中，DIANA靶向来自微生物的遗传物质。在一些实施方案中，DIANA靶向来自细菌例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的遗传物质。在一些实施方案中，DIANA靶向来自真菌的遗传物质。在一些实施方案中，可用于微生物鉴定的DIANA的寡聚体序列如以下表1、表2、表3、表4或表5中所示：
表1示出了用于鉴定微生物的DIANA序列
Figure BPA0000281908730000131
Figure BPA0000281908730000141
表2示出了用于鉴定通常与感染性心内膜炎相关的微生物的DIANA序列
Figure BPA0000281908730000142
Figure BPA0000281908730000161
Figure BPA0000281908730000181
Figure BPA0000281908730000191
Figure BPA0000281908730000201
表3示出了用于鉴定通常与新生儿脓毒症相关的微生物的DIANA序列
表4示出了通常与抗微生物剂抗性相关的DIANA序列
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表5示出了用于鉴定真菌的DIANA序列
Figure BPA0000281908730000382
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在一些实施方案中，优选的DIANA寡聚体的长度为7至20个碱基(即7至20聚体)。在另一些实施方案中，优选的DIANA寡聚体的长度为12至18个碱基(即12至18聚体)。
在一些实施方案中，本文提供的DIANA包括作为表1至5中所述序列的互补序列、反向或反向互补序列的序列。在一些实施方案中，本文提供的DIANA包含与表1至5中所述序列共有至少约60％至70％同一性的序列，或者表1至5中所述序列的互补序列、反向或反向互补序列。在另一个实施方案中，DIANA具有与表1至5的序列共有至少约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的序列，或者表1至5中所述序列的互补序列、反向或反向互补序列。术语“同一性”或“同源性”或“相似性”是指两个DIANA序列之间的序列关系，并且可以通过为了比较而对齐时比较每个序列中的核苷酸位置来确定。术语“同一性”是指两个序列之间核酸相同的程度。术语“同源性”或“相似性”是指两个功能等同的DIANA序列的相关性。
如上所述，DIANA序列还包括表1至5中提供的序列的功能片段和与表1至5中的那些序列共有某些序列同一性的序列，条件是它们具有与微生物特异性退火并对其进行鉴定的功能。在一个方面，这些片段序列在表1至5中原始序列的任一端或两端具有1、2、3、4、5或6个更少的碱基。这些较短的序列也在本公开内容的范围内。
另外，如上所述，DIANA序列(包括表1至5中提供的那些序列以及与表1至5中的那些序列共有某些序列同一性的序列)可以并入到更长的序列中，条件是它们具有与微生物特异性退火并对其进行鉴定的功能。在一个方面，更长的序列在原始序列的任一端或两端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的碱基。这些更长的序列也在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，DIANA寡聚体可包含一种或更多种人工核碱基，例如但不限于假胞嘧啶(pseudo-cytosine)、胍基G钳(guanidinium G-clamp)、二氨基嘌呤、肌苷等。应理解的是，出于多种原因，本领域技术人员可利用人工或非天然碱基。尽管有以上所述，还是碱基配对法则决定结合(侵入)是否会发生。因此，应理解的是，在非限制性实例中，在DIANA寡聚体中使用假胞嘧啶代替胞嘧啶被定义为同源序列。
在一些实施方案中，ssDNA是目标的而不是dsDNA。在一些实施方案中，在DNA分子的DIANA标记之前，通过变性方案或通过不对称扩增过程从dsDNA产生ssDNA。
在一些实施方案中，DNA完全为双链体形式。在一些实施方案中，DNA局部地为双链体形式。
在一些实施方案中，DIANA寡聚体被修饰成包含一个或更多个结合部分。在一些实施方案中，结合部分使DIANA结合至固体基底。在一些实施方案中，使DIANA结合至固体基底可用于下游的分离或洗涤步骤。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，结合部分包括但不限于非共价结合部分(例如生物素、地高辛、毛地黄毒苷)或共价结合部分(例如，COOH基团、NHS-酯基团、马来酰亚胺(malemide)化学和点击化学(Click chemistry))。
在一些实施方案中，结合部分通过一个或更多个接头与DIANA探针隔开。在一些实施方案中，接头是单个分子。在一些实施方案中，接头由多个单独分子的线性或支化链构成，所述分子组合以产生单个接头分子。
在一些实施方案中，接头长度为约20至200、约40至180、约60至160、约80至140或约100至120个原子。在一些实施方案中，接头长度为至少40个原子。所公开的接头长度在本领域中不常用。
在一些实施方案中，沿着单个接头使用一个或更多个结合部分。在一些实施方案中，沿着单个接头有两个或更多个结合部分，其中每个接头具有1个或更多个结合部分，并且其中每个结合部分沿着寡聚体附接到不同的位置。在一些实施方案中，多个结合部分提高表面结合动力学和/或产率和/或效率和/或强度。
在一些实施方案中，首先用一种或更多种DIANA标记DNA扩增子，然后将杂交复合体捕获到固相表面上。
在一些实施方案中，在捕获微生物遗传物质DNA之前，将DIANA与固体表面一起孵育。
在一些实施方案中，固相表面是珠、纳米颗粒、微粒或平坦基底。在一些实施方案中，固相表面被进一步化学修饰成促进DIANA与其的结合。在一些实施方案中，在系统(例如板或芯片)上的各个孔或室中进行捕获靶标扩增子并将其固定在固相表面上的操作。
在一些实施方案中，孔用针对单一病原体的多于一种DIANA探针激活；例如，金黄色葡萄球菌的检测区。在一些实施方案中，单孔中的一种或更多种探针可以用于多种病原体；例如，金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和白念珠菌的单孔。
本文中使用的“原子”是指碳原子、氮原子、氧原子或能够形成两个或更多个共价键的任何原子。或者，在一些实施方案中，“原子”是指两个共价结合的原子之间的距离。作为实例，但不作为限制，以下结构：DIANA-(CH2)40-(结合部分)具有长度为40个原子的接头(-(CH2)40-)。作为实例，但不作为限制，以下结构：DIANA-(CH2)40-O-(CH2)40-(结合部分)具有长度为81个原子的接头(-(CH2)40-O-(CH2)40-)。作为实例，但不作为限制，以下结构：DIANA-(CH2)40-O-NH-(CH2)30-(结合部分)具有长度为72个原子的接头(-(CH2)40-O-NH-(CH2)30-)。作为实例，但不作为限制，以下结构：DIANA-(CH2)40-O-N(CH2)3CH3-(CH2)30-(结合部分)具有长度为72个原子的接头(-(CH2)40-O-N(CH2)3CH3-(CH2)30-)(-(CH2)3CH3组分从氮原子分支出去并且对接头的长度没有贡献)。
微生物遗传物质
本文中所公开的方法、测定和试剂盒旨在检测DIANA与微生物遗传物质的结合。本文中使用的“微生物遗传物质”包括微生物的多核苷酸。多核苷酸包括包含核苷酸聚合物(核苷酸单体)的任何化合物和/或物质。多核苷酸包括例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。微生物的示例性多核苷酸包括例如基因组DNA、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA和sRNA。
在一些实施方案中，微生物遗传物质来自细菌细胞。在一些实施方案中，微生物遗传物质来自革兰氏阳性菌细胞。在一些实施方案中，微生物遗传物质来自革兰氏阴性菌细胞。在一些实施方案中，微生物遗传物质来自真菌细胞。
样品和样品收集
在一些实施方案中，样品为约1μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl或任意两个先前列出的量之间的任意量。在一些实施方案中，样品为约100μl至2.5ml、约200μl至2ml、约300μl至1.5ml、约400μl至1ml或约500μl至750μl。在一些实施方案中，样品为约0.5ml至10ml、约1ml至9ml、约2ml至8ml、约3ml至7ml或约4ml至6ml。在一些实施方案中，样品为约1.0ml至3ml。在一些实施方案中，样品为约0.1ml至1.0ml。在一些实施方案中，较大的样品体积对以低浓度存在的微生物提供更高的灵敏度。
在一些实施方案中，例如，当测试新生儿脓毒症时，可以使用较小的样品体积。在一些实施方案中，样品为约0.5ml至约1.5ml。在一些实施方案中，样品为约0.1ml至约1.0ml。在一些实施方案中，样品为约0.1ml、约0.2ml、约0.3ml、约0.4ml、约0.5ml、约0.6ml、约0.7ml、约0.8ml、约0.9ml、约1.0ml、约1.1ml、约1.2ml、约1.3ml、约1.4ml、约1.5ml、约1.6ml、约1.7ml、约1.8ml、约1.9ml或约2.0ml。
在一些实施方案中，样品来自对象。对象包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫、两栖动物和鱼类。在一些实施方案中，哺乳动物对象是人。在一些实施方案中，对象是成人。在一些实施方案中，对象是儿童(即2至16岁)。在一些实施方案中，对象是婴儿(即，小于2岁)。
在一些实施方案中，所述对象患有或怀疑患有感染，例如微生物感染。微生物感染的实例包括例如脓毒症，例如感染性心内膜炎和新生儿脓毒症。微生物感染的其他实例包括但不限于肺炎、泌尿道感染、关节感染、脊髓液感染等。
在一些实施方案中，样品中或怀疑存在于样品中的微生物细胞包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、病毒颗粒或其组合。
在一些实施方案中，样品包括体液、身体排泄物或身体分泌物，例如血液、尿、唾液、粪便或痰。在一些实施方案中，样品由人血液构成。在一些实施方案中，利用全血或未经处理的血液是有利的，因为这消除了将血液分离成其多种组分的需要，这种分离过程是相当费力的过程。
在一些实施方案中，本文中所述的方法包括从对象获取样品。
对于血液中的测定，微生物负荷可能很低，并且潜在的污染是一个严重的问题。污染可能以游离核酸或微生物(微生物)的形式出现。污染微生物可能来自许多来源，包括患者的皮肤、健康护理提供者、医院设备等。本文提供的是用于收集血液样品的改进方法。不希望受理论束缚，例如通过从同一次抽血或同一静脉内管线(intravenous line)中依次收集多个小瓶的血液而在同一次抽取中收集多于一个血液样品可以降低第二样品和另外样品中的污染水平，因为污染物将包含在第一样品中。污染物水平的这种降低同样使得本文中所述测定中的性能得到改善。在一些实施方案中，从对象获取样品包括从对象抽取一个或更多个小瓶的血液，优选地从同一次抽血或同一静脉内管线抽取。在一些实施方案中，从对象的单个管线例如外周血管线或从IV管线抽取血液。
在一些实施方案中，从同一管线从患者抽取多于一个小瓶的血液。不希望受理论束缚，使用两个或更多份样品管来收集患者血液尤其有利于降低假阳性、提高灵敏度和提高准确性。在一些实施方案中，在本文中所述的测定中不使用第一小瓶血液。在一些实施方案中，第一小瓶血液被丢弃或用于替代目的。
在一些实施方案中，在本文中所述的方法中待使用的小瓶包含抗凝剂，例如EDTA，其是在此公开的测试中使用的优选的抗凝剂。在一些实施方案中，将约0.05至5ml体积的血液收集到第一血液小瓶(未对其进行测试)中。在一些实施方案中，待测试的血液体积为约1至10ml。在另一些实施方案中，待测试的血液体积为约1.5ml至25ml。
用于使用DIANA鉴定和评价微生物物种的综合方法
在一些实施方案中，本技术提供了用于监测和/或鉴定和/或表征对象中的微生物细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤中的一个或更多个：(i)从样品中耗尽真核生物DNA，(ii)裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质，(iii)分离多种微生物遗传物质，(iv)扩增多种微生物遗传物质，(v)使所扩增的微生物遗传物质与多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)接触或孵育，以及(vi)检测一种或更多种DIANA与其目标微生物遗传物质的结合。
在一些实施方案中，进行所有步骤(i)-(vi)。在一些实施方案中，进行步骤(ii)-(v)中的一些。作为实例，但不作为限制，在某些样品基质中，由于真核细胞的浓度相对较低，因此可能可以跳过步骤(i)。例如，某些样品(例如尿)由于真核细胞浓度低而通常不需要步骤(i)。在另一个非限制性实例中，如果微生物细胞的浓度足够高以允许使用者利用较小的样品体积，使得真核细胞中的人DNA量不足以阻碍/抑制/降低下游过程(例如但不限于酶促扩增)的灵敏度等，则可能可以跳过步骤(i)。
耗尽样品中的真核生物DNA
在一些实施方案中，本文中所述的方法包括耗尽样品中的真核生物DNA。
在一些实施方案中，例如但不限于，当患者样品未经过预处理步骤例如离心时，该过程中的第一步是通过使用渗透应激(osmotic stress)、非离子型洗涤剂的组合和离子交换树脂的选择性裂解过程从样本中选择性去除人DNA，如WO 2016/044621A1中所述，其全部内容并入本文。
在一些实施方案中，从样品中耗尽真核生物DNA包括向样品添加真核细胞裂解溶液，其中真核细胞裂解溶液主要裂解真核细胞而不是微生物细胞，并从样品中去除由真核细胞的裂解释放的真核生物DNA，其中一个或更多个完整的微生物细胞保留在样品中。在一些实施方案中，该方法包括终止真核细胞裂解反应。
真核细胞的裂解
在一些实施方案中，真核细胞裂解剂是溶液(以下为“真核细胞裂解溶液”)。或者，在一些实施方案中，在使用前将真核细胞裂解剂沉淀并重悬于水或水性缓冲液中。
在一些实施方案中，真核细胞裂解溶液包含一种或更多种洗涤剂或表面活性剂。在一些实施方案中，洗涤剂或表面活性剂是非离子的、阴离子的、阳离子的、两性离子的或非洗涤剂磺基甜菜碱。洗涤剂和表面活性剂包括但不限于BigCHAP、脱氧BigCHAP、Brij 35、Brij 58P、Cymal-1、Cymal-2、Cymal-5、Cymal-6、癸基-β-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十六烷基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、癸基-β-D-1-硫代吡喃麦芽糖苷、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基-β-二硫代吡喃葡萄糖苷、毛地黄皂苷、二甲基癸基氧化膦(APO-10)、十二烷基二甲基氧化膦(APO-12)、IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630和IGEPAL CO-720、N-辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-8)、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-9)、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-10)、诺乃洗涤剂(nonidet)P40-替代品、Pluronic F-68、皂苷、thesit、Triton X-100、Triton X-114、吐温20、吐温40、吐温80、胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、N-1-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、三甲基(十四烷基)溴化铵(TTAB)、ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)、ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)、C7BzO、CHAPS、CHAPSO、EMPIGEN BB、3-(N，N-二甲基辛基氨基)丙烷磺酸盐内盐(SB3-8)、3-(癸基二甲基氨基)-丙烷磺酸盐内盐(SB3-10)、3-(十二烷基二甲基氨基)-丙烷磺酸盐内盐(SB3-12)、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-14)、3-(N，N-二甲基棕榈基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-16)、3-(N，N-二甲基十八烷基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-18)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)和3-(苄基二甲基氨基)丙烷磺酸盐(NDSB 256)。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，真核细胞裂解溶液的表面活性剂浓度为约0.27％至15％v/v、约0.39％至13％v/v、0.45％至12％(v/v)或约0.60％至10％(v/v)的吐温表面活性剂和/或约0.22％至10％(v/v)、约0.16％至8.25％(v/v)或约0.44％至6.75％(v/v)的Triton或IGEPAL。在一些实施方案中，吐温表面活性剂选自吐温-20、吐温-40和吐温80。在一些实施方案中，Triton是Triton X-100或Triton X-114。在一些实施方案中，IGEPAL选自IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630和IGEPAL CO-720。
在一些实施方案中，表面活性剂以干燥形式单独储存并在使用前重悬。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，真核细胞裂解反应物(例如，与样品组合的真核细胞裂解溶液(以下为“混合物”))包含的表面活性剂终浓度为约0.25％至1％(v/v)、约0.35％至0.85％(v/v)、约0.45％至0.75％(v/v)或约0.55％至0.65％(v/v)的吐温表面活性剂和/或约0.15％至0.65％(v/v)、约0.25％至0.55％(v/v)或约0.35％至0.45％(v/v)的Triton或IGEPAL。在一些实施方案中，吐温表面活性剂选自吐温-20、吐温-40和吐温-80。在一些实施方案中，Triton是Triton X-100或Triton X-114。在一些实施方案中，IGEPAL选自IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630和IGEPAL CO-720。
在一些实施方案中，一种或多种洗涤剂降低了真核细胞的结构完整性。
在一些实施方案中，将至少一种消泡剂与真核细胞裂解溶液组合。消泡剂包括但不限于消泡剂A、消泡剂204、消泡剂B、消泡剂C、消泡剂Y-30、消泡剂SE-15和基于西甲硅油的消泡剂。
在一些实施方案中，混合物包含小于约0.15M的一价盐。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，当混合物包含少于约0.15M的一价盐时，会诱导渗透应激。在一些实施方案中，混合物包含约0.15M至0.75M、约0.2M至0.7M、约0.25M至0.65M、约0.3M至0.6M、约0.35M至0.55M或约0.4M至0.5M的一价盐。
在一些实施方案中，真核细胞裂解溶液与样品的体积比例为约0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或这些比例中任何两个比例之间的任何比例。
在一些实施方案中，真核细胞裂解反应在约室温下进行。在一些实施方案中，真核细胞裂解反应在约5℃至20℃、约9℃至16℃或约12℃至13℃下进行。在一些实施方案中，真核细胞裂解反应在约25℃至75℃、约30℃至70℃、约35℃至65℃、约40℃至60℃或约45℃至55℃的温度下进行。
在一些实施方案中，真核细胞裂解反应进行约0.01至20分钟、约0.1至9.0分钟、约1.0至8.0分钟、约2.0至7.0分钟、约3.0至6.0分钟、约4.0至5.0分钟。在一些实施方案中，约5分钟之后停止真核细胞裂解过程。
在一些实施方案中，真核细胞裂解溶液不包含缓冲剂。在另一些实施方案中，真核细胞裂解溶液包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括但不限于2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-双(2-羟乙基)氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇(Bis-Tris)、3-(-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷)(TRIS)、磷酸钠、磷酸钾、乙酸钠、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、乙酸钠、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-甲基哌嗪、哌嗪、二乙醇胺和丙烷1，3-二氨基。
在一些实施方案中，真核细胞裂解反应的pH为约6至9的pH。在一些实施方案中，该pH为中性或接近中性。在约6至9或接近中性的pH下真核细胞的选择性裂解与现有方法相反，后者强调了真核细胞裂解反应的碱性条件(例如，pH 9.5至14)。在一些实施方案中，在约6至9或接近中性的pH下进行真核细胞裂解反应优于本领域已知的现有方法，因为在一些表面活性剂的存在下微生物细胞的生存力和/或结构完整性提高。
在一些实施方案中，本文中所述的真核细胞裂解反应的方法优于本领域已知的现有方法，因为本文中所述的真核细胞裂解反应方法适用于集成装置中的自动化。
真核细胞裂解的终止
在一些实施方案中，通过向混合物(即，真核细胞裂解溶液/样品组合)添加包含至少一种电解质的裂解终止溶液来终止真核细胞裂解反应。在一些实施方案中，反应物中电解质的终浓度为约25mM至850mM、约100mM至750mM、约150mM至650mM、约200mM至550mM、约250mM至450mM或约300mM至400mM。可以添加至裂解终止缓冲液的电解质包括但不限于一价盐和二价盐。在一些实施方案中，使用至少一种电解质终止真核细胞裂解反应改善使用阴离子交换树脂的下游处理(例如，真核生物DNA的去除、微生物细胞的分离、微生物细胞的裂解或微生物基因组物质的分离)。
在一些实施方案中，添加至裂解终止缓冲液的电解质包含至少一种一价盐。一价盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、碘化钾、碘化钠、氯化锂、碘化锂、溴化钾、氟化钠和氟化钾。在一些实施方案中，将一价盐单独添加至混合物以终止裂解反应。在一些实施方案中，不需要终止裂解过程。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH低于约9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH为约6至9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液不具有低于4.0或高于11.0的pH。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH为约中性。
在一些实施方案中，裂解终止缓冲液与混合物组合的pH低于约9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液与混合物组合的pH为约6至9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液与混合物组合的pH为约中性。在一些实施方案中，将裂解终止缓冲液与混合物的组合维持在约6至9或约中性的pH改善完整微生物细胞的下游处理(例如，真核生物DNA的去除、微生物细胞的分离、微生物细胞的裂解或微生物DNA的扩增)。
去除真核生物DNA/RNA
在一些实施方案中，通过“选择性捕获”真核生物基因组物质，或者固定真核生物DNA而不捕获或固定完整微生物细胞、真核细胞碎片或其他非核酸物质来进行从混合物或裂解终止缓冲液与混合物组合中的完整微生物细胞中分离真核生物基因组物质。在一些实施方案中，捕获的真核生物基因组物质是真核生物DNA和/或RNA。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂用于捕获/固定真核生物基因组物质。在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种弱阴离子交换树脂(weak anion-exchangeresin，WAX)。WAX的一些实例包括但不限于羧甲基(CM)、二乙基氨基丙基(ANX)、二乙基乙醇胺(DEAE)、Amberlite Ira67、Purolite A847、Amberlite Ira96、Amberlite IRA96SB、Dowex Marathon WBA、Dowex Upcore Mono WB-500、Purolite A835、Dowex Monosphere 77和Dowex Monosphere 66。在一些实施方案中，WAX树脂包含至少一个叔胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种强阴离子交换树脂(stronganion-exchange resin，SAX)。SAX的实例包括但不限于-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3、Amberjet Up4000、Amberjet 9000 OH、Amberlite FPA40 Cl、和Dowex UpcoreMono MA-600。在一些实施方案中，基于SAX的树脂包含季胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是至少一种WAX和至少一种SAX的组合。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂的形式选自纤维、膜、吸着剂、凝胶和滤纸。在一些实施方案中，使具有经裂解真核细胞的样品通过阴离子交换树脂或与阴离子交换树脂接触。在一些实施方案中，阴离子交换树脂在溶液中。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂与支持基底缀合。支持基底的实例包括但不限于颗粒、珠、表面或球体。在一些实施方案中，支持基底是磁性的，例如磁性颗粒或磁珠。在一些实施方案中，阴离子交换树脂在溶液中与支持基底缀合。
在一些实施方案中，支持基底包含二氧化硅、玻璃、金属、基于聚苯乙烯的材料、基于纤维素的材料、基于琼脂糖的材料、基于葡聚糖的材料、基于甲基丙烯酸酯的材料、基于琼脂糖的材料或其组合。在一些实施方案中，支持基底是多孔的。
在一些实施方案中，支持基底是珠或球体，其直径为约10至100μm、约20至90μm、约30至80μm、约40至70μm或约50至60μm。
在另一个实施方案中，支持基底是珠或球体，其直径为约0.01至10μm、约0.1至9.0μm、约1.0至8.0μm、约2.0至7.0μm、约3.0至6.0μm或约4.0至5.0μm。
在一些实施方案中，将混合物与阴离子交换树脂一起孵育约0.1至10分钟、约2至9分钟、约3至8分钟、约4至7分钟或约5至6分钟。在一些实施方案中，将混合物与阴离子交换树脂一起孵育约10至30分钟、约12至28分钟、约15至25分钟、约18至23分钟或约19至22分钟。在一些实施方案中，将混合物与阴离子交换树脂一起孵育少于1分钟。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂被恒定地固定在支持基底上。在一些实施方案中，使经固定阴离子交换树脂与混合物接触和/或孵育，并随后去除混合物。
在一些实施方案中，使与支持基底(例如珠或颗粒)缀合的至少一种阴离子交换树脂与混合物接触和/或孵育。在一些实施方案中，在与混合物接触和/或孵育之后，从混合物中去除与支持基底缀合的阴离子交换树脂。在另一个实施方案中，在与混合物接触和/或孵育之后，将与支持基底缀合的阴离子交换树脂固定并去除混合物。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，当支持基底为已磁化的珠或金属珠并且该已磁化的珠或金属珠暴露于磁体或磁场时，与支持基底缀合的阴离子交换树脂被选择性地固定。
在一些实施方案中，使混合物与阴离子交换树脂接触和/或孵育，从混合物中提取真核生物DNA例如人DNA(hDNA)和/或RNA。在一些实施方案中，真核生物DNA(和/或RNA)至阴离子交换树脂结合。在一些实施方案中，阴离子交换树脂从混合物提取约5％至100％、约10％至99％、约15％至85％、约20％至80％、约25％至75％、约30％至70％、约35％至65％、约40％至60％或约45％至55％的真核生物DNA(和/或RNA)，例如hDNA。在一些实施方案中，阴离子交换树脂从混合物中提取超过95％的真核生物DNA。
微生物的裂解
在一些实施方案中，其中期望对表1至5中所列出的包含细菌和/或真菌的组进行测定，优选的是确保微生物裂解步骤对所有靶标有效。该过程以及用于制备试剂的过程在WO 2016/044621A1中进行了详细说明。在一些实施方案中，去除了真核生物DNA的混合物(或裂解终止溶液与混合物组合)(以下为“分离的微生物细胞样品”)包含一种或更多种微生物细胞。在一些实施方案中，对分离的微生物细胞样品进行进一步处理。在一些实施方案中，使分离的微生物细胞样品与微生物细胞裂解溶液接触。
在一些实施方案中，使用包含一种或更多种化学裂解剂的裂解溶液裂解微生物细胞。在一些实施方案中，化学裂解剂包括但不限于阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂和酶。
在一些实施方案中，微生物裂解反应在约6至9的pH或在中性pH下进行。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液还包含以下的一种或更多种：酶、洗涤剂和其他组分，例如盐、缓冲剂和金属螯合剂。
在一些实施方案中，使用多种裂解溶液。在一些实施方案中，多种裂解缓冲液以逐步方式添加。在一些实施方案中，仅使用单一微生物裂解溶液。
在一些实施方案中，将微生物裂解反应加热至约15℃至50℃、约20℃至45℃、约25℃至40℃或约30℃至35℃。在一些实施方案中，微生物裂解反应在室温下进行。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液包含一种或更多种以下酶或酶组：溶菌酶、溶细胞酶、酶解酶(zymolyase)、变溶菌素和溶葡萄球菌素。在一些实施方案中，一种或更多种酶以干燥或压成丸的形式储存，其中在各酶重悬之后，酶达到以下确定的浓度。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的溶菌酶浓度为约5至200mg/ml、约1至150mg/ml、5至175mg/ml、约15至140mg/ml、约20至100mg/ml、约30至95mg/ml、约45至75mg/ml、约50至62mg/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物(例如，包含微生物裂解溶液和分离的微生物细胞样品的溶液)中的溶菌酶浓度为约0.01至1mg/ml、约0.1至10mg/ml、0.5至15mg/ml、约1至20mg/ml、约0.3至8mg/ml、约0.7至7mg/ml、约0.2至0.9mg/ml、约0.05至0.35mg/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的溶细胞酶浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、约3,000至15,000U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的溶细胞酶浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20U至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、约90至100U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的酶解酶浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425U至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、约3,000至15,000U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的酶解酶浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20U至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、约90至100U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的变溶菌素浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、约3,000至15,000U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的变溶菌素浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、约90至100U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的溶葡萄球菌素浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425U至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、约3,000至15,000U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的溶葡萄球菌素浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600Uml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、约90至100U/ml，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，将一种或更多种盐添加至微生物裂解溶液。在一些实施方案中，一价盐的浓度为约50mM至6M、约150mM至5M、约350mM至4.5M、约550mM至4M、约900mM至3.75M、约1M至3.5M，或者在任意两个先前公开的浓度之间。在一些实施方案中，盐包含一种或更多种一价盐。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，一价盐是NaCl、KCl和/或LiCl中的一种或更多种。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的盐浓度为约50mM至800mM、约100mM至700mM、约200mM至600mM、约300mM至500mM以及约350mM至450mM，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，一种或更多种一价盐以干燥或压成丸的形式储存，其中在各盐重悬之后，盐达到以上确定的浓度。
在一些实施方案中，酶促反应时间为约1至60分钟、约5至55分钟、约10至45分钟、约15至40分钟、约20至35分钟或约25至30分钟。
在一些实施方案中，酶促反应中的DNA污染物被去除或变得不可扩增或不可扩增。在一些实施方案中，使用离子交换树脂实现DNA的去除。
在一些实施方案中，将至少一种DNA嵌入染料添加至微生物裂解溶液。在一些实施方案中，DNA嵌入染料是在用合适波长和剂量的光源活化之后与两条DNA链产生共价键的染料。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，共价键使样品中存在的至少一些DNA不可扩增。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DNA嵌入染料包括但不限于单叠氮乙锭(EMA)和单叠氮丙锭(PMA)。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的DNA嵌入染料的浓度为约0.01μM至1.0μM、约0.1μM至0.9μM、0.2μM至0.8μM、约0.3μM至0.7μM或约0.4μM至0.6μM，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液还包含一种或更多种核酸酶。在一些实施方案中，在使用微生物裂解溶液之前中和核酸酶。所用的确切核酸酶取决于下游目的序列。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，核酸酶选自但不限于EcoRI、HindIII、SaiI、HhaI、DdeI、RsaI、Sau3AI和MspI。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液包含一种或更多种洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂是两性离子洗涤剂。在一些实施方案中，两性离子洗涤剂来自磺基甜菜碱家族。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，磺基甜菜碱洗涤剂包括但不限于N-癸基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-癸基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十八烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐和3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)氨基]丙烷磺酸盐。
在一些实施方案中，洗涤剂是来自吡喃葡萄糖苷家族的非离子洗涤剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，非离子吡喃葡萄糖苷洗涤剂包括但不限于3-乙酰基伞形酮基b-D-吡喃葡萄糖苷、N-戊基b-D-吡喃葡萄糖苷癸基b-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正十二烷基b-D-吡喃葡萄糖苷、十六烷基b-D-吡喃葡萄糖苷、己基b-D-吡喃葡萄糖苷、甲基a-D-吡喃葡萄糖苷、辛基b-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷。
在一些实施方案中，洗涤剂是阳离子洗涤剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，阳离子洗涤剂包括但不限于烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、肉豆蔻基三甲基溴化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、十六烷基(2-羟乙基)二甲基铵、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基氯化铵或四(癸基)溴化铵。在一些实施方案中，阳离子洗涤剂的浓度为约1-100×临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)。
在一些实施方案中，将来自磺基甜菜碱和吡喃葡萄糖苷家族的单一洗涤剂添加至微生物裂解溶液。在一些实施方案中，将来自磺基甜菜碱家族和吡喃葡萄糖苷家族的一种或更多种洗涤剂添加至微生物裂解溶液。作为补充或替代，在一些实施方案中，微生物裂解溶液包含一种或更多种阳离子洗涤剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，阳离子洗涤剂包含烷基三甲基溴化铵、盐酸氨丙啉、苯扎氯铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、甲苄索氯铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、奥芬溴铵、四庚基溴化铵、四(癸基)溴化铵、四(癸基)溴化铵和三辛酰基甲基氯化铵。
在一些实施方案中，单独洗涤剂的浓度取决于微生物裂解反应物中特定洗涤剂的临界胶束浓度(CMC)。在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的每种洗涤剂浓度为约10至11,000、约25至12,500、约50至8,000、约75至7,000、约95至8,500或约98至6,750倍的CMC。在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的洗涤剂浓度为约100至5,000、约125至9,000、约200至8,000、约400至7,000或约500至6,000倍的CMC。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液中的洗涤剂浓度为约100至1000、约200至900、约300至800、约400至700、或约500至600倍的CMC。在一些实施方案中，微生物裂解反应物中的每种洗涤剂浓度为约0.1至100、约1.0至90、约10至80、约20至70、约30至60、或约40至50倍的CMC。
在一些实施方案中，洗涤剂(作为一组或单独地，或其任何组合)以干燥或压成丸的形式储存，其中在各洗涤剂重悬之后，洗涤剂达到以上确定的浓度。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液包含一种或更多种金属螯合剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，金属螯合剂包括但不限于乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，微生物裂解溶液中金属螯合剂的浓度为约50mM至1.0M、约100mM至0.75M、约110mM至500mM、约125mM至500mM、约125mM至450mM，或者在任意两个先前公开的浓度之间。在一些实施方案中，微生物裂解反应物中金属螯合剂的浓度为约5mM至250mM、约10mM至100mM、约15mM至90mM、约20mM至80mM、约125mM至450mM，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，金属螯合剂以干燥或压成丸的形式储存，其中在金属螯合剂重悬之后，金属螯合剂达到以上确定的浓度。
在一些实施方案中，微生物裂解溶液包含一种或更多种还原剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，还原剂是2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。在一些实施方案中，微生物裂解溶液中还原剂的浓度为约10mM至20M、约15mM至15M、约50mM至14M、约100mM至14M或约1 10mM至15M，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，微生物裂解反应物中还原剂的浓度为约1mM至100mM、约10mM至90mM、约20mM至80mM、约30mM至70mM、约40mM至60mM或约45mM至55mM，或者在任意两个先前公开的浓度之间。
在一些实施方案中，还原剂以干燥或压成丸的形式储存，其中在各还原剂重悬之后，还原剂达到以上确定的浓度。
在一些实施方案中，微生物细胞裂解反应在低于约9的pH下进行。在一些实施方案中，微生物细胞裂解反应在约6至9的pH下进行。
在一些实施方案中，微生物细胞裂解反应在约中性pH下进行。在一些实施方案中，本文中公开的微生物细胞裂解方法实现了高分子量微生物DNA的释放。不希望超出理论范围，在一些实施方案中，本文中公开的微生物细胞裂解方法实现了降低在微生物细胞裂解期间微生物遗传物质的剪切并促进了裂解溶液中高分子量微生物DNA的存在。在一些实施方案中，高分子量微生物DNA为约2kbp至200kbp、约10kbp至190kbp、约20kbp至180kbp、约30kbp至170kbp、约40kbp至160kbp、约50kbp至150kbp、约60kbp至140kbp、约70kbp至130kbp、约80kbp至120kbp或约90kbp至110kbp。
微生物基因组物质的分离
在裂解了基于血液的溶液的微生物内容物之后，在一些实施方案中，优选从样品的非DNA组分中分离或纯化微生物基因组DNA(在本文中为“gDNA”)。与采用添加离液盐(chaotropic salt)以实现相同目的的大多数现有方法相反，我们优选的方法需要使用阴离子交换树脂来捕获游离微生物gDNA，并从系统中洗去非DNA组分。在洗脱之后，并且在一些实施方案中，分离的gDNA具有的优点是具有足够的纯度，使得不需要在下游酶促扩增之前对其进行稀释。
在一些实施方案中，在微生物细胞裂解之后，分离和/或纯化微生物遗传物质。在一些实施方案中，经分离和/或纯化的遗传物质是RNA或DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。
在一些实施方案中，通过使微生物裂解反应溶液与填充到柱中的阴离子交换材料接触来分离微生物遗传物质，其中该阴离子交换材料用于吸附和随后洗脱微生物遗传物质。在一些实施方案中，已知离子强度和pH的溶液能够使核酸与阴离子交换柱结合，并使得能够将结合较少的污染物洗掉。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，用于使微生物遗传物质与阴离子交换材料选择性结合的条件包括在一种或更多种以下条件下使微生物裂解反应溶液与阴离子交换柱接触：接触反应在约6至9、约4.5至7或约8至9.5的pH下进行，以及接触反应的一价盐浓度为约100mM至750mM、约450mM至1.75M或约50mM至350mM。然后，去除污染物后可以洗脱结合的遗传物质。在一些实施方案中，阴离子交换树脂用于捕获/固定微生物基因组物质。在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种弱阴离子交换树脂(WAX)。WAX的实例包括但不限于羧甲基(CM)、二乙基氨基丙基(ANX)、二乙基乙醇胺(DEAE)、Amberlite Ira67、Purolite A847、Amberlite Ira96、Amberlite IRA96SB、Dowex Marathon WBA、Dowex Upcore Mono WB-500、Purolite A835、Dowex Monosphere 77和Dowex Monosphere 66。在一些实施方案中，WAX树脂包含叔胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种强阴离子交换树脂(SAX)。SAX的实例包括但不限于-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3、Amberjet Up4000、Amberjet 9000 OH、Amberlite FPA40 Cl、和Dowex Upcore Mono MA-600。在一些实施方案中，基于SAX的树脂包含季胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是WAX和SAX的组合。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂的形式选自纤维、膜、吸着剂、凝胶和滤纸。在一些实施方案中，使具有经裂解真核细胞的样品通过阴离子交换树脂或与阴离子交换树脂接触。在一些实施方案中，阴离子交换树脂在溶液中。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂与支持基底缀合。支持基底的实例包括但不限于颗粒、珠、表面或球体。在一些实施方案中，支持基底是磁性的，例如磁性颗粒或磁珠。在一些实施方案中，阴离子交换树脂在溶液中与支持基底缀合。
在一些实施方案中，支持基底包含二氧化硅、玻璃、金属、基于聚苯乙烯的材料、基于纤维素的材料、基于琼脂糖的材料、基于葡聚糖的材料、基于甲基丙烯酸酯的材料、基于琼脂糖的材料或其组合。在一些实施方案中，支持基底是多孔的。
在一些实施方案中，支持基底是珠或球体，其直径为约10至100μm、约20至90μm、约30至80μm、约40至70μm或约50至60μm。
在另一个实施方案中，支持基底是珠或球体，其直径为约0.1至10μm、约1.0至9.0μm、约2.0至8.0μm、约3.0至7.0μm或约4.0至6.0μm。
在一些实施方案中，将微生物裂解反应物与阴离子交换树脂一起孵育约0.1至10分钟、约2至9分钟、约3至8分钟、约4至7分钟或约5至6分钟。在一些实施方案中，将微生物裂解反应物与阴离子交换树脂一起孵育约10至30分钟、约12至28分钟、约15至25分钟、约18至23分钟或约19至22分钟。在一些实施方案中，将微生物裂解反应物与阴离子交换树脂一起孵育少于1分钟。
在一些实施方案中，将微生物裂解反应物与阴离子交换树脂一起孵育约0.01至10分钟、约0.1至9分钟、1至8分钟、约2至7分钟、3至6分钟或约4至5分钟，这超出了裂解微生物细胞所需的时间。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂被恒定地固定在支持基底上。在一些实施方案中，使固定的阴离子交换树脂与混合物接触和/或孵育，并随后去除混合物。
在一些实施方案中，使与支持基底例如珠或颗粒(例如微粒)缀合的至少一种阴离子交换树脂与混合物接触和/或孵育。在一些实施方案中，在与微生物裂解反应物接触和/或孵育之后，从微生物裂解反应物中去除与支持物基底缀合的阴离子交换树脂。在另一个实施方案中，在与微生物裂解反应物接触和/或孵育之后，将与支持物基底缀合的阴离子交换树脂固定并去除微生物裂解反应物。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，当支持基底为已磁化的珠或金属珠并且该已磁化的珠或金属珠暴露于磁体或磁场时，与支持基底缀合的阴离子交换树脂被选择性地固定。
在一些实施方案中，珠或颗粒被填充到柱中。在一些实施方案中，珠或颗粒为自由漂浮(free floating)形式。
在一些实施方案中，阴离子交换微粒是与可磁化微球结合的弱阴离子交换材料。在一些实施方案中，阴离子交换微粒是与可磁化微球结合的强阴离子交换材料。
在一些实施方案中，阴离子交换微粒是与多孔的基于琼脂糖的微球结合的弱阴离子交换材料。在一些实施方案中，阴离子交换微粒是与多孔的基于琼脂糖的微球结合的强阴离子交换材料。
在一些实施方案中，在使微生物遗传物质与阴离子交换微粒结合之后，使用洗涤缓冲液或洗涤溶液洗涤阴离子交换微粒。
在一些实施方案中，与微生物遗传物质结合期间的盐浓度相比，洗涤溶液的盐浓度升高。在一些实施方案中，改变洗涤条件的pH以实现更严格的洗涤条件。在一些实施方案中，洗涤溶液的pH为约3.0至7.5、约3.5至7.0、约4.0至6.5、约4.5至6.0或约5.0至5.5。
在一些实施方案中，洗涤溶液的盐浓度为约0.5M至3.0M、约0.75M至2.75M、约1.0M至2.5M、约1.25M至2.25M或约1.5M至2.0M。
在一些实施方案中，更显碱性的洗涤溶液是优选的。在一些实施方案中，洗涤溶液的pH为约9.5至10.5、约10.0至11.0、约10.5至11.5、约11.0至12.0或约11.5至12.5。在一些实施方案中，更显碱性的溶液的盐浓度小于约0.5M、约0mM至100mM、50mM至200mM、100mM至300mM或约200mM至500mM。
在一些实施方案中，洗涤溶液包含一种或更多种表面活性剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，表面活性剂包括但不限于吐温和Triton-X。在一些实施方案中，吐温和/或Triton-X浓度为约0.01％至1.0％(v/v)、约0.1％至0.9％(v/v)、约0.2％至0.8％(v/v)、约0.3％至0.7％(v/v)或约0.4％至0.6％(v/v)。在一些实施方案中，洗涤溶液包含一种或更多种洗涤剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，洗涤剂包括但不限于两性离子洗涤剂。在一些实施方案中，两性离子洗涤剂浓度为约0.1×至350×CMC、约1.0×至300×CMC、约10×至250×CMC、约50×至200×CMC或约100×至150×CMC。
在一些实施方案中，用于分离微生物DNA的方法包括洗脱步骤。在一些实施方案中，通过从阴离子交换微粒上洗脱或去除DNA来促进分离过程的竞争。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约12至13.5。在本领域中，使用pH大于约12的洗脱缓冲液并不常用。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含缓冲剂，例如磷酸钠或磷酸钾。在一些实施方案中，磷酸钠或磷酸钾的浓度为约0.01M至1M、约0.1M至1.8M、约0.4M至1.6M、约0.8M至1.4M或约1.0M至1.2M。在一些实施方案中，不需要缓冲剂。
作为补充或替代，在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含氢氧化钠或氢氧化钾。在一些实施方案中，氢氧化钠或氢氧化钾的浓度为约10至500mM、约30至450mM、约50至400mM、约70至350mM、约90至300mM、约110至250mM或约130至200mM。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液还包含一种或更多种一价盐。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，一价盐包括但不限于NaCl、KCl和LiCl。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液中的一种或更多种一价盐的浓度为约0mM至200mM、约25mM至175mM、约50mM至150mM、约75mM至125mM或约90mM至110mM。在本领域中，使用一价盐浓度小于约200mM的洗脱缓冲液并不常用。在一些实施方案中，洗脱缓冲液不包含任何一价盐。
在一些实施方案中，微生物遗传物质的分离还包括核酸(例如，DNA或RNA)纯化步骤。在一些实施方案中，纯化步骤包括使用离液盐。
在一些实施方案中，核酸纯化步骤包括添加约6M至9M的氯化胍或硫氰酸胍。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，纯化允许核酸与基于二氧化硅的固相材料有效结合，所述基于二氧化硅的固相材料例如滤器/膜、嵌入在重力柱或旋转柱(spin column)中的滤器/膜，或者珠/微球/磁性颗粒。在一些实施方案中，固相材料的后续洗涤进一步去除了大多数剩余的盐和其他滞留(hold-over)组分。在一些实施方案中，使用富盐、基于醇的缓冲液完成洗涤。在一些实施方案中，添加少于2M的氯化胍或硫氰酸胍。
在一些实施方案中，通过添加pH大于约5.0的基于水的溶液来洗脱以上分离的微生物遗传物质。在一些实施方案中，通过添加pH为约6至9的基于水的溶液来洗脱分离的微生物遗传物质。在一些实施方案中，通过添加pH大于约10的基于水的溶液来洗脱分离的微生物遗传物质。
在一些实施方案中，从阴离子交换树脂洗脱基因组物质后，不需要另外的纯化或脱盐。
在一些实施方案中，从阴离子交换树脂洗脱之后，使用尺寸排阻膜浓缩和/或纯化gDNA。在一些实施方案中，通过对阴离子交换树脂施加一个或更多个结合、洗涤和/或洗脱步骤来浓缩和/或纯化gDNA。在一些实施方案中，浓缩和/或纯化包括以下中的一个或更多个：(i)一个或更多个结合步骤；一个或更多个洗涤步骤；以及一个或更多个洗脱步骤。本领域技术人员将根据最佳操作的要求修改过程以满足纯度和体积限制。尽管有以上所述，该过程以及用于制备试剂的过程在WO2016044621A1中进行了详细说明。
微生物基因组物质的酶促扩增
在一些实施方案中，优选酶促扩增微生物遗传物质(微生物gDNA)。在一些实施方案中，对分离的微生物遗传物质进行扩增。在一些实施方案中，扩增的遗传物质是RNA或DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dDNA)。在一些实施方案中，DNA是核糖体DNA(rDNA)。在一些实施方案中，扩增对微生物的物种或属具有特异性的微生物遗传物质。
在一些实施方案中，可以通过等温扩增或热循环扩增过程来实现酶促扩增。在一些实施方案中，聚合酶链反应或PCR是酶促扩增的优选方法，其是公知的基于热循环的酶促扩增方法。
在一些实施方案中，进行单个扩增反应，例如，不将gDNA分成多于一份的反应物。不希望受理论束缚，这可以提高灵敏度。
在一些实施方案中，优选对于待测定的整个范围病原体利用引物对的最小集合，例如rDNA引物。不希望受理论束缚，这已经显示出提高灵敏度，并降低特定基因组区域的扩增偏差。作为实例但不限于此，如果使用者选择利用rDNA分析表1至3和5中标示的整个组，则合适的引物混合物可包含用于扩增细菌gDNA的单个引物对和用于扩增真菌gDNA的单个引物对。在一些实施方案中，来自表4的一个或更多个靶标的添加将需要一个或更多个引物对。在一些实施方案中，引物结合位点在所有靶标微生物中高度保守。用于扩增目的保守区的引物对是本领域技术人员公知的。设计用于特定基因组区域的引物对也是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，可以使用以下引物中的一些或全部：
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在一些实施方案中，扩增子大于约400bp。在一些实施方案中，扩增子为约400至4000bp、约700至3700bp、约1000至3400bp、约1300至3100bp、约1600至2700bp、约1900至2400bp或约2100至2200bp。在一些实施方案中，使用以上公开的长度的扩增子对于本文中公开的方法中的下游处理(例如，微生物遗传物质的检测和鉴定)是有利的。
在一些实施方案中，扩增产物是经纯化的。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，用于纯化扩增产物的方法包括将与离液盐组合的扩增子可逆地结合或吸收到玻璃或二氧化硅纤维或颗粒上，然后对其进行洗涤和洗脱。在一些实施方案中，纯化方法包括但不限于在基于醇的溶液(例如，乙醇或异丙醇)中沉淀，与阴离子交换树脂或尺寸排阻滤器接触。在一些实施方案中，扩增产物的净化去除了可能干扰下游过程的过多引物、dNTP、盐和其他组分。
在一些实施方案中，不需要纯化过程，并且扩增产物/溶液可以照原样用于下游过程中。
在一些实施方案中，通过PCR扩增微生物遗传物质，并修改PCR循环数以针对样品输入量、样品类型和/或微生物负荷评估进行调整。在一些实施方案中，通过等温扩增来扩增微生物遗传物质，并修改扩增时间以针对样品输入量、样品类型和/或微生物负荷评估进行调整。
尽管有以上所述，该过程以及用于制备试剂的过程在WO2016/044621A1中进行了详细说明。
扩增的基因组物质的基于DIANA的捕获和/或固定
在一些实施方案中，使所扩增的微生物遗传物质与多种DIANA接触或孵育，并检测扩增的微生物遗传物质。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质(例如，扩增的微生物DNA)的孵育在约20℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约25℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约30℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约37℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约45℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约55℃至65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质的孵育在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃的温度下进行。在一些实施方案中，DIANA与微生物遗传物质(例如，扩增的微生物DNA)的孵育在约65℃至99℃的温度下进行。
本文提供的方法提供了在10分钟或更短的时间内，在高于25℃的DIANA降低温度下侵入DIANA的方法。如以下更详细地描述的，对于持续10分钟或更短的侵入反应，使用低于65℃的侵入温度是新的并且是有利的。
在一些实施方案中，侵入反应持续约0.1至5分钟、约1至10分钟、约5至30分钟或约10至60分钟。在一些实施方案中，侵入反应持续少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟，例如1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。
在一些实施方案中，在WO 2016/044621A1中描述了DIANA侵入溶液(invasionsolution)的组成。
在一些实施方案中，侵入溶液包含缓冲剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，缓冲剂包括但不限于tris、磷酸钠和磷酸钾。
在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约1mM至500mM、约50mM至450mM、约100mM至400mM、约150mM至350mM或约200mM至300mM。在一些实施方案中，不需要缓冲剂。在一些实施方案中，侵入溶液的pH为约pH 6至约pH 9。
在一些实施方案中，侵入溶液包含一种或更多种一价盐。在一些实施方案中，一价盐是NaCl或KCl。在一些实施方案中，一价盐的浓度为约1mM至150mM、约5mM至145mM、约15mM至130mM、约25mM至115mM、约35mM至100mM、约45mM至85mM或约55mM至70mM。在一些实施方案中，侵入溶液不包含一价盐。所公开的侵入测定的盐浓度低于标准杂交测定中使用的盐浓度。
在一些实施方案中，侵入溶液包含一种或更多种表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂降低非特异性结合。作为实例，但不作为限制，表面活性剂包括但不限于吐温-20或TritonX-100。在一些实施方案中，侵入溶液中表面活性剂的浓度为约0.01％至1.0％(v/v)、约0.1％至0.9％(v/v)、约0.2％至0.8％(v/v)、约0.3％至0.7％(v/v)或约0.4％至0.6％(v/v)。
在一些实施方案中，侵入溶液包含改变排除体积的组分(例如，拥挤剂(crowdingagent))。作为实例，但不作为限制，拥挤剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)、EG-200、EG-250、EG-300、EG-400、EG-500、EG-750、EG-1,000、EG-9,500、EG-2,000、EG-4,000、EG-5,000、EG-6,000、EG-8,000、EG-10,000、EG-12,000、EG-13,000、EG-20,000、葡聚糖(DX)、聚乙烯醇(PVA)、Ficoll(FC)、DX-1,000、DX-5,000、DX-12,000、DX-50,000、DX-80,000、PVA 89k-98k、PVA 85k-124k、PVA 130k、PVA 31k-50k、PVA 50k-80k、PVA 70k-100k、PVA 90k-120k、PVA170k-250k、PVA 61k、PVA 31k、PVA 130k、PVA 67k、PVA 27k、PVA 25k、FC-400、FC-70、FC-40、甘油、葡萄糖和蔗糖。在一些实施方案中，侵入溶液中拥挤剂的浓度范围为侵入溶液总体积的约1％至20％(v/v)、约3％至17％(v/v)、约6％至14％(v/v)或约9％至11％(v/v)。在一些实施方案中，侵入溶液包含一种或更多种DNA变性剂。作为实例，但不作为限制，DNA变性剂包括但不限于DMSO、甲酰胺和甜菜碱。
在一些实施方案中，侵入溶液还包含DMSO、甲酰胺、甜菜碱或其组合。在一些实施方案中，DMSO和/或甲酰胺为侵入溶液总体积的约1％至30％(v/v)、约5％至25％(v/v)、约10％至20％(v/v)或约14％至16％(v/v)。在一些实施方案中，侵入缓冲液中甜菜碱的浓度为约0.1M至2.5M、约0.5M至2.0M或约1.0M至1.5M。
在一些实施方案中，侵入溶液的pH为约10或更高。在一些实施方案中，pH大于约10的侵入溶液有利于DNA变性或去稳定化。
洗涤
在一些实施方案中，在DIANA侵入之后进行洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤步骤降低了非特异性结合。在一些实施方案中，洗涤使用高温洗涤溶液。在一些实施方案中，洗涤溶液的温度为约60℃至99℃或20℃至65℃。优选的DIANA洗涤缓冲液的组成描述于WO2016/044621A1中。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含以下中的一种或更多种：1)一价盐，例如如NaCl或KCl，其为约50至650mM、约100至600mM、约150至550mM、约200至500mM、约250至450mM或约300至400mM；2)缓冲至接近中性pH，例如约6至9；和3)表面活性剂，例如吐温-20或Triton X-100，其为约0.1％至1.0％(v/v)、约0.2％至0.9％(v/v)、约0.3％至0.8％(v/v)、约0.4％至0.7％(v/v)或约0.5％至0.6％(v/v)。在一些实施方案中，洗涤缓冲液被加热。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含一种或更多种DNA去稳定剂或变性剂，例如DMSO、甜菜碱和甲酰胺。在一些实施方案中，DMSO和/或甲酰胺为侵入溶液总体积的约10％至30％(v/v)、约15％至25％(v/v)、约10％至20％(v/v)或约14％至16％(v/v)。在一些实施方案中，侵入缓冲液中甜菜碱的浓度为约0.1M至2.5M、约0.5M至2.0M或约1.0M至1.5M。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液的pH高于9.0，并且包含约0mM至300mM、约50mM至250mM、约100mM至200mM或约125mM至175mM的一价盐和/或表面活性剂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液的pH低于9.0，并且包含约0mM至800mM、约50mM至750mM、约100mM至700mM、约150mM至650mM、或约200mM至600mM、约250mM至550mM、约300mM至500mM或约350mM至450mM的一价盐和/或表面活性剂。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，洗涤步骤包括洗涤大小为约14至18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度定义为约：TM(DNA)+20℃，并且较高的洗涤温度为99℃。
在一些实施方案中，用于浸入和洗涤的优选温度由DIANA探针的长度、其基本组成(即GC含量)以及反应发生的条件决定。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，DIANA侵入反应的速率受到目的双链体DNA区域可以被有效地“打开”从而暴露出核碱基的限制。因此，温度的升高只是发挥作用的一个参数，添加试剂也发挥作用。此外，关于洗涤条件，并且不希望受理论束缚，在一些实施方案中，DIANA洗涤条件至少取决于DIANA探针与靶DNA的结合强度。另外，诸如温度、电解质、pH、其他添加剂的参数在建立最佳条件中发挥着重要作用。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA侵入过程包括使用大于18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的侵入温度定义为约：TM(DNA)+0.7℃×(碱基数)，并且较高的侵入温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA侵入过程包括使用小于/短于14个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的侵入温度定义为：TM(DNA)+1.1℃×(碱基数)，并且较高的侵入温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，洗涤步骤包括洗涤大于18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度定义为：TM(DNA)+0.9℃×(碱基数)，并且较高的洗涤温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，洗涤步骤包括洗涤小于/短于14个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度定义为：TM(DNA)+1.25℃×(碱基数)，并且较高的洗涤温度为99℃。
低温DIANA侵入和洗涤
不希望受理论束缚，侵入的过程类似于杂交的过程，其中结合主要是由于沃森-克里克碱基配对法则，但不限于此。通过指出这一点，目的是强调侵入的先决条件是“接近”核碱基，其在双链体DNA(局部地或普遍地，和以下讨论的)的情况下大多数情况下是“隐藏的”。
不希望受理论束缚，DIANA侵入的速率限制步骤是打开双链体DNA从而使核碱基可用以进行侵入的能力。“打开”并不一定意味着DNA变性，而是所谓的DNA呼吸(DNAbreathing)增加，其中在双链体DNA内形成局部、瞬时的泡。随着呼吸的增加，这些泡变得(1)更频繁、(2)更常见、(3)寿命更长(即稳定)和(4)更大。DNA呼吸是天然的、物理的过程，其描述了负糖磷酸骨架和氢键的竞争能量学，所述氢键是核碱基与碱基对堆积相互作用之间的氢键。DNA呼吸可能与系统中存在或不存在DIANA无关。
本领域已知的DIANA侵入方法通常描述了使用37℃或更低的温度。在这样的温度下，侵入极其缓慢-以小时为尺度。在向环境温度移动的甚至更低的温度下，DNA侵入变得更加缓慢。显然，在快速诊断技术领域中存在对更快速侵入的需求。
最近已经描述了在1至10分钟的时间框架内能够实现快速且高效地DNA侵入的反应条件。这些方法在WO 2016/044621A1中公开。WO 2016/044621A1中公开的方法在高于约65℃的温度下可以是有用的(参见从第[0248]段开始的部分)。
本文公开了用于在某些条件下将侵入温度进一步降低至65℃同时仍满足10分钟以下(实际上是5分钟以下)的时间框架的方法。这些方法采用了使用DIANA技术，主要是单链DNA或RNA。这在以前没有进行过描述。
在一些实施方案中，靶DNA或RNA主要是单链的。在一些实施方案中，局部诱导双链结构以产生优选条件。RNA是天然的单链，而DNA是天然的双链。在一些实施方案中，对双链DNA进行处理以产生单链DNA。处理步骤包括但不限于酶促、化学或机械处理。其他处理方法在本领域中是公知的。
一旦有了单链DNA或RNA靶分子，局部双链体或发夹结构即可稳定。这可以通过提高反应混合物中的电解质浓度来实现。在一些实施方案中，向侵入溶液添加电解质。
在一些实施方案中，向侵入溶液添加一价盐。在一些实施方案中，以高于50mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以100mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以200mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中、以约50mM、51mM、55mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、125mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、175mM、180mM、190mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、450mM或500mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以51mM至500mM、51mM至250mM、51mM至100mM或100mM至200mM的浓度添加一价盐。
在一些实施方案中，向侵入溶液添加二价盐。在一些实施方案中，以高于5mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以7mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以10mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM或25mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以6mM至50mM、6mM至25mM、6mM至10mM或10mM至20mM的浓度添加一价盐。
在一些实施方案中，向侵入溶液添加三价盐。在一些实施方案中，以高于0.1mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以0.3mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以0.5mM或以上的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、2.0mM或2.5mM的浓度添加一价盐。在一些实施方案中，以0.2mM至1.0mM、0.2mM至0.7mM、0.2mM至0.5mM或0.5mM至1.0mM的浓度添加一价盐。
在另一些实施方案中，可以在不稳定条件下以固有的双链体核酸分子在降低的温度下以高速完成侵入。不希望受理论束缚，本文中所述的条件并不意味着实现DNA模板的完全变性，而意味着足够的不稳定以使侵入温度降低。这些条件的确切性质除双链体靶标的长度之外，还取决于如WO 2016/044621A1中确定的和本文中所述的关于变性剂和电解质浓度所使用的反应溶液。
在一些实施方案中，侵入溶液的pH(缓冲的或非缓冲的)为约10.2至12.2。在一些实施方案中，pH为约10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1或12.2。在一些实施方案中，pH为10.2至11.0。在一些实施方案中，pH为10.5至11.5。在一些实施方案中，pH为11.0至12.0。在一些实施方案中，pH为10.2或以上。在一些实施方案中，pH为10.5或以上。在一些实施方案中，pH为11.0或以上。在一些实施方案中，pH为11.5或以上。在一些实施方案中，优选的pH针对特定的数据目标、反应添加剂、靶标长度和GC组成以及优选的温度范围进行了优化。
在一些实施方案中，用于去除DIANA与DNA的非特异性结合的洗涤溶液同样可以在25℃至65℃的温度下使用。在一些实施方案中，前述洗涤溶液的pH(缓冲的或非缓冲的)为约10.7至12.7。在一些实施方案中，pH为约10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.4、12.4、12.5、12.6或12.7。在一些实施方案中，pH为10.7至11.5。在一些实施方案中，pH为11.0至11.8。在一些实施方案中，pH为11.3至12.0。在一些实施方案中，pH为11.7至12.7。在一些实施方案中，pH为10.7或以上。在一些实施方案中，pH为11.0或以上。在一些实施方案中，pH为11.5或以上。在一些实施方案中，pH为12.0或以上。在一些实施方案中，优选的pH针对特定的数据目标、反应添加剂、靶标长度和GC组成、DIANA长度以及优选的温度范围进行了优化。
检测
在一些实施方案中，DIANA与其各自靶标的结合的检测是通过检测区中的光学、化学、电学或机械检测方法进行的。用于检测DIANA与其各自靶标的方法描述于WO 2016/044621A1中。
在一些实施方案中，光学检测是通过使用荧光或发光进行。
在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记定位在侵入的DIANA上。在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记定位在经由固定的寡聚体捕获的DNA扩增子上。在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记定位在一些或所有潜在靶标通用的第二寡聚体上。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，可检测标记包括但不限于荧光染料、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶、甲氧基香豆素、丹酰、芘、Alexa Fluor 350、AMCA、Marina Blue染料、dapoxyl染料、二烷基氨基香豆素、bimane、羟基香豆素、cascade blue染料、Pacific Orange染料、Alexa Fluor 405、Cascade Yellow染料、Pacific Blue染料、PyMPO、Alexa Fluor 430、荧光素、Alexa Fluor 488、Oregon Green 488、BODIPY493/503、Oregon Green 514、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、BODIPY TMR、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、BODIPY 558/568、罗丹明红染料、Alexa Fluor 568、BODIPY 581/591、Alexa Fluor 594、德克萨斯红染料、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 750和Alexa Fluor 790。
作为实例，但不作为限制，能够间接检测的可检测标记包括但不限于地高辛配基(DIG)、生物素或二硝基苯基。
在一些实施方案中，微生物物种的鉴定是通过DNA扩增子标记进行的。
在一些实施方案中，在扩增过程开始之前，用可检测标记标记扩增中所用的引物。
在一些实施方案中，在扩增过程中使用包含标签或被修饰成实现下游标签缀合的经修饰核苷酸。作为实例，但不作为限制，经标签修饰的核苷酸包括但不限于经二乙基氨基香豆素(DEAC)、花青3(Cy3)、花青5(Cy5)、荧光素(FITC)、丽丝胺(Lissamine)、R110、R6G、四甲基罗丹明(TAMRA)或德克萨斯红染料修饰的核苷酸。能够进行后续标记的经修饰核苷酸的实例可以是但不限于经氨基-地高辛配基(DIG)、生物素或二硝基苯基(DNP)修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，DNA扩增子的标记通过随后与嵌入染料一起孵育来实现。作为实例，但不作为限制，嵌入染料包括但不限于PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Safe、TOTO-1、YOYO-1、YOYO-3、POPO-1、BOBO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3、SYTOX-Blue、SYTOX-Green、SYTOX-Orange、SYTOX-Red和EtBr。
在一些实施方案中，首先用一种或更多种DIANA标记DNA扩增子，然后将杂交复合体捕获到固相表面上。
在一些实施方案中，在捕获扩增子之前，将DIANA与固体表面一起孵育。
在一些实施方案中，固相表面是珠、纳米颗粒、微粒或平坦基底。在一些实施方案中，固相表面被进一步化学修饰成促进DIANA与其的结合。
在一些实施方案中，检测区是例如在相同孔、管或室中，或者流体盒中的相同区域中进行DIAA侵入/洗涤过程的相同区域。在另一些实施方案中，检测区是与进行DIANA侵入/洗涤过程的区域不同的区域。
在一些实施方案中，本文中所述的方法的检测限(LOD)为1至100CFU/ml。在一些实施方案中，本文中所述的方法的LOD为1至50CFU/ml。在一些实施方案中，本文中所述的方法的LOD为1至10CFU/ml。在一些实施方案中，LOD小于1CFU/ml。
在一些实施方案中，样品的体积影响该方法的LOD。作为实例，但不作为限制，输入的样品体积的增加将允许检测更稀有的微生物，从而提高了LOD测量的灵敏度。
在一些实施方案中，所有类型的微生物具有类似的LOD，而在另一些实施方案中，各个LOD可能不同。
在一些实施方案中，使用每单位体积的CFU或菌落形成单位的标准可能无法测量微生物的检测限，因为微生物可能(1)未形成菌落，或(2)可能不可培养。
血流感染
在一些实施方案中，本文中公开的允许使用DIANA鉴定和评价微生物物种的方法被优化用于检测血流感染(BSI)。正如本文所讨论的，由于可能会阻碍下游处理(例如PCR)的血液组分，因此在BSI的情况下检测微生物面临着独特的挑战，而由于血液中微生物的频率较低，因此检测BSI通常需要大的血液体积而使这一挑战放大。
本文中所述的方法包括血液处理中的数个创新性步骤，以允许有效分离和扩增微生物DNA，从而允许使用DIANA进行最佳检测。这些包括(i)提高所提取的微生物DNA的长度；(ii)使用离子交换技术；以及(iii)从全血样品中有效分离人DNA。在一些实施方案中，相对于本领域已知方法，所提取的微生物DNA的长度增加。不希望受理论束缚，这是因为高分子量微生物DNA(gDNA)提高PCR灵敏度。在一些实施方案中，使用离子交换技术。在一些实施方案中，高分子量gDNA通过离子交换与低分子量gDNA分离。通过利用DNA固有的高电荷主链作为排除标准，离子交换剂不仅使gDNA与非DNA组分分离，而且同样使高分子量gDNA与较短的DNA片段区别开来。在一些实施方案中，从全血中去除大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％或大于99.9％的人DNA。已经开发了无需离心即可从全血样品中去除hDNA的简单、高效的方法。组合起来，这些方法可有效克服使用未经稀释提取物时PCR抑制的问题，同时降低低分子量污染DNA的背景扩增。整个过程有效、稳健且可重现，但在直接从全血中产生纯的、PCR-准备的gDNA中可以足够简单以容易地转换为自动化。
微生物负荷的量化
在一些实施方案中，本文中所述的方法包括监测微生物(例如病原体)的负荷。这可用于例如以下情况：测量对象中随时间的一种或多种微生物负荷，监测感染的过程，或者观察微生物对治疗干预(例如抗生素或抗真菌剂)的响应。在一些实施方案中，本文中所述的方法提供了定量测量微生物负荷的能力，即，该方法提供了输入的病原体负荷与信号输出之间的直接相关性。在一些实施方案中，本文中所述的方法提供了半定量测量微生物负荷的能力。
在一些实施方案中，测量微生物负荷的能力在临床、医学或科学上是有用的。
在一些实施方案中，随时间例如在多个时间点，例如在第一和第二时间点，测量微生物负荷。在一些实施方案中，在第一和第二时间点测量微生物负荷可以允许在对象中监测感染的过程或对治疗的响应。在一些实施方案中，微生物(例如病原体)负荷的提高指示对象患有恶化的感染。在一些实施方案中，微生物例如病原体负荷的提高指示对象有未改善的感染。在一些实施方案中，微生物(例如病原体)负荷没有变化指示对象患有未能解决的感染。在一些实施方案中，如果对象正在接受例如用抗微生物剂的治疗，则微生物(例如病原体)负荷的提高指示微生物物种不对抗微生物剂易感。在一些实施方案中，如果对象正在接受例如用抗微生物剂的治疗，则微生物(例如病原体)负荷的降低指示微生物物种对抗微生物剂易感。关于微生物负荷的具体响应取决于化合物-宿主-微生物的关系。在一些实施方案中，第二时间点在第一时间点之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时。
在一些实施方案中，测量微生物负荷可用于测量微生物物种对离体的治疗剂例如抗微生物剂的易感性。在一些实施方案中，如本文中所述从对象获取例如获得样品。在一些实施方案中，在暴露于抗微生物剂之后，测量样品中的微生物负荷，然后在同一样品中在第二时间点测量微生物负荷。
在一些实施方案中，样品可以分成多份样品，例如等分试样。在一些实施方案中，将样品分成1、2、3、4、5、6或更多个等分试样。在一些实施方案中，将样品分成多个等分试样，并在未经处理的样品中测量微生物负荷。在一些实施方案中，将样品分成多个等分试样，并且用抗微生物剂处理一个或更多个等分试样，之后测量微生物负荷。
在一些实施方案中，在用抗微生物剂处理之后10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1小时10分钟、1小时20分钟、1小时30分钟、2小时、2小时30分钟、3小时、4小时、5小时、6小时或7小时，测量用抗微生物剂处理的样品中的微生物负荷。
可以将用抗微生物剂处理的样品的微生物负荷与处理之前的相同样品的微生物负荷或者与来自处理之前或未经处理的相同来源的不同样品的微生物负荷进行比较，以评估抗微生物剂对微生物物种的影响。在一些实施方案中，暴露于抗微生物负荷之后微生物负荷降低指示该微生物物种对抗微生物剂易感。在一些实施方案中，暴露于抗微生物剂之后微生物负荷提高或微生物负荷没有变化指示该微生物物种对抗微生物剂不易感或具有抗性。
抗微生物剂包括例如氨苄西林、阿莫西林、金霉素、杆菌肽、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢克洛、头孢氨苄、头孢拉定、环丙沙星、克拉维酸、氯唑西林、双氯西林、红霉素、氟氯西林、庆大霉素、短杆菌肽、甲氧西林、新霉素、苯唑西林、青霉素、万古霉素、卡泊芬净、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和咪康唑。
在一些实施方案中，抗微生物剂是抗生素。在一些实施方案中，抗生素可以是与以下的抗生素种类有关的化合物：青霉素、四环素、头孢菌素、喹诺酮、林可霉素、大环内酯、磺酰胺、糖肽、氨基糖苷和/或碳青霉烯。在一些实施方案中，抗生素可以来自替代的抗生素种类。
在一些实施方案中，抗微生物剂是抗真菌剂。在一些实施方案中，抗真菌剂可以是与来自以下的抗真菌剂种类有关的化合物：唑类、烯丙胺类、棘球白素类、核苷类似物和/或多烯类。在一些实施方案中，所选抗真菌剂可选自替代的抗真菌剂种类。
在一些实施方案中，通过校准过程确定初始样品中存在的微生物的量、浓度或数目。这与需要培养的方法以及用非集成方法的其他分子方法形成对比。
在一些实施方案中，校准过程包括一个或更多个校准步骤。在一些实施方案中，对于给定的负荷输入范围(即1至100CFU/ml)的定量或半定量负荷评估的校准包括将使用本文中所述方法的DIANA侵入测定的结果与使用相同的输入(例如相同的输入量或已知的相对输入量)的菌落计数的结果进行比较。在一些实施方案中，对于给定的负荷输入范围的定量或半定量负荷评估的校准包括输入预定的细胞数量。在一些实施方案中，对于给定的负荷输入范围可完成的用于定量或半定量负荷评估的校准包括输入预定的gDNA数量。
在一些实施方案中，定量或半定量在特定输入负荷动态范围内是准确的，所述范围例如1与100至3,000之间、2与100至3,000之间、3与100至3,000之间、4与100至3,000之间、5与100至3,000之间、6与100至3,000之间、7与100至3,000之间、8与100至3,000之间、9与100至3,000之间、10与100至3,000之间、11与100至3,000之间、12与100至3,000之间、13与100至3,000之间、14与100至3,000之间、15与100至3,000之间、16与100至3,000之间、17与100至3,000之间、18与100至3,000之间、19与100至3,000之间、20与100至3,000之间、21与100至3,000之间、22与100至3,000之间、23与100至3,000之间、24与100至3,000之间、25与100至3,000之间、26与100至3,000之间、27与100至3,000之间、28与100至3,000之间、29与100至3,000之间或者30与100至3,000之间的CFU输入。在一些实施方案中，输出或信号动态范围为约10x与50x之间、约20x与100x之间、约30x与300x之间、约40x与400x之间、约50x与500x之间、约60x与600x之间、约70x与700x之间、约80x与800x之间、约90x与900x之间、约100x与1000x之间、约100x与1250x之间、约100与1500x之间、约100与1750x之间或约100x与2000x之间。
在一些实施方案中，通过改变输入体积和/或提高或降低酶促扩增步骤的输出或产率来调节输入负荷动态范围。作为实例，但不作为限制，如果输入为1至100CFU，在当前条件下重新校准的最佳PCR循环数为30，假设PCR循环效率为85％，则通过使用约20至22个PCR循环，250至2,500CFU的输入可以实现100x的类似动态范围。
在一些实施方案中，提高或降低酶促扩增步骤的输出或产率以在检测步骤中容纳更少或更多的DIANA探针。
在一些实施方案中，在检测步骤中使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种DIANA探针。在一些实施方案中，在检测步骤中使用多于20种DIANA探针。在一些实施方案中，在检测步骤中使用多于40种DIANA探针。在一些实施方案中，在检测步骤中使用多于80种DIANA探针。在一些实施方案中，在检测步骤中使用多于150种DIANA探针。在一些实施方案中，在检测步骤中使用多于500种DIANA探针。在一些实施方案中，此处限定的过程促进了利用15至25种DIANA探针作为系统的能力，同时实现了500至1,000x的动态范围检测。
在一些实施方案中，对所有待测试生物进行一次用于负荷评估的校准。在一些实施方案中，对所有待测试革兰氏阳性微生物进行一次用于负荷评估的校准。在一些实施方案中，对所有待测试革兰氏阴性微生物进行一次用于负荷评估的校准。在一些实施方案中，对所有待测试真菌进行一次用于负荷评估的校准。在一些实施方案中，对每个待测试属进行一次用于负荷评估的校准。在一些实施方案中，对每个待量化的生物进行用于定量负荷评估的校准。
在一些实施方案中，没有对不同样品类型进行单独的用于定量或半定量负荷评估的校准。在一些实施方案中，对不同样品类型(例如血液、尿等)进行单独的用于定量负荷评估的校准。在一些实施方案中，对具有可能影响测定读出的化合物(例如抗生素、抗凝剂、药物化合物等)的样品进行单独的用于定量负荷评估的校准。
在一些实施方案中，用于定量或半定量负荷评估的校准可以产生结果范围。作为实例，但不限于此，给定的输入负荷可以产生100±9的信号。
在一些实施方案中，在负荷输入与信号输出之间可以存在一个或更多个数学关系，例如线性、多项式、指数关系等。
在一些实施方案中，将测量多于一种的微生物物种，并且用于负荷评估的校准将以下因素中的一个或更多个考虑在内：相对裂解产率、相对扩增产率、用于扩增的靶区域的基因组拷贝、DIANA捕获/检测效率。在一些实施方案中，没有将这些因素中的任一个考虑在内。在一些实施方案中，将这些因素的子集考虑在内。在一些实施方案中，将这些因素全部考虑在内。一个非限制性实例是样品中存在两种病原体例如两种革兰氏阴性菌物种的情况。考虑到这些细菌被裂解的容易性，以及用于扩增两个物种的单个引物对，很可能只需要考虑目标基因组拷贝和DIANA捕获/检测效率。
在一些实施方案中，确定病原体负荷变化的能力可以在多种应用中使用，例如但不限于在药物/化合物开发过程中，临床试验的丰富化，监测体外治疗的性能，监测体内治疗的性能，确定是否要改变治疗或护理，建立化合物-病原体-宿主关系。
微生物谱
在一些实施方案中，将与负荷评估组合的、多微生物感染/接种的样品的无生长偏差检测定义为“微生物谱”。在一些实施方案中，微生物谱包括半定量或定量测定，其包含可以区分两种或更多种微生物的两种或更多种DIANA探针。
在一些实施方案中，该测定可以区分2或更多、5或更多、10或更多、20或更多、50或更多或者100或更多种微生物，例如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约50、约75、约100、约150、约225、约250、约350、约500、约750、约1,000、约1,500、约2,000或约2,500种微生物。在一些实施方案中，该测定可以区分2至2,250、约5至250、约10至225或约10至750种微生物。
在一些实施方案中，评估微生物谱的能力包括评估样本中一种或更多种微生物的相对微生物负荷的能力(微生物1的负荷相对于微生物2的负荷，等)。
在一些实施方案中，评估微生物谱的能力包括评估样本中一种或更多种微生物的绝对微生物负荷的能力(微生物1的负荷相对于微生物2的负荷，等)。
在一些实施方案中，评估微生物谱的能力包括评估样本中一种或更多种微生物的相对和绝对微生物负荷的能力(微生物1的负荷相对于微生物2的负荷，等)。
在一些实施方案中，评估微生物谱的能力可在临床、医学或科学上具有效用。
在一些实施方案中，确定由于处理、未经处理、时间、药物化合物等导致的微生物谱变化或其缺乏的能力可在临床、医学或科学上具有效用。
在一些实施方案中，确定微生物谱变化的能力可以在多种应用中使用，例如但不限于在药物/化合物开发过程中，临床试验的丰富化，监测体外治疗的性能，监测体内治疗的性能，确定是否要改变治疗或护理，建立化合物-病原体-宿主关系。
流体装置
在某些实施方案中，本文中所述的流体装置和方法涉及将相对大体积(例如，数毫升)的流体与微米级或毫米级流体通道接合的独特方法。例如，在一些实施方案中，本文中所述的装置包括一系列流体贮存器，其可以适于且布置成包含相对大量(例如，数毫升)的流体，例如试剂。每个流体贮存器可以与一个或更多个流体通道连接。该装置还可以包括一个或更多个与流体贮存器流体连通的气体室。例如，气体室可以用于对贮存器中的流体加压，以促进流体流入和/或流出流体通道。流体通道可以与流体枢纽连接，这可以有利于一种或更多种流体在两个或更多个流体贮存器之间流动。例如，流体枢纽可以包括一系列阀和/或通道，其将流体流引导至特定的贮存器以进行特定操作(例如，裂解、反应、分离、扩增、检测)。然后，可以通过将流体经由流体通道输送回流体枢纽并输送到不同的贮存器中来进行后续操作。在一些情况下，流体枢纽可以有利于将气体输送至一个或更多个贮存器，并且随后输送至一个或更多个气体室。如本文中所述的流体装置的使用可以有利于在不使用多个泵和/或压力源下使流体在两个或更多个贮存器之间输送。例如，在一些情况下，可以向流体装置施加恒定压力，并且可以依次打开多个阀，使得流体在两个或更多个流体贮存器之间输送(例如，无需调整、改变、或重定向压力)。
有利地，本文中所述的装置可以用于进行反应和/或步骤的特定组合，而不需要使用者干预(例如，自动或半自动)、吸移单独试剂或大规模实验室过程(例如，离心)。与用于样品检测和分析的流体装置相比，本文中所述的装置在一些情况下可以是独立的(例如，不需要专用仪器)。
在一些实施方案中，流体装置包含流体枢纽和多个流体贮存器。在一些实施方案中，流体装置包含多个流体枢纽和多个流体贮存器。在某些实施方案中，每个流体贮存器与从流体枢纽分支的分支通道连接。例如，如图1所示，流体装置100包含流体枢纽110和流体贮存器120，流体贮存器120与从流体枢纽110分支并且与流体枢纽110流体连通的分支通道125连接。在某些实施方案中，阀122可以定位在分支通道125和流体枢纽110之间。然而，在一些替代实施方案中，在分支通道和流体枢纽之间可以不存在阀。
在一些情况下，流体装置100包含经由分支通道105与流体枢纽110流体连通的流体贮存器115(例如，样品入口贮存器)。在一些这样的实施方案中，可以将流体引入样品入口贮存器中并经由流体枢纽输送至流体贮存器。例如，可以将流体引入流体贮存器115并输送至流体枢纽，随后通过打开阀122输送至分支通道125并输送至流体贮存器120。在一些实施方案中，可以在流体贮存器120中进行特定操作(例如，裂解、反应、分离、扩增、检测)。
在一些实施方案中，气体室可以与流体贮存器流体连通。例如，如图2所示，流体装置102包含与气体室190流体连通的流体贮存器120。在一些实施方案中，流体管道(例如，流体通道)195有利于气体室190和流体贮存器120之间的流体连通。在一些实施方案中，气体可以从气体室190流至流体贮存器120。在另一些实施方案中，气体可以从流体贮存器120流至气体室190。在一个示例性实施方案中，可以将气体引入流体枢纽110中并通过打开阀122输送至分支通道125，随后输送至流体贮存器120。在一些这样的实施方案中，然后可以将气体从流体贮存器120输送至气体室190。如下面更详细描述的，将气体引入流体贮存器中可以有助于流体贮存器中试剂的混合。
在某些实施方案中，流体装置包含多个流体贮存器和多个从流体枢纽分支的分支通道。在一些这样的实施方案中，每个流体贮存器均可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，分支通道可以与流体枢纽直接流体连通。在某些实施方案中，一个或更多个阀可以定位在每个分支通道和流体枢纽之间。在一个示例性实施方案中，如图3所示，流体装置104包含多个流体贮存器，其包括流体贮存器115(例如，样品入口贮存器)、流体贮存器120、流体贮存器130、流体贮存器140、流体贮存器150、流体贮存器160和流体贮存器170。每个流体贮存器可以分别经由分支通道105、125、135、145、155、165和175与流体枢纽110连接。在一些情况下，一个或更多个流体贮存器可以包含流体(例如，反应物、缓冲液)。在某些实施方案中，一个或更多个流体贮存器可以用于进行特定操作(例如，裂解、分离、扩增和/或反应)。在一些情况下，阀(例如，阀122、阀132、阀142、阀152、阀162、阀172)可以定位在分支通道和流体枢纽之间。在一个示例性实施方案中，流体可以被引入流体贮存器115中并被输送至流体枢纽110(经由分支通道105)。在这样的实施方案中，阀122可以打开(并且数个或所有其他阀关闭)，使得流体从流体枢纽110输送至流体贮存器120(经由分支通道125)。在某些实施方案中，然后可以打开阀132，使得流体从流体贮存器120输送至流体枢纽110(经由分支通道125)并输送到流体贮存器130中(经由分支通道135)。
流体装置可以包含任意合适数目的分支通道。例如，在某些实施方案中，流体装置包含至少2个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个或至少40个分支通道，每个通道从流体枢纽分支(例如，延伸)。在一些实施方案中，流体装置包含少于或等于50个、少于或等于40个、少于或等于30个、少于或等于20个、少于或等于10个、少于或等于5个、或者少于或等于4个分支通道，每个通道从流体枢纽分支。上述范围的组合也是可能的(例如，至少2个且少于或等于50个)。其他范围也是可能的。
在某些实施方案中，流体装置包含多个流体贮存器，每个贮存器连接至与流体枢纽流体连通的分支通道。例如，在某些实施方案中，流体装置包含至少2个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个或至少40个流体贮存器，每个贮存器与分支通道流体连通(例如，连接)。在一些实施方案中，流体装置包含少于或等于50个、少于或等于40个、少于或等于30个、少于或等于20个、少于或等于10个、少于或等于5个、或者少于或等于4个流体贮存器，每个贮存器与分支通道流体连通(例如，连接)。上述范围的组合也是可能的(例如，至少2个且少于或等于50个)。其他范围也是可能的。
在一些情况下，流体装置可以包含一个或更多个另外的与流体枢纽流体连通的室和/或区域。例如，再次参照图3，在一些实施方案中(例如，在多个流体贮存器中进行一系列操作之后)，流体可以从流体枢纽110输送至流体通道185(例如，通过打开阀182)。如下面更详细描述的，流体通道185可以与例如一个或更多个处理室和/或一个或更多个检测区流体连通。
在一些情况下，气体室可以对大气开放(例如，用于排出气体)。在某些实施方案中，气体室可以与压力源流体连通，使得可以向在气体室中的第二流体(例如，气体)施加压力，使得第二流体推动包含在与气体室流体连通的流体贮存器中的第一流体。
如上所述，在一些实施方案中，流体装置包含与流体贮存器流体连通的气体室。在一些实施方案中，气体室可以具有特定容积。在某些实施方案中，气体室的容积为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL或至少5mL。在某些实施方案中，气体室的容积为小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于10mL)。其他范围也是可以的。
如上所述，在一些实施方案中，流体可以在流体枢纽和一个或更多个流体贮存器之间输送。在一些实施方案中，流体可以与存在于流体贮存器中的试剂反应以在流体贮存器中形成经反应流体(reacted fluid)。在一些这样的实施方案中，可以向经反应流体施加压力，使得经反应流体流入流体枢纽中。例如，在一些实施方案中，可以向与流体贮存器流体连通的气体室施加压力，使得经反应流体流入流体枢纽中。在某些实施方案中，然后可以将流体输送(例如，通过继续施加压力)至一个或更多个另外的分支通道。例如，如图2所示，流体可以从流体枢纽110流入流体贮存器120中(在阀122打开之后经由分支通道125)并与试剂反应以形成经反应流体。在一些实施方案中，可以经由气体室190向经反应流体施加压力，使得经反应流体从流体贮存器120流出并流入流体枢纽110中。在打开阀152之后，经反应流体可以从流体枢纽110流出并流入分支通道155中。在一些实施方案中，流体可以通过在一个或更多个另外的流体贮存器之间流动来经历一系列另外的反应和/或操作。在一个示例性实施方案中，经反应流体可以从第二流体贮存器流入流体枢纽中并随后流入第三流体贮存器中(例如，用于与一种或更多种另外的试剂反应)。
在一些实施方案中，向流体装置的多个组件(例如，气体室、流体贮存器、流体枢纽和/或其中包含的流体)施加恒定差压。在某些实施方案中，一个或更多个阀的打开和/或关闭有助于流体在一个或更多个流体贮存器和流体枢纽之间流动。在一些情况下，差压阻止一个或更多个流体贮存器之间的流动。在一些实施方案中，恒定差压是正压。在某些实施方案中，恒定差压是负压。在一些情况下，恒定差压可以为至少0.1psig、至少0.2psig、至少0.3psig、至少0.5psig、至少0.8psig、至少1psig、至少2psig、至少5psig、至少10psig、或至少15psig。在某些实施方案中，恒定差压为小于或等于20psig、小于或等于15psig、小于或等于10psig、小于或等于5psig、2psig、小于或等于1psig、小于或等于0.8psig、小于或等于0.5psig、小于或等于0.3psig、或者小于或等于0.2psig。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1psig且小于或等于20psig)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，可以通过用与第一流体不混溶的第二流体推动(即，移位)第一流体来输送第一流体(例如，液体)。在某些实施方案中，第二流体是气体。例如，在一些实施方案中，流体贮存器可以包含第一流体(例如，储存的试剂)，并且第二流体可以被引入流体贮存器中，使第一流体从流体贮存器移位(例如，经由分支通道移位到流体枢纽中)。在某些实施方案中，流体通道(例如，分支通道)可以包含第一流体，并且第二流体可以被引入流体通道中，使第一流体从分支通道移位(例如，移位到流体贮存器中、移位到流体枢纽中)。在一些实施方案中，可以向第二流体施加恒定差压，使得第二流体接触并推动第一流体。
在一个示例性实施方案中，第一流体可以被引入第一分支通道中，并且第二流体在第一分支通道中，同时第一分支通道与流体枢纽流体连通。再次参照图2，在一些实施方案中，分支通道125可以与流体枢纽110流体连通(例如，通过打开阀122)，并且分支通道155可以未与流体枢纽流体连通(例如，通过关闭阀152)。在一些这样的实施方案中，存在于分支通道125中的流体可以被引入到分支通道125中的第二流体(例如，经由流体管道195从气体室190引入)推动，并且流体被推动到流体枢纽110中。在一些实施方案中，第二流体进入流体枢纽。
在一些实施方案中，第一流体(例如，由第二流体推动的第一流体)可以具有特定体积。例如，在一些实施方案中，第一流体的体积为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL或至少5mL。在某些实施方案中，第一流体的体积可以为小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于10mL)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，第二流体与第一流体不混溶。在某些实施方案中，第二流体包含气体(例如，经灭菌气体)。在某些传统的流体(例如，微流体)装置中，通常不希望气体在系统中流动，因为其可以引入可抑制液体流动的气泡。有利地，在本文中所述的流体装置中使用气体可以用于促进一种或更多种流体在系统中流动和/或促进流体混合，如本文更详细描述的。
如上所述，在一些实施方案中，流体装置包含至少一个与流体贮存器流体连通的流体通道。本文中所述的流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)可以具有特定的平均截面尺寸。通道的“截面尺寸”(例如，直径、宽度)垂直于流体流的方向进行测量。在一些实施方案中，至少一个通道的平均截面尺寸为小于或等于约3mm、小于或等于约2mm、小于或等于约1mm、小于或等于约800微米、小于或等于约600微米、小于或等于约500微米、小于或等于约400微米、小于或等于约300微米、小于或等于约200微米、小于或等于约175微米、小于或等于约150微米、或者小于或等于约125微米。在某些实施方案中，至少一个通道的平均截面尺寸为大于或等于约100微米、大于或等于约125微米、大于或等于约150微米、大于或等于约175微米、大于或等于约200微米、大于或等于约250微米、大于或等于约300微米、大于或等于约400微米、大于或等于约500微米、大于或等于约600微米、大于或等于约800微米、大于或等于约1mm、或者大于或等于约2mm。上述范围的组合也是可能的(例如，约250微米至约2mm、约400微米至约1mm、约300微米至约600微米)。其他范围也是可能的。还可以对通道的尺寸进行选择以例如在通道中允许特定体积或线性流量的流体和/或在通道中容纳特定体积的流体。当然，通道的数目和通道的形状可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法改变。流体通道可以具有任何截面形状(圆形、卵形、三角形、不规则形、梯形、正方形或矩形等)。
一个或更多个流体通道的通道长宽比(长度：平均截面尺寸)还可以为至少5∶1、至少6∶1、至少8∶1、至少10∶1、至少20∶1、至少50∶1、或至少100∶1。
流体通道可以具有任何合适的容积。在一些实施方案中，流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)的容积可以为至少0.1微升、至少0.5微升、至少1微升、至少2微升、至少5微升、至少10微升、至少25微升、至少50微升、至少100微升、至少200微升、至少500微升、或至少1000微升。在某些实施方案中，一个或更多个流体通道的容积可以为小于或等于2000微升、小于或等于1000微升、小于或等于500微升、小于或等于200微升、小于或等于100微升、小于或等于50微升、小于或等于25微升、小于或等于10微升、小于或等于5微升、小于或等于2微升、小于或等于1微升、或者小于或等于0.5微升。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1微升且小于或等于2000微升、至少0.1微升且小于或等于1000微升)。其他范围也是可能的。
流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)也可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，一个或更多个流体通道的长度为至少1cm、至少2cm、至少5cm、至少10cm或至少20cm。在某些实施方案中，一个或更多个流体通道的长度可以为小于或等于30cm、小于或等于10cm、小于或等于5cm、或者小于或等于2cm。上述范围的组合是可能的(例如，至少1cm且小于或等于30cm)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，至少一个流体通道的纵向轴线与至少一个流体贮存器的纵向轴线(例如，高)基本上垂直。例如，如图4所示，流体装置400包含流体贮存器410和流体通道420。在一些实施方案中，流体贮存器412的纵向轴线412与流体通道420的纵向轴线422基本上垂直。如该图中举例说明性地所示，流体贮存器412的纵向轴线412与流体通道420的纵向轴线422位于不同的平面上。通过延伸贮存器的纵向轴线(例如，高)，与其中流体贮存器和流体通道(与流体贮存器连接)的纵向轴线在同一平面上或彼此平行的配置相比，该配置可以允许流体贮存器容纳更大的体积量。
在一些实施方案中，上述至少一个流体通道是分支通道。在某些实施方案中，流体枢纽是如本文中所述的流体通道(例如，长度为至少1cm)。
在一些实施方案中，每个流体贮存器可以具有特定容积。例如，在一些实施方案中，每个流体贮存器的容积可以为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL、至少5mL、至少10mL、至少25mL、或至少50mL。在某些实施方案中，每个流体贮存器的容积可以小于或等于100mL、小于或等于50mL、小于或等于25mL、小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于100mL)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，流体贮存器可以是储存用贮存器(storage reservoir)(例如，用于储存用于进行特定操作的一种或更多种试剂)。试剂可以被储存并且密封在流体贮存器中，例如，在使用者使用流体装置之前和/或在将样品插入装置中之前。在一些实施方案中，包含在流体贮存器中的一种或更多种试剂可以是液体试剂(例如，洗涤缓冲液、裂解试剂、分离试剂)。在某些实施方案中，包含在流体贮存器中的一种或更多种试剂可以是干燥的、冻干的和/或丸化的试剂。在一些这样的实施方案中，可以使储存的试剂混悬(例如，在将流体引入包含储存的试剂的流体贮存器中之后)。
在一些情况下，流体贮存器可以限定用于进行特定操作的区域。在一些实施方案中，流体贮存器可以重复使用并且限定用于进行多于一个操作的区域。在一些情况下，一个或更多个操作可以并行进行(例如，在一个或更多个流体贮存器中)。
在一些情况下，流体贮存器可以重复用于两个或更多个操作。在某些实施方案中，第一流体贮存器可以用于第一反应，并且在流体已经流至一个或更多个另外的流体贮存器之后，流体可以再次流至第一流体贮存器以进行与第一反应相同或不同的第二反应。在一个示例性实施方案中，可以在第一流体贮存器中进行例如裂解的第一操作，并且在流体已经流至一个或更多个另外的流体贮存器(例如，用于进行一个或更多个特定操作)之后，流体可以流至第一流体贮存器以进行第二操作，例如混合。本领域技术人员将理解，使用流体贮存器进行裂解和混合操作仅是示例性的，并且本文中所述的一个或更多个操作可以在同一或不同的贮存器中进行。在一些情况下，流体贮存器可以重复用作废物贮存器(例如，用于储存在不同贮存器中进行的特定操作之后剩余的废流体)。有利地，与用于样品检测和分析的其他流体装置相比，将一个或更多个流体贮存器重复用作废物贮存器的能力可以例如减小流体装置的尺寸和成本，和/或可以消除在流体装置操作期间移除废产物和/或废流体的需要。
应当理解，尽管本文主要描述了检测，但是在一些实施方案中，本文中所述的流体装置和方法可以用于监测多个过程、事件或条件，例如微生物负荷。例如，装置或方法可以用于监测源自多个来源(例如，身体部位)的样品的微生物负荷的变化和/或用于监测随时间和/或响应于所应用治疗微生物负荷的变化。在一些实施方案中，本文中所述的流体装置和方法可以用于确定微生物负荷的定量效应(例如，以及定性效应)。监测可以在单个检测事件中定期或连续发生。
在某些实施方案中，可以加热一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道。在一些实施方案中，流体贮存器和/或一个或更多个流体通道可以通过邻近流体贮存器的一个或更多个加热元件(包括例如电阻加热器、热电加热器、光学加热器等)加热。在一些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器(或者其中包含和/或储存的一种或更多种流体)加热至特定温度(例如，用于给定操作，例如裂解、分离、扩增、检测)。例如，在某些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道加热至至少5℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少37℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、至少100℃、或至少110℃。在某些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道加热至以下温度：低于或等于120℃、低于或等于110℃、低于或等于100℃、低于或等于95℃、低于或等于90℃、低于或等于85℃、低于或等于80℃、低于或等于75℃、低于或等于70℃、低于或等于60℃、低于或等于50℃、低于或等于40℃、低于或等于37℃、低于或等于35℃、低于或等于30℃、低于或等于25℃、低于或等于20℃、低于或等于15℃或者低于或等于10℃。上述范围的组合是可能的(例如，至少5℃且低于或等于100℃)。其他范围也是可能的。在一些情况下，温度可以是循环的(例如，在扩增操作期间)。例如，在一些实施方案中，温度可以在50℃至120℃之间或在70℃至120℃之间以及在约25℃与75℃之间进行循环。
在一些实施方案中，阀可以定位在分支通道和流体枢纽之间。例如，再次参照图1，在某些实施方案中，阀122可以定位在分支通道125和流体枢纽110之间。在一些实施方案中，阀是流闸门(flow-gate)。在某些实施方案中，阀可以是基于膜的阀。例如，可以在基于膜的阀上设置活塞，使得阀关闭。在某些实施方案中，活塞可以升高，使得阀打开。其他流动限制阀也是可能的，包括但不限于微型螺线管、歧管、可变形凝胶和/或膜，以控制流体从流体枢纽到一个或更多个分支通道的通过或流动。在一些实施方案中，本文中所述的流体装置和/或方法可以包含2015年9月15日授权且题为“Simplified gating method forsealing and flow control in micro and nano devices”的美国专利No.9,132,426(其出于所有目的而通过引用整体并入本文)中描述的一种或更多种阀(例如，流闸门)。其他阀也是可能的。
在一些情况下，定位在气体室和流体贮存器之间的流体管道包含阀(例如，流闸门)。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个裂解区。在一些实施方案中，一个或更多个裂解区与流体通道(例如，流体枢纽)流体连通。在某些实施方案中，如本文所述，一个或更多个裂解区与分离区流体连通。在一些情况下，一个或更多个裂解区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个裂解区可以与流体枢纽流体连通。在某些实施方案中，裂解操作包括化学裂解，包括例如使患者的样品暴露于化学裂解试剂，其导致选定真核生物细胞的细胞膜打开或破裂。在某些实施方案中，在样品流至流体贮存器之前，流体贮存器包含一种或更多种裂解试剂(例如，储存的裂解试剂)。在另一些实施方案中，可以在样品流至流体贮存器之后向流体贮存器添加一种或更多种裂解试剂。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体装置104包含第一裂解区和第二裂解区，所述第一裂解区包含用于进行第一裂解操作的流体贮存器120，所述第二裂解区包含用于进行第二裂解操作的流体贮存器130。在一些实施方案中，第一裂解区包含一种或更多种储存的裂解试剂。在某些实施方案中，第二裂解区包含一种或更多种储存的裂解试剂，其可以与第一裂解区中的裂解试剂相同或不同。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至第一裂解区，并且可以向第一裂解区添加一种或更多种裂解试剂(例如，从一个或更多个另外的包含裂解试剂的流体贮存器流出的裂解试剂)。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至第二裂解区，并且可以向第二裂解区添加一种或更多种裂解试剂(例如，从一个或更多个另外的包含裂解试剂的流体贮存器流出的裂解试剂)。
在一些实施方案中，一个或更多个裂解操作包括裂解选定真核生物细胞(例如，存在于患者样品中的选定真核生物细胞)。在一些实施方案中，裂解操作从样品中释放哺乳动物DNA(例如，使得其可以从样品中分离和/或除去)。在某些实施方案中，可以在裂解之后将释放的选定真核生物DNA从样品中分离和/或除去，从而从样品中耗尽选定真核生物基因组物质。
在一些实施方案中，裂解操作包括裂解一种或更多种微生物细胞。在一些实施方案中，裂解操作将微生物基因组物质从微生物细胞释放到流体中(例如，使得其可以被分离、扩增和/或检测)。在一些情况下，一种或更多种微生物细胞的裂解发生在裂解选定真核生物细胞之后。在一些这样的实施方案中，在裂解一种或更多种微生物细胞之前，样品已经基本上耗尽选定真核生物DNA。在一些替代实施方案中，一种或更多种微生物细胞的裂解在不裂解选定真核生物细胞下进行。在某些实施方案中，在裂解选定真核生物细胞之后但在裂解微生物细胞之前，至少一部分微生物细胞可以是完整的(例如，未裂解的)。
裂解溶液、裂解试剂和裂解条件如本文中所述。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个分离区。在某些实施方案中，一个或更多个分离区与一个或更多个裂解区流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个分离区可以与流体枢纽流体连通。在一些情况下，一个或更多个分离区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在某些实施方案中，在一个或更多个裂解操作之后，可以从流体中分离经裂解的基因组物质(例如，选定真核生物基因组物质、微生物基因组物质)和/或使其与流体隔离。在一些情况下，通过与支持基底结合并将支持基底和基因组物质与流体隔离来分离基因组物质。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，在进行第一裂解操作之后，流体(例如，包含经裂解的物质)流至包含流体贮存器140的第一分离区，用于进行第一分离操作(例如，以从流体中去除/耗尽选定真核生物基因组物质)。在一些这样的实施方案中，然后可以将流体(例如，基本上耗尽选定真核生物基因组物质)输送至流体贮存器130以进行第二裂解操作。在进行第二裂解操作之后，流体可以流至包含流体贮存器150的第二分离区，用于进行第二分离操作(例如，以从流体中去除/耗尽选定真核生物基因组物质、以从流体中分离微生物基因组物质)。基于本说明书的教导，本领域技术人员将理解，可以在分离操作之前进行(例如，在两个或更多个流体贮存器中进行)两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个裂解操作。
可以使用本文中所述的方法通过流体装置内的阴离子交换来分离微生物遗传物质。支持基底可以添加到或包含在一个或更多个流体贮存器中(例如，在一个或更多个分离区中)以进行分离操作。在某些实施方案中，基因组物质(例如，经裂解的基因组物质)与支持基底的至少一部分结合。基因组物质可以以任何合适的方式附接或结合至支持基底。
在一些实施方案中，使结合至支持基底的至少一种阴离子交换剂与流体(例如，经裂解的流体)接触和/或孵育。在一些实施方案中，在与流体接触和/或孵育之后，从流体中移除阴离子交换剂。在另一个实施方案中，在与流体接触和/或孵育之后，固定阴离子交换剂并移出流体。
基因组物质可以如下从流体中分离：例如向包含结合到支持基底的基因组物质的流体贮存器施加磁场，使得支持基底被吸引到磁场源，并且流体可以从流体贮存器移出(例如，流出)。移出的流体可以流至例如废流体贮存器。
在某些实施方案中，在分离操作期间和/或之后，可以洗脱分离的基因组物质。例如，在一些实施方案中，通过从阴离子交换剂和/或支持基底洗脱或移出基因组物质来促进分离过程的完成。在一些实施方案中，基因组物质的洗脱包括添加洗脱缓冲液(例如，储存在与流体枢纽流体连通的流体贮存器中，并输送至分离区)。在某些实施方案中，在分离操作期间和/或之后，可以在洗脱之前洗涤结合至阴离子交换剂的分离的基因组物质。
在一些实施方案中，流体装置包含扩增区。在某些实施方案中，扩增区与至少一个反应区流体连通。在一些情况下，扩增区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，扩增区与流体枢纽流体连通。在某些实施方案中，在一个或更多个裂解和/或分离操作之后，可以扩增微生物基因组物质。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体装置104可以包含含有流体贮存器170的扩增区。在一些这样的实施方案中，流体贮存器170可以包含用于扩增基因组物质的一种或更多种试剂。在某些实施方案中，一种或更多种试剂(例如，储存在一个或更多个另外的流体贮存器中)可以流至流体贮存器170以进行扩增操作。在一些实施方案中，扩增的基因组物质是RNA或DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA(ssDNA)和/或双链DNA(dDNA)。在一些实施方案中，DNA是核糖体DNA(rDNA)。
在一些实施方案中，可以稀释在扩增操作期间产生的扩增子。在某些实施方案中，可以向包含在扩增操作期间产生的扩增子的流体中添加侵入缓冲液。例如，在某些实施方案中，再次参照图3，流体贮存器170可以包含扩增操作的产物并且侵入缓冲液(例如，储存在一个或更多个另外的流体贮存器中的侵入缓冲液)可以流入流体贮存器170中。侵入缓冲液在下面更详细地描述。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个反应区(例如，其包含一个或更多个流体贮存器)。在某些实施方案中，一个或更多个反应区与一个或更多个分离区流体连通。在一些情况下，一个或更多个裂解区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个反应区可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，反应区包括洗涤操作。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体贮存器160可以包含用于进行洗涤操作的洗涤区。在一些实施方案中，洗涤区包含一种或更多种洗涤缓冲液。洗涤缓冲液可以储存并密封在流体贮存器中，例如，在使用者使用流体装置之前和/或在将样品插入装置中之前。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至洗涤区，并且可以向洗涤区添加一种或更多种洗涤缓冲液(例如，从一个或更多个另外的储存洗涤缓冲液的流体贮存器流出的洗涤缓冲液)。在某些实施方案中，流体贮存器包含分离区和洗涤区。也就是说，在一些实施方案中，流体(例如，样品)可以存在于其中已经进行特定操作(例如，裂解、分离)的流体贮存器中并且可以向该流体贮存器添加洗涤缓冲液(例如，从一个或更多个另外的流体贮存器流出的洗涤缓冲液)，以洗涤任何未结合的组分和/或废试剂。
在一些实施方案中，在使微生物基因组物质与结合至支持基底的阴离子交换剂结合之后，使用洗涤缓冲液洗涤支持基底。在一些这样的实施方案中，并且在洗涤操作之前，将与微生物基因组物质结合的阴离子交换剂固定，使得可以移除未结合的物质而基本上不损失微生物基因组物质。
在一些实施方案中，一个或更多个反应区包括流体的中和(例如，用碱或酸进行)。例如，在一些实施方案中，可以向在一个或更多个流体贮存器中的流体中添加酸以改变流体的pH。酸和碱可以储存在一个或更多个如本文中所述的贮存器中。
在某些实施方案中，一个或更多个反应区包含或含有储存的双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)(例如，用于检测一种或更多种微生物病原体)。
在一些实施方案中，可以混合包含在流体贮存器中的一种或更多种流体。在某些实施方案中，混合包括搅拌，例如机械搅拌(例如，超声搅拌)。
在一些实施方案中，本文中所述的装置和方法可有利于在不使用混合组件(例如，螺旋桨等)的情况下混合两种或更多种流体(例如，样品和试剂)。在一些情况下，可以通过在特定操作之前、期间和/或之后使气体(例如，经灭菌气体)的流流入流体贮存器中来进行混合。气体流可以流动任何合适的时间(例如，至少1秒、3秒、5秒、7秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、60秒；和/或少于120秒、60秒)。在一些这样的实施方案中，气体流不需要是连续的，而可以是脉冲的。在一些这样的实施方案中，气体流可以引起流体贮存器中一种或更多种流体和/或试剂的混合和/或均化。气体可以从例如流体枢纽流入流体贮存器中，并且从流体贮存器流至与流体贮存器流体连通的气体室。气体流过包含一种或更多种流体(和一种或更多种试剂)的流体贮存器并流入气体室中可以使一种或更多种流体和一种或更多种试剂混合。在一些实施方案中，通过包含在流体贮存器中的流体的气体流动导致流体中的湍流。不希望受理论束缚，湍流可以导致流体贮存器中的流体和/或试剂混合。
例如，再次参照图2，可以将流体引入流体贮存器120中。在一些实施方案中，气体可以从流体枢纽110流入流体贮存器120中(经由阀122和分支通道125)，使得气体流入流体贮存器中通过流体。在一些这样的实施方案中，气体(但不是流体)可以流入与气体室190流体连通的流体管道195中。在一些实施方案中，气体室可以对大气开放并且气体排放到大气中。
在某些实施方案中，基本上阻止第一流体和/或试剂流入气体室中。例如，在一些实施方案中，定位在流体贮存器和气体室之间的阀(或流闸门)可以阻止一种或更多种流体和/或试剂流入气体室中，同时选择性地允许气体流入气体室中。
在某些实施方案中，流体贮存器被构造、布置和操作以进行一组特定操作。在一个示例性实施方案中，该组操作包括从样品中选择性地耗尽选定真核生物DNA(例如，通过裂解选定真核生物细胞和/或分离提取其基因组物质)、裂解其中的一种或更多种微生物细胞、分离微生物基因组物质(例如，DNA和/或RNA)、扩增微生物基因组物质、与双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)反应、以及检测一种或更多种微生物病原体。在一些这样的实施方案中，还可以进行一个或更多个另外的洗涤、分离、反应、混合或其他操作。
在一些实施方案中，在上述一个或更多个操作之后，流体(例如，包含扩增子和/或侵入缓冲液的流体)可以被分入用于计量(例如，在计量通道中)DIANA结合/侵入和/或检测(例如，检测区)的一个或更多个处理室中。在一些实施方案中，一个或更多个处理室各自与扩增区和/或至少一个反应区流体连通。在一些情况下，一个或更多个处理室可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个处理室可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，流体装置包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、十二个或更多个、十四个或更多个、或者十六个或更多个处理室。例如，如图5所示，流体装置500包含与多个处理室520流体连通的流体通道510，每个处理室520包含计量通道525。在某些实施方案中，每个计量通道彼此具有相同的长度、容积、长宽比和/或截面尺寸。在一些情况下，计量通道的使用将流体分开使其基本上相等地流入每个计量通道中。有利地，计量通道的使用可以产生两个或更多个基本上相等的流体体积(例如，使得包含在流体中的一种或更多种病原体的检测以相等体积并且基本上同时进行)。
在某些实施方案中，处理室包含检测区。例如，再次参照图5，每个处理室包含与计量通道525流体连通的检测区530。在一些实施方案中，每个检测区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文中所述的流体贮存器的区域流体连通。在某些实施方案中，每个检测区与每个处理室流体连通。在一些情况下，一个或更多个检测区可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，在每个检测区中包含靶向期望病原体的一种或更多种探针。在一些这样的实施方案中，可以通过一种或更多种探针与病原体结合并产生信号来检测一种或更多种微生物病原体的存在。在一些实施方案中，可以通过光学、化学、电学或机械检测方法来检测信号。
在一些实施方案中，在扩增操作之后，可以检测和/或鉴定(例如，在计量通道中)在酶促扩增期间生成/产生的扩增子。
在一些实施方案中，可以使用DNA侵入人工核酸(DIANA)来检测和鉴定微生物基因组物质。例如，在一些实施方案中，可以将DIANA添加到包含在扩增操作期间产生的扩增子的流体贮存器中。在某些实施方案中，一种或更多种DIANA可以存在于一个或更多个计量通道的检测区中。
图6A中示出了流体装置的一个示例性透视图。在一些实施方案中，流体装置600包含第一区域610和第二区域620，所述第一区域610包含多个流体通道，所述第二区域620包含多个流体贮存器。在一些情况下，流体装置包含盖630，其包含多个流体管道(例如，定位在一个或更多个气体室和一个或更多个流体贮存器之间的流体管道)。
图6B是流体装置600的自顶向下视图。在一些实施方案中，第二区域620包含一个或更多个流体贮存器，其包括例如示例性的流体贮存器625。在某些实施方案中，第一区域610包含多个流体通道，其包括例如示例性的流体通道635。如图6B所示，流体装置还包含多个计量通道640(每个计量通道包含检测区645)。
在一些实施方案中，包含多个流体通道的第一区域610还包含附接到流体装置的底部的薄膜(例如，薄膜聚合物)(例如，以封闭流体通道)。在一些情况下，附接到装置底部的薄膜具有相对高的光学透明度(例如，以有利于有效地检测从一个或更多个检测区发射的任何光学信号)。
在一些实施方案中，流体装置具有总宽度、总高度和总长度。例如，再次参照图6B，流体装置600具有总高度650和总宽度660，以及总长度670。
在某些实施方案中，流体装置的总高度与总宽度之比为至少1∶1、至少2∶1、至少3∶1、至少5∶1、或至少10∶1。在一些实施方案中，流体装置的总高度与总长度之比为至少1∶1、至少2∶1、至少3∶1、至少5∶1、或至少10∶1。
在某些实施方案中，流体装置具有特定的总宽度。在一些实施方案中，流体装置的宽度为约2至5英寸、约2.5至5英寸、3至6英寸。
在某些实施方案中，流体装置具有特定的总长度。在一些实施方案中，流体装置的长度为约5至12英寸、约6至16英寸、或8至20英寸。
在一些实施方案中，流体装置占据特定的表面积。在一些实施方案中，流体装置占据的表面积为约10至63平方英寸、约17至85平方英寸、约23至115平方英寸或约28至120平方英寸。如本文中所述的表面积是在平行于多个流体通道(并且垂直于至少一个流体贮存器)的流体装置的最大截面上测量的。
在一些实施方案中，流体装置包括用于添加样品，例如将样品注射到样品入口贮存器中的开口。在一些实施方案中，开口具有可再密封的盖。在一些实施方案中，打开盖需要机械力，其中在没有机械力的情况下盖保持闭合。在一些实施方案中，开口覆盖有膜，样品被插入通过所述膜。
在一些实施方案中，流体样品或样本经由流体装置中构造和布置成从vacuette或者类似样本管或瓶接收和提取流体样品的接收器流至流体装置。
在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收Monovette的接收器。通过在Monovette的柱塞上施加力/压力，来自Monovette的流体样本经由接收器流至流体装置。在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收Vacuette的接收器。在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收能够和/或储存和/或输送流体的任何容器的接收器。
在一些实施方案中，流体装置被构造和布置成并入一个或更多个设计成使样品从样本瓶或接收器流出的管。在一些实施方案中，这样的管各自且单独地可以提供正压、负压和/或环境压力以促进样品流入装置中。在一些实施方案中，一个或更多个管设计成串联、和/或并联、和/或顺序工作，以能够使样品有效地流入装置中。在一些实施方案中，仅需要单个管。
在一些实施方案中，并且在可以使用多于一个管来使样品从瓶流至流体装置的情况下，可以紧密靠近地放置，一个非限制性实例可以是“并排”。在另一个非限制性实例中，一个管可以放置在另一个管内。
在一些实施方案中，这些管可以用于在使样品能够流至流体装置之前刺穿瓶的密封。
在一些实施方案中，样品通过气动力从瓶流至流体装置，而在另一些情况下，其可以是机械的或电的。
在一些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置可以用于来自单个全血样品的超过10种单独微生物病原体的分析(例如，鉴定、和/或检测、和/或筛选、和/或定量)。在一些实施方案中，引入流体装置中的全血样品的体积为至少1mL。在一些情况下，本文中所述的方法和/或流体装置可以用于细菌和/或真菌的分析(例如，鉴定、和/或检测、和/或筛选、和/或定量、和/或监测)。在一些实施方案中，分析包括高灵敏度化学发光检测。
在一些实施方案中，所述方法和/或装置通过化学反应(例如，不使用机械力或电力)在单个反应中并行地裂解细菌和真菌二者。在某些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置包括在不使用离心机的情况下从全血样品中耗尽选定真核生物DNA。在某些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置在裂解过程期间不剪切基因组物质(例如，从而能够提取和/或分离长度通常超过5kbp的高分子量基因组物质)。在某些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置包括酶促产生长度大于1000bp的扩增子。在一些情况下，本文中所述的方法和/或装置包括在30分钟以内将DNA固定到固体基底，其中DNA长度大于1kbp。
在一些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置不需要使用任何离液盐用于其任何过程。
在一些实施方案中，本文中所述的一个或更多个操作或一组操作可以半自动或自动地进行。
在某些实施方案中，一个或更多个流体贮存器可以储存一种或更多种试剂和/或可以配置成接收废流体。
在一些实施方案中，所述方法和/或装置包括沿在正方向和负方向二者上的三个平面(X、Y和Z)转移(例如，流动)一种或更多种流体(例如，通过使用流动限制性结构)。在某些实施方案中，用于将流体从第一流体贮存器转移至第二流体贮存器的多个流体通道位于单个平面内。在某些实施方案中，在流体装置中流动的一种或更多种流体可以具有相对大的体积(例如，0.5至10ml)或相对减小的体积(例如，0.01μl至500μl)。
在一些情况下，所述方法和/或装置包括通过将无菌气体作为流或作为脉冲添加到室来混合、搅拌和/或均化流体(例如，和一种或更多种试剂)。
组合学微生物检测
在某些实施方案中，本文中所述的方法和/或装置包含DIANA探针用于以序列高序列特异性捕获DNA并将DNA固定到固体表面或基底。在一些情况下，本文中所述的方法和/或装置包括在一个或更多个处理室中合并多种DIANA探针，使得一种或更多种信号的组合说明病原体的鉴定(例如，从而降低为说明病原体鉴定所需的处理室的数目)。
在一些实施方案中，检测区的位置将产生关于捕获哪个靶标的信息(例如，由于存在DIANA探针)。在一些实施方案中，检测到的颜色(例如，当将荧光用作光学检测方式时)和位置的组合可以用于解密捕获了哪个靶标。
在一些实施方案中，在一个或更多个检测区中存在信号(例如，光学信号)指示存在特定微生物病原体的基因组物质。在一些实施方案中，通过组合学(例如，多重)方法提供特定分析物(例如微生物或病原体)的检测。在这样的方法中，检测到的分析物的种数可以大于用于检测的活性检测区的数量。在一些实施方案中，流体装置包含两个或更多个检测区。在一些实施方案中，检测一种或更多种扩增子(例如，通过产生可检测的信号，例如光学信号)的检测区的特定组合可以指示一种或更多种特定病原体的存在。
在一个非限制性实例中，在第一检测区和第二检测区而非第三检测区中检测到的信号指示患者样品中存在第一病原体。在第一检测区和第三检测区而非第二检测区中检测到的信号指示患者样品中存在与第一病原体不同的第二病原体。
使用组合学方法进行检测相对于传统的1对1检测方法(例如，在单个孔中检测病原体和/或多个孔中的单病原体检测)可以提供数个优点，包括例如，简化流体通道设计、减小占用空间、减少处理时间、提高精度和/或简化检测。
在一些实施方案中，单一类型的光学信号(例如，特定波长或频率的光学信号)可以用于检测多种病原体。例如，单荧光标签可以用于流体装置中，并且在病原体存在下，一个或更多个检测区从荧光标签产生可检测的光学信号，指示存在特定微生物病原体的基因组物质。
在病原体特异性基因组物质的情况下，可以将与特定病原体相关的不同病原体基因组物质(PGM)鉴定为PGMn，其中n＝1、2、3、...、n。例如，在一些实施方案中，在鉴定十五种潜在病原体中的一种的流体装置设计中，流体装置可以鉴定PGMn，其中n＝1、2、3、...、15，其中可以使用8个检测区对十五种潜在病原体进行检测。在表6中所示的一个示例性实施方案中，一个或更多个检测区中特定捕获寡聚体的存在将指示患者样品中特定病原体的存在。
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例如，在一个具体实施方案中，如果在检测区1和4中产生可检测信号，则唯一的共有PGM是PGM1，指示患者样品中存在对应于PGM1的特定病原体。作为另一个实例，在另一个实施方案中，如果在检测区1和7中产生可检测信号，则唯一的共有PGM是PGM4，指示患者样品中存在对应于PGM4的特定病原体。
本文中使用的术语“组”或“选单(menu)”是指任何给定测定旨在检测的微生物。例如，如果设计测定来检测PGMn微生物，则组中将存在n种不同的微生物。
基于本说明书的教导，本领域技术人员将理解，这样的组合学方法不限于15种潜在病原体和/或8个检测区，而是该组合学方法可用于使用两个或更多个(例如，四个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、十二个或更多个、十五个或更多个、二十五个或更多个、五十个或更多个)检测区来检测两种或更多种、四种或更多种、六种或更多种、八种或更多种、十种或更多种、十二种或更多种、十五种或更多种、或者二十种或更多种、五十种或更多种、一百种或更多种、两百种或更多种、五百种或更多种病原体。
在一些实施方案中，一种或更多种病原体的检测不使用组合学方法。例如，在某些实施方案中，每个检测区对应于单一病原体。
感染性心内膜炎的无培养微生物诊断
在美国，感染性心内膜炎(IE)每年影响超过45,000名患者，主要是患有既往病症例如心脏瓣膜损伤或侵入性操作的患者，并且IE的特征在于发病率和死亡率高(20％至40％)。现在IE被认为是在美国最严重威胁生命的感染之一。当细菌或真菌黏附于心内膜表面并形成小病变或“赘生物(vegetation)”时，即会发生IE。这些赘生物含有高病原体浓度，并且不仅难以根除而且随着微生物不断释放到血流中而诱发“持续脓毒症”。
IE的不一致和非特异性临床表现为准确且及时的诊断提出了重大挑战。目前，通过不同的标准组(杜克标准(Duke criteria))对IE进行诊断，这些标准组包括患者的病史、发热反应、超声心动图，以及至关重要地，基于阳性血液培养的微生物学证据。反过来，不良结果直接与无法在疾病的时间进程中足够早地正确诊断IE有关。由于在缺乏适当的抗微生物干预的情况下预后会迅速恶化，因此已广为接受的是，用微生物的相应ID确认血流感染(BSI)的时间是决定结果的关键因素之一。然而，目前检测微生物的诊断标准依赖于血液培养，这不仅费时而且在检测顽固性病原体或用抗生素预治疗的患者的感染中也无效，导致大量培养阴性的IE病例。尽管当前的分子方法有可能克服这些问题中的一些，但是它们在组大小、灵敏度、细节水平和时间要求方面存在明显的缺点，并因此临床接受度低。鉴于具有相应ID的及时BSI确认是正确进行疾病管理的前提，因此目前的微生物诊断方案明显已过时。
在确定IE的诊断标准中，培养结果是不可缺少的。然而，使用血液培养物鉴定IE的病原物(etiologic agent)有两个主要缺点，其延迟了适当的抗微生物治疗的施用：(1)数天甚至数周的长周转时间，以及(2)由于用抗生素进行预治疗或存在难以培养的病原体而导致的高的假阴性患病率。如本文中所述，本文中所述的方法擅长检测以非常低的负荷存在的大量病原体。
在IE病例中普遍存在的病原体包括例如金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、草绿色链球菌组(VGS；特别地，缓症链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosis)和唾液链球菌(Streptococcus salivarius))、解没食子酸链球菌(Streptococcus galloyticus)以及HACEK组(包括副流感嗜血杆菌、放线共生放线杆菌、人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏菌属(Kingella spp.)、贝氏柯克斯体和巴尔通氏体属)。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含所有前述病原体。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体的亚群。在一些实施方案中，测试组或测试选单仅包含前述病原体中的一种。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体中的一些或全部以及未列出的另外的微生物。
在表7中列出了与与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合的DIANA。在一些实施方案中，表7中列出的DIANA探针中的一种用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表7中列出的一些DIANA探针用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表7中列出的DIANA探针全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表7中列出的DIANA探针中的一些或全部与表7中未列出的DIANA探针组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。
表7：通常与感染性心内膜炎相关的DIANA和微生物
在一些实施方案中，与与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合的DIANA包含SEQ ID NO：1至7、15、16和20至131。在一些实施方案中，具有SEQ IDNO：1至7、15、16和20至131的序列的DIANA探针中的一种用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至7、15、16和20至131的序列的DIANA探针中的一些用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至7、15、16和20至131的序列的DIANA探针全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQID NO：1至7、15、16和20至131的序列的DIANA探针中的一些或全部与不具有SEQ ID NO：1至7、15、16和20至131的序列的DIANA探针组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。
表1中示出了金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、白念珠菌和近平滑念珠菌的示例性DIANA探针序列。表2中示出了凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、侵蚀艾肯菌、金格杆菌、放线共生放线杆菌、副流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、人心杆菌、贝氏柯克斯体和巴尔通氏体属的示例性DIANA探针序列。在WO2013176992A2中已鉴定出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、白念珠菌和近平滑念珠菌的另外的DIANA探针序列。
表8中示出了用于本文中所述的流体装置的8孔检测系统的非限制性实例，该系统并入了表7中列出的微生物或病原体。在表8中示出的实例中，可以基于来自两个检测孔而不只是一个检测孔的光学特征来确定病原体ID。例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染将通过来自孔#2和#5的信号进行鉴定，并与粪肠球菌(E.faecalis)感染加以区分，粪肠球菌感染将通过孔#2和#7进行鉴定。
表-8
Figure BPA0000281908730001021
新生儿脓毒症中普遍存在的病原体的无培养微生物鉴定
新生儿脓毒症是新生儿的重大健康风险。尽管患者护理的进步有助于降低其发病率，但在美国每年估计有9,100名新生儿患有这种疾病，并且超过3,000名新生儿将无法生存。有充足的文献证明，感染得不到适当抵消的这些脆弱患者的预后每小时都会恶化。尽早确定具有相应微生物ID的BSI可能是结果的关键决定因素，因为这使针对性抗微生物干预的时滞最小化。遗憾的是，目前检测BSI的诊断标准的血液培养通常需要数天才能得出结果。此外，在新生儿中培养尤其成问题，因为抽血体积减少通常会导致假阴性结果，而母体抗生素的流行可显著降低灵敏度。面对这种现实，在缺乏诊断确认的情况下临床医生常规地纯粹基于经验开始治疗。虽然这是一种必要的风险，但这些方法低效、昂贵，可能未中靶，并提高了并发症(包括不良响应和药物-药物相互作用)的可能性。对于患有BSI的新生儿，适当的抗微生物干预将严重延迟，而没有BSI的新生儿则暴露于不必要的抗微生物剂中，可能危害健康微生物组的发展。因此，目前使用血液培养是检测BSI病原体的唯一方法，并且是改善患者护理的关键障碍。
使用培养物鉴定新生儿BSI的病原体有两个主要缺点，这些缺点会延迟适当抗微生物剂的施用：(1)数天的长周转时间；以及(2)高的假阴性结果患病率，通常由于用抗生素进行预治疗(通常来自母亲)，连同减少的抽血体积使灵敏度降低。虽然分子方法原则上能够解决这些问题，但它们始终不能达到所需的灵敏度，同时覆盖足够的病原体数量或达到提供可行信息所需的详细程度。与血液培养相反，要求保护的方法、装置和试剂盒允许快速且准确地鉴定少量血液中的低水平微生物。
新生儿脓毒症病例中普遍存在的病原体包括例如金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、草绿色链球菌组(VGS；特别地，缓症链球菌、口腔链球菌、变形链球菌、血链球菌、咽峡炎链球菌和唾液链球菌)、单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、白念珠菌和近平滑念珠菌。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含所有前述病原体。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体的亚群。在一些实施方案中，测试组或测试选单仅包含前述病原体中的一种。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体中的一些或全部以及未列出的另外的微生物。
在表9中列出了与与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合的DIANA。在一些实施方案中，表9中列出的DIANA探针中的一种用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表9中列出的一些DIANA探针用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表9中列出的DIANA探针全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，表9中列出的DIANA探针中的一些或全部与表9中未列出的DIANA探针组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。
表9：通常与新生儿脓毒症相关的DIANA和微生物
Figure BPA0000281908730001041
与通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合的DIANA具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列的DIANA探针中的一种用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列的DIANA探针中的一些用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列的DIANA探针全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列的DIANA探针中的一些或全部与不具有SEQ ID NO：1至16、20至31、53至63和132至140的序列的DIANA探针组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如鉴定通常与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法中。
表1中列出了金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、铜绿假单胞菌、黏质沙雷氏菌和鲍氏不动杆菌的示例性DIANA探针序列。表2中列出了凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌和流感嗜血杆菌的示例性DIANA探针序列。表3中列出了单核细胞增多性李斯特菌和脑膜炎奈瑟菌的示例性DIANA探针序列。在WO2013176992A2中已鉴定出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、肠杆菌属/克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、白念珠菌和近平滑念珠菌的另外的DIANA探针序列。
表10中示出了用于本文中所述的流体装置的9孔检测系统的非限制性实例，该系统并入了表9中列出的微生物或病原体。在表10中示出的实例中，将基于来自两个检测孔而不只是一个检测孔的光学特征来确定病原体ID。例如，金黄色葡萄球菌感染将通过来自孔#2和#6的信号进行鉴定，并与粪肠球菌感染加以区分，粪肠球菌感染将通过孔#3和#6进行鉴定。
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血流感染中普遍存在的革兰氏阳性病原体的无培养微生物检测及其抗性赋予机 制
在美国，菌血症(即脓毒症)依然是重要的医疗负担。由于预后每小时都会恶化，因此早期诊断一直被确定为对提供最佳患者护理至关重要。使用血液培养的目前诊断标准不适用于及时诊断，因为它们需要数天才能交付结果。此外，培养往往会受到抗微生物剂的抑制，给阴性结果添加不确定性。考虑到如果在数小时内未使用适当的抗生素，存活率会迅速下降，在缺乏诊断确认的情况下临床医生常规地纯粹基于经验开始治疗。这些经验干预措施依赖于“最佳猜测”方法，这些方法低效、昂贵，可能未中靶并提高了并发症(包括不良响应和药物-药物相互作用)的可能性。然而，由于缺乏及时的信息，这是必要的风险。因此，对降低死亡率至关重要的关键进展是无需培养即可直接从临床样本中早期鉴定细菌病原体及其抗性状，使实现假说驱动的一线干预。
“需要培养”已被反复确定为针对性治疗干预的最大障碍。本文中所述的方法、装置和试剂盒提供了快速且准确地鉴定血液中的病原体的无培养方法。
本文中所述的方法、装置和试剂盒旨在检测脓毒症中普遍存在的病原体亚群的感染，特别是革兰氏阳性菌，并检测其抗性机制。在脓毒症的情况下普遍存在的病原体包括例如金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌以及草绿色链球菌组(VGS；特别地，缓症链球菌、口腔链球菌、变形链球菌、血链球菌、咽峡炎链球菌和唾液链球菌)。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含所有前述病原体。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体的亚群。在一些实施方案中，测试组或测试选单仅包含前述病原体中的一种。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体中的一些或全部以及未列出的另外的微生物。
在一些实施方案中，组或选单包含前述病原体中的一些或全部以及赋予抗微生物剂抗性的遗传物质或赋予抗微生物剂抗性的基因的标记。在一些实施方案中，组或选单包含前述病原体中的一些或全部以及赋予抗微生物剂抗性的遗传物质的一种或更多种标记。在一些实施方案中，组或选单包含赋予抗微生物剂抗性的遗传物质的一种或更多种标记。赋予抗微生物剂抗性的遗传物质包括例如MecA、MecC和VanA和/或VanB。
表11中示出了与可赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质结合的DIANA，例如SEQ ID NO：141至372。在一些实施方案中，表11中列出的DIANA探针中的一种，例如SEQ ID NO：1至8、20至31、59至63和141至372用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定可赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法中。在一些实施方案中，表11中列出的DIANA探针中的一些，例如SEQ ID NO：1至8、20至31、59至63和141至372用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定可赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法中。在一些实施方案中，表11中列出的DIANA探针，例如SEQ ID NO：1至8、20至31、59至63和141至372全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定可赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法中。在一些实施方案中，表11中列出的DIANA探针中的一些或全部，例如SEQ ID NO：1至8、20至31、59至63和141至372与表11中未列出的DIANA探针组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定可赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法中。
表11：与革兰氏阳性血流感染和抗微生物剂抗性或降低的抗微生物剂易感性相关的DIANA和微生物。
靶标 Seq ID
金黄色葡萄球菌 001
凝固酶阴性葡萄球菌 002、003和020至031
粪肠球菌 004
屎肠球菌 008
肺炎链球菌 005
无乳链球菌 006
酿脓链球菌 007
草绿色链球菌 059至063
赋予针对抗葡萄球菌的青霉素之抗性的基因 141至372
赋予针对万古霉素的抗性的基因 373至493
表1中示出了金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌和酿脓链球菌的示例性DIANA探针序列。表2中示出了凝固酶阴性葡萄球菌和草绿色链球菌的示例性DIANA探针序列。表4中示出了抗葡萄球菌的青霉素和万古霉素抗微生物剂抗性基因的示例性DIANA探针序列。在WO2013176992A2中已鉴定出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌和酿脓链球菌的另外的DIANA探针序列。
在一些实施方案中，以下引物用于本文中所述方法的扩增反应中：
Figure BPA0000281908730001091
在一些实施方案中，使用仅优先扩增革兰氏阳性菌的引物。
多种微生物的检测和去卷积复杂感染
在一些实施方案中，使用本文中所述的用于检测微生物的方法、装置和试剂盒检测到了多于一种类型的微生物。在一个非限制性实例中，如果应当在单个患者血液样品中同时检测到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白念珠菌，则在一些实施方案中，指出所有三种病原体可以是该疾病的根源并且所有三种病原体都需要原样治疗，这具有临床效用。作为实例，但不作为限制，治疗可以包括施用三种抗微生物剂，每一种对三种不同的病原体具有特异性。在一些实施方案中，使用本文中所述的方法指出三种病原体中的每一种的相对负荷，这可以具有临床效用。在一些实施方案中，这可以通过将输出信号与如先前所述的校准曲线相关来实现。在另一些实施方案中，不需要校准曲线，因为该关系可以是给定测试的内部关系，同时将酶促扩增之前目标基因的拷贝数考虑在内。
本文中所述的方法可用于使特定微生物与经鉴定的抗微生物剂抗性或易感性基因相关联。作为实例，但不作为限制，如果应当与赋予mecA抗性的遗传物质组合鉴定金黄色葡萄球菌和CoNS，则在一些实施方案中，鉴于通常情况下CoNS可被视为抽血的人为产物(即污染物)，了解mecA基因的来源具有临床效用。
在一些实施方案中，检测到的微生物均不具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11所列的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向。在一些实施方案中，检测到赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIAA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向。在一些实施方案中，检测到的一种微生物具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向。在一些实施方案中，检测到的一些微生物具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向。在一些实施方案中，所有检测到的微生物均具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的基因，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向。在一些实施方案中，检测到的所有微生物均具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向，并且其均具有相同的赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质。在一些实施方案中，所有检测到的微生物均具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向，并且其具有不同的赋予抗微生物剂或易感性的遗传物质。
在一些实施方案中，检测到的一种或一些微生物具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向，并且该微生物被鉴定为具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质。在一些实施方案中，开始用抗微生物剂的治疗。在一些实施方案中，改变用抗微生物剂的治疗，例如改变抗微生物剂。
在一些实施方案中，检测到的一种或更多种微生物是与感染例如脓毒症相关的致病性微生物。在一些实施方案中，检测到的一种或更多种微生物是污染物，例如在从对象收集期间或之后引入样品中的污染物。在一些实施方案中，检测到的一种或更多种微生物是对象的共生细菌，即非致病性细菌。在一些实施方案中，与感染相关的致病性微生物和污染物二者均被检测到。在一些实施方案中，与感染相关的致病性微生物和共生细菌二者均被检测到。
在一些实施方案中，检测到的一种、一些或所有微生物具有赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质，例如表11中列出的赋予抗微生物剂抗性的遗传物质，其可以被表4中列出的一种或更多种DIANA(例如SEQ ID NO：141至493)靶向，并且使用本文中所述的技术，例如通过使微生物遗传物质与靶向赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的一种或更多种DIANA(例如具有表4所示序列例如SEQ ID NO：141至493的DIANA)接触，来鉴定赋予抗微生物剂抗性的遗传物质。
在一些实施方案中，使用靶向赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的一种DIANA。在一些实施方案中，使用靶向赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的多于一种DIANA。在一些实施方案中，使用均靶向赋予相同抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的两种或更多种DIANA。
在一些实施方案中，两种或更多种DIANA靶向相同的扩增子。在一些实施方案中，两种或更多种DIANA靶向不同的扩增子。
在一些实施方案中，靶向赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的DIANA例如对于细菌或真菌、对于属或对于物种是通用的。在一些实施方案中，靶向赋予抗微生物剂抗性或易感性的遗传物质的DIANA是病原体特异性的。
为此目的利用两种DIANA探针的非限制性实例包括，在一些实施方案中，一种单一DIANA探针可以用作以通用的方式靶向赋予抗性的遗传物质的更通用的探针，而第二种DIANA探针可以用作以病原体特异性方式靶向赋予抗性的遗传物质的更特异性的探针。在另一些实施方案中，两种DIANA探针均以病原体特异性方式靶向赋予抗性的遗传物质。
在一些实施方案中，在相同的扩增子上完成赋予抗性的遗传物质的病原体特异性检测，而在另一些实施方案中，在不同的扩增子上完成。
化学计量，即检测到的靶标之间的相对信号，可以以多种方式使用，例如，将检测到的遗传物质(例如抗生素抗性基因)与混合群中的特定微生物相关联。这些方法采用绝对和/或半定量本文中所述微生物的操作。
在一些实施方案中，本文中所述的方法包括：
(i)使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与单一微生物物种或微生物组群结合；
(ii)使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质结合；以及
(iii)确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的化学计量；
其中化学计量用于确定哪些微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质。
在一些实施方案中，当在检测中存在最小偏差时，优选使用化学计量，或者如果确实存在偏差，则可以对其进行解释。
在一些实施方案中，当用于病原体ID的基因组序列与赋予抗性的标记ID之间的基因组拷贝数关系是已知的时，优选使用化学计量。在一些实施方案中，当用于病原体ID的基因组序列与赋予抗性的标记ID之间的基因组拷贝数关系虽然不是已知的但可以测量时，优选使用化学计量，或者如果不能测量，则可以对其进行解释。在一些实施方案中，当用于病原体ID的基因组序列与赋予抗性的标记ID之间的基因组拷贝数关系是恒定的时，优选使用化学计量。在一些实施方案中，当用于病原体ID的基因组序列与赋予抗性的标记ID之间的基因组拷贝数关系虽然不是恒定的但在给定范围内(例如，5％、10％、15％、20％或25％)是恒定的时，优选使用化学计量。
在一些实施方案中，当从测定中获得半定量或定量测量结果是可行的时，优选使用化学计量。
在一些实施方案中，化学计量的使用不能以完美的置信度推断所需的信息，而是仅在置信水平内推断。
在一些实施方案中，单一微生物物种或微生物组群的检测是半定量或定量的。在一些实施方案中，赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质的检测是半定量或定量的。
在一些实施方案中，已知用于检测单一微生物物种或微生物组群的靶序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质之间的基因组拷贝数比率。在一些实施方案中，能够确定用于检测单一微生物物种或微生物组群的靶序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质之间的基因组拷贝数比率。在一些实施方案中，能够确定用于检测单一微生物物种或微生物组群的靶序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质之间的基因组拷贝数比率。在一些实施方案中，用于检测单一微生物物种或微生物组群的靶序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质之间的基因组拷贝数比率是恒定的。在一些实施方案中，用于检测单一微生物物种或微生物组群的靶序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质之间的基因组拷贝数比率变化不超过5％、10％、15％、20％或25％。
在一些实施方案中，确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的化学计量包括确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的比率。
在一些实施方案中，检测到多于一种微生物物种，并且确定每种微生物物种的化学计量。在一些实施方案中，如果化学计量(例如，获得的微生物物种的信号与获得的检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的信号之间的比率)与拷贝数比率相同或变化不超过5％、10％、15％、20％或25％，则微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质，所述拷贝数比率为用于鉴定微生物物种的目标序列与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质之间的拷贝数比率。
仅用于举例说明的情况下，不作为限制，考虑同时检测到的两种病原体，即P-1和P-2与单一的赋予抗性的基因(出于举例说明性目的，称为R-1)组合，可能会试图推断R-1是源自P-1还是P-2，或者可能是两者。
出于举例说明性目的，假定，对于P-1和P-2，在测试中获得的检测信号分别等于1,000个单位和50个单位，并且对于R-1，在测试中获得的检测信号等于100个单位。假定系统中没有偏差或噪音，并且已知对于P-1和R-1以及P-2和R-1的基因组拷贝比率为10∶1(用于病原体ID的序列的10个拷贝相对于用于赋予病原体抗性的基因检测的序列的单个拷贝)，则可以推断，由于化学计量，R-1源自P-1而不是P-2。类似地，如果获得的R-1的信号为5，则可以推断R-1源自P-2而不是P-1。类似地，如果获得的R-1的信号为105，则可以推断R-1源自P-1和P-2二者。
在一些实施方案中，确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的化学计量包括考虑到(例如在数学上和/或统计学上)与测定相关的偏差。与测定相关的偏差包括但不限于微生物裂解效率不同、维持高分子量DNA的可能性不同、DNA分离效率不同、酶促扩增效率不同和DIANA检测效率不同。
在一些实施方案中，进行校准操作。在一些实施方案中，在测定的开发期间进行校准操作，例如以考虑与测定相关的偏差。在另一些实施方案中，以密切接近测定时预期条件的方式进行校准操作。
在一些实施方案中，进行逐步校准方式，其中以不同水平进行多次校准。在一些实施方案中，例如将整份样品-输入/结果-输出过程考虑在内来进行单一校准。
在一些实施方案中，校准包括DIANA探针捕获/检测偏差的校准。在一些实施方案中，校准包括放大偏差的校准。在一些实施方案中，校准包括所需裂解产量的校准。在一些实施方案中，校准仅包括上述校准中的一种。在一些实施方案中，校准包括上述校准中的多于一个或全部。在另一些实施方案中，校准包括涵盖多个参数的单一校准。
在一些实施方案中，对包含金黄色葡萄球菌、CoNS和mecA的混合测定结果进行去卷积。在一些实施方案中，校准包括以下中的一项或更多项：(1)在多个负荷输入(扩增子拷贝数)下针对每个靶标的DIANA信号输出及其数学关系；(2)酶促扩增输出与输入，以建立金黄色葡萄球菌与mecA以及CoNS与mecA的数学关系；(3)金黄色葡萄球菌和CoNS的裂解产量与负荷。在一些实施方案中，通过进行以上校准中的一些或全部，在检测到金黄色葡萄球菌和CoNS的情况下，可以建立具有置信区间的数学数以使mecA基因的起源去卷积。
在一些实施方案中，化学计量用作确认步骤。举例来说，但不限于此，应将P-1鉴定为金黄色葡萄球菌，将P-2鉴定为屎肠球菌，并将R-1鉴定为mecA基因；由于在大多数情况下(由使用者定义)，mecA起源于金黄色葡萄球菌，因此不需要化学计量来对R-1的起源进行去卷积。然而，在一些实施方案中，证实该假定具有效用。
在一些实施方案中，化学计量可以用于指示赋予抗性的遗传物质的潜力。作为实例，但不作为限制，化学计量可能指示如果以接近检测限的负荷检测到病原体，则没有检测到的R-1信号意味着它低于其检测限，并且不能对赋予抗性的遗传物质做出任何假定。
在一些实施方案中，化学计量可以用于确定(rule-in)感染。作为实例，但不作为限制，如果检测到R-1，并且通过校准推断出，R-1的检测比P-1的检测更灵敏，则R-1信号的存在指示存在感染及其相应的赋予抗性的基因，但是在一些实施方案中，病原体的ID可能仍然未知。
真菌病原体的无培养鉴定
真菌感染可以是局部的(如鹅口疮的情况)或全身性的。处于全身性真菌感染的重大风险之中的患者包括免疫受损的患者、中性粒细胞减少的患者以及具有长期血管内线的住院患者。在白血病患者中，全身性真菌感染导致约25％的与感染相关的死亡。念珠菌物种引起的感染是医院血流感染的第四最重要原因。在某些其他情况下，真菌感染也是主要问题。在接受肺、胰腺或肝移植的那些患者中，严重的真菌感染可能导致5％至10％的死亡。在多至13％的极低出生体重婴儿中会发生获得性真菌脓毒症。真菌例如假丝酵母(Candidayeast)可以通过血液导管进入血流。
全身性真菌感染的常规诊断是通过血液培养。与细菌一样，血液培养诊断的弱点是延迟适当抗微生物剂的施用。在真菌的情况下这一点甚至更为明显，真菌通常比细菌具有更长的倍增时间。与血液培养相反，要求保护的方法、装置和试剂盒允许快速且准确地鉴定少量血液中的低水平微生物。
真菌感染中普遍存在的病原体包括例如近平滑念珠菌、热带念珠菌、耳念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、吉利蒙念珠菌、皱褶念珠菌、无名念珠菌、挪威念珠菌、平常念珠菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)和棒曲霉(Aspergillusclavatus)。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含所有前述病原体。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体的亚群。在一些实施方案中，测试组或测试选单仅包含前述病原体中的一种。在一些实施方案中，测试组或测试选单包含前述病原体中的一些或全部以及未列出的另外的微生物。
表12中列出了DIANA，例如用于鉴定真菌的DIANA，例如可用于鉴定全身性真菌感染中常见病原体的DIANA，并且其包含SEQ ID NO：15至19和494至571。在一些实施方案中，表12中列出的DIANA探针中的一种(例如SEQ ID NO：15至19和494至571)用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定真菌物种或真菌组群的方法中。在一些实施方案中，表12中列出的一些DIANA探针(例如SEQ ID NO：15至19和494至571)用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定真菌物种或真菌组群的方法中。在一些实施方案中，表12中列出DIANA探针(例如SEQ ID NO：15至19和494至571)全部都用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定真菌物种或真菌组群的方法中。在一些实施方案中，表12中列出的DIANA探针中的一些或全部(例如SEQ ID NO：15至19和494至571)与表12中未列出的DIANA探针(例如SEQ ID NO：15至19和494至571)组合用于本文中所述的方法、装置和试剂盒中，例如用于鉴定真菌物种或真菌组群的方法中。
表12：通常与真菌血流感染相关的DIANA和微生物。
靶标 Seq ID
白念珠菌 015
近平滑念珠菌 016和494至500
克鲁斯氏念珠菌 017
光滑念珠菌 018
热带念珠菌 019和501至510
耳念珠菌 511至520
葡萄牙念珠菌 521至527
乳酒念珠菌 528至539
吉利蒙念珠菌 540至544
皱褶念珠菌 545至551
无名念珠菌 552至561
挪威念珠菌 562至566
平常念珠菌 567至571
试剂盒
本公开内容还提供了将本文中所述DIANA用于本文中所述方法中的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含用于在不事先富集的情况下检测和/或鉴定和/或评估来自样品的一种或更多种微生物的试剂和方案。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于以下过程的试剂和方案：
(i)从样品中耗尽真核生物DNA；
(ii)裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
(iii)分离多种微生物遗传物质；
(iv)扩增多种微生物遗传物质；和
(v)使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列；以及
(vi)检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示样品中存在与血流感染相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
在一些实施方案中，其包括本文中所述的流体装置。在一些实施方案中，试剂盒可另外包含用于本文中所述的任何方法的说明书。所包含的说明书可以包含检测微生物遗传物质的描述，例如通过从样品中耗尽真核生物DNA，裂解微生物细胞，分离遗传物质，扩增遗传物质，使所扩增的遗传物质与DIANA接触以及检测结合。试剂盒还可包含从对象获得样品的描述。在一些实施方案中，说明书包含基于诊断标准选择要测试的对象。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于负荷评估、微生物谱分析和微生物检测的预校准试剂。
在一些实施方案中，试剂以合适的包装提供。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装等。
在一些实施方案中，试剂盒可以手动使用(人工操作)。在一些实施方案中，试剂盒的使用可以是自动化的。用于自动化的非限制性实例包括机器人移液站和本文中所述的流体装置。
实施例
实施例1：多种微生物感染的检测
本实施例显示了使用本文中公开的方法以两个临床相关的负荷水平直接从人全血检测到大肠杆菌为5CFU/ml，表皮葡萄球菌为6CFU/ml，无乳链球菌为11CFU/ml，粪肠球菌为19CFU/ml以及近平滑念珠菌为6CFU/ml。
方法
在以上负荷(以CFU/ml表示)下，用大肠杆菌(ATCC#BAA-2469)、表皮葡萄球菌(ATCC#51625)、无乳链球菌(ATCC#13813)、粪肠球菌(ATCC#29212)和近平滑念珠菌(ATCC#14243)接种抽取到EDTA真空容器中的新鲜人全血，模拟了复杂的微生物感染。
提取1.5ml人造人血液并并置于新的小瓶中。向1.5ml的血液样品添加包含2％(v/v)的吐温-20和1.3％(v/v)的Triton-X100的1.5ml裂解溶液。约2分钟之后，向合并的混合物添加NaCl至终浓度为150至300mM，并添加WAX缀合的磁性颗粒。约2分钟之后，使用稀土磁体将磁性颗粒固定在小瓶表面，并将约3ml溶液移出并置于新的小瓶中。
向新的小瓶添加微生物裂解溶液。微生物裂解溶液包含以下：交联和亲和纯化的溶菌酶(2至13mg)、变溶菌素(10至350U)、酶解酶(18至200U)和溶葡萄球菌素(65至250U)以及基于洗涤剂的试剂，其包含吡喃葡萄糖苷、阳离子洗涤剂和磺基甜菜碱(所有这些试剂的浓度均高于其各自的CMC(＞10×))。微生物裂解溶液还包含EDTA(约10mM)和2-巯基乙醇(约25mM)。将合并的反应混合物孵育约10至15分钟，此后向溶液添加WAX缀合的磁性颗粒。约2分钟之后，使用稀土磁体将磁性颗粒固定在小瓶表面，并且将微生物裂解溶液移出并弃去。
用包含1M NaCl的缓冲洗涤溶液反复洗涤珠。用pH 12.5的洗脱试剂将微生物DNA从珠洗脱下来。洗脱后，用以下引物序列(5`-3`)对微生物DNA进行16S/18S rDNA的PCR：
每种引物包含半抗原部分用于随后的标记。PCR之后，将样品等分到17个室中，每个室中装载有具有表1中标示的序列的生物素化γ-修饰PNA探针，和包含吐温-20、NaCl和聚-EG-12,000的侵入支持试剂。将每个孔加热至75℃至90℃，保持4分钟，并添加5ml MyOneC1链霉亲和素包被珠贮存液。将γPNA探针固定在珠上之后，将珠在至少75℃至95℃的温度下在包含150至550mM NaCl的溶液中洗涤。在洗涤之后，向每个室添加包含靶向引物-半抗原的HRP-缀合物的溶液，其与捕获的扩增子上的游离半抗原(如果存在的话)结合。在中性低盐洗涤下进行多个洗涤步骤之后，添加鲁米诺以仅在捕获微生物DNA的地方产生明显的光学特征。使用Promega GloMax读板仪读取光学特征，其中积分时间为2.5秒/孔。每个反应重复三次。
结果
只能在大肠杆菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌和近平滑念珠菌通道(这些通道来自用对以上病原体具有特异性的γ-修饰的PNA探针激活的室)中发现清楚可辨的光学特征。参见图7。还要注意根据微生物负荷输入和rDNA拷贝的组合评估负荷的能力。
这些结果表明本文中公开的组合物和方法可以使具有来自样品血液的至少两种特定病原体的复杂微生物感染去卷积。因此，本文中公开的组合物和方法可用于检测和鉴定样品中的微生物。
等同方案
认为上述书面说明书足以使本领域普通技术人员能够实施本发明。本发明在范围上不受所提供的实施例的限制，因为这些实施例旨在仅作为本发明的一个或更多个方面的说明。其他功能上等同的实施方案被认为在本发明的范围内。根据前述描述，除了本文中所示的和所述的那些以外的本发明的多种修改对于本领域技术人员而言将变得明显。本发明的每个限制可以包括本发明的多个实施方案。因此，预期涉及任一个要素或要素组合的本发明的每个限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用上不限于附图中阐述或示出的部件的构造和布置的细节。本发明能够具有另一些实施方案并且能够以多种方式实践或实施。
此外，本文中使用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加项目。
在本申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。
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Claims (63)

1.鉴定来自对象样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法，所述方法包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列；以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
2.鉴定来自对象样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法，所述方法包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)孵育少于10分钟，以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)进行的孵育在约20℃至约65℃的温度下进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约20℃至约64℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约30℃至约64℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约37℃至约64℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约40℃至约64℃。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约50℃至约64℃。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约37℃至约60℃。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约40℃至约60℃。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度为约50℃至约60℃。
12.根据权利要求2所述的方法，其中将所述扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)孵育在包含一价盐的孵育溶液中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一价盐以高于50mM的浓度存在。
14.根据权利要求2所述的方法，其中将所述扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)孵育在包含二价盐的孵育溶液中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述二价盐以高于5mM的浓度存在。
16.根据权利要求2所述的方法，其中将所述扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)孵育在包含三价盐的孵育溶液中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述三价盐以高于0.1mM的浓度存在。
18.根据权利要求2所述的方法，其中将所述扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)孵育在pH为约10.2至约12.2的孵育溶液中。
19.监测对象中一种或更多种特定微生物物种随时间的病原体负荷的方法，所述方法包括：
在第一时间测量从所述对象获得的第一样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷，以及
在第二时间测量从所述对象获得的第二样品中的病原体负荷，其中在从所述对象获得所述第一样品之后至少约1小时的时间从所述对象获得所述第二样品，其中
从所述第一样品和第二样品中耗尽真核生物DNA，
裂解所述第一样品和所述第二样品中的一种或更多种微生物细胞，其中所述一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质，
分离所述多种微生物遗传物质，
扩增所述多种微生物遗传物质，
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在从所述对象获得所述第一生物样品之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，从所述对象获得所述第二生物样品。
21.确定对象中一种或更多种特定微生物物种对一种或更多种抗微生物剂的易感性的方法，所述方法包括：
从所述对象获得一份或更多份样品，任选地将所述一份或更多份样品中的任意一份或更多份分成多份样品；
在从所述对象获得的一份或更多份样品中的一份中或者所述多份样品中的一份中测量所述一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷；
将从所述对象获得的一份或更多份样品中的至少一份或者将所述多份样品中的至少一份与所述一种或更多种抗微生物剂孵育至少1小时，以获得用一种或更多种抗微生物剂处理的样品；以及
测量用所述一种或更多种抗微生物剂处理的样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷，
其中使用与所述一种或更多种抗微生物剂一起孵育的样品中的一种或更多种特定微生物物种的病原体负荷来确定所述病原体的抗微生物剂易感性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述多份样品等于2、3、4、5或6份或更多份样品。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或更多种抗微生物剂选自氨苄西林、阿莫西林、金霉素、杆菌肽、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢克洛、头孢氨苄、头孢拉定、环丙沙星、克拉维酸、氯唑西林、双氯西林、红霉素、氟氯西林、庆大霉素、短杆菌肽、甲氧西林、新霉素、苯唑西林、青霉素、万古霉素、卡泊芬净、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和咪康唑。
24.鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法，所述方法包括：
将所述样品施加至装置，所述装置包含：
样品入口；
与所述样品入口流体连通的流体通道，其中所述流体通道的长度为至少1cm且通道长宽比为至少5∶1；
与所述流体通道流体连通的第一裂解区；
与第一裂解区流体连通的第一分离区；
与所述第一分离区流体连通的第二裂解区；
与所述第二裂解区流体连通的第二分离区；
与所述第二分离区流体连通的至少一个反应区；
与至少一个所述反应区流体连通的扩增区；
多个处理室，其各自与至少一个所述反应区和/或所述扩增区流体连通；和
一个或更多个检测区，其中所述检测区包含一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)，所述DNA侵入人工核酸(DIANA)包含选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列。
25.如权利要求24所述的方法，其包括与每个处理室流体连通的检测区。
26.如权利要求24所述的方法，其中该流体装置具有n个检测区并且能够鉴定n+x种特定微生物物种，并且其中x大于或等于1。
27.鉴定来自对象的样品中的一种或更多种特定微生物物种的方法，所述方法包括：
将所述样品施加至流体装置，所述流体装置包含：
流体贮存器；
与所述流体贮存器流体连通的气体室；
与所述流体贮存器流体连通的流体通道；和
一个或更多个检测区，其中所述检测区包含一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)，所述DNA侵入人工核酸(DIANA)包含选自SEQ ID NO：20至571的一种或更多种序列，
其中所述流体贮存器的纵向轴线与所述流体通道的纵向轴线基本上垂直，进行以下步骤：
将第一流体引入所述流体贮存器，其中所述第一流体是液体；
将第二流体引入所述气体室，其中所述第二流体是气体；以及
向所述第二流体施加压力，以使得所述第二流体从所述气体室流至所述流体贮存器，并推动所述第一流体从流体柱进入所述流体通道中，
其中所述一种或更多种DIANA与所述样品的结合指示所述样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
28.如权利要求27所述的方法，其包括使体积为至少0.1ml的第一流体经由所述流体通道流入所述流体贮存器中。
29.如权利要求27所述的方法，其包括在所述流体贮存器中引入气体的流或泡以引起所述第一流体与试剂混合，其中所述气体从所述流体通道输送。
30.如权利要求27所述的方法，其包括使所述气体从所述流体贮存器流入所述气体室中，并基本上阻止所述第一流体和/或试剂流入所述气体室中。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述流体装置具有n个检测区并且能够鉴定n+x种特定微生物物种，并且其中x大于或等于1。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述对象是哺乳动物，例如人。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述对象被怀疑患有感染，例如细菌或真菌感染。
34.流体装置，其包含一个或更多个处理室和一个或更多个检测区，其中包含选自SEQID NO：20至571的一个或更多个序列的一种或更多种DNA侵入人工核酸(DIANA)被包含在至少一个所述检测区内。
35.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中每个流体贮存器的容积为至少0.1mL。
36.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中每个气体室与流体贮存器流体连通。
37.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中每个气体室的容积为至少0.1ml。
38.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中每个流体通道与一个或更多个流体贮存器流体连通。
39.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中每个流体通道的容积小于2000μL。
40.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
41.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中所述流体通道的长度为至少1cm。
42.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其中所述流体通道的通道长宽比为至少5∶1。
43.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其包含至少10个从流体枢纽分支的分支通道。
44.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其包含多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间。
45.如权利要求24至34中任一项所述的方法或流体装置，其包含多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
46.鉴定来自患有感染的对象的样品中的微生物物种组群中的哪些微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法，所述方法包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQID NO：1至4和20至31的序列；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：141至493的序列；
检测和量化所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，并检测所述多种DIANA中的一种或更多种与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的微生物遗传物质的结合；以及
确定从检测到的单一微生物物种或微生物组群获得的信号与从检测到的赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质获得的信号之间的化学计量；
其中所述化学计量用于确定哪些微生物物种包含赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质。
47.鉴定与对象中的心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法，其包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)和与心内膜炎和/或脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：20至131的一个或更多个序列；以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在与心内膜炎和/或脓毒症相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
48.鉴定与对象中的新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群的方法，其包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)和与新生儿脓毒症相关的单一微生物物种或微生物组群结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：132至140的一个或更多个序列；以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在与新生儿脓毒症相关的一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述样品的体积为0.1至1ml。
50.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述样品的体积为0.5至2.0ml。
51.鉴定在对象的病原体中赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质的方法，其包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，所述多种DNA侵入人工核酸(DIANA)与赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质结合，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：141至493的一个或更多个序列；以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与所述微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中的病原体中存在赋予对抗微生物剂的抗性或降低的易感性的遗传物质。
52.鉴定对象中的真菌物种或真菌组群的方法，其包括：
从所述样品中耗尽真核生物DNA；
裂解所述样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物遗传物质；
分离所述多种微生物遗传物质；
扩增所述多种微生物遗传物质；
使所扩增的微生物遗传物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触，其中所述多种DIANA包含选自SEQ ID NO：494至571的一个或更多个序列；以及
检测所述多种DIANA中的一种或更多种与其相应单一真菌物种或真菌组群的微生物遗传物质的结合，其中结合的检出指示所述样品中存在一种或更多种特定真菌物种或真菌组群。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法或流体装置，其中所述多种DIANA中的一种或更多种被修饰成包含一个或更多个结合部分。
54.根据权利要求53所述的方法或流体装置，其中所述一个或更多个结合部分是非共价结合部分。
55.根据权利要求53或54中任一项所述的方法或流体装置，其中所述一个或更多个结合部分是共价结合部分。
56.根据权利要求1至53中任一项所述的方法或流体装置，其中所述多种DIANA中的一种或更多种包含接头。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法或流体装置，其中所述多种DIANA中的一种或更多种还包含间隔区。
58.根据权利要求1至27或46至57中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述血液样品是全血样品。
60.组合物，其包含含有选自SEQ ID NO：20至571的序列的一种或更多种DIANA。
61.试剂盒，其包含一种或更多种DIANA，其中所述DIANA含有选自SEQ ID NO：20至571的一个或更多个序列。
62.根据权利要求60或61中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或更多种DIANA被修饰成包含一个或更多个结合部分。
63.根据权利要求60或61中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或更多种DIANA包含接头。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11840721B2 (en) * 2017-04-03 2023-12-12 Helixbind, Inc. Methods and devices for identifying microbial infections
EP3956479A4 (en) * 2019-04-16 2023-01-25 Helixbind, Inc. METHODS AND DEVICES FOR ULTRASENSITIVE DIRECT DETECTION OF MICROORGANISMS
CN115175765B (zh) 2020-02-25 2024-05-07 海利克斯拜恩德股份有限公司 用于流体系统的试剂载体

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033720A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Hôpitaux Universitaires De Geneve Analytical chip for detection of 16s-rrna from clinically relevant bacteria and analytical method based thereon
WO2004061085A2 (en) * 2002-12-30 2004-07-22 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for pathogen detection and analysis
US20060160121A1 (en) * 2004-10-05 2006-07-20 Wyeth Probe arrays for detecting multiple strains of different species
US20100021910A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-28 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Methods and Systems for Microfluidic DNA Sample Preparation
US20110177960A1 (en) * 2006-03-10 2011-07-21 Ellen Murphy Microarray for monitoring gene expression in multiple strains of Streptococcus pneumoniae
US20120329050A1 (en) * 2009-12-22 2012-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US20130267429A1 (en) * 2009-12-21 2013-10-10 Lawrence Livermore National Security, Llc Biological sample target classification, detection and selection methods, and related arrays and oligonucleotide probes
US20150099657A1 (en) * 2012-05-20 2015-04-09 Helixbind Methods and compositions for the diagnosis of sepsis using gamma peptide nucleic acids
US20150284764A1 (en) * 2012-11-06 2015-10-08 Viktor Veniaminovich Tets Method for Determining the Sensitivity of Microorganisms to Antimicrobial Substances
CN105063759A (zh) * 2015-08-03 2015-11-18 宁夏医科大学总医院 检测脑脊液病原菌的基因芯片
WO2016044621A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Helixbind, Inc. Methods and devices for detecting and identifying microorganisms

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214555B1 (en) 1996-05-01 2001-04-10 Visible Genetics Inc. Method compositions and kit for detection
DE10027113A1 (de) * 1999-12-23 2001-09-27 Andreas Hoeft Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens
US20040010129A1 (en) * 2001-11-01 2004-01-15 Po-Hsiang Hsu Nucleic acid kit for bacterial pathogen diagnosis and method for using the same
EP1473370A3 (en) * 2003-04-24 2005-03-09 BioMerieux, Inc. Genus, group, species and/or strain specific 16S rDNA Sequences
US20070031850A1 (en) 2003-06-05 2007-02-08 Mounts William M Nucleic acid arrays for detecting multiple strains of a non-viral species
FR2881437B1 (fr) 2005-01-31 2010-11-19 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique
JP2009514551A (ja) 2005-11-09 2009-04-09 プリメーラ バイオシステムズ インコーポレーティッド 病原体の多重定量検出方法
WO2008061091A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Grandis Jennifer R Antisense guanidinium peptide nucleic acid (gpna) oligonucleotides as antitumor agents
EP2806037B1 (en) 2008-05-13 2016-09-21 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
US20120276530A1 (en) 2009-08-24 2012-11-01 Trustees Of Boston University Label-free sensing of pna-dna complexes using nanopores
CN102918166A (zh) 2010-03-30 2013-02-06 波士顿大学董事会 用于纳米孔解链依赖性核酸测序的工具和方法
WO2011143340A2 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Trustees Of Boston University Use of nanopore arrays for multiplex sequencing of nucleic acids
US9193758B2 (en) 2011-04-08 2015-11-24 Carnegie Mellon University Center For Technology Transfer & Enterprise Conformationally-preorganized, miniPEG-containing γ-peptide nucleic acids
EP2780480B1 (en) 2011-11-14 2018-10-03 Carnegie Mellon University Gamma-pna miniprobes for fluorescent labeling
US20140200167A1 (en) 2012-08-01 2014-07-17 Nanomdx, Inc. Functionally integrated device for multiplex genetic identification
CN104867962B (zh) 2015-05-06 2019-04-05 京东方科技集团股份有限公司 一种oled阵列基板及其制作方法、oled显示装置
JP7073328B2 (ja) * 2016-03-14 2022-05-23 ヘリックスバインド・インコーポレイテッド 集積流体デバイスと関連する方法
US11840721B2 (en) * 2017-04-03 2023-12-12 Helixbind, Inc. Methods and devices for identifying microbial infections
EP3956479A4 (en) 2019-04-16 2023-01-25 Helixbind, Inc. METHODS AND DEVICES FOR ULTRASENSITIVE DIRECT DETECTION OF MICROORGANISMS

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033720A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Hôpitaux Universitaires De Geneve Analytical chip for detection of 16s-rrna from clinically relevant bacteria and analytical method based thereon
WO2004061085A2 (en) * 2002-12-30 2004-07-22 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for pathogen detection and analysis
US20060160121A1 (en) * 2004-10-05 2006-07-20 Wyeth Probe arrays for detecting multiple strains of different species
US20110177960A1 (en) * 2006-03-10 2011-07-21 Ellen Murphy Microarray for monitoring gene expression in multiple strains of Streptococcus pneumoniae
US20100021910A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-28 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Methods and Systems for Microfluidic DNA Sample Preparation
US20130267429A1 (en) * 2009-12-21 2013-10-10 Lawrence Livermore National Security, Llc Biological sample target classification, detection and selection methods, and related arrays and oligonucleotide probes
US20120329050A1 (en) * 2009-12-22 2012-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US20150099657A1 (en) * 2012-05-20 2015-04-09 Helixbind Methods and compositions for the diagnosis of sepsis using gamma peptide nucleic acids
US20150284764A1 (en) * 2012-11-06 2015-10-08 Viktor Veniaminovich Tets Method for Determining the Sensitivity of Microorganisms to Antimicrobial Substances
WO2016044621A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Helixbind, Inc. Methods and devices for detecting and identifying microorganisms
CN105063759A (zh) * 2015-08-03 2015-11-18 宁夏医科大学总医院 检测脑脊液病原菌的基因芯片

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US11840721B2 (en) 2023-12-12
EP3607093A1 (en) 2020-02-12
US20210017581A1 (en) 2021-01-21

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