CN110831438A - 包含查耳酮的杀线虫剂协同组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杀线虫剂的协同组合物，其包含查耳酮的组合，查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30，具有有效的杀线虫和抑线虫性能。单独的查耳酮在浓度高达10^‑2‑10^‑3M时显示100％的杀线虫活性，而查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30的组合则在低至10^‑4‑10^‑6M的浓度下显示100％的杀线虫活性，其产生协同作用，其中所述查耳酮的比例为1:1。与单独的每种查耳酮相比，查耳酮的这些组合还显示出有效的抑线虫活性。该协同杀线虫组合物为环境安全的并且对人和动物无毒。

Description

包含查耳酮的杀线虫剂协同组合物

技术领域

本发明涉及杀线虫剂，其是在农业领域中用于杀死植物寄生虫、特别是线虫的组合物。更具体地，本发明涉及包含具有杀线虫和抑线虫特性的查耳酮组合的杀线虫剂协同组合物。

背景技术

线虫是农业产业的一个主要威胁，因为它们给产量造成严重损失，从而对经济产生重大影响。众所周知，线虫仅次于昆虫，会对蔬菜作物(例如西红柿、葫芦、马铃薯)、水果作物(例如柑橘、椰子、番石榴、葡萄和石榴)、粮食(例如大米和小麦)、重要的经济作物(如棉花和烟草)、观赏开花植物(例如非洲菊和玫瑰)造成严重损害。已经发现线虫单独或与其他土壤微生物结合会攻击植物的几乎每个部分，包括根、茎、叶、果实和种子。预计它们会在全球范围内造成12.3％的产量损失(1570亿美元)，其中据报道4030万美元来自印度(Singh等，2015)。

属于根结线虫属的根结线虫是园艺和大田作物上三个对经济造成最大破坏的植物寄生线虫属之一。它们是几种植物根的专性寄生虫，并且南方根结线虫是全球主要害虫之一。

杀线虫剂是用于杀死这些植物寄生线虫的组合物。所使用的大多数杀线虫剂是对人有高毒性并且也是对有益的土壤细菌有害的化学组合物。几种杀线虫剂还显示出会污染地下水，并导致臭氧层损耗。一种著名的杀线虫剂甲基溴已在包括美国和印度在内的多个国家被禁止使用。广泛用于大田作物的另一种高毒性杀线虫剂是呋喃丹，由于其对鸟类和蜜蜂的有害作用，已在多个国家逐步淘汰。诸如甲拌磷之类的杀线虫剂很容易穿过土壤进入地下水并污染地下水。

与化学杀线虫剂相关的严重缺陷使得必须开发用于控制线虫的新技术。一种这样的方法是产生转基因植物品系，其表达对线虫具有抗性的转基因基因。但是，这是耗时且昂贵的方法，其需要大量的前期研究活动。在许多国家，引入转基因品系遭到强烈反对。

一种有效的方法涉及杀线虫剂组合物的产生，所述杀线虫剂对环境安全、无毒并且易于产生和使用。

查耳酮是一组天然存在的化合物，其中央核心由芳族酮和烯酮组成；并且是母体化合物(2E)-1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮的衍生物。查耳酮及其衍生物是具有广谱生物活性的分子。已知查耳酮具有抗逆转录病毒、抗炎、抗寄生虫、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物、抗菌和抗肿瘤特性。已知在各种双子叶植物和单子叶植物、蕨类植物和裸子植物中自然存在几种查耳酮。由于查耳酮和类查耳酮结构自然存在于许多植物中，因此使其为生态友好的；并且它们与几种生物活动的联系大大增加了其在农业中的潜在用途。

查耳酮((2E)-1,3-二苯基丙-2-烯-1-酮)具有化学式C₁₅H₁₂O，而其他查耳酮通常是具有式X结构的该母体化合物的衍生物：

查耳酮结构由两个芳环，即环A和环B组成，它们通过三碳a,β-不饱和羰基系统连接。已知至少有三十种天然存在的查耳酮具有与环A或B相连的几种化学基团。

表1提供了三十种查耳酮(查耳酮1至查耳酮30)的结构，其中基本结构为式X中提供的结构。

表1

天然存在的查耳酮名称和结构

Attar等人已经表明，已知查耳酮具有杀线虫活性，但是，各个查耳酮的功效变化很大，在不同浓度下从低至5％到高达100％的杀线虫活性。此外，仅在非寄生型线虫秀丽隐杆线虫上测试了查耳酮的作用。在高于10^-2M的浓度下观察到了各个查耳酮的活性。由于毒性、土壤污染、渗入地下水和其他相关问题，使用较高浓度的化合物以实现最小抑制作用变得非常受限制。

一组查耳酮可统一表示为结构式1：

查耳酮17的化学名称为(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮，分子式如式2所示：

查耳酮25的化学名称为(2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮，分子式如式3所示：

查耳酮30的化学名称为(2E)-3-苯基-1-(2-噻吩基)-2-丙烯-1-酮，分子式如式4所示：

查耳酮17、查耳酮25和查耳酮30在实验室条件下浓度为10^-4M时，已分别显示出针对秀丽隐杆线虫的杀线虫活性。但是，它们在农业领域中对根结线虫以及对处理过的植物的生长的影响尚不清楚。通常，大多数杀线虫剂对植物生长具有不利影响，并且还对植物健康生长所需的重要土壤细菌有害。如现有技术中已知的，查耳酮的使用具有其自身的挑战，其不仅限于经济方面、毒性浓度以及对植物生长和环境的不利影响。

本发明考虑了现有技术的缺点，并提供了一种使用包含非常低浓度的查耳酮组合的组合物防治线虫的方法，从而使其在实际使用中对环境安全。

发明目的

因此，本发明的主要目的是提供杀线虫剂的协同组合物。

本发明的另一个目的是提供包含查耳酮组合的协同杀线虫组合物。

本发明的又一个目的是提供一种协同杀线虫组合物，其中，查耳酮的浓度在10^-4-10^-6M的范围内。

本发明的又一个目的是提供一种协同杀线虫组合物，其中，在10^-4-10^-6M的范围内的查耳酮的浓度足以显示对根结线虫的杀线虫活性。

本发明的又一个目的是提供对有益土壤微生物无害的协同杀线虫组合物。

本发明的又一个目的是提供协同杀线虫组合物，其除防治根结线虫种群外还显示出对植物具有植物滋补作用。

发明内容

本发明涉及杀线虫剂组合物，其用于农业目的以防治植物寄生虫，特别是线虫。更具体地，本发明涉及包含查耳酮组合的杀线虫剂的协同组合物。

在主要实施方式中，本发明提供了杀线虫剂的协同组合物，所述杀线虫剂包括查耳酮的组合，其属于称为查耳酮的一组化合物，并且是母体化合物1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮的衍生物。更具体地，本发明提供了杀线虫剂的组合物，其包含至少两个查耳酮的组合，其中所述组合包括：

1.查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}和查耳酮25{(2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮；

或者

2.查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}和查耳酮30{(2E)-3-苯基-1-(2-噻吩基)-2-丙烯-1-酮}；

其中

所述查耳酮的比例为1：1；和

所述查耳酮是具有结构式1的化合物(2E)-1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮的衍生物：

已知查耳酮显示出杀线虫活性，但是，大多数都在浓度高达10^-2M时显示活性。此外，将线虫与单个查耳酮接触会需要24-30小时使线虫麻痹，并且至少需要5天才能诱发线虫死亡。本发明提供了在低至10^-4-10^-6M浓度下具有有效杀线虫活性的查耳酮组合的协同组合物，其中，在2小时内可见线虫的麻痹效果并且在24小时内诱导线虫死亡。

在又一个实施方式中，本发明提供了含有查耳酮的杀线虫剂的协同组合物，其中以每株植物5-40mg的浓度对植物使用包含查耳酮的杀线虫剂是特别有效的，对于土壤中的线虫显示出杀线虫和抑线虫活性，并限制了在处理过的植物根部形成线虫诱导的虫瘿的数量。因此，至少两种查耳酮的协同组合作为有效且非常经济的杀线虫组合物。

附图说明

可以参考以下附图获得对本发明方法的完整理解：

图1是在96孔板实验中查耳酮17和查耳酮25组合对线虫的作用的图示。

图2是在96孔板实验中查耳酮17和查耳酮30组合对线虫的作用的图示。

图3是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第10天植物芽的长度的影响的图示。

图4是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天植物芽的长度的影响的图示。

图5是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第35天植物芽长度的影响的图示。

图6是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第10天植物叶片长度的影响的图示。

图7是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天植物叶片长度的影响的图示。

图8是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第35天植物叶片长度的影响的图示。

图9是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第10天发育的花的数量的影响的图示。

图10是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天发育的花的数量的影响的图示。

图11是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第35天发育的花的数量的影响的图示。

图12是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天发育的果实数量的影响的图示。

图13是与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天发育的果实数量的影响的图示。

图14描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对经处理植物在第35天发育的果实数量的影响的图示。

图15描绘了在用相应杀线虫剂处理14天后(样品1)，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图16描绘了在用相应杀线虫剂处理14天后(样品2)，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图17描绘了在用相应杀线虫剂处理19天后(样品1)，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图18描绘了在用相应杀线虫剂处理19天后(样品2)，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图19描绘了在用相应杀线虫剂处理19天后(样品3)，表3中提供的化学或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图20描绘了表3中提供的化学或生物杀线虫剂在25天第一次处理、然后在第25天第二次处理后黄瓜植株根上虫瘿形成程度的影响，以及在第二次处理20天后(即第45天)对黄瓜植株根上虫瘿形成程度影响的图示。

发明详述

现在将在下文中详细描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解释为限于在此阐述的实施方式。相反，提供实施方式使得本公开将是透彻的，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。

本文使用的术语“杀线虫剂”是指具有杀线虫和/或抑线虫活性的化合物或化合物的组合。

本文使用的术语“植物滋养作用”是指通过使用特定的化合物或化合物的组合在已处理植物或农作物的生长和发育中使用所显示的其他积极优势，而不是已使用输入/过程的直接效应。

本发明涉及一种协同组合物，其包含活性化合物，所述活性化合物具有特别是针对根结线虫的杀线虫活性，并且对处理过的农作物表现出植物滋养作用。更具体地，本发明涉及杀线虫剂的协同组合物，其包含查耳酮的组合。查耳酮的协同组合是独特的，作为杀线虫组合物非常有效，并且与其他现有的线虫防治方法相比更为经济。尽管查耳酮单独显示杀线虫活性，但是至少两种查耳酮的组合提高了功效，带来了协同作用，并且显著减少了杀线虫活性所需的查耳酮的量，因此降低了组合物的生产成本。作为附加的优点，所述查耳酮的协同组合物对处理过的农作物具有植物滋养作用，显示出至少植物芽和叶的长度以及农作物所开的花和结的果实的数量的增加。

本发明涉及用于防治线虫的协同组合物，其包含在10^-2-10^-3M的浓度下具有100％的抗线虫功效的有效量的式2化合物

和浓度为10^-2-10^-3M时具有100％的抗线虫功效的有效量的式1化合物

其中，

环A为

其中，

式1与式2的比例为1:1；

所述组合物在10^-4-10^-6M的浓度下具有100％的协同抗线虫功效；并且

所述组合物对土壤微生物具有低活性。

在本发明的主要实施方式中，本发明提供了包含查耳酮的杀线虫剂组合物，其中所述杀线虫剂组合物是至少两种查耳酮的协同组合，包括：

1.查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}和查耳酮25{(2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮；

或者

2.查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}和查耳酮30{(2E)-3-苯基-1-(2-噻吩基)-2-丙烯-1-酮}；

所选查耳酮的比例为1:1；并且

所述查耳酮是具有结构式1的化合物(2E)-1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮的衍生物：

单独的查耳酮在长达3天的时间内，浓度高达10^-2-10^-3M时，显示出100％的杀线虫活性。所提出的包含查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30的特定组合的组合物，在一天之内以10^-4-10^-6M的浓度观察到100％的杀线虫活性。单独的查耳酮需要约24-30小时使线虫麻痹(抑线虫活性)，并且需要72-120小时以诱导线虫死亡(杀线虫活性)，而查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30的协同组合使线虫在2小时内麻痹，并在24小时内诱导线虫死亡。因此，提出的查耳酮组合作用为有效的抑线虫和杀线虫组合物。具有有效的抑线虫性能的杀线虫组合物是非常期望的特征，其使得所述组合物能够在非常早期作用于寄生虫。因此，所提出的杀线虫剂的协同组合物具有显著高的抑线虫性能，并且非常经济。

所述杀线虫组合物还包含至少一种增量剂、乳化剂和/或表面活性剂。

所述杀线虫组合物包括农业化学活性化合物，例如能够处理植物的物质、杀真菌剂、杀细菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭螺剂、安全剂、植物生长调节剂、植物养分和生物防治剂。

在另一个实施方式中，本发明有利地提供了包含查耳酮的杀线虫剂的组合物，其中查耳酮显示出杀线虫和抑线虫的特性，但是，查耳酮对其他有益的土壤微生物没有显示出严重的影响。更具体地说，查耳酮在10^-4-10^-6M的浓度下具有100％的杀线虫活性，但对土壤微生物(如铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌)的活性却大大降低。

在又一个实施方式中，本发明有利地提供了包含查耳酮的杀线虫剂的协同组合物，其中，由查耳酮组成的杀线虫剂的使用显示出对处理过的作物的植物滋养作用，不限制作物的生长或生产力，实际上提高了处理过的作物的整体生产力。所述含有查耳酮的杀线虫剂组合物以每株植物5-40mg的浓度施用，不会不利地影响植物的整体生长或生产力，包括芽的生长、叶片长度以及植物开花和结果的数量。

在又一个实施方式中，本发明提供了包含查耳酮的杀线虫剂的协同组合物，其中包含查耳酮的杀线虫剂在植物上的使用对土壤中的植物寄生线虫具有剧烈的杀线虫和/或抑线虫作用。所述包含查耳酮的杀线虫剂的组合物以每株植物5-40mg的浓度施用，杀死了土壤中约95％的线虫，破坏了活的线虫，并且未观察到新的线虫幼虫。包含查耳酮的杀线虫剂比化学杀线虫剂(呋喃丹)和生物杀线虫剂(籼稻异小杆线虫(昆虫病原线虫)和杀线虫真菌(淡紫拟青霉))更有效。

在又一个实施方式中，本发明有利地提供了包含查耳酮的杀线虫剂的协同组合物，其中在植物上使用包含查耳酮的杀线虫剂严重限制了线虫诱导的虫瘿的生长和数量。与未处理的植物和用其他众所周知的杀线虫剂(例如化学杀线虫剂(呋喃丹)和生物杀线虫剂(昆虫病原线虫籼稻异小杆线虫和淡紫拟青霉))处理过的植物相比，在处理过的植物的根部虫瘿形成非常低。

在本发明的另一个实施方式中，所述杀线虫组合物还包含能够显示多部位作用的化合物，例如波尔多混合物、敌菌丹、克菌丹、百菌清、氢氧化铜、环烷酸铜、氧化铜、氯氧化铜、硫酸铜(2+)、抑菌灵、二噻农、多果定、多果定游离碱、福美铁、氟代福尔培、福尔培、双胍辛盐、双胍辛乙酸盐、双胍辛胺、双胍辛胺苯磺酸盐、双胍辛胺三乙酸盐、代森锰铜、代森锰锌、代森锰、代森联、代森联锌、喹啉铜、普罗帕脒、丙森锌、硫和硫制剂(包括多硫化钙、福美双、甲苯氟磺胺、代森锌和福美锌)。

在本发明的另一个实施方式中，所述杀线虫组合物还包括能够诱导宿主防御的化合物，例如阿拉酸式苯-5-甲基、异噻菌胺、噻菌灵和噻酰菌胺。

在本发明的另一个实施方式中，杀线虫组合物还包括脂质和膜合成的抑制剂，例如联苯、地茂散、氯硝胺、克瘟散、土菌灵、iodocarb、异稻瘟净、稻瘟灵、霜霉威、霜霉威盐酸盐、胺丙威、吡菌磷、五氯硝基苯、四氯硝基苯和甲基立枯磷。

本发明的活性化合物组合和杀线虫组合物可以进一步包括至少一种其它附加组分，如助剂、溶剂、载体或支撑体、填料、表面活性剂或增量剂，它们都是农业上可接受的。根据本发明的一个优选实施方式，本发明的活性化合物组合和杀线虫组合物还包括助剂、溶剂、载体、表面活性剂和/或增量剂。

根据本发明，术语“载体”或“支撑体”包括天然或合成的有机或无机物质，其为了更好的适应性与活性化合物混合或组合，以应用到植物或植物部分或种子。支撑体或载体，可以是固体或液体，通常是惰性的，应该适合在农业中使用。合适的固体或液体载体/支撑体包括例如铵盐和天然地面矿物，例如高岭土、粘土、滑石粉、白垩、石英、凹凸棒石、蒙脱石或硅藻土，以及地面合成矿物，例如细二氧化硅、氧化铝和天然或合成硅酸盐、树脂、蜡、固体肥料、水、醇(特别是丁醇)、有机溶剂、矿物油和植物油及其衍生物。也可以使用这种支撑体或载体的混合物。适用于颗粒的固体支撑体/载体为：例如，粉碎和分馏的天然矿物，例如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石、无机和有机膳食的合成颗粒，以及有机材料的颗粒，例如锯末、椰子壳、玉米棒子和烟草秸秆。合适的液化气态增量剂或载体是在环境温度和大气压下呈气态的液体，例如气溶胶推进剂，例如丁烷、丙烷、氮气和二氧化碳。增粘剂，例如羧甲基纤维素和呈粉末、颗粒和胶乳形式的天然和合成聚合物，例如阿拉伯胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯或天然磷脂，例如脑磷脂和卵磷脂以及合成磷脂，可以用于制剂中。其他可能的添加剂是可以任选地进行改性的矿物油和植物油以及蜡。如果使用的增量剂是水，则例如也可以使用有机溶剂作为辅助溶剂。合适的液体溶剂基本上是：芳族化合物，例如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯化芳族化合物或氯化脂族烃，例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂族烃，例如环己烷或石蜡；例如矿物油馏分，矿物和植物油；醇，例如丁醇或乙二醇，以及它们的醚和酯；酮，例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物还包含“表面活性剂”，其包括离子型或非离子型的乳化剂、分散剂或湿润剂或这些表面活性剂的混合物。可以提及例如聚丙烯酸盐、木质素磺酸盐、酚磺酸盐或萘磺酸盐、环氧乙烷与脂肪醇或脂肪酸或与脂肪胺的缩聚物、取代的酚(特别是烷基酚或芳基酚)、磺基琥珀酸酯的盐、牛磺酸衍生物(特别是牛磺酸烷基酯)、聚氧乙基化醇或酚的磷酸酯、多元醇的脂肪酸酯以及上述具有硫酸、磺酸和磷酸盐功能的化合物的衍生物。优选地，表面活性剂含量可以占组合物重量的5％至40％。

还可以包括其他组分，例如防护胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、稳定剂、螯合剂。更一般而言，活性材料可以与符合常规配制技术的任何固体或液体添加剂结合。

通常，根据本发明的组合物可以包含0.05至99重量％、优选10至70重量％的活性材料。

根据本发明的杀线虫组合物可以以各种形式使用，例如气溶胶分配器、胶囊悬浮液、冷雾浓缩物、粉剂、乳油、水包油型乳化液、油包水型乳化液、胶囊化颗粒、细颗粒、种子处理用可流动浓缩物、气体(加压)、气体生成产品、颗粒、热雾浓缩物、大颗粒、微颗粒、油分散性粉末、油溶混性可流动浓缩物、油溶混性液体、糊剂、植物小棒、干种子处理用粉末、涂覆杀虫剂的种子、可溶性浓缩物、可溶性粉剂、种子处理用溶液、悬浮浓缩物(可流动浓缩物)、超低容量(ulv)液体、超低容量(ulv)悬浮液、水分散性颗粒或片剂、浆料处理用水分散性粉末、水溶性颗粒或片剂、种子处理用水溶性粉末和可湿性粉末。

这些组合物不仅包括准备通过合适的装置(例如喷雾或除尘装置)施用于待处理植物或种子的组合物，还包括浓缩的市售组合物，在将其施用于农作物上之前必须对其进行稀释。

实施例1

程序方法学

A)南方根结线虫繁殖

番茄植株接种了南方根结线虫幼体，并保持在生长室中。至少两个月后，从根中提取南方根结线虫虫卵进行实验。下面说明提取南方根结线虫虫卵的程序。

根部组织可以利用手术刀片和表面皿用手切碎，也可以用食物加工机切碎。然后将切碎的组织放入瓶中，并用10％稀释的漂白剂洗涤。然后在无菌条件下，将根部溶液倒入筛子(顶部为60号筛子，底部为500号筛子)。从500号筛子的底部收集粗卵收集物，每个15mLFalcon管中放入5mL漂白剂和虫卵混合物。然后将5mL 70％的蔗糖溶液放入每个Falcon管中。然后将1mL双重蒸馏无菌水层轻轻放在每个Falcon管中的蔗糖混合物顶部。然后将样品以1200rpm离心5分钟。将悬浮在蔗糖溶液和1mL水层之间的胚胎从每个Falcon管中总共收集3mL(溶液的顶层3mL)置于新鲜的15mL Falcon管中。加入10mL的5％漂白剂溶液，并将虫卵涡旋10分钟。然后将Falcon管以2000rpm离心5分钟。然后除去上清液，并将虫卵在10mL的无菌双蒸馏水中漂洗，并在2000rpm下再离心5分钟。重复此过程两次或更多次。在最后一次洗涤后，除去5mL上清液，而将剩余的5mL水与虫卵混合并置于5mL有盖培养皿中。然后将虫卵放入25-27℃的培养箱中，约10天后孵化幼虫(J2期)。将幼虫放在25-27℃的培养箱中进行保存。

B)准备测试溶液和放置线虫

将待测试的查耳酮置于1.5mL的Eppendorf管中，并加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)制成10^-1M的溶液。该储备溶液用于在无菌双蒸馏水中进一步稀释(10^-4M至10^-5M)。例如，将10μL的10^-1M的查耳酮的DMSO溶液添加到9990μL的无菌双蒸馏水中以制备用于线虫试验的10^-4M溶液。将100μL在水中的稀释液吸移到96孔板的30个孔中，并且将幼虫从提取的J2南方根结线虫的储备中转移到每个孔中。对于阴性对照，为确认DMSO的浓度没有杀死线虫，对于每个实验，将30只幼虫置于100μL的1％的DMSO的无菌双蒸馏水溶液中(过去的工作表明秀丽隐杆线虫幼虫可以在该浓度的DMSO中存活)(Attar等，2011)。

C)监测线虫

该生物测定法旨在测试肽和查耳酮的杀虫能力(死亡率百分比)。每个测试均在96孔板中进行，每个孔中都有一只线虫(共30孔)。线虫在处理溶液中培养5天。在解剖显微镜下，通过用探针干扰后检查每只线虫的活动来检查线虫的活率。

实施例2

杀线虫组合物的功效

如前所述，将相同数量的线虫在96孔板在各种处理溶液中培养5天。计算在第5天死亡或存活的线虫的数量。实验结果总结在图1中，该图描绘了显示在96孔板中包含查耳酮17和查耳酮25的组合对线虫的处理效果的图。图2描述了显示在96孔板中包含查耳酮17和查耳酮30的组合对线虫的处理效果的图。

如图1和图2所示，在水中或1％DMSO中培养J2期幼虫线虫在第5天引起的线虫死亡少于10％，这些处理用作阴性对照。然而，将线虫幼虫在由毒死蜱和吡虫啉组成的化学混合物(1：1比例)中培养会在第5天导致约50％的死亡，这是阳性对照。单独使用查耳酮17或查耳酮25或查耳酮30处理线虫幼虫，到第5天在浓度约为10^-4-10^-5M时，导致80-85％的死亡。而查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30组合处理线虫幼虫，到第5天导致线虫死亡近100％，其中查耳酮的总浓度为10^-4-10^-5M，查耳酮比例为1：1。实际上，查耳酮17和查耳酮25或查耳酮17和查耳酮30的组合的使用引起线虫自身在三天内死亡几乎100％。在96孔板实验中，以10^-4M的剂量使用查耳酮17和查耳酮25(TA)的组合足以杀死100％的线虫。在96孔板实验中，以10^-4M和10^-5M的剂量使用查耳酮17和查耳酮30(TB)的组合足以杀死100％的线虫。

这些结果表明，查耳酮组合，无论查耳酮17和查耳酮25还是查耳酮17和查耳酮30，在低至10^-4-10^-5M的浓度对杀死线虫具有协同作用，并且作为杀线虫组合物非常有效。

这清楚地表明，查耳酮组合，查耳酮17和查耳酮25(TA)、查耳酮17和查耳酮30(TB)，在诱导线虫死亡方面非常有效。

实施例3

查耳酮对常见微生物的影响

测试了单个查耳酮对两种常见的土壤微生物(铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌)和两种常见的实验室微生物(大肠杆菌和酿酒酵母)的影响。使微生物在含有10^-4、10^-5或10^-6M浓度查耳酮的营养琼脂平板上生长，并在营养琼脂平板上生长24-48小时后对菌落形成单位(CFU)进行计数。

表2

查耳酮对常见微生物的影响

查耳酮17似乎限制了所测试的两种土壤微生物(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)的生长，但没有限制大肠杆菌和酿酒酵母的生长(表1)。另一方面，查耳酮25似乎促进铜绿假单胞菌的生长，限制枯草芽孢杆菌的生长，不影响大肠杆菌或酿酒酵母的生长。

总体而言，与它们对寄生线虫的作用相比，单个查耳酮对其他微生物的作用有限。

实施例4

查耳酮17和25或查耳酮17和30的组合对植物生长的影响

与未经处理的植物和经阳性对照处理过的植物相比，温室(poly house)中将近4500株黄瓜作物被用于研究查耳酮组合对整体植物生长的影响：呋喃丹(一种众所周知的且广泛使用的化学杀线虫剂)、Nema power(生物杀线虫剂-昆虫病原线虫(EPN)、籼稻异小杆线虫)和杀线虫真菌淡紫拟青霉。土壤类型为红色沙质土壤。

使用以下化学溶液来研究每种化学物质或化学物质组合对植物总体生长的影响，如表3所示。

表3

植物中使用的化学品及其组合

其中为了便于解释：

UTC是未经处理的对照植物；

TA是查耳酮17和查耳酮25的组合；以及

TB是查耳酮17和查耳酮30的组合。

研究了化学品或生物杀线虫剂对植物的影响，并在第10、21和35天收集了数据。以下示例提供了表3中第10、21和35天提供的化学品或生物杀线虫剂作用的代表性数据。

A)对植物芽长度的影响

图3是与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物的第10天植物芽的长度的影响的图示。如图3所示，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30组合(TB50)的组合物已显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未经处理的植物(对照-UTC)相比，在TB50中观察到芽长增加了32％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25组合(TA150)的组合物也显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA150处理的植物中观察到芽长增加了21％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养生长没有显示出相似的积极作用。

图4描绘了与未处理的植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理的植物的第21天的植物芽的长度的影响的图示。如图4所示，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TB50中观察到芽长增加了34％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25的组合(TA150)也显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA150处理的植物中观察到芽长增加了34％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养作用没有相似的积极作用。

图5描绘了与未处理的植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理的植物的第35天的植物芽的长度的影响的图示。如图5所示，查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)以每株10mg的剂量施用。TB50在维持植物营养生长方面显示出高的功效。与未处理的植物相比，在TB50中观察到芽长增加了36％。

类似地，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25的组合(TA150)也显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在用TB150处理的植物中观察到芽长增加了34％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养作用未显示出相似的积极作用。

B)对植物叶片长度的影响

图6描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物的第10天植物叶片长度的影响的图示。

如图6所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株植物10mg的剂量施用显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA50中观察到叶长增加了30％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB150)也显示出在维持植物营养生长方面的高功效。

与未处理的植物相比，在TA150处理的植物中观察到叶长增加了30％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养作用未显示出相似的积极作用。

图7描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物的第21天植物叶片长度的影响的图示。

如图7所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株植物10mg的剂量施用显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA50中观察到叶长增加了39％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB150)也显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未经处理的植物相比，在TB150处理的植物中观察到叶长增加了30％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养作用未显示出相似的积极作用。

图8描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物的第35天的植物叶片长度的影响的图示。

如图8所示，查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)以每株植物10mg的剂量施用显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未经处理的植物相比，在TB50中观察到叶长增加了30％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25的组合(TA150)显示出在维持植物营养生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TB150处理的植物中观察到芽长增加了30％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的营养作用未显示出相似的积极作用。

C)对开花数量的影响

图9描绘了与未处理的植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理的植物在第10天开花数量影响的图示。

如图9所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株植物10mg的剂量施用显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未经处理的植物相比，在TA50中观察到花的数量增加了200％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB150)显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未经处理的植物相比，在用TB150处理过的植物中观察到花的数量增加了189％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

图10描绘了与未处理的植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理的植物在第21天开花数量影响的图示。

如图10所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株10mg的剂量施用显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA50中观察到花的数量增加了187％。

类似地，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TB50处理的植物中观察到花的数量增加了121％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

图11描绘了与未处理的植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对处理的植物在第35天开花数量影响的图示。

如图11所示，查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)以每株10mg的剂量施用。TB在维持植物生殖生长方面显示出高的功效。与未处理的植物相比，在TB50中观察到花朵数量增加了112％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

D)对所结果实数量的影响

图12描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理的植物在第21天结出的果实数量的影响的图示。

如图12所示，查耳酮17和查耳酮30的组合(TB150)以每株植物30mg的剂量施用显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理植物相比，在TB150中观察到果实数量增加了131％。

类似地，以每株植物30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25(TA150)显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA150处理的植物中观察到果实数量增加了120％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

图13描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天结出的果实数量的影响的图示。

如图13所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株植物10mg的剂量施用显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA50中观察到果实数量增加了187％。

类似地，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB50)显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TB50处理的植物中观察到果实数量增加了121％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

图14描绘了与未处理植物相比，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对经处理植物在第21天结出的果实数量的影响的图示。

如图14所示，查耳酮17和查耳酮30的组合(TB100)以每株植物20mg的剂量施用显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TB150中观察到果实数量增加了135％。

类似地，以每株植物10mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)显示出在维持植物生殖生长方面的高功效。与未处理的植物相比，在TA50处理的植物中观察到果实数量增加了90％。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有显示出相似的积极作用。

表4

与未处理的植物相比，化学品或生物杀线虫剂对处理后28天植株总体生长的影响

如表4所示，查耳酮17和查耳酮25的组合，或查耳酮17和查耳酮30的组合对经处理植物的总体生长的影响可忽略不计，而如果这些植物不处理或用其他杀线虫剂处理，则它们对植物生长显示出显著的负效应。

实施例5

查耳酮17和25或查耳酮17和30的组合对土壤中根结线虫的影响

图15描绘了用相应的杀线虫剂处理14天(样品1)后，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图16描绘了用相应的杀线虫剂处理14天(样品2)后，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

如图15和图16所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株植物10mg的剂量施用，足以杀死土壤中约95％的线虫；未观察到线虫幼虫，并且活的线虫被毁容了；然而，相同物质20mg或30mg剂量的效果则明显不那么有效。这表明查耳酮17和查耳酮25的组合的最佳工作剂量为每株植物10mg。

同样，查耳酮17和查耳酮30的组合以每株植物20mg的剂量施用(TB100)，足以杀死土壤中约95％的线虫；并且对所有线虫都显示出抑线虫作用。尽管10mg或30mg剂量的效果相对不那么有效，但是，在每株植物30mg的剂量，观察到对所有线虫均具有抑线虫、毁容和麻痹作用。这表明查耳酮17和查耳酮30的组合的最佳工作剂量为每株植物20mg。

化学阳性对照呋喃丹和生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉即使在较高剂量下对土壤中的线虫也没有显著影响。

这清楚地表明查耳酮组合：查耳酮17和查耳酮25、查耳酮17和查耳酮30是土壤中线虫的高效杀手。

图17描绘了用相应的杀线虫剂处理19天(样品1)后，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图18描绘了用相应的杀线虫剂处理19天(样品2)后，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

图19描绘了用相应的杀线虫剂处理19天(样品3)后，表3中提供的化学品或生物杀线虫剂对土壤中根结线虫的影响的图示。

如图17、图18和图19所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA50)以每株10mg的剂量施用，在处理19天后，显示出在杀死和维持土壤中少量线虫方面的高功效。

类似地，以每株植物20或30mg的剂量施用查耳酮17和查耳酮30的组合(TB100和TB150)显示出在杀死和维持土壤中的少量线虫的高功效。

化学阳性对照呋喃丹或生物阳性对照EPN和淡紫拟青霉对植物的繁殖效果没有相同的积极作用。

实施例6

查耳酮17和25或查耳酮17和30的组合对被感染植物根部虫瘿形成的影响

虫瘿是由于植物响应虫瘿诱导生物的异常生长活性而形成的结构。类似地，根结线虫在受感染植物的根部诱导这种虫瘿形成。虫瘿的数量随着感染时间的增加而增加。

研究了化学品和生物杀线虫剂对被感染植物根部虫瘿形成的影响。黄瓜植株被各自的杀线虫剂感染或未经处理(对照)，并在处理的第1天和处理25天后对形成虫瘿的植物根部的数量进行了计数。在第25天，在相同的植株上用相应的杀线虫剂进行了第二轮处理；再次，计数每株植物在第45天形成虫瘿的的植物根部的数量。

表5提供了化学或生物杀线虫剂对温室中黄瓜植株根部虫瘿形成的总体影响。提供的根部虫瘿指数为1-5，其中

1＝无虫瘿，

2＝1-25％，

3＝26-50％，

4＝51-75％，并且

5＝>75％的根部形成虫瘿。

表5

化学或生物杀线虫剂对受感染植物根部虫瘿形成的影响

图20描绘了表3中提供的化学或生物杀线虫剂在第一次处理25天后并随后在第25天进行第二次处理，对黄瓜植株根部虫瘿形成程度的影响，以及在第二次处理20天后(即第45天)对黄瓜植株根部虫瘿形成程度的影响。

如图20所示，查耳酮17和查耳酮25的组合(TA100)，以及查耳酮17和查耳酮30的组合(TB100)以每株30mg的剂量显示出在控制黄瓜植株根部中虫瘿形成方面的高功效，而TB100组合显示出更高的效力。

同样，研究了不同查耳酮对番茄植株的影响。番茄植株在盆中生长，并保持在温室中。本实验中使用的查耳酮浓度为10^-4M。相比较，查耳酮处理过的植物虫瘿评分平均为2-3，而其他处理中的平均值为4。

Claims (5)

1.一种用于控制线虫的组合物，其包含：

(a)在10^-2-10^-3M的浓度下具有100％的抗线虫功效的有效量的式2化合物

和

(b)在10^-2-10^-3M的浓度下具有100％的抗线虫功效的有效量的式1化合物

其中

环A是

或者

其中，

式1与式2的比例为1:1；

所述组合物在10^-4-10^-6M的浓度下具有100％的协同抗线虫功效；和

所述组合物对土壤微生物具有低活性。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种增量剂、乳化剂和/或表面活性剂。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种农业化学活性化合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述农业化学活性化合物选自但不限于能够处理植物的物质，杀真菌剂、杀细菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、灭螺剂、安全剂、植物生长调节剂、植物养分和生物防治剂。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中低浓度协同组合10^-4-10^-6M可用于农业目的。

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