CN110812483A - 稳定细胞骨架系统在视网膜色素变性疾病治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了稳定细胞骨架系统在视网膜色素变性疾病治疗中的应用。具体地，本发明提供了一类与稳定细胞骨架有关的化合物的用途，它们被用于制备(i)预防和/或治疗视网膜色素变性的药物；(ii)防止或延缓视网膜的感光细胞退化或细胞死亡的药物。本发明的化合物和药物可有效延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡，从而为治疗视网膜色素变性疾病提供了全新的治疗途径和方案。

Description

稳定细胞骨架系统在视网膜色素变性疾病治疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医疗领域，更具体地涉及稳定细胞骨架系统在视网膜色素变性疾病治疗中的应用。
背景技术
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)是一类以视网膜感光细胞或黑色素上皮细胞功能异常及变性为主要特征的遗传性的视网膜变性疾病。由于基因的突变导致视网膜中的视杆细胞与视锥细胞退化死亡，在人群中的发病率为1/4000，在我国患病率更高约为1/1000。
视网膜色素变性通常是慢性及进行性的。疾病的初始阶段表现为夜盲症，然后逐步发展到视野缩小，最终导致失明。在病变的早期，分布于周边负责暗光下视力的视杆细胞逐渐变性，患者在暗光下的视力逐渐减弱，表现为夜盲；随着病变发展到中期，视杆细胞大量缺失导致周边视野逐渐缺失，视野缩小；病变到后期时，富集于中央凹负责色觉感受的视锥细胞进一步凋亡，中央视野也逐步缺失，最终视杆细胞与视锥细胞都消失而致盲。
视网膜色素变性列入了我国120种罕见病名录中，是一种遗传性疾病，目前还没有有效的治疗手段。对于患者，现在常用的治疗方法为避免光刺激或者补充维生素A来减缓感光细胞凋亡的速率，效果十分有限。
目前已经发现有50多种基因的突变与此疾病相关。这些基因发生突变以后导致蛋白质失去功能或部分失去功能、影响别的蛋白质的功能或者产生对细胞有害的功能，从而影响到视网膜中的感光细胞(视杆细胞与视锥细胞)。由于许多基因的突变都可以导致视网膜色素变性，因此，针对单一靶基因的治疗方法也就只能治疗这一个基因突变产生的视网膜色素变性，难以保证对别的基因突变引起的视网膜色素变性也有效。
虽然利用干细胞技术来治疗视网膜色素变性是一种新的技术途径，然而目前也还没有取得实质性的突破。由于干细胞治疗的技术复杂性，以及干细胞本身的一些特点，使得干细胞治疗真正走入临床应用仍需要在疗效以及安全性方面取得实质性的突破。
综上所述，本领域迫切需要开发新的能够有效延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡，进而有效治疗视网膜色素变性疾病的药物和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可有效延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡，进而有效治疗视网膜色素变性疾病的药物和方法。
在本发明的第一方面，提供了一种(或一类)化合物或物质的用途，其特征在于，所述的化合物或物质被用于制备(i)预防和/或治疗视网膜色素变性的药物；和/或(ii)防止或延缓视网膜的感光细胞退化或死亡的制剂或药物；
其中，所述化合物或物质选自下组：(a)高尔基体碎片化抑制剂；(b)微管骨架稳定剂；(c)微管蛋白乙酰化促进剂；(d)MAP1B蛋白或其促进剂；(e)Hsp90α或其促进剂；或其组合。
在另一优选例中，所述的感光细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的视网膜色素变性是哺乳动物(如人)的视网膜色素变性。
在另一优选例中，所述的感光细胞是人的感光细胞。
在另一优选例中，所述的化合物包括：小分子化合物、核酸、多肽、抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的化合物是微管蛋白乙酰化促进剂。
在另一优选例中，所述的微管蛋白乙酰化促进剂选自下组：去乙酰化酶的抑制剂。较佳地，所述微管蛋白乙酰化促进剂为组蛋白去乙酰酶HDAC或其它对微管蛋白质有去乙酰化作用的去乙酰化酶的抑制剂。
在另一优选例中，所述的去乙酰化酶的抑制剂选自下组：曲古柳菌素A(trichostatin)、抗去乙酰化酶的抗体、抑制去乙酰化酶表达的miRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的化合物不是Hsp90α或其促进剂。
在另一优选例中，所述的化合物不是Hsp90β或其促进剂。
在另一优选例中，所述的化合物是MAP1B蛋白或其促进剂。
在另一优选例中，所述的化合物是MAP1B蛋白的泛素化抑制剂。
在另一优选例中，所述的药物包括眼用制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型包括眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有：(a)活性成分，所述活性成分选自下组：(a1)微管蛋白乙酰化促进剂；(a2)MAP1B蛋白或其促进剂；或其组合；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述药物组合物为缓释剂型。
在另一优选例中，所述的微管蛋白乙酰化促进剂包括：去乙酰化酶的抑制剂；较佳地，为组蛋白去乙酰酶HDAC或其它对微管蛋白质有去乙酰化作用的去乙酰化酶的抑制剂。
在另一优选例中，所述的去乙酰化酶的抑制剂选自下组：曲古柳菌素A(trichostatin)、抗去乙酰化酶的抗体、抑制去乙酰化酶表达的miRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分不是Hsp90α或其促进剂。
在另一优选例中，所述的活性成分不是Hsp90β或其促进剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗视网膜色素变性。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于防止或延缓视网膜的感光细胞退化或死亡。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的或纯化的复合物，其特征在于，所述的复合物是Hsp90α和MAP1B形成的复合物。
在另一优选例中，所述的复合物的分子量为约350KDa。
在本发明的第四方面，提供了本发明第三方面所述的复合物的用途，它用于制备筛选治疗视网膜色素变性的药物的制剂；或用于筛选治疗视网膜色素变性的药物。
在本发明第五方面，提供了一种筛选视网膜色素变性的候选治疗药物的方法，包括步骤：
(a)提供一实验组和一对照组，其中，实验组和对照组的实验条件相同，不同点在于在实验组还施用测试化合物；
(b)观察实验组和对照组中的选自下组的一个或多个指标，并进行比较：
(b1)Hsp90α-MAP1B复合物的数量；
(b2)高尔基体碎片化程度；
(b3)微管骨架稳定化程度；
(b4)微管蛋白乙酰化程度；
(b5)MAP1B蛋白的数量和/或活性；
(b6)MAP1B蛋白的泛素化程度；
(b7)Hsp90α蛋白的数量和/或活性；
(c)如果出现一个或多个预期的指标结果，则提示所述的测试化合物是视网膜色素变性的候选治疗药物，
其中，所述的预期的指标结果的定义如下：
(b1)对于Hsp90α-MAP1B复合物的数量，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b2)对于高尔基体碎片化程度，实验组的实验结果显著低于于对照组的实验结果；
(b3)对于微管骨架稳定化程度，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b4)对于微管蛋白乙酰化程度，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b5)对于MAP1B蛋白的数量和/或活性，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b6)对于MAP1B蛋白的泛素化程度，实验组的实验结果显著低于对照组的实验结果；
(b7)Hsp90α蛋白的数量和/或活性，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果。
在另一优选例中，所述的术语“显著高于”指实验组的测量值Z1与对照组的测量值Z0的比值(Z1/Z0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥3。
在另一优选例中，所述的术语“显著低于”指实验组的测量值Z1与对照组的测量值Z0的比值(Z1/Z0)≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(d)对步骤(c)中确定的候选治疗药物，进一步在动物模型中测试对视网膜感光细胞的退化和/或死亡的影响；或在动物模型中评估对视网膜色素变性的治疗和/或预防效果。
在另一优选例中，所述的候选物是对Hsp90β无作用，但对Hsp90α有促进的物质。
在本发明的第六方面，提供了一种治疗哺乳动物视网膜色素变性的方法，包括步骤：给需要的对象施用一化合物或物质或含所述化合物或物质作为活性成分的药物，其中，所述化合物或物质选自下组：(a)高尔基体碎片化抑制剂；(b)微管骨架稳定剂；(c)微管蛋白乙酰化促进剂；(d)MAP1B蛋白或其促进剂；(e)Hsp90α或其促进剂；或其组合。
在另一优选例中，所述药物的剂型包括眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述的化合物包括药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的对象是人。
在本发明第七方面，提供了一种构建视网膜色素变性的非人哺乳动物模型的方法，包括步骤：
(a)在所述的动物中，下调视网膜中Hsp90α和/或MAP1B的表达或活性，从而形成视网膜色素变性动物模型。
在另一优选例中，所述的下调包括基因下调(knock-down)和基因敲除(knock-out)。
在另一优选例中，所述的下调包括给所述动物施用Hsp90α抑制剂，从而使得视网膜中Hsp90α的表达或活性下降。
在另一优选例中，所述方法包括：提供一Hsp90α基因被下调(knock-down)和敲除(knock-out)的转基因的受精卵，然后将所述受精卵再生为转基因动物，即为视网膜色素变性的动物模型。
在另一优选例中，所述的下调包括给所述动物施用MAP1B抑制剂，从而使得视网膜中Hsp90α的表达或活性下降。
在另一优选例中，所述方法包括：提供一MAP1B基因被下调(knock-down)和敲除(knock-out)的转基因的受精卵，然后将所述受精卵再生为转基因动物，即为视网膜色素变性的动物模型。
在另一优选例中，所述的动物选自下组：啮齿动物、非人灵长动物、宠物。
在另一优选例中，所述的动物选自下组：大鼠、小鼠。
本发明还提供了用上述方法制备的非人哺乳动物模型。
在本发明第八方面，提供了一种非人哺乳动物模型的用途，其中，所述的动物模型中Hsp90α和/或MAP1B的表达或活性是下调的，其特征在于，所述动物模型被用于筛选治疗视网膜色素变性的药物；或用于制备用于筛选治疗视网膜色素变性的药物的动物模型。
在本发明第九方面，提供了一种Hsp90α或其促进剂的用途，用于制备(a)提高MAP1B稳定性的制剂；(b)降低MAP1B的泛素化程度的制剂；和/或(c)抑制MAP1B降解的抑制剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Hsp90α在视网膜中的表达。其中
A.Hsp90α和β亚型在小鼠组织中的表达谱。从出生后六周的野生型C57BL6小鼠中分离各种组织，用免疫印迹(Western blot)检测各种组织中的Hsp90α和β蛋白质亚型。
B.在小鼠视网膜中，Hsp90α的表达不随年龄变化而变化，而Hsp90β的表达在3周龄视网膜发育完成以后被抑制。分离不同年龄段的野生型C57BL6小鼠(出生后0.5,1,2,3,4,5,6周)的视网膜，并且通过免疫印迹检测Hsp90α及Hsp90β的蛋白质水平。
C.Hsp90α及Hsp90β在视网膜组织中的定位。视网膜石蜡切片和分离的单个视杆细胞分别用抗Hsp90α，抗Thr5/7磷酸化的Hsp90α(pHsp90α)及抗Hsp90β抗体与抗乙酰化α-tubulin(Ac-tub)抗体共同免疫荧光组化染色。抗乙酰化α-tubulin(Ac-tub)抗体用于标记视杆细胞内段和外段之间的连接纤毛。图示标尺为10μm。
D.Hsp90α在连接纤毛处的定位。抗γ-tubulin抗体用于标记连接纤毛基体。图示标尺为10μm。
图2显示了Hsp90α基因敲除引发小鼠感光细胞凋亡及视网膜退化。其中，
A.免疫印迹检测Hsp90α基因敲除小鼠的敲除效率。+/+，-/+及-/-分别表示野生型、Hsp90α敲除杂合子以及纯合子。所有组织均来自于同窝6周龄对应基因型的小鼠，等量蛋白上样进行免疫印迹检测。
B.Hsp90α免疫荧光染色检测小鼠视网膜中Hsp90α基因敲除效率。抗乙酰化α-tubulin(Ac-tub)抗体用于标记连接纤毛。图示标尺为10μm。
C.显微观察Hsp90α敲除小鼠处于不同年龄(3周，6周和15周)视网膜的变化，15周龄的Hsp90α敲除小鼠的视网膜显著变薄，外核层的细胞核数量大幅下降。OS表示感光细胞外段；IS表示感光细胞内段；ONL表示外核层，即感光细胞核层；INL表示内核层。图示标尺为20μm。
D.扫描电镜观察Hsp90α敲除小鼠感光细胞的变化。15周龄的Hsp90α敲除小鼠的视杆细胞外段明显变形。图示标尺为10μm。
E.Hsp90α敲除小鼠感光细胞发生凋亡。用TUNEL染色来标记凋亡细胞。-/-#1及-/-#2表示两只独立的Hsp90α敲除小鼠。在视网膜组织形态还处于基本正常状态的6周龄基因敲除小鼠中，检测到了感光细胞的凋亡。图示标尺为25μm。
图3显示了Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞的超微结构异常以及视网膜感光细胞内段与外段间的蛋白质运输障碍。其中，
A.15周的Hsp90α基因敲除小鼠视网膜感光细胞发生严重病变，其外段膜盘异常折叠并伴随着内段细胞间隙充斥大量囊泡。采用扫描和透射电镜技术检测到大量感光细胞超微结构的严重形变。白色和黑色的箭头均指示内段细胞间异常堆积的囊泡。图示标尺为
B.视紫红质(rhodopsin)异常滞留于Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞内段及外核层。麦胚凝集素(WGA)用来标记细胞膜及囊泡。箭头显示零星的包裹于囊泡中的视紫红质异常滞留在3周龄的Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞内段中。6周龄Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞的内段中集聚了更多的滞留视紫红质。
图4显示了Hsp90α基因敲除导致视网膜感光细胞完全失去了对光的电生理反应。其中，
A.20周龄的Hsp90α基因敲除小鼠的左右双眼分别在有光刺激和暗环境下的视网膜电生理图(Electroretinogram)。可以看到，检测的这只基因缺失小鼠的双眼视网膜已经完全失去了视觉电信号的产生。
B.15和20周龄小鼠视网膜电信号各种波的统计结果。视杆细胞与视锥细胞的各型视网膜电波加以量化统计。每个数值是三只小鼠的平均值。无论是野生型小鼠还是基因敲除小鼠，双眼中取视网膜电生理图信号强的那只眼的数值代表这只小鼠。
图5显示了Hsp90α基因敲除引发感光细胞高尔基体碎片化以及MAP1B蛋白量显著下调。图中标尺均为10μm。其中，
A.Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞高尔基体发生了严重的碎片化。视网膜石蜡切片通过GM130免疫染色标记高尔基体膜系统，在基因敲除小鼠视网膜中各个感光细胞中高尔基体的分布不再如野生型小鼠视网膜那般整齐。透射电镜观察野生型及Hsp90α基因敲除小鼠感光细胞高尔基体形态表明，基因敲除小鼠感光细胞内的高尔基体呈现出严重的碎片化。
B.Hsp90α与MAP1B相互作用。对Hsp90α与免疫沉淀的蛋白质进行蛋白质谱分析，发现MAP1B是Hsp90α的一个结合蛋白质。其相互作用通过在ΗΕK293T细胞中共同表达的外源表达带Flag标签的MAP1B与带HA标签的Hsp90α的相互作用得到验证。用Flag亲和胶进行免疫共沉淀。
C.Hsp90α基因敲除小鼠视网膜中MAP1B及乙酰化α-tubulin发生了显著下调。视网膜来自于同窝3周龄或6周龄对应基因型的小鼠，等量蛋白上样进行免疫印迹检测。
D.Hsp90α可以提高MAP1B的稳定性减少其降解。带Flag标签的MAP1B与空载体或带HA标签的Hsp90α共同表达于HEK293T细胞中。当与ΗA-Hsp90α共表达时，MAP1B的表达量显著提高。在蛋白酶体抑制剂MG132处理后检测蛋白泛素化水平，发现与HA-Hsp90α共表达的MAP1B，其泛素化水平显著降低。
图6显示了Hsp90缺乏引发HeLa细胞高尔基体碎片化。其中，
A.免疫印迹检测HeLa细胞中Hsp90的敲低效率。通过RNA干扰技术(RNAi)抑制Hsp90在HeLa细胞中的表达。siNC为阴性对照；siHsp90-1为同时作用于Hsp90α及Hsp90β的一条siRNA；siHsp90-2为混合了分别作用于Hsp90α或Hsp90β的两条siRNA；siHsp90α或siHsp90β表示分别作用于对应Hsp90亚型的siRNA。
B.敲低Hsp90引发HeLa细胞高尔基体发生严重碎片化。通过GM130免疫染色或者直接透射电镜技术对HeLa细胞高尔基体形态进行观察。高尔基体呈现明显的碎片化。图中标尺为10μm。
C.高尔基体形态的统计分析。根据形态差异，高尔基体被分为网状、松散状和碎片状三大类。每个样品中取不少于200个细胞进行分析。以上统计分析为三次独立实验的结果。
D.免疫印迹检测siRNA抵抗的外源Hsp90α及Hsp90β的表达。建立稳定表达siRNA抵抗的外源Hsp90α或Hsp90βHeLa稳转细胞株，利用其进行Hsp90敲低的表型回复实验。
E.外源表达siRNA抵抗的Hsp90α或Hsp90β能够回复Hsp90敲低引发的高尔基体碎片化。对稳定表达GFP空载，GFP-Hsp90α和GFP-Hsp90β的稳转HeLa细胞株进行Hsp90RNAi，统计分析其高尔基体形态。每个样品中取不少于200个细胞进行分析。统计分析为三次独立实验的结果。
图7显示了外源表达MAP1B能够回复因Hsp90缺乏而引发的高尔基体碎片化。图中标尺均为10μm。其中，
A.免疫荧光染色检测外源MAP1B的表达。带Flag标签的GFP或MAP1B分别表达于Hsp90敲低的HeLa细胞中，用抗Flag抗体和抗MAP1B抗体进行共染，检测MAP1B的表达。
B.外源表达MAP1B能够回复Hsp90缺乏而引发的高尔基体碎片化。通过GM130免疫染色来观察高尔基体的形态。箭头显示Hsp90敲低的外源MAP1B阳性的细胞。
C.高尔基体形态的统计分析。带Flag标签的GFP或MAP1B分别表达于Hsp90敲低的HeLa细胞中，通过GM130染色来观察高尔基体形态，并对带Flag标签的细胞统计分析其高尔基体形态。每个样品中取不少于200个细胞进行分析。统计分析为三次独立实验的结果。
D.外源MAP1B表达能提高HeLa细胞中α-tubulin乙酰化水平。Flag标记的GFP或MAP1B表达于对照或Hsp90敲低的HeLa细胞中，通过免疫荧光染色来观察对应细胞中乙酰化α-tubulin的变化。无论是在对照或Hsp90敲低的HeLa细胞中，MAP1B的表达显著提高细胞微管骨架的乙酰化水平。
图8.MAP1B通过提高α-tubulin乙酰化水平来回复因Hsp90缺乏引发的高尔基体碎片化。图中标尺均为10μm。A.Hsp90敲低引发HeLa细胞α-tubulin乙酰化程度降低。通过对乙酰化α-tubulin(Ac-tub)进行免疫荧光染色来观察Hsp90敲低的HeLa细胞中微管乙酰化程度的变化。B.Trichostatin A能够有效提高α-tubulin乙酰化水平。在对照或Hsp90敲低的HeLa细胞中加入不同浓度的Trichostatin A(200nM,300nM,400nM,500nM)，通过免疫印迹检测发现α-tubulin乙酰化水平随抑制剂浓度的提高明显增加。C.Trichostatin A处理能够有效回复因Hsp90缺乏而引起的高尔基体碎片化。通过对GM130免疫荧光染色来观察HeLa细胞中的高尔基体形态。D.Hsp90敲低的HeLa细胞进行Trichostatin A处理后对其高尔基体形态进行统计分析。每个样品中取不少于200个细胞进行分析。统计分析为三次独立实验的结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在一类特定视网膜色素变性疾病中，微管骨架稳定性下降以及由此造成的高尔基体碎片化是造成视网膜感光细胞退化和死亡的主要原因。本发明还首次意外地发现，Hsp90α在感光细胞中结合了一个微管结合蛋白MAP1B，在由Hsp90α缺失所导致的视网膜色素变性模型中，Hsp90α缺失导致了视网膜中MAP1B蛋白质的显著下降。Hsp90α可降低MAP1B的泛素化修饰，而缺失Hsp90α导致促进了MAP1B泛素化降解。在感光细胞中MAP1B下降以后，导致微管蛋白乙酰化水平的下降，微管骨架的不稳定使得高尔基体碎片化，影响了感光细胞中的蛋白质运输，并导致感光细胞凋亡与视网膜退化。而采用本发明的用于稳定微管骨架的活性成分(尤其是微管蛋白乙酰化促进剂等)，可以有效延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡，进而有效治疗视网膜色素变性疾病。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明的实验表明：小鼠缺失Hsp90α蛋白质以后，其视网膜在出生以后不断退化，大量视杆细胞发生细胞凋亡。视网膜免疫组化、电镜观察表现以及视网膜电图(Electroretinogram)检验表现出典型的视网膜色素变性的病理组织表型和症状。因此，Hsp90α基因敲除小鼠是一个视网膜色素变性疾病的动物模型。此外，通过细胞机制的研究，本发明人发现细胞内微管蛋白的乙酰化与微管骨架的稳定性是Hsp90α基因敲除在小鼠视网膜引起视网膜色素变性的主要原因。在细胞中，通过稳定微管蛋白的乙酰化和微管骨架完全可以逆转缺失Hsp90蛋白质所引起的细胞表型。
Hsp90α/Hsp90β蛋白和基因
人Hsp90α基因名称HSP90AA1，基因ID3320，位于14号染色体上14q32.31位点，共有13个外显子。转录mRNA的编码序列有2565个碱基，翻译的Hsp90α蛋白质全长有855个氨基酸。
人Hsp90β基因名称HSP90AB1，基因ID3326，位于6号染色体上6p21.1位点，共有14个外显子。转录mRNA的编码序列有1899个碱基，翻译的Hsp90β蛋白质全长有633个氨基酸。
在哺乳动物中，Hsp90有两种亚型Hsp90α和Hsp90β，二者的同源性高达90％，在蛋白序列和结构上差别很小，一般认为二者在细胞功能上有一定互补性。然而，在人的正常细胞组组织中通常只有Hsp90β亚型表达，而不表达Hsp90α。在睾丸和视网膜感光细胞中正好相反，主要表达的是Hsp90α，而不是Hsp90β。本发明的研究表明，当在视网膜感光细胞中缺乏Hsp90α以后，会导致视网膜病变，并且一般没有Hsp90β来补偿Hsp90α的缺乏。当然，如果在缺乏Hsp90α的视网膜感光细胞中特异性地诱导Hsp90α和/或Hsp90β，则有助于预防、缓解、或治疗某些视网膜病变。
MAP1B蛋白和基因
人MAP1B基因名称MAP1B，基因ID4131，位于5号染色体上5q13.2位点，共有8个外显子。转录mRNA的编码序列有7407个碱基，翻译的MAP1B蛋白质全长有2469个氨基酸。
活性成分
基于本发明人的研究，本发明提供一类活性成分(包括化合物或物质)的用途，所述的活性成分被用于制备(i)预防和/或治疗视网膜色素变性的药物；和/或(ii)防止或延缓视网膜的感光细胞退化或死亡的制剂或药物。
在本发明中，所述的活性成分可以直接或间接地提高细胞骨架相同的稳定性，从而防止高尔基体的碎片化，进而
在本发明中，所述的活性成分可以是所述化合物或物质，典型地，本发明活性成分是选自下组的一种或多种或其组合：
(a)高尔基体碎片化抑制剂；
(b)微管骨架稳定剂；
(c)微管蛋白乙酰化促进剂；
(d)MAP1B蛋白或其促进剂；
(e)Hsp90α或其促进剂；
(f)Hsp90β或其促进剂。
本发明的活性成分包括(但并不限于)：小分子化合物、核酸、多肽、抗体、或其组合。
在另一优选例中，一类优选的活性成分是微管蛋白乙酰化促进剂，较佳地是去乙酰化酶的抑制剂；较佳地是组蛋白去乙酰酶HDAC或其它对微管蛋白质有去乙酰化作用的去乙酰化酶的抑制剂。
在另一优选例中，所述的去乙酰化酶的抑制剂选自下组：曲古柳菌素A(trichostatin)、抗去乙酰化酶的抗体、抑制去乙酰化酶表达的miRNA、或其组合。
在另一优选例中，本发明的活性成分不是Hsp90α或其促进剂。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明活性成分(尤其是小分子化合物或其药学上可接受的盐)；(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明活性成分的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明活性成分。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有滴眼液、针剂、眼用凝胶和眼药膏。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如，眼部滴眼液的配制可这样进行：将本发明活性成分或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明活性成分或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织(如眼部或视网膜)。此外，本发明活性成分或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明活性成分或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.001～10wt％，较佳地0.1～5wt％，每日可1～6次给药，每次1～5滴。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次揭示了对于Hsp90α缺失的视网膜感光细胞，可以通过稳定微管骨架来恢复被解体碎片化的高尔基体。一旦高尔基体得以恢复，那么其碎片化所导致的感光细胞内外段之间的蛋白质运输障碍就可以恢复正常，从而延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡。
(b)本发明的通过稳定细胞微管骨架来预防和/或治疗视网膜色素变性疾病的方法，具有通用性，使得这一方法不仅仅是局限在少数基因突变引起的视网膜色素变性症，有望开发成具有一定的普遍疗效的方法。
(c)基于本发明，可以从小分子化合物作为活性成分，这些活性成分对生物组织毒副作用小，可通过眼局部用，从而减少剂量和减小全身副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
在视网膜中Hsp90分子伴侣蛋白质主要是Hsp90α亚型，其缺失以后导致视网膜退化变性，呈现出典型的视网膜色素变性疾病的症状和病理形态
1.1实验方法
小鼠组织免疫印迹：从实验小鼠中获取心、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、肌肉、脑、视网膜和睾丸等组织，匀浆以后把蛋白质溶解于SDS上样缓冲液中。测定蛋白质浓度，每种组织取20μg等量蛋白质进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。
不同发育阶段小鼠视网膜免疫印迹：取出生后0.5、1、2、3、4、5、6周的小鼠视网膜，按上述组织免疫印迹方法进行分析。
小鼠视网膜切片免疫荧光染色：从野生型或Hsp90α基因敲除小鼠中获取眼球，切口以后放入Carnoy's固定液中固定过夜。然后，正丁醇脱水3天，石蜡1石蜡2中渗透各12小时，石蜡3中渗透24小时。石蜡包埋并切成5μm厚度的组织切片。37℃烤台烤片过夜。视网膜石蜡切片经二甲苯、正丁醇脱蜡及梯度乙醇和纯净水复水后，在PH8.0浓度为1mM的EDTA溶液中进行高压抗原修复。之后进行封闭、通透、一抗染色、二抗染色、细胞核染色以及封片等步骤。做好的片子在激光共聚焦显微镜下观察拍照。
小鼠视网膜切片HE染色：小鼠视网膜石蜡切片经二甲苯、正丁醇脱蜡及梯度乙醇和纯净水复水后，进行常规苏木精和伊红染色，用中性树脂封片后于BX51显微镜下观察视网膜组织形态的变化。
TUNEL染色：从野生型或Hsp90α基因敲除小鼠中获取眼球，切口以后放于4％多聚甲醛溶液中固定过夜。经10％、20％、30％蔗糖溶液梯度脱水后，用组织包埋液包埋，放于-20℃保存待切。将组织进行冰冻切片，厚度为10μm。按照常规TUNEL方法染色，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。
扫描电子显微镜(SEM)检测：从野生型或Hsp90α基因敲除小鼠中获取眼球，在解剖镜下迅速剖出视网膜，平均切成8小片，在2.5％戊二醛中固定过夜。PBS漂洗后，继续在1％锇酸固定液固定1h。经30％、50％、70％、80％、95％及无水乙醇梯度脱水后，进行临界点干燥。将视网膜固定于贴在观察底座的导电胶上进行喷金。在扫描电子显微镜下观察视感光细胞形态。
透射电子显微镜(TEM)检测：同SEM电镜获取小鼠视网膜，切成小片并在2.5％戊二醛中固定过夜。磷酸缓冲生理盐水漂洗后，继续在1％锇酸固定液固定1小时。经30％、50％、70％、80％、95％，无水乙醇及无水丙酮梯度脱水后，纯丙酮+包埋液(1:1)室温渗透1.5小时，之后置于纯包埋液于室温干燥柜中渗透过夜。用812包埋剂将样品包埋在包埋槽，60℃烘箱内聚合48小时。用超薄切片机进行70nm厚度切片后，进行2％醋酸铀-柠檬酸铅双染色后进行透射电镜观察及拍片。
小鼠视网膜电流图(Electroretinogram)：取待测的Hsp90α基因敲除小鼠及其同窝出生的野生型小鼠，于黑暗条件下暗适应2小时。之后所有的准备工作均在红灯下进行。将小鼠腹腔注射氯胺酮(80mg/kg)进行麻醉，在眼睛内点硫酸阿托品进行散瞳。将小鼠放于测定电生理的软台上，固定电极，在眼睛内滴入奥布卡因进行眼部局部麻醉，滴入卡波姆进行水合后，开始视网膜电流程序。视杆-ERG,最大-ERG,视锥-ERG及Flicker-ERG被依次测定。
1.2结果
对小鼠不同组织中Hsp90蛋白质通过免疫印迹(Western blot)分析发现，Hsp90β亚型广泛分布在各种不同的组织中，而Hsp90α亚型只在视网膜、睾丸和大脑中分布(图1A)。小鼠视网膜通常在出生以后3周才能完全发育成熟，对出生后不同周龄段小鼠视网膜中Hsp90蛋白质的分析发现在3周龄以内的小鼠视网膜中Hsp90同时具有Hsp90α和Hsp90β两种亚型。但是在3周龄以后，Hsp90β蛋白质的表达被抑制，成年小鼠视网膜中Hsp90α是主要的Hsp90亚型(图1B)。
在Hsp90α基因敲除的小鼠中，视网膜中缺乏Hsp90α蛋白质。而成年后Hsp90β的表达又处于被抑制的低水平状态。因此，视网膜中缺乏Hsp90分子伴侣蛋白质。从图2和图3的结果中可以看到视网膜出现了大量的异常：视网膜中外层细胞核层变薄细胞核大量减少，视杆细胞外段变形膨胀细胞膜盘扭曲，视杆细胞凋亡，以及视杆细胞中视紫红蛋白质向外段运输异常等。这些视网膜视杆细胞的异常表明Hsp90α基因敲除导致视网膜萎缩退化。
进一步视网膜电图(Electroretinogram)检测显示Hsp90α基因敲除小鼠在20周龄的时候已经基本处于完全失明状态(图4)。
实施例2
缺乏Hsp90α影响视网膜感光细胞的微管骨架和高尔基体，从而导致感光细胞内的蛋白质运输受阻
2.1实验方法
Hsp90α与MAP1B互作验证：在HEK293T细胞内用LipofectamineTM2000转染带Flag标签的MAP1B与带HA标签的Hsp90α或者二者与对应的空载的组合，过表达48h后，用IP缓冲液裂解。在细胞上清中加入Anti Flag亲和凝胶，4℃孵育4小时后收样，进行免疫印迹检测蛋白互作。
Hsp90α抑制MAP1B泛素化检测：在HEK293T细胞内用LipofectamineTM2000转染带Flag标签的MAP1B与带HA标签的Hsp90α或空载体。转染42小时后加入DMSO或者20μm MG132处理6小时。用IP缓冲液裂解。在细胞上清中加入Anti Flag亲和凝胶，4℃孵育4小时后收样，用抗Ub抗体检测MAP1B在有或没有Hsp90α存在下的泛素化程度。
2.2结果
视网膜感光细胞的外段不含有任何的蛋白质合成细胞器，其需要的蛋白质全部依靠在内段合成以后运输到外段。Hsp90α缺失的视网膜感光细胞所表现出的视紫质蛋白在内段滞留现象表明缺乏Hsp90α以后内段蛋白质运输受到了抑制，使得蛋白质不能及时输送到外段。原本只在视杆细胞外段定位的视紫质蛋白质也大量出现在视杆细胞的内段(图3B)。这说明内段合成的视紫质蛋白质不能及时地被运输到细胞外段。
蛋白质运输与细胞内的高尔基囊泡相关。蛋白质在内质网合成以后，通过高尔基体加工成熟并运输到相应的细胞部位。Hsp90α缺失的视网膜感光细胞内段中视紫质蛋白质滞留显示高尔基体受到了影响，内段中的蛋白质不能被及时运输。视网膜免疫组化分析和视网膜感光细胞亚细胞结构的电镜观察显示在Hsp90α缺失的视网膜感光细胞中高尔基体碎片化十分严重(图5A)。细胞内的高尔基体呈现出不规则的小泡，而不是有规律的膜片腔。碎片化的高尔基体影响了感光细胞内蛋白质的运输，从而使得感光细胞外段得不到足够的蛋白质补充，细胞就逐渐凋亡，视网膜就不断退化。
高尔基体的稳定与细胞微管骨架相关，微管骨架的不稳定会导致高尔基体的碎片化现象(8-12)。通过蛋白质组学分析，发现Hsp90α在感光细胞中结合了一个微管结合蛋白MAP1B，Hsp90α缺失导致了视网膜中MAP1B蛋白质的显著下降(图5B和C)。体外细胞株HEK293T中的实验表明，Hsp90α降低MAP1B的泛素化修饰，缺失Hsp90α导致MAP1B泛素化降解(图5D)。感光细胞中MAP1B下降以后，导致微管蛋白乙酰化水平的下降，微管骨架的不稳定使得高尔基体碎片化，影响了感光细胞中的蛋白质运输。因此，缺乏Hsp90α所引起的感光细胞凋亡和视网膜退化的关键是高尔基体的碎片化。如果能防止高尔基体的碎片化发生，就可以阻止Hsp90α缺乏所引起的感光细胞凋亡与视网膜退化。
实施例3
促进微管蛋白质乙酰化可以逆转Hsp90缺失导致的高尔基体碎片化
由于视网膜感光细胞无法在体外培养，难以实验操作视杆细胞或视锥细胞。在本实施例中，利用HeLa来研究Hsp90α缺失导致高尔基体碎片化的细胞机制，在HeLa细胞中探索阻止Hsp90α缺失引起的高尔基体碎片化的方法。
此外，还测试了去乙酰化酶抑制剂对于高尔基体碎片化的影响。
3.1实验方法
Hsp90敲低的HeLa细胞高尔基形态观察：采用免疫荧光或者电镜的方式对Hsp90敲低的HeLa细胞高尔基形态观察。使用LipofectamineTM RNAiMAX Regent(Invitrogen)按照说明书转染针对Hsp90的siRNA。RNAi72h后，将细胞于冷甲醇-20℃固定5分钟，进行GM130免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下进行高尔基体形态观察及统计。若进行电镜观察，制样方式与上面视网膜制样相同。
过表达Hsp90α或Hsp90β回复Hsp90敲低引发的高尔基体碎片化实验：构建稳定表达抵抗Hsp90靶向siRNA的GFP-Hsp90α或GFP-Hsp90β以及稳定表达GFP空载的HeLa稳转株。在这3株稳转细胞株中进行Hsp90RNAi,RNAi 72小时后，将细胞固定于4％多聚甲醛，室温固定30分钟后进行GM130免疫荧光染色。在激光共聚焦显微镜下进行高尔基体形态观察及统计。
过表达MAP1B回复Hsp90敲低引发的高尔基体碎片化实验：使用LipofectamineTMRNAiMAX Regent(Invitrogen)按照说明书转染针对Hsp90的siRNA。siRNA转染48小时后，用LipofectamineTM 3000转染带Flag标签的MAP1B质粒或者带Flag标签的GFP质粒。质粒转染24小时后，将细胞固定于4％多聚甲醛，室温固定30分钟后进行GM130和Flag免疫荧光染色。统计Flag阳性细胞的高尔基体形态。
TSA回复Hsp90敲低引发的高尔基体碎片化实验：使用LipofectamineTM RNAiMAXRegent(Invitrogen)按照说明书转染针对Hsp90的siRNA。转染的同时加入不同浓度(200nM,300nM,400nM,500nM TSA)。处理72小时后，将细胞于冷甲醇-20℃固定5分钟，进行GM130免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下进行高尔基体形态观察及统计。
3.2结果
由于HeLa细胞不同于视网膜感光细胞中主要表达Hsp90α亚型，而是同时表达Hsp90α和β两种亚型，本发明人在HeLa细胞中用RNA干扰技术同时抑制了Hsp90α和β蛋白质(图6A)。结果显示RNA干扰抑制了Hsp90蛋白质以后，HeLa细胞中的高尔基体呈现出明显的碎片化(图6B)。如果RNA干扰的Hela细胞中表达了Hsp90α或β蛋白质，高尔基体的碎片化现象得到抑制(图6D和E)。由此可见，在体外培养的HeLa细胞中呈现了视网膜中Hsp90α缺失导致的高尔基体碎片化现象。
在视网膜感光细胞中，Hsp90α与MAP1B结合并且Hsp90α缺失直接导致MAP1B蛋白质下降。为了验证MAP1B下降是Hsp90α缺失导致微管不稳定之间的中间蛋白质，在Hsp90被RNA干扰抑制的HeLa细胞中过量表达MAP1B(图7A)。结果发现，在Hsp90表达被抑制的HeLa细胞中过表达MAP1B就可以阻止高尔基体碎片化(图7B和C)，同时也大幅提高了微管蛋白的乙酰化(图7D)。这一发现证实只要能维持细胞中MAP1B的蛋白质水平不下降，那么Hsp90缺失也不会影响到高尔基体的完整性。
在视网膜中，Hsp90α的缺失不但导致MAP1B的下降，也导致微管蛋白乙酰化的下降(图5C)。在RNA干扰抑制Hsp90的HeLa细胞中也同样有类似的现象(图6A和图8A)。
研究表明，MAP1B与微管蛋白的乙酰化与微管骨架的稳定相关。而且，在Hsp90表达被抑制的HeLa细胞中微管蛋白的乙酰化可以被过表达MAP1B所大幅提高(图7B)。因此，Hsp90缺失导致的MAP1B蛋白质水平的下降最终是通过影响微管蛋白乙酰化来影响微管骨架的稳定性的。只要稳定细胞中的微管蛋白的乙酰化水平就可以维持微管骨架单位稳定性，前面那些蛋白质的缺失最终就不能影响到高尔基体的完整性。这一假设被去乙酰化酶抑制剂实验所证实。
在用去乙酰化酶抑制剂trichostatin A处理Hsp90表达被抑制的HeLa细胞以后，细胞中微管蛋白的乙酰化水平显著提高(图8B)。而且，细胞中的高尔基体碎片化得到逆转，呈现出完整的高尔基体形态(图8C和D)。在细胞中，只要用去乙酰化酶抑制剂维持微管蛋白的乙酰化以及微管骨架的稳定性，那些Hsp90和MAP1B蛋白质下降所导致的高尔基体碎片化就可以得到逆转。在细胞中，这些蛋白质水平仍未得到恢复，但是它们影响的细胞功能得到了恢复。
虽然Hsp90α的缺失导致HeLa细胞内高尔基体碎片化，但是只要使细胞内的微管蛋白保持乙酰化水平，从而使微管骨架保持稳定，那么，高尔基体解体碎片化的现象就会被恢复。尽管那些缺失的蛋白质的功能可能仍旧处于失活状态，但是，只要微管骨架的稳定就可以覆盖蛋白质缺失导致的不良效应。
在HeLa细胞中发现的这一结果提示对于Hsp90α缺失的视网膜感光细胞同样存在着可以通过稳定微管骨架来恢复被解体碎片化的高尔基体。一旦高尔基体得以恢复，那么其碎片化所导致的感光细胞内外段之间的蛋白质运输就可以得到恢复。这就可以延缓或阻止视网膜感光细胞的退化与凋亡。这为治疗视网膜色素变性疾病提供了一个全新的治疗途径和方案。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种化合物或物质的用途，其特征在于，所述的化合物或物质被用于制备(i)预防和/或治疗视网膜色素变性的药物；和/或(ii)防止或延缓视网膜的感光细胞退化或死亡的制剂或药物；
其中，所述化合物或物质选自下组：(a)高尔基体碎片化抑制剂；(b)微管骨架稳定剂；(c)微管蛋白乙酰化促进剂；(d)MAP1B蛋白或其促进剂；(e)Hsp90α或其促进剂；或其组合。
2.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(a)活性成分，所述活性成分选自下组：(a1)微管蛋白乙酰化促进剂；(a2)MAP1B蛋白或其促进剂；或其组合；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的微管蛋白乙酰化促进剂包括：去乙酰化酶的抑制剂；较佳地为组蛋白去乙酰酶HDAC或其它对微管蛋白质有去乙酰化作用的去乙酰化酶的抑制剂。
5.一种分离的或纯化的复合物，其特征在于，所述的复合物是Hsp90α和MAP1B形成的复合物。
6.如权利要求5所述的复合物的用途，其特征在于，用于制备筛选治疗视网膜色素变性的药物的制剂。
7.一种筛选视网膜色素变性的候选治疗药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一实验组和一对照组，其中，实验组和对照组的实验条件相同，不同点在于在实验组还施用测试化合物；
(b)观察实验组和对照组中的选自下组的一个或多个指标，并进行比较：
(b1)Hsp90α-MAP1B复合物的数量；
(b2)高尔基体碎片化程度；
(b3)微管骨架稳定化程度；
(b4)微管蛋白乙酰化程度；
(b5)MAP1B蛋白的数量和/或活性；
(b6)MAP1B蛋白的泛素化程度；
(b7)Hsp90α蛋白的数量和/或活性；
(c)如果出现一个或多个预期的指标结果，则提示所述的测试化合物是视网膜色素变性的候选治疗药物，
其中，所述的预期的指标结果的定义如下：
(b1)对于Hsp90α-MAP1B复合物的数量，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b2)对于高尔基体碎片化程度，实验组的实验结果显著低于于对照组的实验结果；
(b3)对于微管骨架稳定化程度，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b4)对于微管蛋白乙酰化程度，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b5)对于MAP1B蛋白的数量和/或活性，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果；
(b6)对于MAP1B蛋白的泛素化程度，实验组的实验结果显著低于对照组的实验结果；
(b7)Hsp90α蛋白的数量和/或活性，实验组的实验结果显著高于对照组的实验结果。
8.一种构建视网膜色素变性的非人哺乳动物模型的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在所述的动物中，下调视网膜中Hsp90α和/或MAP1B的表达或活性，从而形成视网膜色素变性动物模型。
9.一种非人哺乳动物模型的用途，其中，所述的动物模型中Hsp90α和/或MAP1B的表达或活性是下调的，其特征在于，所述动物模型被用于筛选治疗视网膜色素变性的药物；或用于制备用于筛选治疗视网膜色素变性的药物的动物模型。
10.一种Hsp90α或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备(a)提高MAP1B稳定性的制剂；(b)降低MAP1B的泛素化程度的制剂；和/或(c)抑制MAP1B降解的抑制剂。
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