CN110801512A - 一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用。本发明公开的多肽为HT‑39，HT‑39为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列1的多肽；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。实验证明，本发明的HT‑39能够刺激垂体分泌FSH和LH，并能通过刺激垂体促性腺激素的分泌来调控E2和T的产生，具有促进性腺发育成熟的能力，可作为一种安全、有效的同源性激素用于动物的人工催熟。

Description

一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用。
背景技术
哲罗鲑(Hucho taimen)是鲑形目、鲑科、哲罗鱼属的一种大型珍稀的经济鱼类，主要分布在我国黑龙江、图门江、额尔齐斯河等水系。随着人们对水产品消费需求日益增加，且对健康食品意识的增强，哲罗鲑野生资源已不能满足市场需求。随着水产养殖业的迅猛发展，目前哲罗鲑已经实现了全人工的繁育，且其人工养殖规模正在逐步扩大。野生成熟哲罗鲑在春季开江后，溯河向溪作生殖洄游，通常其生殖期于的5月中旬开始，集群在水流湍急、砂砾底质的河川产卵。根据野生哲罗鲑生殖规律，一般在每年的4月中旬人工对哲罗鲑注射催熟、催产激素，刺激哲罗鲑卵巢成熟，实现人工催产。
哲罗鲑的生殖活动主要受下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamic-pituitary-ovaryaxis)的调控，促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)作为下丘脑-垂体-卵巢轴的关键信息分子，它直接作用于垂体，刺激垂体分泌促卵泡素(Folliclestimulating hormone，FSH)和促黄体素(Luteinizing hormone，LH)。垂体FSH和LH在不同阶段通过血液循环调节外周靶性性腺类固醇激素(雌二醇，E2；睾酮，T)的产生，具有调控配子最终成熟、促使卵母细胞或精子最后成熟、刺激排放的作用。E2和T调节卵黄和精子的发生，在下丘脑和垂体水平上通过正反馈刺激未成熟鱼类GnRH和GtHs的合成与释放，启动HPG轴的功能，刺激性腺发育。在自然条件下，随着硬骨鱼卵巢不断发育，其血清中E2的含量呈现逐渐下降趋势，它在卵细胞发育初期起主要作用。T具有将卵黄蛋白原运输到卵细胞内，从而促进卵细胞发育成熟的能力，在卵细胞发育后期起主要作用。
最早发现且已确定具有刺激垂体分泌的促性腺激素释放激素是人工合成的哺乳类的促黄体素释放素(LHRH：luteinizing-hormone Releasing-hormone；亦即哺乳类促性腺激素释放激素，mGnRH)。随着对GnRH的深入研究，对于GnRH有了全新的认识。根据脊椎动物的GnRH前体，将GnRH进化划分为三个主要分支，其中一支为包括所有鱼类的下丘脑促激素分泌的sGnRH。现阶段，在全人工繁育过程中主要通过注射鲑鱼释放激素类似物(S-GnRH-A)，绒毛膜促性腺激素和地欧酮促使GtH大量释放，诱导进哲罗鲑卵巢成熟，排卵等生命活动。然而，由于GnRH的分泌核群具有种属的差异，对哲罗鲑人工催产时使用外源激素不仅影响其对垂体激素的诱导能力，而且会产生一定的特异性反应，且重复性的使用会引起鱼体产生免疫反应，对哲罗鲑生殖、生理功能造成伤害。因此开发新型的同源性促性腺激素释放素类似物对哲罗鲑进行催熟、催产，将避免哲罗鲑对激素的敏感性，减少异体活性物质造成的反应特异性伤害，在此基础上大大增加哲罗鲑繁育效率，对哲罗鲑健康养殖具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何促进动物，尤其是鱼的性腺成熟。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了HT-39的下述任一应用：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放；
X5、制备促进动物性腺成熟产品；
X6、制备促进动物垂体分泌促性腺激素产品；
X7、制备促进动物产生性激素产品；
X8、制备促进动物配子成熟或排放产品；
所述HT-39为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列1的多肽；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的HT-39，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的多肽。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的HT-39可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还提供了与所述HT-39相关的生物材料的下述任一应用：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放；
X5、制备促进动物性腺成熟产品；
X6、制备促进动物垂体分泌促性腺激素产品；
X7、制备促进动物产生性激素产品；
X8、制备促进动物配子成熟或排放产品；
所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述HT-39的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HT-39的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的编码HT-39的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码HT-39且具有相同作用，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码HT-39的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
B2)所述的含有编码HT-39的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达HT-39的DNA，该DNA不但可包括启动HT-39基因转录的启动子，还可包括终止HT-39基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有HT-39基因表达盒的重组载体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
所述细胞系不包括繁殖材料。
上述应用中，所述动物可为雌性或雄性动物。
上述应用中，所述动物可为鱼。所述鱼可为哲罗鲑。
上述应用中，所述性腺可为卵巢或精巢；
所述促性腺激素可为促卵泡素或促黄体素；
所述性激素可为雌二醇或睾酮；
所述配子可为卵细胞或精子。
所述HT-39或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了具有如下任一功能的产品，所述产品的活性成分为所述HT-39：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放。
上述产品中，所述动物可为雌性或雄性动物。
上述产品中，所述动物可为鱼。进一步，所述鱼可为哲罗鲑。
上述产品中，所述性腺可为卵巢或精巢；
所述促性腺激素可为促卵泡素或促黄体素；
所述性激素可为雌二醇或睾酮；
所述配子可为卵细胞或精子。
本发明中，促进动物垂体分泌促性腺激素可体现在提高垂体中lhβ基因和/或fshβ基因的表达量上。
实验证明，本发明的HT-39能够刺激垂体分泌FSH和LH，并能通过刺激垂体促性腺激素的分泌来调控E2和T的产生，具有促进性腺发育成熟的能力，可作为一种安全、有效的同源性激素用于动物的人工催熟。
附图说明
图1为细胞水平上HT-39的安全性测定结果。
图2为不同处理组垂体中lhβ和fshβmRNA含量变化。同一基因不同组别中标有不同字母表示差异达到显著性水平(P≤0.05)。
图3为不同处理组血清中E2和T含量变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、HT-39可以促进哲罗鲑卵巢发育成熟
一、实验材料
试验用鱼来自黑龙江水产研究所渤海冷水鱼试验站，挑选体质健壮、规格和重量基本一致的同一批全人工培育的3龄雌性哲罗鲑，体质量500-600g。试验用鱼采用流水养殖方式，实验用水为山泉水，溶氧>6.00mg/L，温度保持在13.00-15.00℃,NH4/NH3<0.02mg/L,pH 7.10-7.20。
试验用多肽为合成多肽，将其命名为HT-39，其氨基酸序列：QHWSYGWLPGGKRSVGELEATIKMMDTGGVVALPEETSA(序列表中序列1)，分子量为4189.70Da；PI为4.96。该肽段为单链，不具有化学键的修饰。
实验用细胞为虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad，RTG-2)：美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号：CCL-55。
二、细胞毒性实验
采用细胞培养基(含2％FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的MEM培养基)溶解多肽HT-39，得到多肽溶液，用于细胞毒性实验。
将对数生长期的RTG-2细胞接种于96孔培养板中，待细胞长成单层后分别加入100μL不同浓度的多肽溶液(多肽在培养体系中的浓度分别为15.625μg/mL、31.25μg/mL、62.50μg/mL、125μg/mL、250μg/mL)，即多肽组，每个稀释度设8个重复，同时设正常对照组和空白对照组，正常对照组与多肽组的区别仅在于正常对照组在细胞长成单层后加入的为100μL的细胞培养基，空白对照组与多肽组的区别仅在于空白对照组不接种细胞。二氧化碳培养箱18℃培养观察并记录细胞病变情况。培养3天后取出培养板，MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)测定细胞活性。
MTT法测定细胞活性的步骤为：96孔培养板每孔加MTT溶液20μL(5mg/mL，PBS溶解，pH＝7.40)，培养箱18℃继续孵育4小时后，每孔加入150μL二甲基亚砜进行终止反应，脱色摇床振荡10分钟，使结晶物充分融解。在酶联免疫检测仪波长490nm处测量各孔的吸光值(A)。计算细胞活力，细胞活力＝(A多肽组-A空白对照组)/(A正常对照组-A空白对照组)×100％。
从图1中可以看出，HT-39在小于等于250μg/mL浓度下未显著抑制RTG-2细胞的增殖(P≥0.05)，RTG-2细胞仍然可以保持95％以上的活性，结果显示在小于等于250μg/mL浓度下HT-39对RTG-2细胞没有毒性作用。
三、HT-39对哲罗鲑的影响
1、实验设计与采样
采用生理盐水溶解多肽HT-39至一定浓度得到HT-39溶液用于催熟实验。
选取40尾雌性哲罗鲑并将其随机分为4组(A，B，C，D组)，每组10尾。然后按照如下方式处理各组：
A组：每尾背部注射1mL生理盐水；
B组：每尾背部注射1μg/kg体重剂量的HT-39溶液，注射体积均为1mL；
C组：每尾背部注射3μg/kg体重剂量的HT-39溶液，注射体积均为1mL；
D组：每尾背部注射5μg/kg体重剂量的HT-39溶液，注射体积均为1mL。
注射3天后以MS-222麻醉(300mg/L)哲罗鲑，然后尾部采血，血液4℃静置后于2000r/min离心30min，收集血清于-20℃保存，用于测定血清中雌二醇(E2)与睾酮(T)含量。而后打开哲罗鲑头颅，采集位于间脑后侧丘脑下方的下丘脑及丘脑末端垂体窝内垂体组织，用于RNA的提取。
2、结果
2.1、HT-39对细胞及哲罗鲑安全性测定
注射3天后统计各组的存活率，结果显示，各处理组哲罗鲑均无死亡情况发生，这一结果表明采用1～5μg/kg体重剂量的HT-39对哲罗鲑进行催熟试验具有较好的安全性。
2.2、实时荧光定量PCR检测
提取下丘脑与垂体组织RNA。采用多功能酶标仪检测RNA的浓度与纯度；利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。根据GenBank上GnRHR(大西洋鲑，Salmo salar)、lhβ(虹鳟，Oncorhynchus mykiss)、fshβ(大西洋鲑，Salmo salar)基因序列，利用Premier 5.0设计荧光定量PCR特异引物引物序列见表1。以管家基因β-actin(亚东鲑，Salmo truttafario)作为内标基因。利用One Step
Figure BDA0002274369710000061
PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit(TaKaRa，Japan)试剂盒测定下丘脑GnRHR基因及垂体FSH与LH基因表达水平，用比较CT法(ΔΔCT)分析数据。
表1哲罗鲑垂体激素基因荧光定量引物
Figure BDA0002274369710000062
数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，对激素mRNA表达水平分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05表示差异显著。
由图2中可以看出，多肽处理组(B、C、D组)中垂体lhβ和fshβ基因表达量均显著高于对照组(A组)(P≤0.05)。垂体中lhβ基因的表达量随着HT-39注射剂量的增加而逐渐升高，当注射剂量为3μg/kg体重时，与A组(对照组)相比较，垂体lhβ基因的表达量高达90倍以上(P≤0.05)。通过对垂体fshβ基因分析发现，当注射剂量为3μg/kg体重时，垂体fshβ基因表达量升高了1.74±0.32倍，而当注射剂量为5μg/kg体重时与注射剂量为3μg/kg体重时相比垂体fshβ基因表达量则显著降低(P≤0.05)。综上结果表明，HT-39具有刺激垂体分泌LH和FSH的生物活性，且3μg/kg体重注射剂量时其刺激垂体分泌激素能力优于1μg/kg与5μg/kg体重注射剂量。
2.3、血清中E2和T含量变化
采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测待测血清中雌二醇(E2)与睾酮(T)含量，雌二醇的检测采用上海酶联生物科技有限公司的鱼雌二醇(E2)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(货号为ml003452)进行，睾酮的检测采用上海酶联生物科技有限公司的鱼睾酮(T)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(货号为ml1022671)进行，均采用试剂盒操作步骤进行。
E2检测步骤如下：
1E2标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度的E2标准品溶液50μL；
2加样：分别设置空白孔(不加样品及酶标试剂)，待测样品孔。在待测样品孔中加样品稀释液40μL，再加入待测样品10μL，轻轻晃动混匀；
3加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；
4温育：封板膜封板后置于37℃温育60分钟；
5洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，拍干，如此重复5次；
6显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
7终止：每孔加终止液50μL终止反应(此时反应液由蓝色转变为黄色)；
8测定：以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光值。测定应在加终止液后15分钟内进行。
T检测步骤如下：
1设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度的T标准品溶液50μL；
2分别设置空白孔(不加样品及酶标试剂)，待测样品孔。在待测样品孔中加样品50μL；
3除空白孔，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，：封板膜封板后置于37℃温育60分钟；
4小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，拍干，如此重复5次；
5每孔加入底物A、B各50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光孵育15分钟；
6每孔加终止液50μL终止反应，15分钟内在450nm波长测量各孔的吸光值。
由图3中可以看出，多肽处理组(B、C、D组)中血清E2含量均显著高于对照组(A组)(P≤0.05)。血清中E2的含量随着HT-39注射剂量的增加(1μg/kg体重，3μg/kg体重)而显著升高；当HT-39注射剂量为5μg/kg体重时，D组血清中E2含量与C组中E2含量无显著差异(P≤0.05)。血清中T含量变化趋势与E2变化趋势相似。从图中看出，血清中T含量随着HT-39注射剂量的增加显著升高，当注射剂量为5μg/kg体重时，血清中T含量最高，达到50.77±8.36pg/mL。以上结果表明，注射HT-39提高了血清中E2与T的含量，说明HT-39具有促进哲罗鲑卵细胞发育成熟的能力。
HT-39能够刺激哲罗鲑垂体分泌FSH和LH，并能通过刺激垂体促性腺激素的分泌来调控E2和T的产生，具有促进哲罗鲑卵巢发育成熟的能力，可作为一种安全、有效的同源性激素用于哲罗鲑的人工催熟。
<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120> 一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Gln His Trp Ser Tyr Gly Trp Leu Pro Gly Gly Lys Arg Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Leu Glu Ala Thr Ile Lys Met Met Asp Thr Gly Gly Val Val Ala
20 25 30
Leu Pro Glu Glu Thr Ser Ala
35

Claims (8)

1.HT-39的下述任一应用：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放；
X5、制备促进动物性腺成熟产品；
X6、制备促进动物垂体分泌促性腺激素产品；
X7、制备促进动物产生性激素产品；
X8、制备促进动物配子成熟或排放产品；
所述HT-39为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列1的多肽；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。
2.与权利要求1中所述的HT-39相关的生物材料的下述任一应用：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放；
X5、制备促进动物性腺成熟产品；
X6、制备促进动物垂体分泌促性腺激素产品；
X7、制备促进动物产生性激素产品；
X8、制备促进动物配子成熟或排放产品；
所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述的HT-39的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为雌性或雄性动物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述动物为鱼。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述鱼为哲罗鲑。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述性腺为卵巢或精巢；
所述促性腺激素为促卵泡素或促黄体素；
所述性激素为雌二醇或睾酮；
所述配子为卵细胞或精子。
7.权利要求1中所述的HT-39或权利要求2所述的生物材料。
8.具有如下任一功能的产品，其活性成分为权利要求1中所述的HT-39：
X1、促进动物性腺成熟；
X2、促进动物垂体分泌促性腺激素；
X3、促进动物产生性激素；
X4、促进动物配子成熟或排放。
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