CN110786828B - 一种经颅电刺激组件，装置，系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种经颅电刺激组件，装置，系统及应用，涉及实验设备技术领域。其用于动物颅骨电刺激，其包括头环，玻璃片，导线和导电胶带。头环开设有成像孔，玻璃片用于与动物皮层接触，导线用于环绕于玻璃片的外周并与动物颅骨接触，导电胶带粘接覆盖于导线和颅骨上。由上述经颅电刺激组件，装置，系统及应用可以实现动物的长期经颅电刺激，能够用于研究动物清醒状态下长期电刺激过程中细胞形态和功能的变化，进而研究电刺激产生的可塑性机制。
Description
技术领域
本发明涉及实验设备技术领域，具体而言，涉及一种经颅电刺激组件，装置，系统及应用。
背景技术
目前，采用双光子显微镜研究经颅电刺激产生皮层可塑性机制的实验都是急性实验，现有的技术只能进行短期的电刺激观察，缺乏长期双光子成像的经颅电刺激装置。经颅电刺激需要每天重复电刺激才能发挥功效，因此实现长期成像对研究电刺激产生的可塑性机制非常重要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经颅电刺激组件，装置，系统及应用，从而解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种经颅电刺激组件，其用于动物颅骨电刺激，其包括头环，玻璃片，导线和导电胶带。头环开设有成像孔，玻璃片用于与动物皮层接触，导线用于环绕于玻璃片的外周并与动物颅骨接触，导电胶带粘接覆盖于导线和颅骨上。
导线用于传递电信号从而实现电刺激。优选的，在动物开颅区域的周边颅骨上开设凹槽，将导线放置其中，利于导线固定。导线与颅骨保持接触保证电信号的传递。
在头环上设置成像孔是用于后续对颅骨开颅区的显微成像。成像孔的直径为1cm。观察时，显微镜的物镜对准成像孔。
设置玻璃片用于对动物颅骨开颅区进行封盖，能够减少皮层的搏动，采用显微镜透过玻璃片进行成像能够获得清晰的大脑皮层图像。同时能够防止外界环境感染，动物可以放回饲养保持良好状态，实现长期活体成像。本发明提供的经颅电刺激组件可以控制电刺激颅骨的面积，既可以实现长期的经颅电刺激，也可以进行电刺激过程中动物的细胞形态和功能变化的观察。使用时，玻璃片与动物颅骨接触的外周使用粘性物质密封，优选的，采用康派特医用胶粘结。
导电胶带优选为导电铜箔胶带，导电胶带用于控制电极刺激面积。
使用时，用导电胶带将导线固定于动物颅骨上。优选的，用钻头在紧靠开颅区域的周边颅骨上用钻头磨出一条细的环形凹槽，磨薄即可。将导线置于环形凹槽内，上面用导电胶带固定导线。
导电胶带的面积大小决定了电极与颅骨的接触面积，不同的实验设计可以使用不同面积大小的导电胶带，另外还有粘结的作用。
在本发明应用较佳的实施例中，上述经颅电刺激组件还包括粘结剂。
在本发明应用较佳的实施例中，上述粘结剂为康派特医用胶和牙科水泥。
康派特医用胶用于玻璃片与颅骨的密封，可以初步固定玻璃片。牙科水泥用于将玻璃片、颅骨以及头环之间的缝隙全部粘接牢固，确保动物在饲养过程中不会由于外力使玻璃片发生移动而导致实验失败。
在本发明应用较佳的实施例中，上述头环还设置有用于将动物固定于实验台的安装孔。通过设置安装孔可以实现老鼠头部与实验台的固定，防止动物活动而无法稳定成像。
在本发明应用较佳的实施例中，上述安装孔的数目至少为2个。安装孔可以根据稳固的需要进行调整。
在本发明应用较佳的实施例中，上述导线的材料为银，金或铜等导电金属。导线的材质优选为银，银的导电性能强，且柔软易操作。在其他实施例中，也可以是其他软的导电金属丝。
一种经颅电刺激装置，其用于动物颅骨电刺激，其包括经颅电刺激组件和外部的电刺激器，外部电刺激器与导线连接。
一种经颅电刺激系统，其用于动物颅骨电刺激成像，其包括经颅电刺激装置和显微镜；显微镜透过经颅电刺激组件的玻璃片成像；
优选的，显微镜为双光子显微镜。使用时，将双光子显微镜的物镜对准头环上的成像孔，透过玻璃片对下方的皮层进行成像。
一种经颅电刺激装置或经颅电刺激系统在双光子成像中的应用。
一种使用经颅电刺激装置进行动物长期电刺激的方法，其包括对动物颅窗开颅区域进行预处理。开颅后，在暴露的皮层注射病毒载体，采用康派特医用胶将圆形玻璃片和暴露的皮层密封好，然后在开颅区域的周边颅骨磨出一条细的环形凹槽，将导线环绕于环形凹槽中并用一定面积的导电胶带固定，确定刺激面积。将导线引出与外界的电刺激器连接，用牙科水泥将头环固定在动物颅骨上，同时使用牙科水泥将玻璃片周边进一步固定牢固。
进一步地，对动物颅窗开颅区域进行预处理包括动物麻醉，清除局部头皮，用低浓度头孢(头孢和盐水比例1:250)冲洗，确定颅窗开颅区域位置和大小，例如直径3-4mm的颅窗。
在本发明应用较佳的实施例中，上述病毒载体为转染皮层神经元的病毒载体；
优选的，病毒载体为AAV-Syn-GCaMP6f-WPRE，也可以使用其它病毒载体特异性转染星型胶质细胞，小胶质细胞等。
上述载体可以实现神经元内GCamp6f荧光蛋白的表达，能够作为监测细胞内钙浓度变化的指示剂。在双光子激发下，通过双光子显微镜可以观察到GCamp6f荧光强度的变化，用于反映细胞的活动。
一种使用经颅电刺激装置进行双光子成像的方法，其包括将经颅电刺激装置固定于动物头颅，并对动物腹腔注射药物或尾静脉注射荧光标记物，再用双光子显微镜透过经颅电刺激装置的成像孔进行显微成像；
优选的，荧光标记物为荧光素、德克萨斯红或罗丹明等。
当需要对细胞和血管同时双光子成像时，只需要每次尾静脉注射荧光标记物即可。当需要给予药物干预时，只需要进行腹腔注射，即可用于药物干预前后的双光子成像。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过提供一种经颅电刺激组件，装置，系统及应用可以实现动物的长期经颅电刺激，能够用于研究清醒动物长期电刺激过程中细胞形态和功能的变化，进而研究电刺激产生的可塑性机制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为经颅电刺激装置安装于动物模型头部的成像示意图；
图2为图1的俯视图；
图3为采用图1的装置进行的电刺激和双光子成像效果展示(A)小鼠皮层注射病毒3周后神经元内GCamp6f荧光蛋白表达效果图，圆圈代表神经元；(B)通过银丝进行电刺激诱发的神经元钙信号变化。电刺激参数为双向脉冲，频率为50Hz，电流强度为0.3mA，持续时间为2秒钟；
图4为尾静脉注射德克萨斯红的小鼠皮层血管和神经元成像(左图为浅表层图像，右图为较深层图像)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种经颅电刺激组件。参照图1和图2所示，金属头环上开设有成像孔和安装孔，圆形玻璃片覆盖动物开颅皮层，玻璃片周边有银丝导线和导电胶带，将圆形玻璃片用康派特医用胶和牙科水泥固定在动物颅骨上。
实施例2
本实施例提供了实施例1中的经颅电刺激装置的安装及使用方法，具体包括如下步骤：
(1)手术器械、经颅电刺激装置进行高压锅灭菌消毒；
(2)正常饲养8周龄的小鼠，采用异氟烷气体麻醉，固定在立体定位仪上。清除局部头皮和筋膜，用低浓度头孢(头孢和盐水比例1:250)冲洗，确定颅窗开颅区域，直径可选3-4mm。开颅后，在暴露的皮层注射病毒载体AAV-Syn-GCaMP6f-WPRE，转染皮层神经元，从而在神经元中表达GCamp6f荧光蛋白，进而实现后期的双光子钙成像，研究神经元的钙活动变化。注射病毒载体后，采用康派特胶水将圆形玻璃片和暴露的皮层周边颅骨密封好。
(3)在紧靠玻璃片的周边颅骨上用钻头磨出一条细的环形凹槽，磨薄即可，再将直径为150μm的银丝环绕在环形凹槽内。采用一定大小的导电胶带将银丝稍微固定在环形凹槽内，银丝末端伸出引线用于与外界电刺激器连接。用牙科水泥将实施例1中的头环固定在小鼠颅骨上，同时将玻璃片也使用牙科水泥进一步固定稳定。
进一步地，本实施例中导线为银丝。
(4)手术完毕，将小鼠放回饲养。每天腹腔注射0.1ml地塞米松和头孢的混合液，持续注射一周，防止皮层产生炎症，饲养3周后即可进行成像。
(5)在进行电刺激实验时，在银丝的末端连上电刺激器用于经颅电刺激，同时在双光子显微镜下进行皮层钙成像。每天重复一定时间的电刺激，在同一只动物上研究长时间经颅电刺激对皮层细胞的影响。
实验例1
本实验例是采用实施例2中的小鼠模型进行的电刺激和双光子成像实验。小鼠皮层注射病毒3周后神经元内GCamp6f荧光蛋白表达效果图参照图3中A图所示，由图可知，神经元正常表达GCamp6f荧光蛋白。设置电刺激参数为双向脉冲，频率为50Hz，电流强度为0.3mA,持续时间为2秒钟。实验结果参照图3中的B图所示，通过银丝进行电刺激诱发的神经元钙信号变化明显。
实验例2
本实验例进行尾静脉注射德克萨斯红的小鼠皮层血管和神经元成像试验。成像结果参照图4所示，箭头所指示类似形状的结构均为血管，而圆圈结构均为神经元。左图为浅表层图像，右图为较深层图像。由图4可知，本发明提供的经颅电刺激装置可以对细胞和血管同时双光子成像，且图像清晰，即本发明提供的经颅电刺激装置能够用于研究清醒动物在电刺激下细胞形态、功能以及神经血管耦合关系发生的变化。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种经颅电刺激组件，其特征在于，其用于动物颅骨电刺激，其包括头环，玻璃片，导线和导电胶带，所述头环开设有成像孔，所述玻璃片用于与动物皮层接触，所述导线用于环绕于所述玻璃片的外周并与所述动物颅骨接触，所述导线设置于动物颅骨磨出的环形凹槽内，所述导电胶带粘接于所述导线外周；所述头环还设置有用于固定动物颅骨的安装孔。
2.根据权利要求1所述的经颅电刺激组件，其特征在于，所述经颅电刺激组件还包括粘结剂。
3.根据权利要求2所述的经颅电刺激组件，其特征在于，所述粘结剂为牙科水泥和康派特医用胶。
4.根据权利要求1所述的经颅电刺激组件，其特征在于，所述安装孔的数目至少为2个。
5.根据权利要求1所述的经颅电刺激组件，其特征在于，所述导线的材料为银，金或铜。
6.一种经颅电刺激装置，其特征在于，其用于动物颅骨电刺激，其包括权利要求1-5任一项所述的经颅电刺激组件。
7.一种经颅电刺激系统，其特征在于，其用于动物颅骨电刺激成像，其包括权利要求6所述的经颅电刺激装置和显微镜；所述显微镜透过经颅电刺激组件的玻璃片成像；
所述显微镜为双光子显微镜。
8.一种权利要求6所述的经颅电刺激装置或权利要求7所述的经颅电刺激系统在双光子成像中的应用。
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