CN110777151B

CN110777151B - 一种调控类黄酮合成的基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110777151B
Application number: CN201810850168.XA
Authority: CN
Inventors: 王中; 杨军; 王姗姗; 武明珠; 张剑锋; 李锋; 谢小东
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2018-07-28
Filing date: 2018-07-28
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2038-07-28
Also published as: CN110777151A

Abstract

本发明涉及一种调控类黄酮合成的基因及其编码蛋白与应用，属于植物基因工程技术领域。调控类黄酮合成的基因，序列如SEQ ID NO：1所示，该来源于普通烟草，命名为NtMYB27，NtMYB27基因全长1240bp，包含3个内含子和4个外显子，其编码区全长597bp。本发明通过基因序列的克隆分析、表达载体的构建以及基因表达检测等技术发现NtMYB27转录因子能够抑制叶片中黄酮醇类物质的合成，而这种抑制作用是通过抑制NtFLS和NtCHS基因的表达来实现的。因此，本发明证实NtMYB27是植物黄酮醇合成的负调控因子，当该基因表达受到抑制或者功能缺失时，能显著增加植物叶片中黄酮醇类物质的含量，为后续利用基因编辑技术提升植物黄酮醇含量提供明确的靶标基因。

Description

一种调控类黄酮合成的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种调控类黄酮合成的基因及其编码蛋白与应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

烟草是主要的经济作物之一，在我国国民经济中占有重要的地位。烟草中多酚类物质主要有单宁类、香豆素类和黄酮类等。黄酮类化合物香精烟珠的活性成分在卷烟中随烟气进入人体口腔，可以直接作用于喉部，起到良好的提高喉部舒适性的作用。

植物体内类黄酮物质的含量受光照强度、紫外线、温度、氮素水平、病菌感染、干旱等影响。此外，植物激素也能调控类黄酮的合成，如脱落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸(jasmonate acid，JA)和细胞分裂素(cytokinins)能诱导类黄酮的合成，赤霉素(gibberellic acid，GA)、乙烯(ethylene)和油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)则抑制该类物质的合成。但是这些环境因素或者发育调控因素对类黄酮合成的影响最终还是通过调控类黄酮合成相关转录因子基因或者功能基因的表达量来实现的。目前已报道的参与调控类黄酮合成的转录因子主要有三种，即MYB、bHLH(basic helixloop-helix)和WD40蛋白。三个密切相关的R2R3-MYB类转录因子MYB11、MYB12和MYB111能够促进类黄酮合成代谢通路上游功能基因的转录，进而促进黄酮醇类物质的合成累积。

借助烟草基因芯片平台数据和基因组数据库，我们进行了芸香苷合成相关转录因子的发掘。通过基因共表达分析我们发现一个MYB类转录因子(Ntab0025110)基因与芸香苷合成关键基因NtFLS的表达水平密切相关，经序列同源性比对发现这个转录因子对应拟南芥中的AtMYB27(AT3G53200)。Albert等发现在矮牵牛中PhMYB27能够显著地抑制花青素的合成，他们分别创制了PhMYB27基因的过表达和RNAi材料，结果发现过表达植株的花瓣颜色变淡，而RNAi植株的叶片颜色变紫，进一步研究表明PhMYB27能够调控花青素合成支路上多数基因的表达。但是他们并没有检测转基因材料中黄酮醇类物质的含量，因此该转录因子是否调控黄酮醇类物质的合成尚未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种调控类黄酮合成的基因。

本发明还提供上述调控类黄酮合成的基因所编码的蛋白。

另外，本发明提供一种含调控类黄酮合成的基因的重组载体及其构建方法。

本发明提供一种含调控类黄酮合成的基因的重组菌及其构建方法。

此外，本发明提供一种含调控类黄酮合成的基因的转基因细胞系及其构建方法。

最后，本发明提供调控类黄酮合成的基因、包含该基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系在类黄酮合成调控中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案包括：

一种调控类黄酮合成的基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示。该来源于普通烟草，命名为NtMYB27，该基因全长1240bp，包含3个内含子和4个外显子(下划线部分所示)，如下所示：

atgcaccaagacgaactgcggagagggcaatggcttgaagaggaagatgagagtctggttatgattat agccatgttaggagaacgtcgttgggatgcgttagcaaaggcttcaggtataatttggctatgccgaaatgttaaaactttaaactgaaacgtatgtgtgcttggtatgacgaaagtcatttgataagaaacattttctggtaaccatacactactaaaagatgactaactcatgaaaacattttcctgaaatattacttctgttgtaccaaacacacccgaagcattaaataactgtgttggaatatgctttaatgcagggctgaggaggagtgggaaaagctgcagattgcgatggttgaac tatctccgtcccaatctaaagcacggtcatattactgcaggtgaagaacatctgataatccaacttcagaaacagt ttggaaacaagtaaagctttttccttcttcataagaatttttaatgctttacaacaaattaattgtctttctgctatccaaacgccgaaagaatcttttcctgtttccaggccaagattgtttcacttgtttacttaattctttttactaaatttacaggtggtcaaagatagctgaacaattgccaggaagaactgataacgaaatcaagaactactggaaaagtca tttaagaaagaaagcactaacatacaaacaaggtgtactacaactctacaagattctgctttaacttttatatactgcactataaaaaacttttatactatcagtgtacttcacatgttattattatggattgcctgctttattttttcaagcatttaagctagttccacttatttatgaacagttaattacctgtaactatcctttaggttatctgatagtgtaaaagttctttcacgcaattagtttatataagttaatgtctgttcccttcccgtgccgtttctcacaaattattggtttcatgtgacagaatcctttggcagtaacacaagtaattcagaacaacaatcatcaactttgaaaagtgacacagtccc ttcttctcatagtgatgactccttttctggaaaaggagattgttcctctgctgattctttggcatactcttcaaat gacacaacattattggattggattccaagttggtcatatgaacaaagcagaatggagcatcatatgtacttttgca gctcaaacctatgtttttgttatcctccatag。

NtMYB27基因的编码区全长为597bp，如SEQ ID NO：1所示的第1-115，329-458，608-708，990-1240位，总共编码198个氨基酸。

调控类黄酮合成的基因所编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种含上述调控类黄酮合成的基因的重组载体。

所述重组载体的构建方法为：将调控类黄酮合成的基因插入到相应表达载体的酶切位点，通过连接酶连接得到重组载体。

一种含上述调控类黄酮合成的基因的重组菌。

所述重组菌的构建方法为：将调控类黄酮合成的基因导入菌体中获得重组菌。具体可以将上述重组载体转入菌体中，筛选得到重组菌。

一种含上述调控类黄酮合成的基因的转基因细胞系。

所述转基因细胞系的构建方法为：将调控类黄酮合成的基因导入植物细胞中获得转基因细胞系。具体可以将上述重组菌转入植物细胞中，培养得到转基因细胞系。

调控类黄酮合成的基因、包含该基因的重组载体、重组菌或转基因细胞系在类黄酮合成调控中的应用。

所述调控类黄酮合成的基因、包含该基因的重组载体、重组菌或转基因细胞系在类黄酮合成调控过程中的应用具体为在黄酮醇类物质合成调控中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过对烟草NtMYB27基因的克隆和表达载体的构建与分析发现，烟草NtMYB27转录因子可以抑制NtFLS和NtCHS基因的表达，进一步地抑制叶片黄酮醇类物质的合成。目前已知的调控黄酮醇合成的转录因子都是正向促进黄酮醇合成的转录因子，尚没有负向调控因子的报道。借助基因编辑技术将负向调控因子敲除，可以显著提高植物中黄酮醇的含量。

附图说明

图1为烟草NtMYB27与拟南芥AtMYB转录因子的进化分析；

图2为NtMYB27氨基酸序列及其与同源蛋白的比对分析；

图3为烟草NtMYB27基因在不同组织中的表达水平；

图4为载体pCAMBIA1301结构示意图；

图5为转基因幼苗的筛选鉴定；

图6为qPCR检测转基因植株中类黄酮合成相关基因的表达水平；

图7为转基因植株中黄酮醇的含量检测。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

下述实施例中，如无特殊说明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

烟草NtMYB27基因序列的克隆，包括以下步骤：

(1)烟草幼苗叶片组织收获后立即用液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存，经液氮充分研磨后，利用烟草RNA快速提取试剂盒(Gene Answer，RT0110)进行提取，严格按照试剂盒说明书操作提取烟草叶片总RNA，提取过程中用DNaseⅠ(Omega，#E1091-01)消化去除基因组DNA，提取完成后用琼脂糖凝胶检测RNA的质量，用Nanodrop测定RNA样品的浓度。选择质量和浓度都良好的样品进行cDNA第一链的合成，合成过程采用PrimeScript^TMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TAKARA，6210A)，严格按照试剂盒说明书操作，得到cDNA样品，检测浓度后用于后续基因的克隆。

(2)利用中国烟草基因组数据库V4.0检索Ntab0025110基因，获得该基因的全长CDS序列。根据数据库中的序列，设计含有酶切位点的特异性扩增引物如下：

NtMYB110-Xba I-F:5’-AAAtctagaATGCACCAAGACGAACTGCGG-3’；

NtMYB110-Kpn I-R:5’-CACggtaccTGGAGGATAACAAAAACATAG-3’。

以烟草叶片的cDNA为模板，利用高保真

HS DNA Polymerase(TAKARA，R010A)进行PCR扩增，扩增程序如下：95℃5min；95℃30s；58℃30s；72℃45s；30cycles；72℃10min；4℃保存。

(3)将扩增得到的PCR产物全部点入1％的琼脂糖凝胶点样孔中，130V电泳30min。在紫外灯下将目的条带割出，装入1.5ml离心管中，利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)，回收目的片段，并再次电泳检测回收结果。

(4)在微量离心管中配制下列连接体系：pMDTM18-TVector(Takara)1μl、回收目的DNA片段0.2pmol(0.1～0.3pmol均可)、Solution I5μl、dd-H₂Oup to 10μl，16℃连接反应过夜。将全部10μl连接产物加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara，9057)，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min后，加入不含抗生素的LB培养液，37℃摇床150转/分钟，恢复培养一小时。吸取适量菌液均匀涂布到含有卡那霉素(终浓度为50微克每毫升)的LB培养基上，37℃倒置过夜培养。挑取单克隆到含有卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床200转/分钟培养两小时。以单克隆菌液为模板，用基因特异性引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆测序。选择测序正确的阳性克隆，用质粒提取试剂盒(Geneanswer,PE112-01)提取质粒，-20℃保存，用于后续的载体构建。

烟草NtMYB27基因序列分析：

通过测序获得烟草NtMYB27基因全长cDNA后，用DNAMAN软件将cDNA序列翻译成氨基酸序列，然后与其他作物中的同源蛋白做了比对和系统进化分析。与拟南芥AtMYB类转录因子的进化树进行分析，图1、图2中的拟南芥AtMYB蛋白序列均来自于https://www.arabidopsis.org/；分析发现，烟草Ntab0025110与拟南芥AtMYB27(AT3G53200)进化关系较近(如图1所示)，系统进化树中烟草NtMYB27与拟南芥AtMYB27聚在一起，表明两者的亲缘关系较近。同时，烟草NtMYB27与近缘的拟南芥AtMYB蛋白序列相似性较高，尤其是在N端，两个关键的MYB-DNA结合域高度的保守(如图2所示)，表明它们在植物中可能发挥着相似的生物学功能。

实施例2

烟草NtMYB27基因表达载体的构建，包括以下步骤：

(1)利用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切测序正确的质粒和pCAMBIA1301质粒，pCAMBIA1301质粒结构示意图如图4所示。37℃酶切2h后，经琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段和切开的pCAMBIA1301质粒。在微量离心管中配置连接体系：酶切的pCAMBIA1301质粒1μl、目的基因片段5μl、T4buffer 1μl、T4连接酶1μl、dd-H₂O 2μl，16℃连接反应过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒。

(2)质粒经PCR鉴定后，转化农杆菌感受态，用于烟草转基因，反义表达载体的构建是利用如下引物进行扩增NtMYB27基因编码区中一段约250bp的片段，随后反向连接到pCAMBIA1301质粒上，经大肠杆菌繁殖后，转化农杆菌用于转基因实验，引物序列为：

NtMYB110-Kpn I-F:5’-CACggtaccGCACGGTCATATTACTGCAGG-3’；

NtMYB110-Xba I-R:5’-AAAtctagaCACTATGAGAAGAAGGGACTG-3’。

试验例1

烟草NtMYB27基因的表达模式分析，具体操作包括：

(1)样品的采集

分别收取盛花期烟草叶片、茎秆、茎节、侧根、须根、花蕾、花萼、花冠、花药、花丝、柱头、花柱和子房等组织样品；此外，收集幼苗期、团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期、打顶期、下部叶成熟期、中部叶成熟期和上部叶成熟期的第10位叶片。所有样品采集后，立即放入液氮中速冻，然后保存于-80℃冰箱中。

(2)NtMYB27基因表达水平检测

利用烟草RNA快速提取试剂盒(Gene Answer，RT0110)提取各组织的总RNA，采用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA，6210A)获得各组织的cDNA样品，经Nanodrop测定cDNA样品的浓度后，用于qPCR定量检测NtMYB27基因表达水平，qPCR定量检测的引物序列如下表1所示,其中NtMYB27-F、NtMYB27-R引物序列横跨两个外显子，可以在CDS序列中可以找到。

表1 qPCR定量检测的引物序列

(3)烟草NtMYB27基因的表达模式结果分析

结果如图3所示，其中图3(a)表示盛花期不同组织样品中NtMYB27基因的表达水平；图3(b)表示不同发育时期叶片中NtMYB27基因的表达水平。

从图3可以看出，烟草NtMYB27基因在叶片中表达量最高，其次是在花萼组织中，在其它组织中的表达量都不高(如图3a所示)。在不同发育时期叶片中，NtMYB27基因的表达量也不相同，打顶期叶片中该基因的表达量最高，下部叶成熟期叶片中的表达量最低(如图3b所示)。农业生产中，烟草要进行打顶处理，从而使叶片成为最终收获的经济组织。烟草叶片中含有丰富的次生代谢物质，这些物质决定着烟草叶片的品质。NtMYB27基因在烟叶叶片中特异性地高表达，预示着该基因可能在调控此生物质代谢过程中发挥着重要作用。

试验例2

烟草转基因实验：

采用叶盘法转化烟草，操作包括：首先，将生长旺盛的烟草叶片消毒后剪成1cm²小块，置于MS分化培养基中；于28℃、光照强度2000Lx、光照时间为16h/d的条件下，预培养2天后放入含有目标质粒的农杆菌菌液中侵染13min(10-15min均可)，期间摇荡菌液数次，然后用无菌滤纸吸干多余菌液；接入MS分化培养基中，于28℃、黑暗条件下共培养4天(3-5天均可)。用无菌水将共培养后的植物体洗涤3次，用无菌纸吸干，转入含潮霉素和羧苄青霉素的MS分化培养基中，恒温培养。每隔10天更换1次培养基。待不定芽长至1-2cm时，将丛生不定芽切割成单个小芽，转移到含潮霉素、羧苄青霉素和活性炭的MS生根培养基中，促进其生根。待根系发育好后，将组培苗取出，用清水洗净根部的培养基，剪掉下部少量叶片，转移到盛有疏松无菌土的花盆中，按常规管理培养。

试验例3

1、转基因植株的鉴定：

在转基因幼苗分化出8片真叶时，提取叶片DNA和RNA样品，分别从核酸水平和转录水平两个层面进行进一步的PCR验证，确定阳性转基因植株。以基因组DNA为模板，用基因特异性上游引物+Flag标签和特异性下游引物+Flag标签进行PCR扩增，扩增引物序列如下表2所示，其中NtMYB27-Flag-F引物序列横跨两个外显子，可以在CDS中序列中找到，NtMYB27-Flag-R是针对载体上Flag标签设计的特异性引物。

表2 PCR扩增引物序列

结果如图5所示，其中图a:#1为阴性水对照；#2-#4为野生型K326对照；#5-#17为过表达株系；#18为阳性质粒对照；图b：#1为阴性水对照；#2-#4为野生型K326对照；#5-#15为反义抑制株系；#16为阳性质粒对照；图c：过表达株系中NtMYB27基因的表达水平；图d：反义抑制株系中NtMYB27基因的表达水平。

在各过表达阳性植株中扩增出了特异的单一条带，而以野生型基因组DNA为模板和水为模板扩增时没有条带(如图5a所示)；同样的，在RNAi阳性植株中也检测到了特异性条带(如图5b所示)；过表达阳性植株中，NtMYB27基因的表达水平显著升高(如图5c所示)；而RNAi植株中NtMYB27基因的表达水平则显著降低(如图5d所示)。

2、相关基因表达水平检测：

上述转基因植株鉴定完成后，采集对照、过表达和RNAi阳性植株样品，提取RNA样品，经反转录、质量检测、建库、测序等流程，获得转录组测序数据，利用中国烟草基因组数据库进行后续的数据分析，结果如下表4所示，与对照植物相比，过表达植株中NtCHS和NtFLS基因的转录水平显著升高，而RNAi植株中两个基因的表达水平显著降低。接着利用qPCR方法对转录组数据进行了验证。如图6所示，NtCHS和NtFLS基因的表达水平在NtMYB27基因过表达植株中显著升高，在NtMYB27基因RNAi植株中显著地降低；而其它基因的表达水平在所有材料中均没有明显变化。这表明NtMYB27能够抑制NtCHS和NtFLS基因的表达，尤其是对NtFLS基因的抑制作用更加明显，相关基因引物序列如下表3所示。

表3相关基因引物序列

试验例4

类黄酮含量测定：

利用超高效液相-三重四级杆串联质谱法测定类黄酮含量，具体操作如下：取50mg烟叶样品，转入1.5mL乙醇-水提取液(内标：伞形花内酯75ng/mL)，常温下超声1h，然后14000rpm离心机条件下离心取上清液后检测。采用的分析条件为：色谱条件BEH Phenyl色谱柱(2.1×150mm，1.7μm)，流动相为0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸甲醇(B)；洗脱梯度：0-2min内B相由5％升到15％，2-10minB相保持15％，10.01-15minB相升到100％；流速为0.3mL/min，柱温为35℃，进样量为1μl；质谱条件电喷雾电离源电离，正离子电离模式下毛细管电压为4kV，雾化气压力为40psi，干燥气流量为12L/min，干燥气温度为290℃，鞘气流量为11L/min，鞘气温度为200℃，采用实时多反应监测(dMRM)模式扫描。

结果如图7所示，其中图a为转基因株系中黄酮醇含量；图b为转基因株系中花青素含量。在NtMYB27过表植株中黄酮醇(flavonol)类物质含量显著地降低，而在NtMYB27-RNAi植株中黄酮醇的含量显著地升高。花青素类物质的含量则没有明显的变化，表明NtMYB27能够抑制烟草叶片中黄酮醇的合成。

总之，本发明发现烟草NtMYB27转录因子能够抑制叶片中黄酮醇类物质的合成，而这种抑制作用是通过抑制NtFLS和NtCHS基因的表达来实现的。

表4相关基因表达水平检测

序列表

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>一种调控类黄酮合成的基因及其编码蛋白与应用

<160>26

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1240

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgcaccaag acgaactgcg gagagggcaa tggcttgaag aggaagatga gagtctggtt 60

atgattatag ccatgttagg agaacgtcgt tgggatgcgt tagcaaaggc ttcaggtata 120

atttggctat gccgaaatgt taaaacttta aactgaaacg tatgtgtgct tggtatgacg 180

aaagtcattt gataagaaac attttctggt aaccatacac tactaaaaga tgactaactc 240

atgaaaacat tttcctgaaa tattacttct gttgtaccaa acacacccga agcattaaat 300

aactgtgttg gaatatgctt taatgcaggg ctgaggagga gtgggaaaag ctgcagattg 360

cgatggttga actatctccg tcccaatcta aagcacggtc atattactgc aggtgaagaa 420

catctgataa tccaacttca gaaacagttt ggaaacaagt aaagcttttt ccttcttcat 480

aagaattttt aatgctttac aacaaattaa ttgtctttct gctatccaaa cgccgaaaga 540

atcttttcct gtttccaggc caagattgtt tcacttgttt acttaattct ttttactaaa 600

tttacaggtg gtcaaagata gctgaacaat tgccaggaag aactgataac gaaatcaaga 660

actactggaa aagtcattta agaaagaaag cactaacata caaacaaggt gtactacaac 720

tctacaagat tctgctttaa cttttatata ctgcactata aaaaactttt atactatcag 780

tgtacttcac atgttattat tatggattgc ctgctttatt ttttcaagca tttaagctag 840

ttccacttat ttatgaacag ttaattacct gtaactatcc tttaggttat ctgatagtgt 900

aaaagttctt tcacgcaatt agtttatata agttaatgtc tgttcccttc ccgtgccgtt 960

tctcacaaat tattggtttc atgtgacaga atcctttggc agtaacacaa gtaattcaga 1020

acaacaatca tcaactttga aaagtgacac agtcccttct tctcatagtg atgactcctt 1080

ttctggaaaa ggagattgtt cctctgctga ttctttggca tactcttcaa atgacacaac 1140

attattggat tggattccaa gttggtcata tgaacaaagc agaatggagc atcatatgta 1200

cttttgcagc tcaaacctat gtttttgtta tcctccatag 1240

<211> 198

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

MHQDELRRGQ WLEEEDESLV MIIAMLGERR WDALAKASGL RRSGKSCRLR WLNYLRPNLK 60

HGHITAGEEH LIIQLQKQFG NKWSKIAEQL PGRTDNEIKN YWKSHLRKKA LTYKQESFGS 120

NTSNSEQQSS TLKSDTVPSS HSDDSFSGKG DCSSADSLAY SSNDTTLLDW IPSWSYEQSR 180

MEHHMYFCSS NLCFCYPP 198

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB110-Xba I特异性上游引物序列

<400>3

aaatctagaatgcaccaagacgaactgcgg 30

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB110-Kpn I特异性下游引物序列

<400>4

cacggtacctggaggataacaaaaacatag 30

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB110-Kpn I上游引物序列

<400>5

cacggtaccgcacggtcatattactgcagg 30

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB110-Xba I下游引物序列

<400>6

aaatctagac actatgagaa gaagggactg 30

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtL25qPCR上游引物序列

<400>7

caaaagttac attccaccg 19

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtL25qPCR下游引物序列

<400>8

tttcttcgtc ccatcaggc 19

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB27qPCR上游引物序列

<400>9

gaaacaagtg gtcaaagata gctg 24

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB27qPCR下游引物序列

<400>10

aatcagcaga ggaacaatct ccttttc 27

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB27-Flag上游引物序列

<400>11

gaaacaagtg gtcaaagata gctg 24

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<221>NtMYB27-Flag下游引物序列

<400>12

cttatcgtca tcgtccttgt aatcg 25

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<221>35S-RNAi上游引物序列

<400>13

tcattcaaga tctctctgcc gacag 25

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<221>35S-RNAi下游引物序列

<400>14

tgaagttgga ttatcagatg ttcttcac 28

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtCHS上游引物序列

<400>15

cgagcttgtc tctgcagccc 20

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtCHS下游引物序列

<400>16

ggaatgtaag cccaacttca c 21

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtCHI上游引物序列

<400>17

tgactcattt gcagcagtgg 20

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtCHI下游引物序列

<400>18

cactctctag ctgcactcca 20

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtF3H上游引物序列

<400>19

accaaagcct gctccaacta 20

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtF3H下游引物序列

<400>20

agtgttcagg ttgcttgctg 20

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtFLS上游引物序列

<400>21

gtgaccaagt tgagattctt agca 24

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtFLS下游引物序列

<400>22

ttcttggtct tgaattttgg tgga 24

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtDFR上游引物序列

<400>23

tgggacagtg agaaggctta t 21

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtDFR下游引物序列

<400>24

tcagccattg tctttgcttc c 21

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtANS上游引物序列

<400>25

aaacatcctt ctcaagttc 19

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<221> NtANS下游引物序列

<400>26

tttagtttcc caaagagaa 19

Claims

1.一种如SEQ ID NO:1所示基因调控烟草叶片中黄酮醇类物质含量的应用，其特征在于：敲除所述基因或降低所述基因表达水平以提高烟草叶片中黄酮醇类物质含量，提高所述基因表达水平以降低烟草叶片中黄酮醇类物质含量。

2.一种如SEQ ID NO:2所示蛋白调控烟草叶片中黄酮醇类物质含量的应用，其特征在于：所述蛋白是如SEQ ID NO:1所示基因编码的蛋白；敲除所述基因或降低所述基因表达水平以提高烟草叶片中黄酮醇类物质含量，提高所述基因表达水平以降低烟草叶片中黄酮醇类物质含量。

3.一种重组载体调控烟草叶片中黄酮醇类物质含量的应用，其特征在于：所述重组载体是包含如SEQ ID NO:1所示基因的重组载体；敲除所述基因或降低所述基因表达水平以提高烟草叶片中黄酮醇类物质含量，提高所述基因表达水平以降低烟草叶片中黄酮醇类物质含量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组载体的构建方法包括如下步骤：将如SEQ ID NO:1所示基因插入到相应表达载体的酶切位点，通过连接酶连接得到重组载体。

5.一种重组菌调控烟草叶片中黄酮醇类物质含量的应用，其特征在于：所述重组菌是包含如SEQ ID NO:1所示基因的重组菌；敲除所述基因或降低所述基因表达水平以提高烟草叶片中黄酮醇类物质含量，提高所述基因表达水平以降低烟草叶片中黄酮醇类物质含量。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述重组菌的构建方法包括如下步骤：将如SEQ ID NO:1所示基因导入菌体中获得重组菌。

7.一种转基因细胞系调控烟草叶片中黄酮醇类物质含量的应用，其特征在于：所述转基因细胞系为包含如SEQ ID NO:1所示基因的转基因细胞系；敲除所述基因或降低所述基因表达水平以提高烟草叶片中黄酮醇类物质含量，提高所述基因表达水平以降低烟草叶片中黄酮醇类物质含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述转基因细胞系的构建方法为：将如SEQID NO:1所示基因导入植物细胞中获得转基因细胞系。