CN110755477A - 一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途，是将石榴皮有效组分和小裂叶荆芥精油，通过国际上公认的按照美国国家临床实验室标准化委员会推荐的微量液基稀释法（M27‑A3）方案用小裂叶荆芥精油联合石榴皮有效部位对白念珠菌标准菌株ATCC 10231进行体外药敏实验。其结果表明：将二者联合用药对白念珠菌具有显著的协同抗菌作用，与单独使用时相比较联合使用时石榴皮有效部位的最低抑菌浓度值下降了约256倍，与单独使用时相比较小裂叶荆芥精油的最低抑菌浓度值比单独使用时下降了1490倍，该发明应用于药物，有良好的经济和药用潜力，具备广阔的应用前景。

Description

一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途
技术领域
本发明涉及一种中药提取物相关的组合物小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途，具体地说，涉及一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的抗白念珠菌药物中的用途。
背景技术
白念珠菌是最常见的机会致病真菌之一。它可引起从皮肤黏膜的表面感染到深在的血流播散性感染。白念珠菌引起浅表感染常常迁延难愈，而在免疫功能受损的个体中，如艾滋病患者、接受化疗以及接受免疫抑制剂治疗的个体表现尤为严重。而全身性念珠菌病，目前虽然有许多抗真菌治疗方法，但仍然致死率极高。念珠菌成为美国医院获得性全身感染的第四大原因，死亡率高达50％。此外，白念珠菌的菌丝为其他微生物细胞和基质提供了一个支架，使生物膜紧密结合在导管及植入医疗设备的表面，为介入治疗埋下隐患。
药物治疗是目前抗白念珠菌的主要治疗方法，主要包括唑类、多烯类、棘白霉素类、抗生素类和嘧啶类。然而，随着耐药的广泛出现和有限的药物种类，使其治疗依然面临着严峻的挑战。因此，寻找到疗效显著靶点明确的抗真菌药物具有重要意义。天然产物长久以来是重要的新药发现来源之一，从1981年至2014年间，FDA批准的一半新药直接或间接来自于天然产物。一些临床上用于治疗真菌感染的药物也来自于天然产物，如两性霉素B和卡泊芬净。植物提取的抗真菌药的最低抑菌浓度值约在100-1000μg/mL,合成类的抗真菌药则约在0.01-10μg/mL范围。因此，植物提取的抗真菌药并非抗真菌治疗的主流药物，但它的辅助治疗作用及与其它药物意想不到协同作用，是近些年来的研究热点。
小裂叶荆芥(Schizonepeta annua(Pall).Schischk)是唇形科裂叶荆芥属(Schizonepeta Briq.)植物。主要分布于俄罗斯、蒙古、中国新疆干旱和亚洲中部的开阔沙质草原地区。它是一种富含精油的植物，全草地上部分阴干后精油得率约为0.5％。传统民族医药，用其抗疲劳、抗抑郁、抗菌、治疗湿疹或气管炎等，而且还可用作食品和饮料的调味品、护肤品添加剂、防腐剂、饲料添加剂。民间有用其全草入药，代替裂叶荆芥，用于治感冒、头痛、皮肤瘙痒，炭炒治疗便血的报道。截至申请日为止，小裂叶荆芥尚未收入药典，也没有小裂叶荆芥精油单独或联合用于抗白念珠菌方面的报道。
石榴皮为《中国药典》收载的品种，具有涩肠、止血、驱虫等功效，还具有促进溃疡粘膜愈合的药理活性。石榴皮约占石榴重量5-8％，工业生产中常被丢弃,而石榴皮中却富含多酚类物质，约10-20％。因石榴皮多酚能够通过化学键与细胞表面膜蛋白质结合或者借助疏水键镶嵌于脂质双分子层，从而具有广谱抗菌、抗病毒、驱虫等药理作用。其中的活性成分安石榴苷、鞣花酸、没食子酸等均具有较强的抗炎抑菌活性。国内尚未查到石榴皮有效组分具有抗白念珠菌活性及相关机制的报道，国外报道石榴皮的甲醇或乙醇提取物的抗白念珠菌的最低抑菌浓度值在250-1000μg/mL。
本发明在对抗白念珠菌的大量研究中表明：小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物具有很好的抗白念珠菌的活性，特别是以特定比例组合使用时具有协同抗白念珠菌的活性。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术中的不足，提供一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的组合物抗白念珠菌用途，本发明从众多己知的中药提取物中选择石榴皮有效部位，从众多己知的精油中选择小裂叶荆芥精油，通过国际上公认的按照美国国家临床实验室标准化委员会推荐的微量液基稀释法(M27-A3)方案用小裂叶荆芥精油联合石榴皮有效部位对白念珠菌标准菌株ATCC 10231进行体外药敏实验。其结果表明：将二者联合用药对白念珠菌具有显著的协同抗菌作用。与单独使用时相比较联合使用时石榴皮有效部位的最低抑菌浓度值下降了约256倍，与单独使用时相比较小裂叶荆芥精油的最低抑菌浓度值比单独使用时下降了1490倍。该发明应用于药物，有良好的经济和药用潜力，具备广阔的应用前景。
本发明所述的一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途，所述小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的组合物在制备抗白念珠菌药物中的用途。
所述组合物中小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的质量比为1:0.02-1:25.6。
本发明所述的一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效部位的组合物的用途，其中组合物的配置方法：
药物储存液的制备：将石榴皮有效部位和小裂叶荆芥精油分别溶于二甲基亚砜制备成100mg/mL的石榴皮有效部位药物储存液和100mg/mL的小裂叶荆芥精油药物储存液；
取96孔无菌微孔板，在纵向第1列自上而下的第1孔到第7孔中，用RPMI 1640液培养基和100mg/mL的石榴皮有效部位药物储备液配制浓度为2mg/mL-31.25μg/mL的药液；再在横向最后一排自左而右的第2孔到10孔，用RPMI 1640液培养基和100mg/mL的小裂叶荆芥精油药物储存液配制浓度为1mg/mL-3.9μg/mL的药液；再分别从这些药液中各取100μL与等体积的RPMI 1640液培养基分别从垂直和水平两个方向做倍比稀释，即得到在96孔板各孔中配置好包含不同浓度的两种药物的组合物。
本发明所述的一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的组合物的用途，其中所述的石榴皮有效部位是从专利申请号201911127266.1中获得。
具体实施方式
通过实施例对本发明进一步描述。所述仅是本发明的优选实施方式，但不仅限于所给出的实施例。
本发明所使用的实验方法按照美国国家临床实验室标准化委员会推荐的微量液基稀释法(M27-A3)方案制备；
实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
白色念珠菌Candida albicans，实验用标准菌株ATCC 10231，购自广东环凯微生物科技有限公司；
受试药物：小裂叶荆芥植物材料由中国科学院新疆生态地理研究所冯缨研究员鉴定，根据2015年中国药典方法，使用克莱文装置采用水蒸汽蒸馏法提取，取100g小裂叶荆芥的干燥的地上部分，加入1200mL超纯水，提取温度300℃，提取时间2h，收集精油，通过Na2SO4干燥，避光密闭4℃保存，-20℃长期保存；
石榴皮有效组分由新疆理化技术研究所申请的发明专利，申请号201911127266.1获得，具体操作按下列步骤进行：
a、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5％-45％之间，或流动相为乙腈-0.1％甲酸水混合物，其中乙腈含量在5％-30％之间，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250mm，内径10mm，填充物粒径10μm，平衡至基线水平；
b、分别称取500mg，750mg，1000mg，1500mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min的区间里，共计接取40个组分；
c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250mm，内径4.6mm，填充物粒径10μm，柱温室温，流速1.0mL/min，监测波长254nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图；
d、对于步骤b中，上样量为500mg时所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1；或上样量为750mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2；或上样量为1000mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3；或上样量为1500mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4，即得到具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。
实施例1
应用棋盘法对石榴皮有效组分和小裂叶荆芥精油的联合应用抗白念珠菌的活性测试：
药物储存液的制备：石榴皮有效组分和小裂叶荆芥精油分别溶于二甲基亚砜制备成100mg/mL药物储存液，贮存于-20℃冰箱备用；
1.1将受试菌株接种于SDA培养基上，35℃培养24-48h后，挑取菌落用生理盐水制成细胞悬浊液，调整浓度为0.5个麦氏单位，再用RPMI 1640培养基做1:20和1:50的连续稀释，将菌悬液浓度调整为1-5×103CFU/mL；
1.2测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：
微量棋盘稀释法，参照美国国家临床实验室标准化委员会M27-A3方案，即酵母菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验方案，取96孔无菌微孔板，在纵向第1列自上而下的第1孔到第7孔中，用RPMI 1640液培养基和100mg/mL的石榴皮有效部位药物储备液配制浓度为2mg/mL-31.25μg/mL的药液；再在横向最后一排自左而右的第2孔到10孔，用RPMI 1640液培养基和100mg/mL的小裂叶荆芥精油药物储存液配制浓度为1mg/mL-3.9μg/mL的药液，再分别从这些药液中各取出100μL与等体积的RPMI 1640液培养基分别从垂直和水平两个方向做倍比稀释，即得到在96孔板各孔中配置好包含不同浓度的两种药物的组合物；在每排第11孔加100μL液体培养基为生长对照，然后在1-11列每一个微孔中加入100μL菌悬液，其接种菌的终浓度为0.5-2.5×103CFU/mL，每排第12孔加200μL液体培养基为空白对照，35℃培养24-48h，每次实验均制备质控阳性药药敏板；
1.3药物敏感终点判读参照美国国家临床实验室标准化委员会M27-A3方案中的视觉直视法判断终点，判定最低抑菌浓度；
2.联合用药的效果评价：
部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数，抑菌浓度分数(FIC)为每一种药物联合抑菌时所需MIC与单用时MIC的比值，而FIC指数(FICI)则等于两种药物FIC之和；当MIC值高于检测最高限时以最高限浓度的两倍值用以计算FICI；当FICI≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用；0.5＜FICI＜4时，为无关作用；当FICI≥4时两药产生拮抗作用；
3.结果与分析：
通过以上定义检测石榴皮有效组分和小裂叶荆芥精油的相互作用，结果如表1所示：
表1抗白念珠菌活性测试结果
Figure BDA0002295897090000041
从表1中表明：小裂叶荆芥精油终浓度为46.88μg/mL、石榴皮有效组分终浓度为0.977μg/mL；小裂叶荆芥精油终浓度为31.25μg/mL、石榴皮有效组分终浓度为15.63μg/mL以及小裂叶荆芥精油终浓度为1.95μg/mL、石榴皮有效组分终浓度为1.95μg/mL的三个药物组合物中，小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分存在协同抗真菌作用，其中小裂叶荆芥精油终浓度为1.95μg/mL、石榴皮有效组分终浓度为1.95μg/mL的药物组合，协同抗白色念珠菌的活性最强。

Claims (2)

1.一种小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分组合物的用途，其特征在于所述小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的组合物在制备抗白念珠菌药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述组合物中小裂叶荆芥精油和石榴皮有效组分的质量比为1:0.02-1:25.6。
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