CN110743036B - 含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3d打印支架及其在感染性骨缺损修复中的应用 - Google Patents

含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3d打印支架及其在感染性骨缺损修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架及其在感染性骨缺损修复中的应用。镓具有良好的抑菌性能，同时还可抑制破骨分化，有效抑制骨感染时可能存在的骨溶解。生物玻璃具有促进成骨分化的能力，且介孔生物玻璃颗粒具有孔道结构，可负载成分并缓慢释放。本发明结合了镓的抗菌、抑制破骨作用及生物玻璃的促成骨分化作用，直接清除局部感染灶和进一步调节骨修复过程中成骨与破骨的平衡。本发明应用3D打印技术，利用聚己内酯良好的生物相容性和力学支撑作用，构建了结构可根据缺损部位特征灵活设计、支架尺寸可控的功能性骨修复支架，其在骨缺损修复中具有重要的应用前景。

Description

含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架及其在感染 性骨缺损修复中的应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架及其在感染性骨缺损修复中的应用。
背景技术
严重的创伤及骨肿瘤切除术后，可导致较大的骨缺损，常需骨填充材料来治疗。而缺损局部，尤其是外源性骨填充材料存在的情况下，细菌暴露风险高，易粘附。且由于创伤局部软组织破坏严重，局部的自体免疫系统清除细菌能力降低，进一步增加了感染性骨缺损治疗的难度。严重的感染存在时，常需做二次手术，取出感染的骨填充材料，彻底清创消除感染灶，再长期大剂量抗生素治疗，会给患者带来严重的痛苦及经济负担。除了感染本身，成骨分化及破骨分化的平衡也会影响骨缺损的愈合，是治疗中需要关注的重点。在正常骨组织中，成骨分化与破骨分化保持一个平衡的状态，在骨改建及骨量维持中发挥重要作用。当感染存在情况下，由于炎症等影响，可破坏这种平衡，发生感染性骨溶解。我们希望通过调节成骨及破骨的平衡，促进感染存在情况下的骨愈合。
3D打印是一种新型的植入物加工技术，最近几年发展迅速，在骨修复领域的应用也得到了较多的关注。目前已有较多报道关于可降解高分子材料与生物陶瓷类材料的复合支架打印，此类支架具有较好的力学及促成骨性能，是本研究设计多功能支架的基础。同时，我们查阅文献发现，相较于羟基磷灰石，生物玻璃可能具有更强的促成骨分化能力，且其具有内部孔道结构、可作为抗菌成分的缓释载体。
镓(gallium)作为一种FDA批准的药物，可有效抑制破骨分化，被用于骨相关疾病治疗，例如全身注射治疗肿瘤患者骨溶解引起的高钙血症。而且，有文献报道镓可影响细菌的铁代谢，具有良好的抗菌作用。本发明首次将含镓生物玻璃3D打印的支架用于感染性骨缺损修复中，可在大段骨缺损局部提供良好的力学支撑，有效控制缺损局部感染发生的同时，也可促进成骨分化和抑制破骨分化，调节成骨与破骨的平衡，发挥促进骨愈合的作用。
发明内容
本发明的目的是提供含镓聚己内酯PCL/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架在感染性骨缺损修复中的应用，通过介孔生物玻璃颗粒负载一定量的镓，再将含镓的生物玻璃颗粒与聚己内酯混合，通过3D打印的方式制备所需的多孔支架。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复材料，该材料由以下百分含量的原料制备而成：聚己内酯50-80％，含镓生物玻璃20-50％；
其中所述含镓生物玻璃的制备方法为：将硝酸镓通过过夜浸泡进入介孔生物玻璃颗粒中使得镓的质量分数为5-10％，随后采用真空冻干法制得干燥的含镓生物玻璃粉末。
使用以上所述的材料制备的含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架，该支架通过低温打印或者高温打印制备而成。
进一步的，所述的低温打印方法为：将聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含镓生物玻璃粉末并混合均匀，继续挥发多余有机溶剂至合适黏稠度，然后将混合物加入低温料筒内进行打印。优选的，所述的有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
进一步的，所述的高温打印方法为：将含镓生物玻璃与聚己内酯通过高温混料机预先混合均匀，然后将混合物加入高温料筒内，设置打印温度至材料熔融后进行打印。
进一步的，该支架可灵活调节内部的孔隙尺寸，能根据需求制备出不同孔径的支架；该支架可设计不同外部结构，例如较为简单的圆柱形或更复杂的骨头仿生结构，满足骨修复局部应用时的不同需求。
本发明所述的3D打印支架在感染性骨缺损修复中的应用。
本发明基于以下实验方案：
(1)支架的3D打印和材料学表征，包括使用ENVISION Tec的3D bioprinting精确打印支架，扫描电镜(SEM)观察支架表面情况，EDS能谱观察镓在支架内分布情况，抗压测试评估支架力学性能；
(2)用超声震荡涂板计数法、扫描电镜的方法评价含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及大肠杆菌(E.coli)的抑菌效果；
(3)原代提取C57小鼠(4周龄，雄性)的BMSCs，在成骨诱导液的环境下与支架共培养，通过7天碱性磷酸酶染色及21天茜素红染色评价支架的成骨性能；
(4)在动物实验中验证含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架在体内可否有效促进感染性骨缺损的修复，包括感染、成骨等评价指标。
本发明基于以下实验过程：
1. 3D支架的打印。实验中用到的3D打印机为ENVISION Tec的3D bioprinting，有两种方法可打印支架，即高温打印和低温打印。预先制备好一定含量的含镓介孔生物玻璃粉末，主要是浸泡和真空冻干法，并将其与PCL制成混合物，用于之后的打印。低温打印法制备混合物是通过有机溶剂溶解PCL并与含镓生物玻璃粉末混合均匀；高温打印法是通过高温混料机直接熔融PCL，并在高温状态下加入含镓生物玻璃粉末，并充分搅拌混合均匀。在打印系统内设置打印形状(方形、圆形或复杂的骨头形状)及内部结构(不同间距的网格结构，常用 300um-1000um)，并调试合适的打印参数，包括打印温度(低温头保持在25度左右，高温打印保持在90度以上，使混合物为可挤出的熔融状态)、打印速度及挤出压力(根据混合物的具体可打印性调整)等。
2. 3D支架体外抗菌性的验证。支架与细菌共培养的过程中可缓释生物玻璃介孔中的镓，通过竞争性抑制细菌铁代谢影响细菌增殖，达到抗菌效果。超声震荡可使支架表面粘附的细菌游离，再做梯度稀释涂板计数就可对支架表面的细菌做定量分析，比较支架抗菌性。而对表面细菌做戊二醛固定处理之后拍摄扫描电镜则可较直观看到支架表面细菌粘附情况，同时可关注细菌在支架表面是否形成生物膜。
3.原代细胞的提取。本实验中使用的都是直接从小鼠骨髓腔中提取的BMSCs细胞和BMM 细胞，分别用于成骨分化和破骨分化实验。具体方法为无菌环境下分离C57小鼠的股骨和胫骨，培养基冲骨髓腔并做进一步培养。诱导成骨需加成骨诱导液，诱导破骨分化需加RANKL 和MCSF两种细胞因子。
4. 3D支架在感染性骨缺损动物模型中抗感染及促进骨修复作用的验证。兔子桡骨上制备感染性骨缺损模型，并置入含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架。分别在第1月、第2月和第3 月获取桡骨标本，进行X线、microCT观察，并经过脱钙、脱水、包埋、切片、染色后获得 HE和Giemsa的切片。
本发明所述3D打印支架的作用效果如下：
其中，含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架由聚己内酯和生物玻璃粉末混合物经精细打印成多孔结构，在提供稳定的力学支撑的同时，也具有一定的降解性；随着新骨的长入，支架缓慢降解，为新骨长入提供足够的空间。
其中，含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架通过生物玻璃粉末的降解及镓的释放，释放出Ga、 Si、Ca等活性成分，发挥抗菌、诱导BMSCs细胞的成骨分化及抑制BMM细胞破骨分化，加速骨修复过程中新骨的生成。
具体而言，含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架可缓释介孔生物玻璃中的镓，而镓的结构类似于铁，可竞争结合铁运输载体，竞争性抑制细菌的铁吸收，从而发挥直接的抗菌作用；同时，释放出的镓还能在基因水平调控BMM细胞的破骨分化，抑制多种破骨相关的基因表达 (ATP6、ACP5、Cfos)，具有很强的抑制破骨分化能力，从而减少了感染微环境下存在的局部骨溶解。支架中含有的生物玻璃，是一种促成骨成分，含生物玻璃粉末的支架较对照组聚己内酯支架，促成骨性能明显增强，可加速骨修复过程中的新骨形成。经力学测试，含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架表现出较好的抗压强度和弹性模量，可满足大段骨缺损局部的稳定支撑，为新骨形成提供稳定的环境。
有益效果：本发明首次公开了含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架，其具有良好的力学性质，内部孔隙分布均匀，且支架整体结构可灵活设计抗菌及促进骨修复作用，适用于解决难治的感染性骨缺损。通过测试结果表明含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架具有显著的抗菌、促进成骨分化、抑制破骨分化的作用，并可在未来治疗感染性骨缺损中发挥重要作用。
附图说明
图1为实施例1.1中扫描电镜的结果图。
图2为实施例1.2中microCT的结果图。
图3为实施例2.1中涂板计数的结果图。
图4为实施例2.2中扫描电镜的结果图。
图5为实施例3.1中碱性磷酸酶的实验结果图。
图6为实施例3.2中破骨分化相关实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明发现含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架不仅可有效抑制细菌增殖，还可明显促进BMSCs的成骨分化，且显著抑制BMM细胞的破骨分化。上述三方面作用，在感染性骨缺损修复中非常重要，在控制感染的前提下，加速新骨形成，加快骨缺损愈合的进展。
实施例1支架的3D打印和材料学表征
1.1将提前准备好的含8％镓的生物玻璃粉末分别与溶于二氯甲烷的PCL充分搅拌混匀，制成适合打印的糊状物，装入料筒中，其中含镓的生物玻璃粉末与PCL的质量比为3：7。在 ENVISION TEC的3D bioprinting上设置10mm直径、2mm高度的圆形模型，并设置每层高度为0.32mm。设置打印速度为3mm/s，打印温度为25℃，挤出压力为2bar。将打印完成的支架烘干后做喷金处理，拍摄扫描电镜并做EDS能谱分析。
图1是实施例1.1中扫描电镜的结果图，图1显示了含生物玻璃的支架表面较单纯PCL支架更为粗糙。
1.2打印尺寸为10mm、高度10mm的支架，用于力学性能检测，microCT分析，主要关注支架的孔径分布、抗压强度和弹性模量。
图2是实施例1.2中microCT的结果图，图2显示了支架结构规则，内部孔隙分布均匀。
实施例2评价含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 及大肠杆菌(E.coli)的抑菌效果
2.1超声震荡后梯度稀释涂板计数来定量支架表面粘附的细菌数量，证明支架抑制细菌增殖的能力。将灭菌处理后的支架置于24孔板中，加入1mL浓度为1*10^6CFUs/mL的E.coli及 MRSA菌液，在37度培养箱孵育24小时后，在超净台中取出孔板内支架，轻轻在PBS中漂洗三遍后，放入无菌离心管中，加入2mLPBS使支架完全浸泡于液体中，超声震荡15min，所得细菌悬液做梯度稀释涂板计数，并在培养箱中孵育24小时后，进行菌落计数，并统计分析支架的抗菌情况。
图3是实施例2.1中涂板计数的结果图，显示8％镓含量的支架及10％镓含量的支架可明显抑制E.coli和MRSA的增殖，对菌落进行计数后可看到细菌数的明显减弱，定量证明了含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架的广谱抗菌性。
2.2扫描电镜观察支架表面细菌粘附情况。支架同细菌共同孵育的实验操作同2.1所述，在孵育24小时后小心取出支架，轻轻漂洗3遍后用2.5％电镜专用戊二醛固定4小时，取出后做梯度酒精脱水(50％，70％，80％，90％，95％，100％)，每个梯度15分钟，最后置于室温中挥发干燥。完全干燥后的支架做喷金处理，拍摄扫描电镜照片，比较支架表面粘附的细菌数量及是否形成明显的生物膜。
图4是实施例2.2中扫描电镜的结果，如图可见含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架较不含镓的对照支架，无论是MRSA还是E.coli，细菌数均明显减少，且表面可见皱缩的细菌，证明支架对细菌有杀伤作用，有效抑制了细菌在表面的增殖和形成生物膜。
实施例3评价含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架对BMSCs成骨分化的促进作用及对 BMM破骨分化的抑制作用。
3.1原代分离4周龄雄性C57小鼠的BMSCs，以1*10^5个/孔的密度种于12孔板中，待细胞过夜贴壁后加入成骨诱导液及上室放有支架的transwell小室，每3天换液，于第7天做碱性磷酸酶(ALP)染色观察3D打印支架对BMSCs的成骨分化能力的促进作用。于21天进行茜素红染色，观察支架对BMSCs晚期矿化的影响。
图5是实施例3.1中碱性磷酸酶的实验结果，可见含生物玻璃的支架可促进BMSCs细胞的 ALP染色，而含镓的支架对ALP染色有一定的增强作用。可认为含镓聚己内酯/生物玻璃3D 打印支架可明显促进BMSCs的成骨分化能力。
3.2原代分离4周龄雄性C57小鼠的BMM细胞，以1*10^5个/mL的密度分别种于96孔板和 12孔板中，加含RANKL和MCSF的培养基，并分别加不同支架的浸提液，每两天换液，第7天对96孔板中的细胞做Trap染色，对12孔板中的细胞做RNA的提取，并做PCR分析BMM 细胞在不同支架处理后，破骨相关基因表达的变化。
图6是实施例3.2中破骨分化相关实验结果，可见单纯PCL支架形成了体积较大的多核细胞，即破骨细胞；而含生物玻璃的支架组形成更多的破骨细胞。只有在含镓的支架组，未见明显的大体积多核细胞，证明破骨分化被镓明显抑制。而PCR结果显示镓可在基因水平影响细胞的破骨分化。
经过以上一系列实验，验证了含镓聚己内酯/生物玻璃3D打印支架可抑制细菌增殖，减少局部感染灶；还可促进BMSCs的成骨分化能力，加快新骨的形成；对BMM破骨分化的抑制可减少感染性骨缺损情况下骨溶解的发生，从而治疗和加速感染性骨缺损的骨愈合。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复3D打印支架，由含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复材料制备，其特征在于，含镓聚己内酯/生物玻璃多孔骨修复材料由以下百分含量的原料制备而成：聚己内酯50-80％，含镓生物玻璃20-50％；其中所述含镓生物玻璃的制备方法为：将硝酸镓通过过夜浸泡进入介孔生物玻璃颗粒中使得镓的质量分数为8-10％，随后采用真空冻干法制得干燥的含镓生物玻璃粉末，所述支架通过低温打印或者高温打印制备而成，所述的低温打印方法为：将聚己内酯溶于有机溶剂中，加入含镓生物玻璃粉末并混合均匀，然后将混合物加入低温料筒内进行打印，所述的高温打印方法为：将含镓生物玻璃与聚己内酯通过高温混料机预先混合均匀，然后将混合物加入高温料筒内，设置打印温度至材料熔融后进行打印，所述的有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
2.根据权利要求1所述的3D打印支架，其特征在于，该支架为圆柱形或骨头仿生结构。
3.权利要求1-2任一项所述的3D打印支架在制备感染性骨缺损修复材料中的应用。
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