CN110726848A - 促甲状腺激素检测免疫试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促甲状腺激素检测免疫试纸将其制备方法，该试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述结合垫上包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体，所述检测线包被有促甲状腺激素单克隆抗体，所述质控线包被有能够与所述第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。上述促甲状腺激素检测免疫试纸，采用双抗体夹心法，将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上，能将反应体系的信号量放大，还从而大大提高了灵敏度和准确性。该促甲状腺激素检测免疫试纸快捷方便、操作简便、重复性好、特异性较强，灵敏度较高、所需血清样本量较小。

Description

促甲状腺激素检测免疫试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗检测技术领域，特别是涉及一种促甲状腺激素检测免疫试纸及其制备方法。

背景技术

促甲状腺激素(缩写，TSH)是由腺垂体分泌的激素，主要负责调节甲状腺细胞的增殖、甲状腺血液供应以及甲状腺激素的合成和分泌，在维持正常甲状腺功能中起最重要的调节作用。目前TSHD的检测方法主要有传统的放射免疫法，酶联免疫吸附方法，化学发光法。其中，放射免疫法和酶联免疫吸附方法的灵敏度不高，检测范围窄，抗干扰能力严重不足，检测时间长，致使临床价值受到很大的限制，已基本退出市场；而化学发光方法的灵敏度高，检测速度快，但是其成本高，血清样本量大，操作复杂，仅适合在大医院进行检测。

因此开发操作简单、灵敏度高、特异性强、所需血清样本量小的TSH检测产品是亟待解决的问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种快捷方便、灵敏度较高、特异性较强的促甲状腺激素检测免疫试纸及其制备方法。

一种促甲状腺激素检测免疫试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水垫设于所述底板上，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述硝酸纤维素膜搭接，所述硝酸纤维素膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述硝酸纤维素膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫，所述结合垫上包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体，所述检测线包被有促甲状腺激素单克隆抗体，所述质控线包被有能够与所述第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。

上述促甲状腺激素检测免疫试纸，采用双抗体夹心法，将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上，能将反应体系的信号量放大，还从而大大提高了灵敏度和准确性。该促甲状腺激素检测免疫试纸快捷方便、操作简便、重复性好、特异性较强，灵敏度较高、所需血清样本量较小，只需要取75μL的血清或全血加入稀释液中，混匀，将待测样本取75μL加入到促甲状腺激素检测免疫试纸的样品垫上即可检测，检测速度快，15min出结果，大大的降低检测成本，检测准确性高，能够结合干式荧光免疫分析仪定量检测荧光信号，实现对血清、血浆或全血中的犬猫TSH精确定量检测。

在其中一个实施例中，在所述结合垫上，所述促甲状腺激素单克隆抗体与所述第一质控抗体的质量比为(40～80):1。

在其中一个实施例中，所述标记微球选自荧光乳胶微球、胶体金微球或磁珠微球。

在其中一个实施例中，所述第一质控抗体和所述第二质控抗体中一个选自羊抗兔IgG抗体，另一个选自兔IgG抗体。

在其中一个实施例中，所述第一质控抗体选自羊抗兔IgG抗体，所述第二质控抗体选自兔抗鼠IgG抗体。

在其中一个实施例中，所述促甲状腺激素检测免疫试纸为犬猫促甲状腺激素检测免疫试纸，所述促甲状腺激素单克隆抗体为犬猫促甲状腺激素单克隆抗体。

一种促甲状腺激素检测免疫试纸的制备方法，包括以下步骤：

将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上；

将促甲状腺激素单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成检测线；

将第二质控抗体包被在所述硝酸纤维素膜上形成与所述检测线相间隔的质控线，所述第二质控抗体能够与所述第一质控抗体特异性结合；

将样品垫、吸水垫、包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体的所述结合垫及具有所述检测线和所述质控线的所述硝酸纤维素膜设于底板上，得到所述促甲状腺激素检测免疫试纸，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述硝酸纤维素膜搭接，所述硝酸纤维素膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫。

在其中一个实施例中，所述将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上的步骤包括：

将促甲状腺激素单克隆抗体与标记微球混合制成第一标记溶液；

将第一质控抗体与标记微球混合制成第二标记溶液；

将第一标记溶液和所述第二标记溶液混合，喷涂在所述结合垫上，干燥。

在其中一个实施例中，所述第一标记溶液和所述第二标记溶液的制备包括如下步骤：

将标记微球制成标记微球溶液；

将促甲状腺激素单克隆抗体或第一质控抗体分别加入所述标记微球溶液，混合，分离取沉淀，进行封闭处理，然后加入保存液，分别制得所述第一标记溶液和所述第二标记溶液。

在其中一个实施例中，控制喷涂在所述结合垫上的所述促甲状腺激素单克隆抗体与所述第一质控抗体的质量比为(40～80):1。

附图说明

图1为一实施例的促甲状腺激素检测免疫试纸的结构示意图；

图2为样品理论浓度和检测浓度的线性关系图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施方式提供了一实施例的促甲状腺激素检测免疫试纸及其制备方法。下面将结合促甲状腺激素检测免疫试纸的制备方法对促甲状腺激素检测免疫试纸的结构进行详细的介绍。

请参阅图1，该促甲状腺激素检测免疫试纸包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和底板5。样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水垫4设于底板5上。结合垫2的两端分别与样品垫1及硝酸纤维素膜3搭接，硝酸纤维素膜3远离结合垫2的一端与吸水垫4搭接。硝酸纤维素膜3上设有相互间隔的检测线31及质控线32，检测线31较质控线32更靠近结合垫2。

结合垫2上包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体。检测线31包被有促甲状腺激素单克隆抗体，质控线32包被有能够与第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。

上述促甲状腺激素检测免疫试纸工作时，待测样品与样品垫1接触，通过层析作用，依次层析至结合垫2和硝酸纤维素膜3。

若待检测样品中含有促甲状腺激素，则样品中的促甲状腺激素先与结合垫2上的用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗结合形成反应复合物，然后在层析作用下，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，被硝酸纤维素膜中的检测线上包被的TSH单克隆抗体所捕获。待检测样品中的TSH越多，检测线上积聚的结合后的复合物越多，显色就更加明显。例如标记微球选自荧光乳胶微球时，荧光信号的强度则反应了被捕获的TSH的数量。反应复合物和用微球标记的第一质控抗体继续层析至质控线32，结合垫上的第一质控抗体与质控线32中的第二质控抗体结合显色。

若待检测样品中不含有促甲状腺激素，则结合垫2上的用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和检测线31包被的促甲状腺激素单克隆抗体均未与促甲状腺激素结合，因此检测线不显色，用微球标记的第一质控抗体继续层析至质控线32，结合垫上的第一质控抗体与质控线32中的第二质控抗体结合显色。

若质控线32不显色，则说明促甲状腺激素检测免疫试纸失效。

上述促甲状腺激素检测免疫试纸，采用双抗体夹心法，将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫2上，能将反应体系的信号量放大，还从而大大提高了灵敏度和准确性。该促甲状腺激素检测免疫试纸快捷方便、操作简便、重复性好、特异性较强，灵敏度较高、所需血清样本量较小，只需要取75μL的血清或全血加入稀释液中，混匀，将待测样本取75μL加入到促甲状腺激素检测免疫试纸的样品垫上即可检测，检测速度快，15min出结果，大大的降低检测成本，检测准确性高，能够结合干式荧光免疫分析仪定量检测荧光信号，实现对血清、血浆或全血中的犬猫TSH精确定量检测。

在一具体示例中，上述促甲状腺激素检测免疫试纸为犬猫促甲状腺激素检测免疫试纸。相应地，其中的促甲状腺激素单克隆抗体为犬猫促甲状腺激素单克隆抗体。

在一示例中，底板5为PVC(聚氯乙烯)材质。

在其中一些实施例中，样品垫1可采用如下方法制备：配制样品垫处理液：含1wt％牛血清白蛋白、1wt％酪蛋白、10wt％蔗糖、0.5wt％吐温20以及0.01M的pH为6.0磷酸盐缓冲液。将样品垫处理液喷涂于玻璃纤维上，制得。进一步地，样品垫处理液的喷涂量为4μL/cm。

其中，包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体的结合垫2是采用如下方法形成的：将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫2上。

在其中一些实施例中，将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫2上的步骤包括：

步骤S11、将促甲状腺激素单克隆抗体与标记微球混合制成第一标记溶液。

步骤S12、将第一质控抗体与标记微球混合制成第二标记溶液。

步骤S13、将第一标记溶液和第二标记溶液混合，喷涂在结合垫上，干燥。

进一步地，步骤S11和步骤S12均包括如下步骤：将标记微球制成标记微球溶液；然后促甲状腺激素单克隆抗体或第一质控抗体分别加入标记微球溶液混合，分离取沉淀，进行封闭处理，然后加入保存液，制成含有第一标记溶液和第二标记溶液。

进一步地，封闭处理的封闭液为TRIS缓冲液；更进一步地，其浓度为0.05M，其pH值为8.0。进一步地，保护液为含1％牛血清白蛋白、5％蔗糖的PH6.0的0.1M磷酸缓冲液。

在一些示例中，在步骤S11和步骤S12中，标记微球在使用前，还包括对标记微球清洗和/或活化的步骤。

具体地，清洗步骤采用的清洗液为MES(中文，2-(N-吗啡啉)乙磺酸)的缓冲液，进一步地，其浓度为0.1M，其pH值为6。更进一步地，清洗步骤采用超声清洗。

具体地，活化步骤所采用的试剂有活化剂A和标记活化剂B，其中活化剂A为50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(简称，NHS)的0.05M的MES缓冲液，调节其pH值为6.0。具体地，标记活化剂B为含50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称，EDC)的0.05M的MES缓冲液。

具体地，在活化步骤之后还包括清洗步骤，清洗步骤所采用的清洗液也为MES缓冲液；进一步地，其浓度为0.05M，其pH值为6。更进一步地，清洗步骤采用超声清洗。

在一些实施例中，控制喷涂在结合垫2上的促甲状腺激素单克隆抗体与第一质控抗体的质量比为(40～80):1。可理解，可通过控制喷涂的第一标记溶液与第二标记溶液的量及其浓度来控制该质量比。

更进一步地在一具体示例中，在标记微球溶液中，标记微球的浓度为14g/1L；促甲状腺激素单克隆抗体与标记微球溶液的用量比为40μg/1mL，第一质控抗体与标记微球溶液的用量比为20μg/1mL。

进一步地，在步骤S13中，第一标记溶液与第二标记溶液的混合质量比为30:1。

换言之，结合垫2上的促甲状腺激素单克隆抗体与第一质控抗体的质量比为60:1。

进一步地，步骤S13中第一标记溶液与第二标记溶液的混合溶液喷涂在结合垫2上的喷涂量为4μL/cm，干燥的条件为置于干燥箱内50℃鼓风干燥过夜(约16h-18h)可得。可理解，其中干燥的条件可以根据需要适当调整。

在其中一些实施例中，标记微球选自荧光乳胶微球、胶体金微球或磁珠微球。

进一步地，标记微球选自荧光乳胶微球，利用荧光乳胶微球示踪物偶联检测抗体。相比于胶体金纳米颗粒，采用荧光乳胶颗粒作为标记物，能够借助于定量分析仪实现定量检测犬猫促甲状腺激素等促甲状腺激素，不仅填补了目前市场上没有荧光免疫层析定量检测犬猫促甲状腺激素的空白，同时也提高了检测灵敏度和准确度，并且将定量检测时间大大缩短，具有快速、简单、现场、干扰小等优点。

其中，具有检测线31和质控线32的硝酸纤维素膜3可采用如下方法制得：将促甲状腺激素单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜3上形成检测线31；将第二质控抗体包被在硝酸纤维素膜3上形成与检测线31相间隔的质控线32。

在其中一些实施例中，第一质控抗体和第二质控抗体中一个选自羊抗兔IgG抗体，另一个选自兔IgG抗体。

进一步地，第一质控抗体选自羊抗兔IgG抗体，第二质控抗体选自兔IgG抗体。在一具体示例中，第二质控抗体选自兔抗鼠IgG抗体。

在一具体示例中，检测线31的制备方法如下：将用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PB)将犬猫TSH单克隆抗体稀释到1mg/mL，按照喷涂量1μL/cm在硝酸纤维素膜3上划线，干燥，得到检测线31。其中干燥条件可为于50℃在干燥箱中干燥72h。

在一具体示例中，质控线32的制备方法如下：用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PB)将兔IgG稀释到0.5mg/mL，按照喷涂量1μL/cm在硝酸纤维素膜3上划线，该线与检测线31平行，干燥条件同检测线31，得到质控线32。

在其中一些实施例中，吸水垫4的制备：将吸水纸裁剪至每条的规格为30cm*2.4cm。

在其中一些实施例中，将上述硝酸纤维素膜3、吸水垫4、样品垫1及结合垫2粘贴在底板5上，组装形成促甲状腺激素检测免疫试纸。

以下为具体实施例。

试纸制备实施例

上述如图1所示的促甲状腺激素检测免疫试纸的制备方法如下。

其中，样品垫可采用如下方法制备：配制样品垫处理液：含1wt％牛血清白蛋白、1wt％酪蛋白、10wt％蔗糖、0.5wt％吐温20以及0.01M的pH为6.0磷酸盐缓冲液。将样品垫处理液喷涂于玻璃纤维上，制得。进一步地，样品垫处理液的喷涂量为4μL/cm。

结合垫可采用如下方法制备：

其中的第一标记溶液的制备步骤包括1)～6)。

1)清洗荧光乳胶颗粒：取一规格为2mL的离心管，加入1mL的荧光乳胶颗粒，14000g离心10min，去上清，取1mL的清洗液，清洗液为0.1M MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，PH6.0；超声重悬，超声2s，间歇5s，重复5次。

2)微球的活化：在步骤1)的离心管中，继续加入100ul的活化剂A和100ul的标记活化剂B，涡旋混匀，旋转培养仪上反应30min；活化剂A为50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，调节PH为6.0；标记活化剂B为含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05MMES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)。

3)活化清洗：将活化后的乳胶颗粒14000g离心10min，去上清，留取沉淀，加入1mL清洗液，所述的清洗液为0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，调节PH为6.0。超声重悬，超声2s，间歇5s，重复5次。

4)偶联抗体：在上述步骤3)超声完成后加入40μg的犬猫促甲状腺激素抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应2小时，反应结束，14000g离心10min离心去上清，留取沉淀。

5)封闭：在上述步骤4)完成超声后，加入1mL的封闭液，封闭液为0.05M的TRIS缓冲液，调节PH为8.0。超声重悬，超声2s，间歇5s，重复5次；涡旋混匀，置于旋转培养器上反应1小时。

6)保存：完成上述反应后，14000g离心10min离心去上清，留取沉淀。加入1mL的标记乳胶颗粒保存液，超声重悬，超声2s，间歇5s，重复5次；保存液含1％牛血清白蛋白、5％蔗糖的pH值为6.0的0.1M磷酸缓冲液。

其中的第二标记溶液的制备步骤与第一标记溶液的制备步骤的基本相同，不同在于步骤4)偶联抗体：在上述步骤3)超声完成后加入20μg的羊抗兔IgG抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应2小时，反应结束，14000g离心10min离心去上清，留取沉淀。

检测线的制备：将用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PB)将犬猫TSH单克隆抗体稀释到1mg/mL，按照喷涂量1μL/cm在硝酸纤维素膜上划线，干燥，得到检测线。其中干燥条件可为于50℃在干燥箱中干燥72h。

质控线的制备：用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PB)将兔IgG稀释到0.5mg/mL，按照喷涂量1μL/cm在硝酸纤维素膜3上划线，该线与检测线31平行，干燥条件同检测线31，得到质控线32。

一、线性范围

采用上述制备的促甲状腺激素检测免疫试纸分别测试待测样品1～5。各待测样品的取样量均为75μL。具体地，待测样品1～5分别是理论浓度为10ng/mL、6.2ng/mL、3.5ng/mL、1.5ng/mL、0.25ng/mL的TSH校准品。然后采用促甲状腺激素检测免疫试纸分别测试测试待测样品1～5，再通过荧光仪读取促甲状腺激素检测免疫试纸上对应的促甲状腺激素读数，得到的检测结果如表1所示。

表1

以表1中的理论浓度和检测值均值为横纵坐标，绘制如图2所示的表格，得到线性相关系数为R2＝0.999，可知该试纸的检测浓度的线性范围为0.25ng/mL-10ng/mL，线性范围广。

二、最低检出限

将阴性血清作为样品，采用上述制备的促甲状腺激素检测免疫试纸重复测试20次，计算平均值+2SD。通过荧光仪读取促甲状腺激素检测免疫试纸上对应的促甲状腺激素读数，得到如表2的数据，从中可知，最低检出限为0.096ng/mL。

表2

三、准确度

其中样本为理论浓度为1ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL的TSH校准品，采用上述制备的促甲状腺激素检测免疫试纸测试，得到如表3的数据。

表3

四、精密度

测试低值质控品和高值质控品，采用上述制备的促甲状腺激素检测免疫试纸检测每种质控品测试20次，计算20次测试的均值和变异系数，得到如表4的数据。

表4

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水垫设于所述底板上，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述硝酸纤维素膜搭接，所述硝酸纤维素膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述硝酸纤维素膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫，所述结合垫上包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体，所述检测线包被有促甲状腺激素单克隆抗体，所述质控线包被有能够与所述第一质控抗体特异性结合的第二质控抗体。

2.如权利要求1所述的促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，在所述结合垫上，所述促甲状腺激素单克隆抗体与所述第一质控抗体的质量比为(40～80):1。

3.如权利要求1所述的促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，所述标记微球选自荧光乳胶微球、胶体金微球或磁珠微球。

4.如权利要求1所述的促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，所述第一质控抗体和所述第二质控抗体中一个选自羊抗兔IgG抗体，另一个选自兔IgG抗体。

5.如权利要求4所述的促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，所述第一质控抗体选自羊抗兔IgG抗体，所述第二质控抗体选自兔抗鼠IgG抗体。

6.如权利要求1～5任一项所述的促甲状腺激素检测免疫试纸，其特征在于，所述促甲状腺激素检测免疫试纸为犬猫促甲状腺激素检测免疫试纸，所述促甲状腺激素单克隆抗体为犬猫促甲状腺激素单克隆抗体。

7.一种促甲状腺激素检测免疫试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上；

将促甲状腺激素单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成检测线；

将第二质控抗体包被在所述硝酸纤维素膜上形成与所述检测线相间隔的质控线，所述第二质控抗体能够与所述第一质控抗体特异性结合；

将样品垫、吸水垫、包被有分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体的所述结合垫及具有所述检测线和所述质控线的所述硝酸纤维素膜设于底板上，得到所述促甲状腺激素检测免疫试纸，所述结合垫的两端分别与所述样品垫及所述硝酸纤维素膜搭接，所述硝酸纤维素膜远离所述结合垫的一端与所述吸水垫搭接，所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述将分别用微球标记的促甲状腺激素单克隆抗体和第一质控抗体包被在结合垫上的步骤包括：

将促甲状腺激素单克隆抗体与标记微球混合制成第一标记溶液；

将第一质控抗体与标记微球混合制成第二标记溶液；

将所述第一标记溶液和所述第二标记溶液混合，喷涂在所述结合垫上，干燥。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一标记溶液和所述第二标记溶液的制备包括如下步骤：

将标记微球制成标记微球溶液；

将促甲状腺激素单克隆抗体或第一质控抗体分别加入所述标记微球溶液，混合，分离取沉淀，进行封闭处理，然后加入保存液，分别制得所述第一标记溶液和所述第二标记溶液。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，控制喷涂在所述结合垫上的所述促甲状腺激素单克隆抗体与所述第一质控抗体的质量比为(40～80):1。

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