CN110724719B - 一种磺达肝葵钠中间体的合成方法 - Google Patents

一种磺达肝葵钠中间体的合成方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，该方法为化学酶法，从起始糖基受体葡萄糖醛酸的β‑对硝基苯苷出发，利用尿苷二磷酸N‑三氟乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在糖基转移酶催化下交替进行糖基化反应构建糖链，然后用酶法进行糖链修饰，最后用碱性裂解和酸催化的苷交换得到目标三糖中间体式(I)。

Description

一种磺达肝葵钠中间体的合成方法
技术领域
本申请涉及医药技术领域，特别是涉及一种磺达肝葵钠中间体的合成方法。
背景技术
磺达肝癸钠(Fondaparinux sodium)，商品名称为
Figure GDA0003906907830000013
是法国SanofiWinthrop Industric研制生产的目前唯一一个化学合成的肝素类寡糖抗凝药物，CAS号为114870-03-0。这是基于肝素与抗凝血酶III(Antithrombin III，AT III)特异性结合的作用位点核心五糖的结构而合成的超低分子肝素，结构如下：
Figure GDA0003906907830000011
相比于未分级和低分子量肝素，磺达肝素可以极大地降低肝素诱导的血小板减少症发病率,因此在临床上使用更加安全。然而，黄达肝素的化学合成涉及到不同类型的多个保护基操作和选择性硫酸化，反应步数多，分离纯化困难，导致合成效率较低，如总合成步数多达60步，总产率小于0.1％，这也导致其成为了最贵的肝素类药物,极大地限制了其更为广泛的使用。化学酶法合成，模拟肝素的生物合成途径，兼有化学合成的灵活性和生物酶法的高效性，反应无需保护基操作且区域、立体选择性专一，对于降低磺达肝素的成本以及实现大规模生产具有重要的意义。
特别是磺达肝素的三糖中间体，见式(I)，含有多硫酸基和艾杜糖醛酸以及还原端的α- 甲基苷，是现有磺达肝素生产的主要困难和核心部分。因此，需要对此中间体的合成方法进行开发。
Figure GDA0003906907830000012
申请内容
解决的技术问题：
本申请需要解决的技术问题是现有技术中反应步数多，分离纯化困难，导致合成效率较低等技术问题，提供一种磺达肝葵钠中间体的合成方法。
技术方案：
一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，反应条件如下：
Figure GDA0003906907830000021
第一步，从化合物(II)出发，经过糖基转移酶催化引入三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体得到化合物(III)：所述化合物(II)为起始反应物，用量为1.2mmol；所述三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体为尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体，用量为1.5mmol；所述糖基转移酶为 PmHS2，用量为20μg/mL；所述化合物(II)、尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体与糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为90％，得到化合物(III)；
第二步，将化合物(III)经过糖基转移酶催化引入葡萄糖醛酸糖基供体，得到化合物(IV)：所述葡萄糖醛酸糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体，将1.2mmol化合物(III)、1.5mmol 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体与20μg/mL糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的 Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为91％，得到化合物(IV)；
第三步：重复第一步和第二步，将化合物(IV)经过糖基转移酶PmHS2催化三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体，产率为91％，再经过糖基转移酶PmHS2催化葡萄糖醛酸糖基供体，产率为89％，得到化合物(V)；
第四步，将化合物(V)碱性水解脱除三氟乙酰基，用磺酰胺基转移酶NST将氨基磺酰胺化得到化合物(VI)：将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入pH 7.0、 50mM的MES溶液50mL，在37℃反应12-15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose 分离得到化合物(VI)0.95g,产率为96％，所述pH 7.0、50mM的MES溶液50mL中含有10 ug/mL的磺酰胺基转移酶NST和1mM的PAPS；
第五步，将位于化合物(VI)糖链中间位置的葡萄糖醛酸结构通过C5-epi进行糖环5位的消旋，然后用2-氧-硫酸转移酶将糖醛酸2-位磺酸化得到化合物(VII)：将0.95g、0.87mmol化合物 (VI)溶解在含有0.2mM的氯化钙、10μg/mL C5-epi、10μg/mL 2-氧-硫酸转移酶和50mM、 pH 7.0的MES磷酸缓冲溶液100mL中，在37℃下反应2小时，反应产物通过高效液相色谱 Q-Sepharose分离得到化合物(VII)0.82g,85％产率；
第六步，将化合物(VII)用6-氧-硫酸转移酶-1(6-OST-1)和6-氧-硫酸转移酶-3(6-OST-3) 将糖环的6-位硫酸化得到化合物(VIII)：将0.82g、0.74mmol化合物(VII)溶解在含有1.5mM 3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-1、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-3 的100mL50 M MES磷酸缓冲溶液中，所述MES磷酸缓冲溶液pH＝7,并于37℃反应15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到白色固体化合物(VIII)0.75g,92％产率；
第七步：将化合物(VIII)采用碱性降解，裂解掉糖链两端的葡萄糖醛酸部分，得到化合物(IX)，所述碱性降解的方法为将1g、0.9mmol化合物(VIII)溶解在10mL、pH 7.0的NaH2PO4缓冲液中，加入高碘酸钠20equiv，在37℃下反应3.5小时，然后加入乙二醇20equiv淬灭反应，反应液通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干再加入10mL、0.5M氢氧化钠溶液并在常温下反应3小时，产物通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干得到化合物(IX)0.7g，产率90％；
第八步：将冻干后的化合物(IX)加入100mL、0.05mM的盐酸甲醇无水溶液中，搅拌1小时，加入0.05mM的NaOH溶液中和至pH＝7.0，通过P-2凝胶柱分离得到式(I)0.65g，产率90％。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第一步、第二步和第三步中三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体和葡萄糖醛酸糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，二磷酸盐形式具体为钠盐、钾盐、铵盐、三乙胺盐或吡啶盐。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第四步磺酰胺化替代技术方案为：将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入3.0equiv三氧化硫-三甲胺络合物和5vol DMF，在37℃下反应5小时；反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到化合物(VI)。
有益效果：
本申请所述一种磺达肝葵钠中间体的合成方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、兼有化学合成的灵活性和生物酶法的高效性，反应无需保护基操作且区域、立体选择性专一，对于降低磺达肝素的成本以及实现大规模生产具有重要的意义；
2、现有工艺对磺达肝素的合成需要使用大量有机金属试剂进行糖基化偶联导致环境污染，本发明避免了此类有毒试剂的使用；
3、现有工艺对磺达肝素的合成涉大量低温反应(-78℃)和惰性气体保护的无水无氧反应,不利于较大规模操作，本发明合成路线的反应条件基本为室温到37℃，也没有无水无氧的反应；
4、现有技术路线合成化合物(I)需要30步以上，本发明只需要8步。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
本技术领域技术人员可以理解的是，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
化合物(II)购于武汉欣欣佳丽生物科技公司，型号20140201。
实施例1:
一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，反应条件如下：
Figure GDA0003906907830000051
第一步：从化合物(II)出发，经过糖基转移酶催化引入三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体得到化合物(III)：所述化合物(II)为起始反应物，用量为1.2mmol；所述三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体为尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体，用量为1.5mmol；所述糖基转移酶为 PmHS2，用量为20μg/mL；所述化合物(II)、尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体与糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为90％，得到化合物(III)；
第二步：将化合物(III)经过糖基转移酶催化引入葡萄糖醛酸糖基供体，得到化合物(IV)：所述葡萄糖醛酸糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体，将1.2mmol化合物(III)、1.5mmol 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体与20μg/mL糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的 Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为91％，得到化合物(IV)；
第三步：重复第一步和第二步，将化合物(IV)经过糖基转移酶PmHS2催化三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体，产率为91％，再经过糖基转移酶PmHS2催化葡萄糖醛酸糖基供体，产率为89％，得到化合物(V)；
第四步：将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用 HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入pH7.0、 50mM的MES溶液50mL，在37℃反应12-15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose 分离得到化合物(VI)0.95g,产率为96％，所述pH 7.0、50mM的MES溶液50mL中含有10 ug/mL的磺酰胺基转移酶NST和1mM的PAPS；
第五步：将位于化合物(VI)糖链中间位置的葡萄糖醛酸结构通过C5-epi进行糖环5位的消旋，然后用2-氧-硫酸转移酶将糖醛酸2-位磺酸化得到化合物(VII)：将0.95g、0.87mmol化合物 (VI)溶解在含有0.2mM的氯化钙、10μg/mL C5-epi、10μg/mL 2-氧-硫酸转移酶和50mM、 pH 7.0的MES磷酸缓冲溶液100mL中，在37℃下反应2小时。反应产物通过高效液相色谱 Q-Sepharose分离得到化合物(VII)0.82g,85％产率；
第六步：将化合物(VII)用6-氧-硫酸转移酶-1(6-OST-1)和6-氧-硫酸转移酶-3(6-OST-3)将糖环的6-位硫酸化得到化合物(VIII)：将0.82g、0.74mmol化合物(VII)溶解在含有1.5mM 3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-1、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-3 的100mL50 M MES磷酸缓冲溶液中，所述MES磷酸缓冲溶液pH＝7,并于37℃反应15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到白色固体化合物(VIII)0.75g,92％产率；
第七步：将化合物(VIII)采用碱性降解，裂解掉糖链两端的葡萄糖醛酸部分，得到化合物(IX)，所述碱性降解的方法为将1g、0.9mmol化合物(VIII)溶解在10mL、pH 7.0的NaH2PO4缓冲液中，加入高碘酸钠20equiv，在37℃下反应3.5小时，然后加入乙二醇20equiv淬灭反应，反应液通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干再加入10mL、0.5M氢氧化钠溶液并在常温下反应3小时，产物通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干得到化合物(IX)0.7g，产率90％；
第八步：将冻干后的化合物(IX)加入100mL、0.05mM的盐酸甲醇无水溶液中，搅拌1小时，加入0.05mM的NaOH溶液中和至pH＝7.0，通过P-2凝胶柱分离得到式(I)0.65g，产率90％。
实施例2：
一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，反应条件如下：
Figure GDA0003906907830000071
第一步，从化合物(II)出发，经过糖基转移酶催化引入三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体得到化合物(III)：所述化合物(II)为起始反应物，用量为1.2mmol；所述三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体为尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体，用量为1.5mmol；所述糖基转移酶为PmHS2，用量为20μg/mL；所述化合物(II)、尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体与糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为90％，得到化合物(III)；
第二步，将化合物(III)经过糖基转移酶催化引入葡萄糖醛酸糖基供体，得到化合物(IV)：所述葡萄糖醛酸糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体，将1.2mmol化合物(III)、1.5mmol 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体与20μg/mL糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的 Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为91％，得到化合物(IV)；
第三步：重复第一步和第二步，将化合物(IV)经过糖基转移酶PmHS2催化三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体，产率为91％，再经过糖基转移酶PmHS2催化葡萄糖醛酸糖基供体，产率为89％，得到化合物(V)；
第四步，将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用 HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入3.0equiv 三氧化硫-三甲胺络合物和5vol DMF，在37℃下反应5小时。反应产物通过高效液相色谱 Q-Sepharose分离得到化合物(VI),产率为96％；
第五步，将位于化合物(VI)糖链中间位置的葡萄糖醛酸结构通过C5-epi进行糖环5位的消旋，然后用2-氧-硫酸转移酶将糖醛酸2-位磺酸化得到化合物(VII)：将0.95g、0.87mmol化合物 (VI)溶解在含有0.2mM的氯化钙、10μg/mL C5-epi、10μg/mL 2-氧-硫酸转移酶和50mM、 pH 7.0的MES磷酸缓冲溶液100mL中，在37℃下反应2小时。反应产物通过高效液相色谱 Q-Sepharose分离得到化合物(VII)0.82g,85％产率；
第六步，将化合物(VII)用6-氧-硫酸转移酶-1(6-OST-1)和6-氧-硫酸转移酶-3(6-OST-3)将糖环的6-位硫酸化得到化合物(VIII)：将0.82g、0.74mmol化合物(VII)溶解在含有1.5mM 3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-1、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-3 的100mL50 M MES磷酸缓冲溶液中，所述MES磷酸缓冲溶液pH＝7,并于37℃反应15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到白色固体化合物(VIII)0.75g,92％产率；
第七步：将化合物(VIII)采用碱性降解，裂解掉糖链两端的葡萄糖醛酸部分，得到化合物(IX)，所述碱性降解的方法为将1g、0.9mmol化合物(VIII)溶解在10mL、pH 7.0的NaH2PO4缓冲液中，加入高碘酸钠20equiv，在37℃下反应3.5小时，然后加入乙二醇20equiv淬灭反应，反应液通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干再加入10mL、0.5M氢氧化钠溶液并在常温下反应3小时，产物通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干得到化合物(IX)0.7g，产率90％；
第八步：将化合物(IX)加入100mL、0.05mM的盐酸甲醇无水溶液中，搅拌1小时，加入0.05mM的NaOH溶液中和至pH＝7.0，通过P-2凝胶柱分离得到式(I)0.65g，产率90％。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，其特征在于，反应条件如下：
Figure FDA0003906907820000011
第一步，从化合物(II)出发，经过糖基转移酶催化引入三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体得到化合物(III)：所述化合物(II)为起始反应物，用量为1.2mmol；所述三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体为尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体，用量为1.5mmol；所述糖基转移酶为PmHS2，用量为20μg/mL；所述化合物(II)、尿苷二磷酸2-位三氟乙酰胺基葡萄糖糖基供体与糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为90％，得到化合物(III)；
第二步，将化合物(III)经过糖基转移酶催化引入葡萄糖醛酸糖基供体，得到化合物(IV)：所述葡萄糖醛酸糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体，将1.2mmol化合物(III)、1.5mmol尿苷二磷酸葡萄糖醛酸糖基供体与20μg/mL糖基转移酶PmHS2在含有25mmol、pH 7.2的Tris和15mmol MnCl2的缓冲溶液中室温下反应15小时，反应通过HPLC进行监测，产物通过C18反相柱分离，产率为91％，得到化合物(IV)；
第三步：重复第一步和第二步，将化合物(IV)经过糖基转移酶PmHS2催化三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体，产率为91％，再经过糖基转移酶PmHS2催化葡萄糖醛酸糖基供体，产率为89％，得到化合物(V)；
第四步，将化合物(V)碱性水解脱除三氟乙酰基，用磺酰胺基转移酶NST将氨基磺酰胺化得到化合物(VI)：将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入pH7.0、50mM的MES溶液50mL，在37℃反应12-15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到化合物(VI)0.95g,产率为96％，所述pH 7.0、50mM的MES溶液50mL中含有10ug/mL的磺酰胺基转移酶NST和1mM的PAPS；
第五步，将位于化合物(VI)糖链中间位置的葡萄糖醛酸结构通过C5-epi进行糖环5位的消旋，然后用2-氧-硫酸转移酶将糖醛酸2-位磺酸化得到化合物(VII)：将0.95g、0.87mmol化合物(VI)溶解在含有0.2mM的氯化钙、10μg/mL C5-epi、10μg/mL 2-氧-硫酸转移酶和50mM、pH 7.0的MES磷酸缓冲溶液100mL中，在37℃下反应2小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到化合物(VII)0.82g,85％产率；
第六步，将化合物(VII)用6-氧-硫酸转移酶-1(6-OST-1)和6-氧-硫酸转移酶-3(6-OST-3)将糖环的6-位硫酸化得到化合物(VIII)：将0.82g、0.74mmol化合物(VII)溶解在含有1.5mM3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-1、0.2μg/mL硫酸基转移酶6-OST-3的100mL50 M MES磷酸缓冲溶液中，所述MES磷酸缓冲溶液pH＝7,并于37℃反应15小时，反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到白色固体化合物(VIII)0.75g,92％产率；
第七步：将化合物(VIII)采用碱性降解，裂解掉糖链两端的葡萄糖醛酸部分，得到化合物(IX)，所述碱性降解的方法为将1g、0.9mmol化合物(VIII)溶解在10mL、pH 7.0的NaH2PO4缓冲液中，加入高碘酸钠20equiv，在37℃下反应3.5小时，然后加入乙二醇20equiv淬灭反应，反应液通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干再加入10mL、0.5M氢氧化钠溶液并在常温下反应3小时，产物通过透析袋截取分子量500Da除盐，冻干得到化合物(IX)0.7g，产率90％；
第八步：将冻干后的化合物(IX)加入100mL、0.05mM的盐酸甲醇无水溶液中，搅拌1小时，加入0.05mM的NaOH溶液中和至pH＝7.0，通过P-2凝胶柱分离得到式(I)0.65g，产率90％。
2.根据权利要求1所述的一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，其特征在于：所述第一步、第二步和第三步中三氟乙酰氨基葡萄糖糖基供体和葡萄糖醛酸糖基供体为二磷酸形式或二磷酸盐形式，二磷酸盐形式具体为钠盐、钾盐、铵盐、三乙胺盐或吡啶盐。
3.根据权利要求1所述的一种磺达肝葵钠中间体的合成方法，其特征在于：所述第四步磺酰胺化替代技术方案为：将1.0equiv化合物(V)加入0.1M的氢氧化锂溶液中，在冰水浴下反应2小时，用HPLC检测三氟乙酰基完全脱除后，用10％稀盐酸将反应体系pH调至7.0，再加入3.0equiv三氧化硫-三甲胺络合物和5vol DMF，在37℃下反应5小时；反应产物通过高效液相色谱Q-Sepharose分离得到化合物(VI)。
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Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions;Xing Zhang，et al;《PNAS》;20190507;第116卷(第19期);第9209页倒数第1-2段，第9210页第1段，图2 *
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