CN110710423B

CN110710423B - 一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法

Info

Publication number: CN110710423B
Application number: CN201910986203.5A
Authority: CN
Inventors: 郑春生; 张丽杰; 刘冰; 高文娜; 张闻天; 骆卫峰
Original assignee: Inspection And Quarantine Technology Center Of Beijing Entry Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection And Quarantine Technology Center Of Beijing Entry Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110710423A

Abstract

本发明涉及一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法如下：将待脱毒玉米种子在40摄氏度预干处理24小时，再在70摄氏度干热处理24小时。本申请的方法首次实现了种子中玉米褪绿斑驳病毒的脱除，且能够彻底脱毒，并具有非常高的发芽率，甚至会提高玉米种子的发芽率，整体效果非常好。更重要的是，该方法过程简单、操作简单、条件温和，对设备要求低，成本低，能够非常好的应用于口岸入境种子检疫工作中，使得玉米褪绿斑驳病毒的有效彻底简单脱除成为现实，且实现从种子源头控制杀灭玉米褪绿斑驳病毒，最终控制盖病毒的危害性和蔓延传播。

Description

一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法。

背景技术

随着世界贸易的深入发展，我国深度参与到频繁的国际农业贸易中，如种苗、花卉、水果、蔬菜、木材等植物及其产品的贸易往来和世园会等园艺展览活动等。上述农业贸易的发展，在带动了国内农业产业发展的同时，也将包括植物病毒在内的有害生物传入传出。近年来，我国多次在进境植物及其产品中检出检疫性病毒，仅2017－2018年，我国进境植物及其产品检出检疫性病毒近600余批次，植物病毒疫情的高发严重威胁了我国的国门生物安全。

目前，口岸对截获的携带检疫性病毒的货物一般做退运或销毁处理，无有效脱毒处理手段。而对于一些稀有种质资源或从国外引进的优质种苗，具有保存价值的植物产品在检出检疫性病毒后都需进行脱毒处理。因此，研究植物检疫脱毒处理技术，形成有效的脱毒处理技术方案，意义重大。目前开展的脱毒处理技术有：生物技术(组培苗)、物理处理(热处理、温汤处理)、化学处理(药剂处理)等。

口岸入境种子脱毒处理虽然重要性强，但技术研究较少。这是因为，口岸入境种子处理通常需要达到以下效果：简单、快速、有效、无害、方便应用的方法，而众所周知，简单的方法往往效果欠佳，效果好的方法往往比较复杂、时间长，而绝大多数方法往往都伴随着或多或少的副作用，即很难做到完全无害。因此，能够同时达到上述这些要求的方法少之又少，简单的方法就那么几种，技术人员创新难度大，效果基本都可预期，成果突破可能性小，因此，为科研带来了极大的难度和不确定性，也由于此，使得本领域属于公认的出成果难、应用难的领域，也导致了有些研究人员对这口岸入境种子脱毒的研究望而却步，不愿意将有限的时间用在这些领域。

然而，在针对口岸检疫工作的实际工作中，植物病毒影响植物的生长和发育，尤其是植物病毒的传染性及增殖性对一种或者一类植物的危害巨大。目前我国口岸进口大量玉米种子，而且我国是仅次于美国的第二大玉米生产国，近年来多次在口岸检出检疫性。而玉米褪绿斑驳病毒最常见的寄主是玉米种子，其能够引起褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。该病毒在田间自然侵染减产10％～15％，在玉米实验田中减产可高达59％。在美国，该病害的病毒玉米褪绿斑驳病毒与玉米矮花叶病毒的A株系或B株系，或小麦线条花叶病毒发生协同作用，产生危害性很大的玉米致死性坏死病。据报道，产量损失可高达91％。在玉米生长的早期(3～7叶期)用玉米褪绿斑驳病毒与玉米矮花叶病毒一起接种玉米植株后，叶片首先发生褪绿、继而坏死，植株发生矮化、早死，玉米穗小而畸形，只有少量籽粒或根本不结穗。在生长后期(14叶期)接种的植株不发生矮化，但最后几片叶发生褪绿或坏死，虽然玉米穗大小正常，但千粒重明显降低。这两种病毒在玉米植株的生长后期发生复合侵染后，虽然叶片表现正常绿色，但玉米穗提前发生黄化并导致坏死，籽粒皱缩。

因此，对玉米褪绿斑驳病毒的脱毒处理非常重要，也非常迫切。基于其迫切程度，对其研究较多，但还没有研究出专门针对该病毒的简单有效的方法，更没有针对口岸入境种子检疫的脱毒方法。而在口岸检疫中便能对其进行有效脱毒，对该病毒的遏制，尤其是避免其传染其它能够作为寄主的种子极其重要。

本发明为了控制其危害性和蔓延传播，并达到从种子源头控制杀灭玉米褪绿斑驳病毒流行危害的目的，研究出来能够在口岸入境种子检疫工作中进行有效脱毒的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，解决了现有技术中存在的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

本发明的一个发明点为提供一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法如下：将待脱毒玉米种子在35-45摄氏度预干处理18-30小时，再在65-75摄氏度干热处理20-28小时。

进一步地，所述待脱毒玉米种子为冷藏的玉米种子、冷冻的玉米种子或室温下的玉米种子。

进一步地，所述预干处理和干热处理均为在恒温干燥箱内进行。

进一步地，将待脱毒玉米种子在40摄氏度预干处理24小时，再在70摄氏度干热处理24小时。

进一步地，所述玉米褪绿斑驳病毒包括玉米种子中的该种病毒。

进一步地，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法还包括光照。所述光照优选为在预干过程中进行照射。这也是一个重要的发明点。

进一步地，所述光照包括紫外光，所述紫外光的波长为340-380nm。

进一步地，所述光照包括自然光，该自然光的波长为470-510nm。

进一步地，所述紫外光与自然光交替照射，每次照射20-40min，各照射1-3次，两种光交接的中间，不照射的时长不超过30min。这也是一个重要的发明点。

进一步地，所述照射剂量为5-30J/cm²。

进一步地，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法中，相对湿度小于80％，优选湿度为25-55％。

本发明提供了一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，其主要的有益效果为：

本申请的方法首次实现了种子中玉米褪绿斑驳病毒的脱除，且能够彻底脱毒，并具有非常高的发芽率，甚至会提高玉米种子的发芽率，整体效果非常好。更重要的是，该方法过程简单、操作简单、条件温和，对设备要求低，成本低，能够非常好的应用于口岸入境种子检疫工作中，使得玉米褪绿斑驳病毒的有效彻底简单脱除成为现实，且实现从种子源头控制杀灭玉米褪绿斑驳病毒，最终控制盖病毒的危害性和蔓延传播。这是本发明的方法为玉米种子中玉米褪绿斑驳病毒脱除的突破性进展，在一定程度上，具有里程碑式的意义。

附图说明

图1是玉米种子从处理、种植、生长、测毒的过程(脱毒效果经过ELISA检测)。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种玉米种子上玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法如下：将待脱毒玉米种子在35-45摄氏度预干处理18-30小时，再在65-75摄氏度干热处理20-28小时。优选将待脱毒玉米种子在40摄氏度预干处理24小时，再在70摄氏度干热处理24小时。

所述预干处理和干热处理均可在恒温干燥箱内进行。当然，在其它设备中进行也可以，只要符合上述条件便可。

实施例2

在实施例1的基础上，所述待脱毒玉米种子为冷藏的玉米种子、冷冻的玉米种子或室温下的玉米种子。

作为进一步优选的实施方式，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法还包括光照。该光照包括紫外光和/或自然光。

更优选的实施方式，上述光照包括紫外光和自然光。优选在预干过程中进行光照便可。通过实验发现，预干过程中能够增加整体的脱毒和发芽效果，并且通过后期的干热等操作，不会增加玉米种子的任何副作用。若在干热过程中照射，很可能会产生一定的副作用，包括种子的发芽率成活率等，但该副作用还没有确认，只是通过一些现象的猜测，后期本发明人可能还会进行研究。

所述光照包括紫外光，所述紫外光的波长为340-380nm，优选360-370nm；所述光照包括自然光，该自然光的波长为470-510nm，优选480-490nm。所述照射剂量为5-30J/cm²，优选7-11J/cm²，光照剂量对于种子的发芽率具有非常大的影响，太高会严重影响发芽率。紫外灯或白炽灯等只需要安装在预干或干热的设备(如恒温干燥箱)上便可，该剂量很容易控制，只需要首次测量所安装的白炽灯和紫外灯的照射所具有的光剂量便可，不需要每次实验均进行操作。

作为更优选的实施方式，在预干过程中进行光照，发芽率和脱毒的彻底性均更优异。照射时，优选所述紫外光与自然光交替照射，照射方式为：交替照射且各照射20-40min，各照射1-3次，优选1次或2次，两种光交接的中间，不照射的时长不超过30min。有助于更彻底的脱毒，且同时能够有利于保持活性和增加发芽率；照射时间。

实施例3

在实施例1或2的基础上，所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法中，相对湿度小于80％，优选25-55％，如55％、30％、25％等，有助于提高脱毒效率以及保持种子活性提高发芽率和成活率。现有的预干或干热处理方法都是要求湿度越小效果越好，如果能控制在10％、5％甚至是2％以内最好了，而且，在人们的认知中也是这样的，干热或预干处理，肯定是湿度越小效果越好，但要想控制低湿度甚至无湿度的环境，这个难度很大，条件也很苛刻，在实际应用中，非常受限制，尤其是口岸检疫工作中，若要控制在2％、5％等这种数据，那么对设备和操作要求就太高了，时间和成本就限制了在口岸检疫中的应用。而本申请的湿度为小于80％，这个湿度在正常的日常环境中是不需要进行控制的。而且本申请优选湿度为25-55％，无需太小，甚至太小反而对短时间内的发芽效果有影响。

实施例4

种子染毒方法：将保存于超低温冰箱具有活性的阳性玉米褪绿斑驳病毒病叶置于研钵里加入液氮进行充分研磨，研磨成糊状，加0.1mol/L的磷酸钠缓冲液稀释，配制成病毒阳性接种液，(阳性接种液通过ELISA方法进行阳性判定检测)。控制在低温的条件，尽快将种子浸泡于阳性接种液中进行接种，不低于30min，无菌水清洗表面，自然晾干。注意该接种液勿反复使用，效果不佳。应现配现用。该方法能够诱导种子内部带毒且能在发芽过程中传毒。

种子发芽的方法：将玉米种子在温热去离子水浸泡种子一小时，后用纱布或报纸包裹放置在湿润、温度适宜(25-28℃)环境中，72小时和144小时观察发芽情况，并计算发芽率。

幼苗培育方法：将玉米种子在25-28℃的环境中撒入营养土中，定时浇水，发芽，生长，取幼苗叶片，研磨，检测玉米褪绿斑驳病毒携带率，如图1所示，图1为脱毒效果经过ELISA检测并证明脱毒效果的图示过程。

方法1：将带有玉米褪绿斑驳病毒玉米种子在40摄氏度预干24小时后70摄氏度干热处理24小时。

方法2：将玉米种子在40摄氏度预干24小时后70摄氏度干热处理24小时。在预干过程中，490nm的自然光和360nm的紫外光照射，照射剂量为5-15J/cm²(没有精确控制，根据电流等因素，基本在这个区间动态平衡)，交替各照射30min，各照射1-3次，中间间隔30小时，保持湿度在30％～40％(没有精确控制，基本在这个区间动态平衡)。

对比1：将玉米种子在40℃下预干处理；

对比2：将玉米种子在直接在70℃下干热处理；

对比3：在方法2的基础上，干热过程中只进行紫外光照射，剂量为100J/cm²；

对比4：进行24小时紫外光照。

对比5：未经过任何脱毒处理的种子。

表1实验组和对照组的实验数据

在上表中，脱毒时间为达到该条件下平衡最大脱毒率和最大发芽率下的时间，该时间均为通过无数次试验得到的。脱毒率＝(不经任何处理的玉米种子中玉米褪绿斑驳病毒的携带量/处理后玉米褪绿斑驳病毒的携带量)*100％。总病毒脱除率，不仅包括玉米褪绿斑驳病毒，还包括其它病毒。玉米植株苗携带病毒率主要指携带玉米褪绿斑驳病毒。

对于方法1，在不进行湿度控制的情况下，湿度范围基本都在30-80％，发芽率较高，达到90％以上，玉米褪绿斑驳病毒的脱毒率高，达到99％以上。其不足之处为：该发芽率较种子没有经过处理的对比组5低一点，且玉米苗具有一定的玉米褪绿斑驳病毒的携带率，脱毒不彻底，虽然低，但其可能存在对其它正常植株的染毒风险，也存在可能大量滋生或传播玉米褪绿斑驳病毒的风险，故存在潜在隐患。

对于方法2，玉米种子的发芽率显著提高，为96％，超过了没有经过脱毒处理的对比组5，其玉米褪绿斑驳病毒的脱毒率达到了100％，即能够完全脱毒，更重要的是，脱毒后进行播种生长，育苗植株的玉米褪绿斑驳病毒携带率为0％，因此，该方法脱毒非常彻底，不会再有生存病毒存在，经过后续的操作，也不会激活病毒，彻底避免了玉米褪绿斑驳病毒的生存、传播风险。且其总的病毒脱毒率也显著提高。总体而言，该方法不仅能够彻底脱毒，还能够增加发芽率与总病毒脱除率，且能够彻底避免后期该病毒再出现风险。

对于对比1：其对于玉米褪绿斑驳病毒的脱毒几乎没有任何作用，而且还降低了种子发芽率，与对比组5相比，整体效果都差。

对于对比2：将种子直接在70℃下处理，对种子的活性伤害极其大，使得种子的活性极其低，72小时的发芽率只有16％，144小时的发芽率也只有61.5％，极其低，远远低于对比组5，该方法不具有任何应用价值。且该结果也为后期在70℃以上的研究关上了门

对比2：玉米植株携带病毒率与病毒脱除率之和远大于100％，则在播种后，存在又感染，或病毒脱除不彻底等情况。

由对比组2可知，该种子没法在70度下处理，对种子伤害太大，种子，最重要的就是发芽率和患病率，发芽率是首要的，对比组2的太低了，根本不可能继续考虑后续研究。对于此类的研究，常规方法都是通过在不同温度下进行尝试，然后找到一个脱毒率和发芽率都相对较高的温度，再进行优化条件，然而，像对比组2这种，直接对种子活性造成如此之大影响的，该温度就不予考虑了，但通过本申请人的研究，发现，先在40摄氏度预干24小时左右(注意，这里是预干，且是24小时左右，时间太长太短都有不利影响)，然后再在70℃左右下干热24小时左右(注意，这里是干热、70、24小时左右)，能够得到很意外的结果，其发芽率居然能够升至90％以上，与对比5相近，这是以前的研究中没有出现过的情况。而且通过进一步优化，能使其发芽率等于或高于对比组5，如方法1，这个结果非常意外，也非常适宜口岸入境检疫，且简单、成本低，效果好。

对于对比组3，通过72小时的发芽率和144小时的发芽率可知，在方法2基础上若只进行紫外光照射，则对于发芽率具有明显影响。效果显著降低。

对于对比组4，若不加任何条件，只进行24小时紫外光照，则对其发芽率具有明显影响，144小时内的发芽率明显降低。且脱毒率仅30％左右，非常低，达不到脱毒作用，且种植后，玉米植株携带玉米褪绿斑驳病毒的概率非常高。

对于对比5，为没经过任何处理的带有玉米褪绿斑驳病毒的种子，其发芽率与正常种子的发芽率基本一致，均比较高，且携带病毒的概率也几乎是100％。盖对比组5可作为阳性对照。

在本发明中，凡是携带有玉米褪绿斑驳病毒的玉米植株，一般都会在生长过程中出现病症，影响产率、产量等。此外，通过研究发现，冷藏条件下的玉米种子直接进行预干和干热，其脱毒效果更好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，其特征在于：所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法如下：将待脱毒玉米种子在35-45摄氏度预干处理18-30小时，再在65-75摄氏度干热处理20-28小时；

所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法还包括光照，所述光照为在预干过程中进行照射；

所述光照包括紫外光和自然光，所述紫外光的波长为340-380nm，该自然光的波长为470-510nm；所述紫外光与自然光交替照射，每次照射20-40 min，各照射1-3次，两种光交接的中间，不照射的时长不超过30min；所述照射剂量为5-30J/cm²；

所述玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法中，环境的相对湿度为25-55%。

2.根据权利要求1所述的玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，其特征在于：所述待脱毒玉米种子为冷藏的玉米种子、冷冻的玉米种子或室温下的玉米种子。

3.根据权利要求1所述的玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，其特征在于：将待脱毒玉米种子在40摄氏度预干处理24小时，再在70摄氏度干热处理24小时。

4.根据权利要求1所述的玉米褪绿斑驳病毒的脱毒方法，其特征在于：所述玉米褪绿斑驳病毒包括玉米种子中的该种病毒。