CN110709098A - 用血浆和血浆制品治疗认知障碍和运动障碍的给药方案 - Google Patents

Abstract

描述了用于治疗和/或预防衰老相关病患的方法和组合物。所述方法中使用的所述组合物包括在治疗和/或预防衰老相关病患诸如认知障碍方面具有功效的血浆和源自血浆的血浆级分。所述方法涉及血浆或血浆级分的脉冲式给药的方案。

Description

用血浆和血浆制品治疗认知障碍和运动障碍的给药方案

相关申请

依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求以下美国临时专利申请的提交日期的优先权：2017年4月26日提交的美国临时专利申请第62/490,519号；2017年11月10日提交的美国临时专利申请第62/584,571号；2018年1月29日提交的美国临时专利申请第62/623,468号；以及2018年3月9日提交的美国临时专利申请第62/641,194号；所述申请的公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及衰老相关疾病的预防和治疗。本发明涉及血液制品(诸如血浆级分)用于使用各种给药范式(dosing paradigm)治疗和/或预防与衰老相关的病患(诸如认知障碍、运动障碍和神经炎症)的用途。

背景技术

以下内容仅作为背景信息提供，并且不被承认为是本发明的现有技术。

衰老是多种人疾病(包括认知障碍、癌症、关节炎、视力丧失、骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病和中风)的重要危险因素。除了自然衰老过程中的正常突触丧失以外，突触丧失是许多神经变性疾患常见的早期病理事件，并且与和这些病患相关的神经元和认知障碍最相关。因此，衰老仍然是与痴呆症相关的神经变性疾病(诸如阿尔茨海默氏病(AD))的单一最主要的危险因素(Bishop,N.A.等,Neural mechanisms of ageing and cognitivedecline.Nature 464(7288),529-535(2010)；Heeden,T.等,Insights into the ageingmind:a view from cognitive neuroscience.Nat.Rev.Neurosci.5(2),87-96(2004)；Mattson,M.P.,等,Ageing and neuronal vulnerability.Nat.Rev.Neurosci.7(4),278-294(2006))。衰老影响包括中枢神经系统在内的身体的所有组织和功能，并且神经变性以及诸如认知或运动技能等功能的下降会严重影响生活质量。认知下降、运动障碍和神经变性病症的治疗在预防和逆转障碍方面取得有限的成功。因此，重要的是鉴定通过防护、抵抗或逆转衰老的影响来维持认知完整性的新治疗。另外，当开发新治疗时，必须研究给药范式以优化那些治疗的功效。

尽管在老年小鼠与年轻小鼠之间进行的联体生活实验表明，与年轻小鼠进行异时血液交换可以改善老年小鼠的认知功能，但最近的报道发现，一次年轻血液的交换并不能增强老年小鼠的神经发生。(Rebo,J.等A single heterochronic blood exchangereveals rapid inhibition of multiple tissues by old blood.Nat.Comm.(2016))。另外，有人怀疑由输注年轻血浆所导致的认知功能与神经发生之间是否存在联系。因此，尚未描述使用刺激神经发生和改善认知功能的血浆或血浆级分的给药方案。

发明内容

本发明基于血液制品的生产和用途，所述血液制品用于治疗和/或预防年龄相关病症，诸如认知障碍疾患、年龄相关痴呆、运动功能障碍、神经炎症和神经变性疾病。本发明认识到，除其它以外，需要用于治疗和/或预防认知障碍、年龄相关痴呆、运动障碍、神经炎症和神经变性疾病的新疗法。源自血液和血浆，本发明的本发明组合物涉及通过利用在治疗和/或预防认知障碍、年龄相关痴呆、运动障碍、神经炎症和神经变性疾病方面表现出功效的血浆级分来解决当前疗法的失败和缺点的解决方案。

本发明认识到血浆蛋白的平均半衰期为2-3天。本发明使用血浆或血浆级分给药方案，所述给药方案在受治疗的受试者中优化神经发生、细胞存活、神经炎症的减少以及改善的认知或运动功能。已发现本发明的给药方案在受试者中触发了所有这些过程(神经发生、细胞存活、改善的认知、减少的神经炎症和改善的运动功能)，并且发现所述过程甚至在最后一剂后数周都一直有活性。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍的受试者。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测受试者的改善的认知功能。本发明的另一个实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍的受试者，其中以导致改善的认知功能或神经发生的方式施用血浆或血浆级分。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有神经变性运动病症(诸如，例如但不限于帕金森氏病)的受试者。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测受试者的改善的运动功能。本发明的另一个实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有神经变性运动病症的受试者，其中以导致改善的运动功能或神经发生的方式施用血浆或血浆级分。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有神经炎症或神经炎症相关病症的受试者。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测受试者的减少的神经炎症。本发明的另一个实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有神经炎症或神经炎症相关病症的受试者，其中以导致减少的神经炎症的方式施用血浆或血浆级分。

本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案施用血浆或血浆级分。本发明的另外的实施方案包括通过至少连续3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的给药方案施用血浆或血浆级分(在本文中称为“脉冲式给药(PulsedDosing)”、“脉冲式剂量(Pulsed Dose)”、“脉冲给药(Pulse Dosing)”，“脉冲剂量(PulseDose)”或“脉冲给药(Pulse Dosed)”)。本发明的另一个实施方案包括通过在最后一次施用的日期后至少连续两天的给药方案施用血浆或血浆级分。本发明的另一个实施方案包括通过非连续的2至14天的给药方案施用血浆或血浆级分，其中剂量之间的每个间隙可各自为0-3天。本发明的另一个实施方案包括在最后一次施用的日期后至少3天监测受试者的改善的认知或运动功能、减少的神经炎症或改善的神经发生。本发明的另一个实施方案包括超过在达到蛋白质在血浆或血浆级分中的平均半衰期时监测受试者的改善的认知或运动功能、减少的神经炎症或改善的神经发生。

在一些情况下，根据本发明的脉冲式给药包括第一组剂量(例如，如上所述的)的施用，随后是不给药期，例如“无给药期”，这之后接着是另一剂量或另一组剂量的施用。该“无给药”期的持续时间可以变化，但是在一些实施方案中，为7天或更长时间，诸如10天或更长时间，包括14天或更长时间，其中在某些情况下，无给药期的范围为15至365天，诸如30天至90天，并且包括30天至60天。这样，该方法的实施方案包括血浆制品的非长期(即，非连续)给药，例如非长期施用。在一些实施方案中，根据需要将脉冲式给药，随后进行无给药期的模式重复多次，其中在一些情况下，将该模式持续1年或更长时间，诸如2年或更长时间，直至并包括受试者的一生。本发明的另一个实施方案包括通过以下给药方案施用血浆或血浆级分：连续5天施用，2-3天无给药期，随后连续2-14天施用。

本发明还认识到不同血浆级分(例如，级分、流出物、血浆蛋白质级分、人白蛋白溶液)之间的蛋白质含量差异可以负责预防和/或改善某些认知障碍或运动障碍并减轻神经变性疾病。通过举例而非限制的方式，本发明的实施方案表明，重组人白蛋白或人白蛋白溶液(HAS)制剂的仅仅较高的白蛋白浓度并不是改善的认知、改善的运动功能、减少的神经炎症、细胞存活或与白蛋白浓度较低的血浆蛋白质级分(PPF)制剂相关的神经发生背后的驱动力。

来自年轻供体的血液和血浆已表现出改善和逆转了脑衰老的既有影响(包括分子、结构、功能和认知水平上)。(Saul A.Villeda,等Young blood reverses age-relatedimpairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.NatureMedicine 20 659-663(2014))。本发明涉及血浆的级分和流出物，其中一些已被常规地用于治疗患者休克，并且发现它们作为治疗衰老相关认知障碍、降低的运动功能和神经炎症或神经变性相关疾病的方法是有效的。

然后，根据本发明的方面，提供了使用血浆的血液制品级分治疗衰老相关认知障碍、年龄相关痴呆、运动障碍、神经炎症和/或神经变性疾病的方法。该方法的方面包括向患有衰老相关认知障碍、运动障碍、神经炎症或神经变性疾病或有发展衰老相关认知障碍、运动障碍、神经炎症或神经变性疾病的风险的个体施用血浆级分。该方法的另外方面包括向患有衰老相关认知障碍、运动障碍、神经炎症或神经变性疾病或有发展衰老相关认知障碍、运动障碍、神经炎症或神经变性疾病的风险的个体施用源自特定年龄范围的供体的集合的血浆级分。该方法的其它方面包括使用脉冲式给药方案施用血浆或血浆级分。还提供用于实践本主题方法的试剂、装置及其工具包。

在实施方案中，血浆级分可以是，例如，从血液分级分离过程(诸如下述的Cohn分级分离过程)获得的几种血浆级分中的一种。在另一个实施方案中，血浆级分可以是本文称为“血浆级分”的类型，其是由正常人白蛋白、α和β球蛋白、γ球蛋白和其它蛋白质单独地或作为复合物组成的溶液。在另一个实施方案中，血浆级分可以是本领域技术人员称为“血浆蛋白质级分”(PPF)的一种类型的血浆级分。在另一个实施方案中，血浆级分可以是“人白蛋白溶液”(HAS)级分。在仍然另一个实施方案中，血浆级分可以是其中基本上所有凝血因子都被除去以便保留级分的功效并降低血栓形成风险的血浆级分。本发明的实施方案还可包括施用例如源自年轻供体或年轻供体的集合的级分。本发明的另一个实施方案可包括监测用血浆级分治疗的受试者的认知改善、改善的运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍、神经变性运动障碍或神经炎症相关疾病的受试者。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测受试者的改善的认知功能、改善的运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案来施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后至少2天监测受试者的改善的认知功能、改善的运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。本发明的另外的实施方案包括通过至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的给药方案来施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后至少3天监测受试者的改善的认知功能改善、改善的运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。本发明的又一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后监测血浆或血浆级分中所述蛋白质的平均半衰期已达到后的认知改善、改善的运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍、运动功能受损、神经炎症或神经发生减少的受试者，其中所述受试者在施用后遵循锻炼方案。本发明的另一个实施方案包括遵循对受试者开出的锻炼方案。本发明的另一个实施方案包括所述受试者以比施用前锻炼的受试者更高的强度和/或更大的频率进行锻炼。本发明的另一个实施方案包括所述受试者以与施用前锻炼的受试者相似的强度和/或频率进行锻炼。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的正在进行干细胞疗法，将进行干细胞疗法或已接受了干细胞疗法的受试者中的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍、运动功能受损、神经炎症或神经发生减少的受试者。本发明的另一个实施方案包括向受试者施用有效量的血浆或血浆级分，其中受试者正在进行干细胞疗法，将要进行干细胞疗法或已经接受干细胞疗法，并且其中用于疗法的干细胞可以是胚胎干细胞、非胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞等。本发明的另一个实施方案包括用有效量的血浆或血浆级分治疗经诊断患有创伤性脊髓损伤、中风、视网膜疾病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、听力丧失、心脏病、类风湿性关节炎或严重烧伤的受试者，并且所述受试者正在进行干细胞疗法，将进行干细胞疗法，或已接受干细胞疗法。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有出版物以及专利申请通过引用并入本文，其引用的程度犹如每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。

附图说明

图1A描绘了使用脉冲剂量和3次/周的给药方案用PPF1处理的小鼠中在旷场试验中的行进的距离。

图1B描绘了使用脉冲剂量和3次/周的给药方案用PPF1处理的小鼠中在旷场中央花费的时间。

图2描绘了使用脉冲剂量和3次/周的给药方案用PPF1处理的小鼠随时间变化的体重。

图3报告了使用脉冲剂量或3次/周的给药方案用PPF1处理的小鼠中的齿状回的颗粒层内的DCX标记细胞的数量。

图4报告了使用脉冲剂量或3次/周的给药方案用PPF1处理的小鼠中的齿状回的颗粒层内的BrdU标记细胞的数量。

图5报告了使用脉冲剂量或3次/周的给药方案用PPF1、年轻人血浆(“YP”)或老年人血浆(“OP”)处理的小鼠中的齿状回的颗粒层内的DCX标记细胞的数量。

图6报告了使用脉冲剂量或3次/周的给药方案用PPF1、YP或OP处理的小鼠中的齿状回的颗粒层内的BrdU标记细胞的数量。

图7报告了用PPF1或YP脉冲给药的小鼠的每天每次试验发现目标洞的时延。

图8报告了使用脉冲给药方案用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)或PPF1处理的小鼠组中的齿状回的颗粒层内的DCX标记细胞的数量。

图9报告了使用脉冲给药方案用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)或PPF1处理的小鼠组中的齿状回的颗粒层内的BrdU标记细胞的数量。

图10报告了在Y型迷宫测试中，处理组进入熟悉臂或新异臂的进入总次数占进入每个臂的总进入次数的百分比。用PPF1或5倍浓缩的PPF1以脉冲剂量处理12月龄小鼠。

图11报告了Y型迷宫测试的进入新异臂对比熟悉臂的次数比率。用PPF1或5倍浓缩的PPF1以脉冲剂量处理12月龄小鼠。

图12报告了用PPF1或5倍浓缩的PPF1脉冲给药的12月龄小鼠中每个海马切片的BrdU标记细胞的数量。

图13报告了用PPF1或5倍浓缩的PPF1脉冲给药的12月龄小鼠中每个海马切片的DCX标记细胞的数量。

图14报告了使用以下方案之一用PPF1或盐水脉冲给药的10.5月龄NSG小鼠中的齿状回的颗粒层内DCX标记细胞的数量：(1)连续5天[PPF1-5d]；(2)连续7天[PPF1-7d]；(3)连续5天，在完成初始给药后6周，又进行连续5天的(“加强型”)给药[PPF1-5d-B]；或(4)连续7天，在完成初始给药后6周，又进行连续7天的(“加强型”)给药[PPF1-7d-B]。

图15报告了使用以下方案之一用PPF1或盐水脉冲给药的10.5月龄NSG小鼠中的齿状回的颗粒层内的BrdU标记细胞的数量：(1)连续5天[PPF1-5d]；(2)连续7天[PPF1-7d]；(3)连续5天，在完成初始给药后6周，又进行连续5天的(“加强型”)给药[PPF1-5d-B]；或(4)连续7天，在完成初始给药后6周，又进行连续7天的(“加强型”)给药[PPF1-7d-B]。

图16报告了使用以下方案之一用PPF1或盐水脉冲给药的10.5月龄NSG小鼠中的齿状回的颗粒层内的EdU标记细胞的数量：(1)连续5天[PPF1-5d]；(2)连续7天[PPF1-7d]；(3)连续5天，在完成初始给药后6周，又进行连续5天的(“加强型”)给药[PPF1-5d-B]；或(4)连续7天，在完成初始给药后6周，又进行连续7天的(“加强型”)给药[PPF1-7d-B]。

图17报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水处理的3月龄和6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的DCX标记细胞的数量。

图18报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水处理的3月龄和6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内Ki67阳性标记细胞的数量。

图19报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水处理的3月龄和6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的BrdU阳性标记细胞的数量。

图20报告了用PPF1或盐水对照脉冲给药的11月龄NSG小鼠中在给定的时间段内的轮转数。阴影区域表示黑暗周期，而进行热板测试时则为加框区域。

图21A显示了用年轻血浆、重组人白蛋白(“rh白蛋白”)和盐水对照处理的10.5月龄NSG小鼠的三个处理组中的齿状回的颗粒层内的BrdU标记细胞的数量。

图21B显示了用年轻血浆、重组人白蛋白(“rh白蛋白”)和盐水对照处理的10.5月龄NSG小鼠的三个处理组中的齿状回的颗粒层内的DCX标记细胞的数量。

图22报告了源自用对照、PPF1、HAS1或rh白蛋白处理的小鼠E16皮质的分离的混合神经元细胞中神经元网络活动增强的程度。

图23描绘了向8周龄(年轻)NSG小鼠施用的澄清的老年人血浆(老年血浆)或盐水的四种施用范式。

图24A描绘了在施用最后一剂后48小时，每周两次用老年血浆给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中海马中的VCAM-1阳性标记。

图24B描绘了在施用最后一剂后48小时，每周三次用老年血浆给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中海马中的VCAM-1阳性标记。

图24C描绘了在施用最后一剂后48小时，用老年血浆脉冲式给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中海马中的VCAM-1阳性标记。

图24D描绘了在施用最后一剂后21天，用老年血浆脉冲式给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中海马中的VCAM-1阳性标记。

图25A描绘了在施用最后一剂后48小时，每周两次用老年血浆给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中的齿状回中的DCX阳性细胞数量。

图25B描绘了在施用最后一剂后48小时，每周三次用老年血浆给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中的齿状回中的DCX阳性细胞数量。

图25C描绘了在施用最后一剂后21天，用老年血浆脉冲式给药处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中的齿状回中的DCX阳性细胞数量。

图26显示了Barnes迷宫逃离时延时间过程，并报告了老年血浆和盐水处理的8周龄(年轻)NSG小鼠的到达和进入逃离洞的时间。用老年人血浆或盐水连续7天处理小鼠，并在最后一次注射后4周测试所述小鼠。

图27描绘了在8周龄(年轻)NSG小鼠的测试的第4天的最后三次Barnes迷宫试验中的平均逃离时延，所述小鼠用老年人血浆或盐水连续处理7天。测试在最后一次注射后4周进行。

图28描绘了在8周龄(年轻)NSG小鼠的Barnes迷宫试验1与3之间的逃离时延的差异，所述小鼠用老年人血浆或盐水连续处理7天。测试在最后一次注射后4周进行。

图29报告了定量聚合酶链式反应(qPCR)的结果，所述定量聚合酶链式反应定量用老年人血浆或盐水连续7天处理的8周龄(年轻)NSG小鼠中的DCX、囊泡谷氨酸受体(vglut1)、突触蛋白1(syn1)、βIII微管蛋白(tuj1)和脑源性神经营养因子(bdnf)的mRNA水平。

图30描绘了用于用35mg/kg红藻氨酸或盐水处理，然后连续5天每天使用PPF1或盐水处理的8周龄(年轻)NSG小鼠的给药范式。

图31A报告了按照图28中描绘的范式处理的小鼠的海马的CA1区域中的CD68阳性面积的百分比。

图31B报告了按照图28中描绘的范式处理的小鼠的海马的CA1区域中的GFAP阳性面积的百分比。

图32报告了用PPF1或盐水对照连续7天脉冲给药同时施用BrdU的6月龄NSG小鼠中的齿状回中的针对BrdU染色的细胞数量。前两列构成了PPF1/盐对照和BrdU的最后一次处理后7天分析的群组；第二个两列构成了PPF1/盐水对照和BrdU的最后一次处理后14天分析的群组。

图33描绘了在利用PPF1的脉冲剂量方案完成后10天，6月龄NSG小鼠的齿状回中增殖性细胞(Ki67+)的增加。

图34描绘了在利用PPF1的脉冲剂量方案完成后10天，6月龄NSG小鼠的齿状回和室管膜下区的切片。

图35A报告了利用7天脉冲给药方案，用PPF1或盐水对照处理的6月龄NSG小鼠中的齿状回中的细胞的细胞命运，其中在脉冲给药方案即将开始之前连续5天施用BrdU。利用BrdU的NeuN+共定位染色的程度表明神经祖细胞变成神经元的程度。利用BrdU的GFAP+共定位染色的程度表明神经祖细胞变成星形细胞的程度。

图35B报告了来自与图35A类似但在12月龄NSG小鼠中进行的实验的结果。

图36A报告了利用7天脉冲给药方案，用老年血浆或盐水对照处理的3月龄NSG小鼠中的齿状回中的细胞的细胞命运，其中在脉冲式给药方案即将开始之前连续5天施用BrdU。利用BrdU的NeuN+共定位染色的程度表明神经祖细胞变成神经元的程度。

图36B报告了图36A中详述的实验的结果，但报告了利用BrdU的GFAP+共定位染色的程度，表明神经祖细胞变成星形胶质细胞的程度

图37报告了利用PPF1或盐水的7天脉冲给药方案处理的18月龄小鼠的(A)全脑、(B)皮层和(C)同形皮层(isocortex)中的cFos阳性细胞的数量。

图38报告了利用PPF1或盐水的7天脉冲给药方案处理的18月龄小鼠的(A)额叶皮层、(B)眶皮层和(C)下边缘皮层和(D)前边缘皮层中的cFos阳性细胞的数量。

图39报告了利用PPF1或盐水的7天脉冲给药方案处理的18月龄小鼠的(A)副嗅核(accessory olfactory nucleus)和(B)嗅结节中的cFos阳性细胞的数量。

图40描绘了利用PPF1或盐水的7天脉冲给药方案处理的18月龄小鼠的额叶皮层(FRP)、眶皮层(ORB)、下边缘皮层(ILA)、前边缘皮层(PL)和副嗅核(AON)中局部皮质激活的基于Voxel统计的可视化。

图41A报告了用PPF1或盐水对照的7天脉冲给药方案处理的22月龄C57BL/6J野生型小鼠中的海马中的CD68免疫反应面积百分比。

图41B报告了用PPF1或盐水对照的7天脉冲式给药方案处理的22月龄C57BL/6J野生型小鼠中的海马中的Iba-1免疫反应面积百分比。

图41C报告了用PPF1或盐水对照的7天脉冲给药方案处理的22月龄C57BL/6J野生型小鼠中的海马中的GFAP免疫反应面积百分比。

图42A报告了使用连续七天的脉冲式给药方案给药后6周、9周和12周，与盐水对照相比的PPF1处理的23月龄野生型C57BL/6J小鼠中的BrdU染色的变化百分比。

图42B报告了使用连续七天的脉冲式给药方案给药后6周、9周和12周，与盐水对照相比的PPF1处理的23月龄野生型C57BL/6J小鼠中的DCX染色的变化百分比。

图43A和43B报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)的体重测量结果。

图44报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)的筑巢的结果。

图45A和45B报告了分别使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)的意大利面食啃咬和相关运动改善的结果。

图46报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)的钢丝悬挂测试(wiresuspension test)的结果。

图47A显示了难度不断增加的五种不同的横梁行走试验(beam walk trial)中使用的横梁形状和大小。

图47B报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)中的5个不同的横梁行走试验的结果。在最后一个处理剂量后72小时进行了横梁行走试验。

图47C报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)的5个不同的横梁行走试验的结果。在最后一个处理剂量后3周进行了横梁行走试验。

图48A至48F报告了使用PPF1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的4至4.5月龄雄性α-突触核蛋白小鼠(品系61)(帕金森氏病的模型)中纹状体和海马染色的组织学结果。检查的组织学标志物包括CD68、Iba-1和NeuN。

图49报告了使用PPF1、HAS1或媒介物对照通过连续7天的脉冲式给药方案处理的12月龄NSG小鼠中的Barnes迷宫逃离时延。

具体实施方式

1.引言

本发明涉及用于治疗和/或预防认知和运动障碍(包括年龄相关痴呆或运动功能下降和/或神经变性疾病)的方法和组合物的鉴定和发现。本文描述了用于治疗患有此类病症的受试者的方法和组合物，这是本发明的方面。本文还描述了在患有认知或运动障碍的受试者中触发神经发生或神经炎减少和/或认知或运动改善的给药方案。本文所述的方法和组合物可用于：预防认知或运动障碍、年龄相关痴呆、神经炎症和/或神经变性疾病；改善认知或运动障碍、年龄相关痴呆、神经炎症和/或神经变性疾病的症状；减缓衰老相关认知或运动障碍、年龄相关痴呆、神经炎症和/或神经变性疾病的进程；和/或逆转衰老相关认知或运动障碍、年龄相关痴呆、神经炎症和/或神经变性疾病的进程。本发明的实施方式包括使用血浆级分作为治疗，诸如从血液分级分离过程(例如，如下文所述的Cohn分级分离过程)中获得的一种或多种级分或流出物。本发明的实施方案包括使用血浆级分(由正常人白蛋白、α和β球蛋白、γ球蛋白和其它蛋白质单独地或作为复合物组成的溶液，在下文中称为“血浆级分”)。本发明的另一个实施方案包括使用血浆蛋白质级分(PPF)作为治疗。本发明的另一个实施方案包括使用人白蛋白溶液(HAS)级分作为治疗。另一个实施方案包括使用来自血液分级分离过程的流出物，诸如下文所述的流出物I或流出物II/III。另外的实施方案包括血浆级分，已从所述血浆级分中基本上除去了所有凝血因子，以便在保持功效的同时降低血栓形成的风险(例如，参见美国专利第62/236,710号和第63/376,529号，所述美国专利通过引用整体并入本文)。

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物，因而，当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。本文中的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些出版物。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。

在提供数值范围的情况下，应理解的是，还明确地公开了该范围的上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)。在所述范围中的任何所述值或居间值与在该所述范围中的任何其它所述值或居间值之间的各个较小范围涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且当两个界限之一、都不或全都包括在所述较小范围中时各个范围也涵盖在本发明内，除非是所述规定范围中的任何明确排除的极限值。当所述范围包含所述限值的之一或两者时，则排除这些所含限值之一或两者的范围也包括在本发明内。

还应指出，可撰写权利要求来排除任何任选的元素。因此，这种陈述旨在充当结合权利要求要素的叙述来使用诸如“仅仅”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的前提基础。

本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文所述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所陈述方法均可以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

2.定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与引述所述出版物相关的方法和/或材料。应理解，如果有矛盾，本公开取代所并入出版物的任何公开内容。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞且提及“该肽”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等效物，例如多肽，诸如此类。

在描述本发明的方法时，术语“宿主”、“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指根据所公开的方法需要这种治疗的任何哺乳动物。此类哺乳动物包括例如人，绵羊、牛科动物、马、猪、犬科动物、猫科动物、非人灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是农场动物。在其它实施方案中，受试者是宠物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。其它受试者可包括家养宠物(例如，狗和猫)、牲畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，如在疾病的动物模型中)以及非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猴子)。因而，本发明的受试者可包括但不限于哺乳动物，例如，人和其它灵长类动物，诸如黑猩猩以及其它猿和猴物种等，其中在某些实施方案中受试者是人。术语受试者还意指包括任何年龄、体重或其它身体特征的人或生物体，其中受试者可以是成人、儿童、婴儿或新生儿。

“年轻人”或“年轻个体”是指按实足年龄为40岁或更年轻，例如35岁或更年轻，包括30岁或更年轻，例如25岁或更年轻，或22岁或更年轻的个体。在一些情况下，充当包含年轻血浆的血液制品的来源的个体是10岁或更年轻，例如5岁或更年轻，包括1岁或更年轻的个体。在一些情况下，受试者是新生儿，并且血浆制品的来源是脐带，其中血浆制品从新生儿的脐带收获。因此，“年轻”和“年轻个体”可以指介于0和40岁之间的受试者，例如0岁、1岁、5岁、10岁、15岁、20岁、25岁、30岁、35岁或40岁的受试者。在其它情况下，“年轻”和“年轻个体”可以指生物学(与按时间顺序相对)年龄，诸如未曾表现出在较年长的个体中表现出的血浆中的炎性细胞因子水平的个体。相反地，“年轻”和“年轻个体”可以指生物学(与按时间顺序相对)年龄，诸如相较于较年长的个体中的水平表现出更高的抗炎细胞因子水平的个体。举例来说，但不限于，炎性细胞因子是嗜酸细胞活化趋化因子，并且年轻受试者或年轻个体与老年个体之间的倍数差异至少为1.5倍。类似地，其它炎性细胞因子的老年个体与年轻个体之间的倍数差异可用于指代生物学年龄。(参见美国专利申请第13/575,437号，其通过引用并入本文)。通常，个体是健康的，例如，个体在收获时没有恶性血液病或自身免疫性疾病。

“患有衰老相关认知障碍或有患有衰老相关认知障碍的风险的个体”意指已度过其预期寿命约50％以上，诸如，60％以上，例如，诸如度过其预期使用寿命70％以上，诸如75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或甚至99％以上的个体。个体的年龄将取决于所述物种。因此，该百分比基于所述物种的预期寿命。例如，在人中，这样的个体是年龄为50岁或以上，例如，60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，通常不超过100岁，诸如90岁，即，在约50至100岁之间，例如50岁...55岁...60岁...65岁...70岁...75岁...80岁...85岁...90岁...95岁...100岁或以上，或50-1000岁之间的任何年龄，患有如下进一步描述的衰老相关病患，例如与自然衰老过程相关的认知障碍的个体；年龄为约50岁或以上，例如，60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，通常不超过100岁，即，在大约50至100岁之间，例如，50岁...55岁...60岁...65岁...70岁...75岁...80岁...85岁...90岁...95岁...100岁，尚未开始显示衰老相关病患(例如，认知障碍)的症状的个体；患有由衰老相关疾病(如下文进一步所述的)引起的认知障碍的任何年龄的个体，以及经诊断患有通常伴随认知障碍的衰老相关疾病的任何年龄的个体，其中该个体尚未开始表现出认知障碍的症状。非人受试者的相应年龄是已知的，并且打算在本文中应用。

如本文中所用，“治疗”是指(i)预防疾病或病症，或(ii)减轻或消除疾病或病症的症状中的任何一种。可以预防性地(在疾病发作之前)或治疗性地(在疾病发作之后)进行治疗。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可为治疗性的。因此，如本文中所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的衰老相关疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者发生疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即导致疾病消退。治疗可引起多种不同的物理表现，例如，基因表达的调节、组织或器官的复壮(rejuvenation)等。治疗剂可以在疾病发作之前、期间或之后施用。对正在进行的疾病的治疗(其中所述治疗使患者的不期望临床症状稳定或减少)特别吸引人。可在受累组织的功能完全失去之前进行此种治疗。可在疾病的症状期期间施用主题疗法，并且在某些情况下，在疾病症状期之后施用主题疗法。

在一些实施方案中，所治疗的衰老相关病患是个体的认知能力的衰老相关损害。认知能力或“认知”意指包括以下的思维过程：注意力和集中力、学习复杂的任务和概念、记忆力(短期和/或长期获取、保留和检索新信息)、信息处理(处理由五种感官收集的信息)、视觉空间功能(视觉感知、深度感知、使用心象、复制图纸、构造物体或形状)、产生和理解语言、言语流畅(唤词(word-finding))、解决问题、做出决定以及执行功能(计划和优先级划分)。“认知能力下降”意指这些能力中的一项或多项能力的逐渐下降，例如记忆力、语言、思维、判断力等的下降。“认知能力受损”和“认知障碍”意指相对于健康个体，例如年龄匹配的健康个体，或相对于该个体在较早的时间点(例如2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年或10年或更早)时的能力的认知能力的降低。“衰老相关认知障碍”意指通常与衰老相关的认知能力受损，包括例如与自然衰老过程相关的认知障碍，例如轻度认知障碍(M.C.I.)；以及与衰老相关的病症(即随着衰老递增而以递增频率被观察到的病症，例如神经变性病患，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、额颞痴呆、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化症、青光眼、肌强直性营养不良、血管性痴呆等)相关的认知障碍。

在一些实施方案中，所治疗的衰老相关病患是个体的运动能力的衰老相关损害。运动能力意指以下运动过程，其包括执行复杂的肌肉和神经动作以产生运动(例如产生小的或精确的运动(例如书写、系鞋带)的精细运动技能以及产生大运动(例如，步行、跑步、踢脚)的粗大运动技能)的能力。“运动下降”意指这些能力中的一项或多项能力的逐渐下降，例如精细运动或粗大运动技能的下降等。“受损的运动”和“运动障碍”意指相对于健康个体，例如年龄匹配的健康个体，或相对于该个体在较早的时间点(例如2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年或10年或更早)时的能力的运动能力/技能的下降。“衰老相关运动障碍”意指通常与衰老相关的运动能力受损或下降，包括例如与自然衰老过程相关的运动障碍以及与衰老相关的病症(即，随着衰老递增而以递增频率被观察到的病症，例如神经变性病患，诸如帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化等)相关的运动障碍或下降。

在一些实施方案中，所治疗的衰老相关病患是个体的神经炎症的的衰老相关增加。“神经炎症”意指神经系统对损伤、感染或神经变性疾病的生化和细胞响应。此类响应旨在通过涉及防御潜在危害的中枢神经系统免疫来减少触发因素。神经变性发生在中枢神经系统中，并表现出神经元结构和功能丧失的标志。神经炎性疾病或与神经炎性相关的病患或疾病，包括例如但不限于神经变性疾病，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化等。

包含血浆组分的血液制品。在实施主题方法时，将包含血浆组分的血液制品施用于有此需要的个体，例如患有认知障碍或运动障碍、神经炎症和/或年龄相关痴呆的个体或有患此类疾病的风险的个体。因此，根据本发明的实施方案的方法包括向至少有患认知障碍或运动障碍、神经炎症、神经变性疾病和/或年龄有关痴呆的风险或患有所述疾病的个体(“接受个体”或“接受者”)施用包含来自个体(“供体个体”或“供体”)的血浆组分的血液制品。“包含血浆组分的血液制品”意指源自血液的包含血浆的任何产品(例如全血、血浆或其级分)。术语“血浆”按其常规含义使用，是指血液的稻草色/淡黄色液体组分，其由约92％的水、7％的蛋白质(诸如如白蛋白、γ球蛋白、抗血友病因子和其它凝血因子以及1％的矿物质盐、糖、脂肪、激素和维生素组成。适用于主题方法的含血浆的血液制品的非限制性实例包括用抗凝剂(例如EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、肝素等)处理过的全血、通过过滤全血以去除白细胞(“白细胞滤除”)而产生的血液制品、由血浆除去法来源的(plasmapheretically-derived)或单采术来源的(apheretically-derived)血浆、新鲜冷冻血浆组成的血液制品、基本上由纯化血浆组成的血液制品以及基本上由血浆级分组成的血液制品。在一些情况下，所使用的血浆制品是非全血浆制品，这意味着该制品不是全血，因此至少在全血中存在这些成分的程度上，其缺乏全血中发现的一种或多种组分，诸如红细胞、白细胞等。在一些情况下，血浆制品基本上是(如果不是完全的话)无细胞的，其中在此类情况下，细胞含量可以为5％体积或更少，例如1％或更少，包括0.5％或更少，其中在一些情况下无细胞血浆级分是完全缺乏细胞的那些组合物，即它们不包括细胞。

包含血浆组分的血液制品的收集。本文描述的方法的实施方案包括施用包含血浆组分的血液制品，所述血浆组分可源自供体，包括人志愿者。术语“源于人的”可以指此类产品。从供体收集包含血浆的血液制品的方法是本领域公知的。(参见，例如，AABB TECHNICALMANUAL,(Mark A.Fung，等，编辑，第18版2014)，通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，捐献是通过静脉穿刺获得的。在另一个实施方案中，静脉穿刺仅是单个静脉穿刺。在另一个实施方案中，不使用盐水体积置换。在优选实施方案中，将血浆除去法过程用于获得包含血浆的血液制品。血浆除去法可包括去除重量调整后的体积的血浆，并使细胞成分返回供体。在优选实施方案中，在血浆除去法过程中使用柠檬酸钠以防止细胞凝结。在柠檬酸盐施用后，从供体收集的血浆的体积优选为690mL至880mL，并且优选与供体的重量协调。

3.血浆级分

第二次世界大战期间，对在士兵丧失大量血液时可用于战场的稳定血浆增溶剂产生了需要。因此，开发了制备冻干血浆的方法。然而，由于复原需要无菌水，因此在战斗情况下很难使用冻干血浆。作为替代方案，E.J.Cohn博士建议可以使用白蛋白，并制备了可立即引入用于治疗休克的即时可用的稳定溶液。(参见Johan，Current Approaches to thePreparation of Plasma Fractions in(Biotechnology of Blood)165(Jack Goldstein编辑，第1版1991))。Cohn博士的纯化血浆级分的方法利用冷乙醇的变性作用，并利用pH和温度的变化来实现分离。

本文所述方法的实施方案包括向受试者施用血浆级分。分级分离是籍以将某些蛋白质亚组与血浆分离的方法。分级分离技术是本领域已知的，并且依赖于Cohn等在20世纪40年代开发的步骤。(E.Cohn,Preparation and properties of serum and plasmaproteins.IV.A system for the separation into fractions of the protein andlipoprotein components of biological tissues and fluids.68J Am Chem Soc 459(1946)，通过引用并入本文)。该过程中涉及几个步骤，每个步骤都涉及导致选择性蛋白质沉淀的特定的乙醇浓度以及pH、温度和重量克分子渗透浓度改变。沉淀物也通过离心或沉淀分离。最初的“Cohn分级分离方法”涉及通过沉淀将蛋白质分离成五个级分，分别称为级分I、级分II+III、级分IV-1、级分IV-4和级分V。白蛋白是该过程最初鉴定的终点(级分V)产物。根据本发明的实施方案，每个级分(或来自先前分离步骤的流出物)包含或潜在地包含治疗上有用的蛋白级分。(参见Thierry Burnouf,Modern Plasma Fractionation,21(2)Transfusion Medicine Reviews 101(2007)；Adil Denizli,Plasma fractionation:conventional and chromatographic methods for albumin purification,4J.Biol.&Chem.315,(2011)；和T.Brodniewicz-Proba,Human Plasma Fractionation and theImpact of New Technologies on the Use and Quality of Plasma-derived Products,5Blood Reviews 245(1991),，以及美国专利第3869431号、第5110907号、第5219995号、第7531513和第8772461号，所述文献和美国专利通过此用并入本文)。可以调整上述实验参数以获得特定的蛋白质级分。

最近，分级分离已达到进一步的复杂性，并且因此组成本发明的另外的实施方案。最近这种复杂性的增加已通过以下方式发生：引入色谱法，导致从现有级分(如冷沉淀物、贫冷血浆(cryo-poor plasma)和Cohn级分)中分离出新蛋白质；通过整合色谱和乙醇分级分离过程提高IgG的回收率；以及病毒减少/灭活/去除。(同前)为了在生理pH和离子强度下捕获蛋白质，可使用阴离子交换色谱。这保持了蛋白质和/或蛋白质级分的功能活性。肝素和单克隆抗体也用于亲和色谱。本领域普通技术人员将认识到，可以调整上述参数以获得特定期望的含血浆蛋白的级分。

在本发明的实施方案中，在工业环境中分级血浆。将冷冻的血浆在1℃至4℃解冻。对解冻的血浆进行连续冷冻离心，并分离出冷沉淀物。将回收的冷沉淀物在-30℃或更低的温度下冷冻并储存。立即处理贫冷沉淀物(“贫冷”)血浆，以捕集(通过例如初级色谱)不稳定的凝血因子(诸如因子IX复合物)及其组分以及蛋白酶抑制剂(诸如抗凝血酶和C1酯酶抑制剂)。连续离心和沉淀分离可用于后续步骤。此类技术是本领域普通技术人员已知的，并且描述于例如美国专利第4624780号、第5219995号、第5288853号和美国专利申请第20140343255号和第20150343025号中，所述美国专利通过引用整体并入本文)。

在本发明的实施方案中，血浆级分可包括含有显著浓度的白蛋白的血浆级分。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分可包括含有相当浓度的IgG或静脉内免疫球蛋白(IGIV)(例如

)的血浆级分。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分可包括IGIV血浆级分，诸如已通过本领域普通技术人员公知的方法(例如，蛋白A介导的耗尽)基本上耗尽了免疫球蛋白(IgG)的(参见Keshishian,H.等，Multiplexed,Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma YieldsNovel Candidates for Early Myocardial Injury,Molecular&Cellular Proteomics,14at 2375-93(2015))。在另外的实施方案中，血浆级分可以是其中基本上所有凝血因子都被除去以便保留级分的功效并降低血栓形成风险的血浆级分。例如，血浆级分可以是2016年8月18日提交的美国专利第62/376,529号(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的血浆级分。

4.白蛋白制品

对于本领域普通技术人员而言，白蛋白血浆制品(“APP”)有两大类：血浆蛋白质级分(“PPF”)和人白蛋白溶液(“HAS”)。PPF源自具有比HAS更高的产率但最低白蛋白纯度低于HAS(对于PPF，>83％，并且对于HAS，>95％)的过程。(Production of human albuminsolution:a continually developing colloid,P.Matejtschuk等，British J.ofAnaesthesia 85(6):887-95,at 888(2000))。在一些情况下，PPF的白蛋白纯度介于83％和95％之间，或者介于83％和96％之间。白蛋白纯度可通过电泳或其它定量测定法(诸如，例如通过质谱法)确定。另外，一些人指出，PPF由于存在蛋白质“污染物”(诸如PKA)而具有不利方面。同前。因此，PPF制剂已不再作为白蛋白血浆制品普及，甚至已从某些国家的药典中除名。同前。与这些关注相反，本发明有益地利用了这些“污染物”。除了α、β和γ球蛋白以及上述的PKA以外，本发明的方法还利用了促进“污染物”中的另外的蛋白质或其它因子，所述另外的蛋白质或其它因子促进诸如神经发生、神经元细胞存活、改善的认知或运动功能以及减少的神经炎症等过程。

本领域技术人员将认识到，有或已经有数种PPF的商业来源(“商业PPF制剂”)。这些商业来源包括Plasma-Plex^TM PPF(Armour Pharmaceutical Co.,Tarrytown,NY)、Plasmanate^TM PPF(Grifols,Clayton,NC)、Plasmatein^TM(Alpha Therapeutics,LosAngeles,CA)和Protenate^TM PPF(Baxter Labs,Inc.Deerfield,IL)。

本领域技术人员还将认识到，有或已经有数种HAS的商业来源(“商业HAS制剂”)。这些商业来源包括Albuminar^TM(CSL Behring)、AlbuRx^TM(CSL Behring)、Albutein^TM(Grifols,Clayton,NC)、Buminate^TM(Baxatla,Inc.,Bannockburn,IL)、Flexbumin^TM(Baxatla,Inc.,Bannockburn,IL)和Plasbumin^TM(Grifols,Clayton,NC)。

a.血浆蛋白质级分(人)(PPF)

根据美国食品和药物管理局(“FDA”)，“血浆蛋白质级分(人)”或PPF是定义为“源自人血浆的由白蛋白和球蛋白组成的蛋白质的无菌溶液”的制品的专有名称。(联邦法规“CFR”21CFR 640.90的代码，其通过引用并入本文)。PPF的来源材料是从按照21CFR 640.1–640.5(通过引用并入本文)规定制备的全血或按照21CFR 640.60–640.76(通过引用并入本文)规定制备的源血浆中回收的血浆。

对PPF进行测试，以确定其符合按照21CFR 640.92(通过引用并入本文)的以下标准：

(a)最终制品应为5.0+/-0.30％的蛋白质溶液；和

(b)最终制品中的总蛋白应由至少83％的白蛋白和不超过17％的球蛋白组成。γ-球蛋白占蛋白质总量的比例不得超过1％。通过已由食品药品管理局生物制品评估与研究中心主任为每个制造商批准的方法测定蛋白质组成。

如本文中所用，“血浆蛋白质级分”或“PPF”是指源自人血浆的由白蛋白和球蛋白组成的蛋白质无菌溶液，其中如通过电泳测定的，白蛋白含量为至少83％且球蛋白(包括α1、α2、β和γ球蛋白)和其它血浆蛋白不超过17％，并且γ球蛋白不超过1％。(Hink,J.H.,Jr.等，Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma ProteinFraction,VOX SANGUINIS 2(174)(1957))。PPF也可以指固体形式，当悬浮在溶剂中时，其具有相似的组成。总球蛋白级分可通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定。(Busher,J.,Serum Albumin and Globulin,CLINICAL METHODS:THE HISTORY,PHYSICAL,ANDLABORATORY EXAMINATIONS,Chapter 10,Walker HK,Hall WD,Hurst JD，编辑(1990))。

b.白蛋白(人)(HAS)

根据FDA，“白蛋白(人)”(在本文中也称为“HAS”)是定义为“源自人血浆的白蛋白的无菌溶液”的制品的专有名称。(联邦法规“CFR”21CFR 640.80的代码，其通过引用并入本文)。白蛋白(人)的来源材料是从按照21CFR 640.1–-640.5(通过引用并入本文)规定制备的全血或按照21CFR 640.60–-640.76(通过引用并入本文)规定制备的源血浆中回收的血浆。白蛋白(人)的其它要求列于21CFR 640.80–640.84(通过引用并入本文)中。

对白蛋白(人)进行测试，以确定其符合按照21CFR 640.82的以下标准：

(a)蛋白质浓度最终制品应符合以下浓度之一：4.0+/-0.25％；5.0+/-0.30％；20.0+/-1.2％；和25.0+/-1.5％的蛋白质溶液。

(b)蛋白质组成。如通过已由食品药品管理局生物制品评估与研究中心主任为每个制造商批准的方法所测定的，最终制品中至少96％的总蛋白质应为白蛋白。

如本文中中所用，“白蛋白(人)”或“HAS”是指源自人血浆的由白蛋白和球蛋白组成的蛋白质的无菌溶液，其中白蛋白含量为至少95％且球蛋白(包括α1、α2、β和γ球蛋白)和其它血浆蛋白不超过5％。HAS也可以指固体形式，当悬浮在溶剂中时，其具有相似的组成。总球蛋白级分可通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定。

如本领域普通技术人员可以认识到的，PPF和HAS级分也可被冷冻干燥或呈其它固体形式。具有适当添加剂的此类制剂可用于制备例如片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。可通过使固体形式溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(诸如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯)中来将所述固体配制成供注射的制剂；并且若需要，含有常规添加剂诸如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

5.凝血因子减少的级分

本发明的另一个实施方案使用从其去除基本上所有凝血因子以便保留级分的功效并降低血栓形成风险的血浆级分。方便地，血液制品可源自年轻供体或年轻供体的集合，并且可使其不含IgM，以提供与ABO相容的年轻血液制品。目前，输注的血浆与ABO血型匹配，因为天然存在的针对A和B抗原的抗体的存在会导致输血反应。当患者接受与ABO不匹配的血浆时，IgM似乎负责输血反应。从血液制品或级分中除去IgM有助于消除被施予本发明的血液制品和血浆级分的受试者中的输血反应。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防受试者的衰老相关病患诸如认知障碍或运动障碍、神经炎症或神经变性的方法。该方法包括：向受试者施用源自个体或个体群的全血的血液制品或血液级分，其中所述血液制品或血液级分基本上不含(a)至少一种凝血因子和/或(b)IgM。在一些实施方案中，血液制品或血液级分所源自的一个或多个个体是年轻个体。在一些实施方案中，血液制品基本上不含至少一种凝血因子和IgM。在某些实施方案中，血液制品基本上不含纤维蛋白原(因子I)。在另外的实施方案中，血液制品基本上缺乏红细胞和/或白细胞。在另外的实施方案中，血液制品基本上是无细胞的。在其它实施方案中，血液制品不含血浆。2016年8月18日提交的美国专利申请第62/376,529号进一步支持本发明的此类实施方案，所述专利申请通过引用整体并入本文。

6.富含蛋白质的血浆蛋白制品处理

本发明的另外的实施方案使用与PPF相比具有降低的白蛋白浓度，但是具有增加量的球蛋白和其它血浆蛋白(被称为“污染物”)的血浆级分。与PPF、HAS、流出物I和流出物II/III一样，所述实施方案都有效地不含凝结因子。在下文中将此类血浆级分称为“富含蛋白质的血浆蛋白制品”。例如，本发明的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由82％的白蛋白和18％的α、β和γ球蛋白以及其它血浆蛋白组成。本发明的另一个实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由81％的白蛋白和19％的α、β和γ球蛋白和/或其它血浆蛋白组成。本发明的另一个实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由80％的白蛋白和20％的α、β和γ球蛋白和/或其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由70％-79％的白蛋白和相应的21％-30％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由60％-69％的白蛋白和相应的31％-40％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由50％-59％的白蛋白和相应的41％-50％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由40％-49％的白蛋白和相应的51％-60％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由30％-39％的白蛋白和相应的61％-70％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由20％-29％的白蛋白和相应的71％-80％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由10％-19％的白蛋白和相应的81％-90％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由1％-9％的白蛋白和相应的91％-99％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由0％的白蛋白和100％的α、β和γ球蛋白和其它血浆蛋白组成。

上述本发明的实施方案还可具有1-5％的总γ球蛋白浓度。

血浆级分中蛋白质的特定浓度可使用相关领域普通技术人员公知的技术来确定。作为示例而非限制，此类技术包括电泳、质谱、ELISA分析和蛋白质印迹分析。

7.血浆级分的制备

制备PPF和其它血浆级分的方法是本领域普通技术人员公知的。本发明的实施方案允许将用于制备人血浆蛋白质级分的血液收集在具有柠檬酸盐或抗凝柠檬酸盐葡萄糖溶液的烧瓶中以抑制凝固，并按照Hink等公开的方法进一步分离级分I、II+III、IV和PPF。(参见Hink,J.H.,Jr.等，Preparation and Properties of a Heat-Treated HumanPlasma Protein Fraction,VOX SANGUINIS 2(174)(1957)，通过引用并入本文)。按照这种方法，可将混合物收集到2–8℃。然后可通过在7℃下离心分离血浆，将其除去，并在-20℃下保存。然后可将血浆在37℃解冻并分级分离，优选在从-20℃储存中取出后的八小时内进行。

可使用pH 7.2的8％乙醇和-2至-2.5℃的温度将血浆从级分I分离，其中蛋白浓度为5.1至5.6％。可在将血浆温度降至-2℃的过程中利用喷嘴以例如450mL/分钟的速率添加冷的53.3％乙醇(176mL/L血浆)与乙酸盐缓冲液(用H₂O将200mL 4M乙酸钠，230mL冰醋酸定容至1L)。可通过超速离心分离级分I并从流出物(流出物I)中除去级分I。可按照本领域普通技术人员公知的方法从级分I获得纤维蛋白原。

通过将流出物调节至pH为6.8，温度为-6℃的21％乙醇并且蛋白质浓度为4.3％来从流出物I分离级分II+III。在将流出物I的温度降至-6℃的过程中，可以使用喷嘴以例如500mL/分钟的速率添加冷的95％乙醇(176mL/L流出物I)和10M乙酸用于pH调节。可通过在-6℃下离心除去沉淀物(级分II+III)。可使用本领域普通技术人员公周知的方法从级分II+III获得γ球蛋白。

通过将流出物调节至pH为5.2，温度为-6℃的19％乙醇并且蛋白质浓度为3％来从流出物II+III(“流出物II/III”)分离级分IV-1。可使用喷嘴添加H₂0和用于pH调节的10M乙酸，同时将流出物II/III保持在-6℃持续6小时。可将沉淀的级分VI-1在-6℃下静置6小时，然后通过在相同温度下离心与流出物分离。通过将乙醇浓度调节至30％(在pH 4.65，温度-7℃下)并且蛋白质浓度为2.5％来从流出物IV-1回收稳定的血浆蛋白质级分。这可通过用冷酸-醇(两份2M乙酸和一份95％的乙醇)调节流出物IV-1的pH值来实现。在保持-7℃的温度的同时，向每升经调节的流出物IV-1中添加170mL冷乙醇(95％)。可将沉淀的蛋白质静置36小时，然后在-7℃下通过离心去除。

可干燥(例如通过冷冻干燥)回收的蛋白质(稳定的血浆蛋白质级分)以去除酒精和H20。可将所得的干燥粉末溶于无菌蒸馏水中，例如使用15升水/kg的粉末，并用1M NaOH将溶液的pH调节至7.0。可通过添加含有乙酰色氨酸钠、辛酸钠和NaCl的无菌蒸馏水(调节至乙酰色氨酸终浓度为0.004M、辛酸终浓度为0.004M以及钠终浓度为0.112M)来使蛋白质的终浓度达到5％。最后，可将溶液在10℃过滤以获得澄清溶液，然后在60℃热处理至少10小时以灭活病原体。

本领域普通技术人员将认识到，上述每种不同的级分和流出物可以与本发明的方法一起用于治疗疾病。例如但不限于，流出物I或流出物II/III可用于治疗诸如认知、运动和神经变性病症的疾病，并且是本发明的实施方案。

制备血浆级分和血浆蛋白质级分(PPF)的前述方法仅是示例性的，并且仅涉及本发明的实施方案。本领域普通技术人员将认识到这些方法可以改变。例如，在本发明的不同实施方案和方法中，可以调节pH、温度和乙醇浓度等，以产生血浆级分和血浆蛋白质级分的不同变化。在另一个实例中，本发明的另外的实施方案设想了使用纳米过滤从血浆级分和血浆蛋白质级分中去除/灭活病原体。

本发明的另外的实施方案设想了使用和/或包含另外的血浆级分的方法和组合物。例如，本发明，除其它以外，证明了特定浓度的白蛋白对于改善认知或运动活动不是至关重要的。因此，本发明设想了具有降低的白蛋白浓度的级分，例如具有低于83％的白蛋白的级分。

8.治疗

本文所述的本发明的方法的方面包括用例如如上所述的包含血浆的血液制品(诸如血浆级分)治疗受试者。实施方案包括用包含血浆的血液制品治疗人受试者。本领域技术人员将认识到，用包含血浆的血液制品治疗受试者的方法是本领域公认的。作为示例而非限制，本文描述的本发明的方法的一个实施方案包括向受试者施用新鲜冷冻血浆以治疗和/或预防认功能障碍知或运动障碍、神经炎症、神经变性和/或年龄-相关痴呆。在一个实施方案中，立即，例如在从供体收集的约12-48小时内向患有认知障碍或运动障碍、神经炎症、神经变性和/或年龄相关痴呆或有患有所述疾病的风险的个体施用包含血浆的血液制品。在此类情况下，可将所述制品在例如0-10℃的冷藏条件下存储。在另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆是已经在-18℃或更冷的条件下冷冻储存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且一旦解冻，在解冻过程开始后60-75分钟向受试者施用所述血浆。每个受试者优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200-250mL)，所述新鲜冷冻血浆优选源自预定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)年轻个体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)相同性别的供体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)年龄在18至22岁的范围内的供体捐献。

在本发明的实施方案中，在按血型捐献后，筛选包含血浆的血液制品。在本发明的另一个实施方案中，按照21CFR 640.33的要求和FDA指南文件中包含的建议，筛选包含血浆的血液制品的诸如HIV I&II、HBV、HCV、HTLV I&II、抗-HBc的传染病病原体。

在本发明的另一个实施方案中，用血浆级分治疗受试者。在本发明的实施方案中，血浆级分为PPF或HAS。在本发明的另外的实施方案中，血浆级分是商业HAS制剂的商业PPF制剂之一。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是源自特定年龄范围的个体(诸如年轻个体)的集合的PPF或HAS，或者是已经历额外的分级分离或加工的经修饰的PPF或HAS级分(例如，一种或多种特定蛋白已被部分或基本上去除的PPF或HAS)。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是已基本上耗尽了免疫球蛋白(IgG)的IGIV血浆级分。“基本上被耗尽的”或使特定蛋白质(诸如IgG)“基本上去除”的血液级分是指这样的血液级分，其含有如使用本领域公知的标准测定所测量的存在于参考制品或全血浆中的量的少于约50％，诸如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、检测不到的水平或这些值之间的任何整数。

9.施用

本文所述的本发明的方法的方面包括用例如如上所述的包含血浆的血液制品(诸如血浆或血浆级分)治疗受试者。实施方案包括用包含血浆的血液制品治疗人受试者。本领域技术人员将认识到，用包含血浆的血液制品治疗受试者的方法是本领域公认的。作为示例而非限制，本文描述的本发明的方法的一个实施方案包括向受试者施用新鲜冷冻血浆以治疗和/或预防认功能障碍知或运动障碍、神经炎症、神经变性和/或年龄-相关痴呆。在一个实施方案中，立即，例如在从供体收集的约12-48小时内向患有认知障碍或运动障碍、神经炎症、神经变性和/或年龄相关痴呆或有患有所述疾病的风险的个体施用包含血浆的血液制品。在此类情况下，可将所述制品在例如0-10℃的冷藏条件下存储。在另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆是已经在-18℃或更冷的条件下冷冻储存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且一旦解冻，在解冻过程开始后60-75分钟向受试者施用所述血浆。每个受试者优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200-250mL)，所述新鲜冷冻血浆优选源自预定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)年轻个体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)相同性别的供体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)年龄在18至22岁的范围内的供体捐献。

在本发明的实施方案中，在按血型捐献后，筛选包含血浆的血液制品。在本发明的另一个实施方案中，按照21CFR 640.33的要求和FDA指南文件中包含的建议，筛选包含血浆的血液制品的诸如HIV I&II、HBV、HCV、HTLV I&II、抗-HBc的传染病病原体。

在本发明的另一个实施方案中，用血浆级分治疗受试者。在本发明的实施方案中，血浆级分为PPF或HAS。在本发明的另外的实施方案中，血浆级分是商业HAS制剂的商业PPF制剂之一。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是源自特定年龄范围的个体(诸如年轻个体)的集合的PPF或HAS，或者是已经历额外的分级分离或加工的经修饰的PPF或HAS级分(例如，一种或多种特定蛋白已被部分或基本上去除的PPF或HAS)。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是已基本上耗尽了免疫球蛋白(IgG)的IGIV血浆级分。“基本上被耗尽的”或使特定蛋白质(诸如IgG)“基本上去除”的血液级分是指这样的血液级分，其含有如使用本领域公知的标准测定所测量的存在于参考制品或全血浆中的量的少于约50％，诸如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、检测不到的水平或这些值之间的任何整数。

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍或运动障碍、神经变性或神经炎症的受试者。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测受试者的改善的认知功能或运动功能、或神经炎症的减少或神经发生的增加。本发明的另一个实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍或运动障碍、神经变性或神经炎的受试者，其中以相对于最近施用的剂量，在达到血浆蛋白或血浆级分蛋白的平均或中位半衰期后导致改善的认知或运动功能、减少的神经炎症或改善的神经发生的方式(在本文中称为“脉冲式给药(Pulsed Dosing)”或“脉冲给药(Pulse Dosed)”)施用血浆或血浆级分。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案来施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后至少3天监测受试者的改善的认知或运动功能、减少的神经炎症或改善的神经发生。本发明的另外的实施方案包括通过至少连续3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的给药方案来施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后至少3天监测受试者的改善的认知或运动功能、减少的神经炎症或增加的神经发生。本发明的仍然另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后监测当已达到所述蛋白质在血浆或血浆级分中的平均半衰期时的认知或运动功能改善、减少的神经炎症或增加的神经发生。本发明的另一个实施方案包括通过非连续的2至14天的给药方案施用血浆或血浆级分，其中剂量之间的每个间隙可各自为0-3天。

在一些情况下，根据本发明的脉冲式给药包括第一组剂量(例如，如上所述的)的施用，随后是不给药期，例如“无给药期”，这之后接着是另一剂量或另一组剂量的施用。该“无给药”期的持续时间可以变化，但是在一些实施方案中，为7天或更长时间，诸如10天或更长时间，包括14天或更长时间，其中在一些情况下，无给药期的范围为15天至365天，诸如30天至90天，包括30天至60天。这样，该方法的实施方案包括血浆制品的非长期(即，非连续)给药，例如非长期施用。在一些实施方案中，根据需要将脉冲式给药，随后进行无给药期的模式重复多次，其中在一些情况下，将该模式持续1年或更长时间，诸如2年或更长时间，直至并包括受试者的一生。本发明的另一个实施方案包括通过以下给药方案施用血浆或血浆级分：连续5天施用，2-3天无给药期，随后连续2-14天施用。

在生物化学上，活性剂的“有效量”或“有效剂量”意指将抑制、拮抗、减少、降低或抑制约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多或50％或更多，在一些情况下60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多，在一些情况下约100％(即，至可以忽略的量)，以及在一些情况下，逆转认知障碍、神经炎症、神经变性或年龄相关痴呆症的进展的活性剂的量。

10.血浆蛋白质级分

在实施本发明的方法时，向受试者施用血浆级分。在实施方案中，血浆级分是血浆蛋白质级分(PPF)。在另外的实施方案中，PPF选自商业PPF制剂。

在另一个实施方案中，PPF由如通过电泳测定的88％的正常人白蛋白、12％的α和β球蛋白以及不超过1％的γ球蛋白组成。用于实施本发明方法的该实施方案的另外的实施方案包括，例如，作为用碳酸钠缓冲并用0.004M辛酸钠和0.004M乙酰色氨酸稳定的5％的PPF溶液的实施方案。另外的制剂，包括改变溶液中PPF的百分比(例如，约1％至约10％，约10％至约20％，约20％至25％，约25％至30％)以及溶剂和稳定剂的浓度的那些制剂可用于实施本发明的方法。

11.特定供体年龄的血浆级分

本发明的另外的实施方案包括施用源自某些年龄范围的个体的血浆的血浆蛋白质级分。实施方案包括施用源自年轻个体的血浆的PPF或HAS。在本发明的另一个实施方案中，年轻个体具有单个特定年龄或特定年龄范围。在另一个实施方案中，供体的平均年龄小于受试者的平均年龄或小于接受治疗的受试者的平均年龄。

本发明的某些实施方案包括合并来自特定年龄范围的个体的血液或血浆，并如上所述分级分离血浆以获得血浆蛋白质级分制品，诸如PPF或HAS。在本发明的替代实施方案中，从适合特定年龄范围的特定个体获得血浆蛋白质级分或特定血浆蛋白质级分。

12.适应症

主题方法以及含血浆的血液制品和级分可用于治疗(包括预防)衰老相关病患，诸如个体的认知或运动能力受损，例如认知障碍，包括(但不限于)年龄相关痴呆、免疫病患、癌症以及身体和功能下降；以及运动障碍，诸如(但不限于)帕金森氏病。患有将受益于利用主题含血浆的血液制品的治疗(例如，通过本文公开的方法)的衰老相关认知障碍或运动障碍、神经炎症和/或神经变性或有发展所述疾病的风险的个体，包括年龄为约50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，以及100岁或以上(即，约50岁至100岁之间，例如50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或约100岁)，并患有与自然衰老过程相关的认知障碍或运动障碍、神经炎症和/或神经变性(例如，轻度认知障碍(M.C.I.)的个体；以及年龄为约50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，通常不超过100岁，即约50岁与90岁之间，例如50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或约100岁，尚未开始表现出认知障碍或运动障碍、神经炎症和/或神经变性的症状的个体。由自然衰老引起的认知障碍和运动障碍、神经炎症和/或神经变性损伤的实例包括：

a.轻度认知障碍(M.C.I.)。轻度认知障碍是对认知的适度破坏，表现为关于记忆力或其它心理功能(诸如计划、遵循指示或做决策)的问题，所述问题随时间推移而恶化，而总体心理功能和日常活动并未受到损害。因此，尽管通常不会发生明显的神经元死亡，但衰老的脑中的神经元容易受到与亚致死年龄相关的结构、突触完整性和突触处的分子加工的变化影响，所有这些变化都会损害认知功能。

患有将受益于利用主题含血浆的血液制品或级分的治疗(例如，通过本文公开的方法)的衰老相关认知障碍或有发展所述疾病的风险的个体，还包括患有由衰老相关病症引起的认知障碍的任何年龄的个体；以及经诊断患有通常伴有认知障碍的衰老相关病症的任何年龄的个体，其中该个体尚未开始表现出认知障碍的症状。此类衰老相关病症的实例包括以下疾病：

b.阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病是一种认知功能的进行性，无可避免的丧失，与大脑皮层和皮层下灰质中过多数量的老年斑相关，所述老年斑还含有b-淀粉样蛋白和由tau蛋白组成的神经原纤维缠结。普通形式会影响60岁以上的人，并且其发病率会随着年龄的增长而增加。其占老年人痴呆症的65％以上。

阿尔茨海默氏病的病因尚不清楚。在约15％至20％的病例中，所述疾病在家族中传播。其余的所谓散发病例有一些遗传决定因素。所述疾病在大多数早期发作和一些晚期发作的病例中具有常染色体显性遗传模式，但晚年外显率变化很大。环境因素是积极调查的重点。

在疾病过程中，突触以及最终神经元在大脑皮层、海马和皮层下结构(包括Meynert的基底核中的选择性细胞丧失)、蓝斑和中缝背核内丢失。大脑葡萄糖的使用和灌注在脑的一些区域(早期疾病的顶叶和颞皮层，晚期疾病的前额叶皮层)中减少。神经炎斑或老年斑(由淀粉样核周围的神经突、星形胶质细胞和神经胶质细胞组成)和神经原纤维缠结(由成对的螺旋状细丝组成)在阿尔茨海默氏病的发病机理中起作用。老年斑和神经原纤维缠结随着正常衰老发生，但它们在阿尔茨海默氏病患者中更加普遍得多。

c.帕金森氏病。

帕金森氏病(PD)是特发性、缓慢进行性、变性CNS病症，其特征在于缓慢而减少的运动(运动迟缓)、肌肉僵硬、静止性震颤(肌张力障碍)、肌肉冻结(muscle freezing)和姿势不稳。最初被认为主要是运动障碍，但现在已经认识到PD也可导致抑郁和情绪变化。PD还可能影响认知、行为、睡眠、自主功能和感觉功能。最常见的认知障碍包括注意力和集中力、工作记忆、执行功能、语言产生和视觉空间功能受损。PD的特征是与运动功能下降有关的症状通常先于与认知功能碍相关的那些症状，这有助于疾病的诊断。

在原发性帕金森氏病中，黑质、蓝斑和其它脑干多巴胺能细胞群的色素神经元退化。原因未知。投射到尾状核和壳核的黑质神经元的丧失导致这些区域中神经递质多巴胺的耗尽。发病通常在40岁以后，在老年人群中发病率逐渐增加。

每年约有60,000美国人被新诊断出帕金森氏病，目前影响约100万美国人。尽管PD本身并不是致命性的，但其并发症是美国死亡的第十四大原因。目前，PD不能治愈，一般在较晚期严重病例中通过手术治疗以控制症状。

PD的治疗选项包括药物施用以帮助控制运动缺陷。这些选项增加或替代在PD患者大脑中浓度低的神经递质多巴胺。此类药物包括：卡比多巴/左旋多巴(其在脑中产生更多的多巴胺)；阿扑吗啡、普拉克索、罗匹尼罗和罗汀汀(多巴胺激动剂)；司来吉兰和雷沙吉兰(防止多巴胺分解的MAO-B抑制剂)；恩他卡朋和托卡朋(儿茶酚-O-甲基转移酶[COMT]抑制剂，其可使大脑中更多左旋多巴可用)；苯扎托品和苯海索(抗胆碱能药)；和金刚烷胺(控制震颤和僵硬)。通常还开具运动/物理疗法以帮助维持身体和精神功能。

然而，当前的治疗选项是治疗PD的症状，不能治愈，并且不能阻止疾病进展。另外，当前的药物在晚期PD中倾向于失去功效。开处方最多的药物左旋多巴通常在开始用药后5至10年内产生不良反应。这些不良反应可以很严重，并可导致剂量之间的运动波动和运动控制的不可预测的摆动以及猝动/抽搐(运动障碍)，这难以控制，甚至与PD自身症状一样致残。因此，仍然需要具有新作用机制的新疗法，其可以与目前的PD药物一起施用或与之联合使用。

d.震颤麻痹。继发性震颤麻痹(也称为非典型帕金森氏病或帕金森氏病+)是由于其它特发性变性疾病、药物或外源毒素引起的基底神经节中多巴胺的丧失或干扰所述多巴胺的作用而导致的。继发性震颤麻痹最常见的原因是摄入抗精神病药或利血平，所述药物通过阻断多巴胺受体而产生震颤麻痹。较少见的原因包括一氧化碳或锰中毒、脑积水、结构性病变(肿瘤、影响中脑或基底神经节的梗塞)、硬脑膜下血肿和变性病症(包括黑质纹状体变性)。某些疾病，如进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底节变性(CBD)和路易体痴呆(DLB)，在可产生特定诊断所必需的主要症状之前，可以表现出震颤麻痹症状，从而可被标记为“震颤麻痹”。

e.额颞痴呆。额颞痴呆(FTD)是由于大脑额叶的逐渐恶化而导致的病患。随着时间的流逝，变性可进展到颞叶。在发病率上仅次于阿尔茨海默氏病(AD)，FTD占早老性痴呆病例的20％。根据受累患额叶和颞叶的功能，可将症状分为三组：

行为变型FTD(bvFTD)，其症状一方面包括嗜睡和自发性，另一方面则具有去抑制性；进行性非流利性失语症(PNFA)，其中观察到由于发音困难、语音和/或句法错误而导致的语音流利性下降，但词语理解能力得到保持；以及语义痴呆症(SD)，其中患者保持流利的正常语音和句法，但在命名和单词理解方面却越来越困难。对于所有FTD患者常见的其它认知症状包括执行功能和专注能力受损。其它认知能力(包括知觉、空间技能、记忆力和实践能力)通常保持不变。可通过在结构MRI扫描中观察到额叶显露和/或颞叶前萎缩来诊断FTD。

存在许多形式的FTD，可使用主题方法和组合物治疗或预防其中任何一种。例如，额颞叶性痴呆的一种形式是语义性痴呆(SD)。SD的特征在于语言和非语言区域域中都失去了语义记忆。SD患者经常表现出唤词困难的抱怨。临床体征包括流利型失语症、命名障碍、单词含义理解能力受损以及相关的视觉失认(无法匹配语义相关的图片或物体)。随着疾病进展，通常观察到与在额颞痴呆中观察到的那些行为和人格变化类似的行为和人格变化，尽管已经描述了几乎没有后期行为症状的“纯”语义性痴呆的病例。结构MRI成像显示颞叶萎缩(主要在左侧)的特征性模式，其中下部受累大于上部受累，颞叶前部萎缩大于后部萎缩。

作为另一个实例，额颞痴呆的另一种形式是皮克氏病(PiD，也称为PcD)。该疾病的典型特征是神经元中tau蛋白的积累，积累成银染的球形聚集物，称为“皮克体”。症状包括语言丧失(失语症)和痴呆。眶额功能障碍患者可以变得具有攻击性并且不适合社会。他们可能会窃取或表现出强迫或重复的刻板行为。背内侧或背外侧额叶功能障碍患者可能表现出缺乏关注、情感冷漠或自发性降低。患者可表现出缺乏自我监控、异常的自我意识以及无法理解含义。双侧后外侧眶额皮层和右前脑岛中灰质丢失患者可能表现出进食行为的改变，诸如病理性喜好甜食(pathologic sweet tooth)。在眶额前外侧皮层中具有更多局灶性灰质丢失的患者可能会发生食欲过盛。虽然最初可以缓解一些症状，但疾病继续发展，并且患者通常在2至10年内死亡。

f.亨廷顿氏病。亨廷顿氏病(HD)是遗传性进行性神经变性病症，其特征在于情绪、行为和精神异常的发展；智力或认知功能丧失；以及运动异常(运动障碍)。HD的经典体征包括舞蹈病的发展-可能影响面部、手臂、腿部或躯干的非自愿、快速、不规则、不平稳移动-以及认知能力下降，包括逐渐丧失思维加工能力和后天智力。可能有记忆力、抽象思维和判断力受损；对时间、地点或身份的不当感知(定向障碍)；增强的躁动；和人格变化(人格解体)。尽管症状通常在生命的第四或第五个十年中变得明显，但发病年龄是可变的，范围从儿童早期至成年晚期(例如70多岁或80多岁)。

HD作为常染色体显性性状在家族中传递。该病症是由于4号染色体上的基因(4p16.3)中编码的指令的异常长的序列或“重复”而发生的。与HD相关的神经系统功能的逐步丧失是由于大脑某些区域(包括基底神经节和大脑皮层)中的神经元丧失所致。

g.肌萎缩性侧索硬化。肌萎缩性侧索硬化(ALS)是快速发展的，一律致命的神经系统疾病，其会攻击运动神经元。最初最常在手中以及较少在脚上发现肌无力和萎缩以及前角细胞功能障碍的体征。发病部位是随机的，进展是不对称的。抽筋很常见，并且可能先于虚弱。很少有患者能够存活30年；发病后3年内50％死亡，5年内20％存活，10年内10％存活。

诊断特征包括在成年中期或晚期期间发作以及进行性、全身性运动受累而无感觉异常。直至疾病晚期神经传导速度才不正常。最近的研究也记录了认知障碍的表现，尤其是即时言语记忆、视觉记忆、语言和执行功能的下降。

甚至在ALS患者的正常出现的神经元中，也报告了细胞体面积、突触数量和总突触长度的减少。已有人提出，当活性区的可塑性达到其极限时，突触的持续丧失会导致功能受损。促进新突触的形成或防止突触丧失可以维持这些患者的神经元功能。

h.多发性硬化。多发性硬化(MS)的特征在于CNS功能障碍的各种症状和体征，并有缓解和反复恶化。最常表现的症状是一个或多个肢体中、躯干中或脸部一侧上的感觉异常；腿或手的无力或笨拙；或视觉障碍，例如一只眼睛的部分失明和疼痛(眼球后视神经炎)、视力昏暗或暗点。常见的认知障碍包括记忆(获取、保留和检索新信息)、注意力和集中力(特别是注意力分散)、信息处理、执行功能、视觉空间功能和言语流畅性受损。常见的早期症状是眼麻痹，导致双视(复视)、一个或多个肢体的短暂无力、肢体轻度僵硬或异常易疲劳、轻微步态不稳(minor gait disturbances)、膀胱控制困难、眩晕和轻度情绪障碍；所有这些都表明分散性CNS受累，并且通常在识别出该疾病之前数月或数年发生。过热可加剧症状和体征。

病程变化很大，不可预测，并且在大多数患者中是间歇性的。起初，数月或数年的缓解可分开发作，尤其是当疾病始于眼球后视神经炎时。然而，一些患者发作频繁且很快丧失行为能力；对于少数患者，过程可以迅速进行。

i.青光眼。青光眼是影响视网膜神经节细胞(RGC)的常见神经变性疾病。有证据支持分区变性程序(compartmentalized degeneration programs)在突触和树突中(包括在RGC中)中的存在。最近的证据还表明，老年人的认知障碍与青光眼之间存在相关性(YochimBP等Prevalence of cognitive impairment,depression,and anxiety symptoms amongolder adults with glaucoma.J Glaucoma.2012；21(4):250-254)。

j.强直性肌营养不良。强直性肌营养不良(DM)是常染色体显性遗传性多系统病症，其特征在于营养不良性肌无力和肌强直。分子缺陷是染色体19q上肌强直素蛋白激酶基因的3'非翻译区的扩大的三核苷酸扩增(CTG)重复。任何年龄均可出现症状，并且临床严重程度范围很广。肌强直在手部肌肉中很明显，即使在轻度情况下，上睑下垂也很常见。在严重的情况下，会出现明显的外周肌无力，通常伴有白内障、早秃、哈奇相(hatchet facies)、心律不齐、睾丸萎缩和内分泌异常(例如,糖尿病)。智力迟钝在严重的先天性形式中很常见，而在较轻的成人形式的病症中观察到与衰老相关的额叶和颞叶认知功能下降，尤其是语言和执行功能下降。严重受累的人在其50多岁早期死亡。

k.痴呆。痴呆描述了一类具有严重影响思维和社交能力，足以干扰日常功能的症状的病症。除了上文论述的衰老相关病症的晚期阶段中观察到的痴呆之外，痴呆的其它实例还包括如下所述的血管性痴呆和具有路易体的痴呆。

在血管性痴呆或“多发性梗塞性痴呆”中，认知障碍是由脑的血液供应问题引起的，通常是由一系列轻度中风，或者有时在其它较小的中风之前或之后出现的一个大中风引起的。血管病变可以是弥漫性脑血管疾病(诸如小血管疾病)或局灶性病变或两者的结果。患有血管性痴呆的患者在急性脑血管事件后出现急性或亚急性认知障碍，此后观察到进行性认知功能下降。认知障碍与在阿尔茨海默氏病中观察到的那些认知障碍相似，包括语言、记忆、复杂的视觉加工或执行功能受损(尽管大脑中的相关变化并非归因于AD病理，而是归因于大脑中长期血流减少)，最终导致痴呆。单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)神经成像可结合涉及精神状态检查的评估用于确认多发性梗塞性痴呆的诊断。

路易体痴呆(DLB，也以包括路易体痴呆、弥漫性路易体病、皮质路易体病和路易型老年性痴呆在内的多种其它名称而为人所知)是一种在解剖学上以路易体(α-突触核蛋白和遍在蛋白的团块)在在神经元中的存在(可在死后脑组织学中检测到的)为特征的痴呆类型。其主要特征是认知能力下降，尤其是执行功能的下降。警觉性和短期记忆将上升和下降。

对生动细致的画面的持续或反复出现的视幻觉通常是早期诊断症状。DLB早期常常与阿尔茨海默氏病和/或血管性痴呆相混淆，尽管其中阿尔茨海默氏病通常相当缓慢地开始，DLB通常具有迅速或急性的发作。DLB症状还包括类似于帕金森氏病的运动症状。DLB与有时在帕金森氏病中发生的痴呆症的区别在于其中痴呆症状相对于帕金森氏病症状出现的时间范围。当痴呆在帕金森氏病发作后一年以上发作时，可诊断为痴呆性帕金森氏病(POD)。当认知症状在帕金森氏病症状出现的同时或一年之内开始时，诊断为DLB。

l.进行性核上性麻痹。进行性核上性麻痹(PSP)是脑部病症，其引起关于步态和平衡的控制的严重的进行性问题以及复杂的眼球运动和思维问题。该疾病的经典体征之一是无法正确地瞄准眼睛，这是由于协调眼球运动的脑区域中的病变而引起的。一些个体将此效应描述为模糊。受累的个体经常表现出情绪和行为的改变，包括抑郁和情感冷漠以及进行性轻度痴呆。所述疾病的长名表示该疾病缓慢地开始，并持续恶化(进行性)，并通过破坏称为核的豌豆大小的结构上方的大脑某些部位(核上)(其控制眼球运动)而导致无力(麻痹)。PSP在1964年首次被描述为一种独特的病症，当时三位科学家发表了将该病患与帕金森氏病相区分的论文。其有时被称为Steele-Richardson-Olszewski综合征，反映了定义该病症的科学家的组合名字。尽管PSP逐渐恶化，但没有人死于PSP本身。

m.共济失调。患有共济失调的人在协调方面存在问题，因为控制运动和平衡的神经系统部分受到影响。共济失调可以影响手指、手、手臂、腿、身体、言语和眼球运动。共济失调一词通常用于描述不协调的症状，其可与感染、损伤、其它疾病或中枢神经系统的变性改变相关。共济失调还用于表示一组称为遗传性和散发性共济失调的神经系统的特定变性疾病，所述疾病是国家共济失调基金会的主要重点。

n.多系统萎缩。多系统萎缩(MSA)是变性神经病症。MSA与脑的特定区域中的神经细胞的变性相关。这种细胞变性会引起关于身体的运动、平衡和其它自主功能(诸如膀胱控制或血压调节)的问题。

MSA的病因尚不清楚，也没有鉴定出具体的危险因素。约55％的病例发生在男性中，其中典型发病年龄在50多岁后期至60多岁早期。MSA经常表现出与帕金森氏病相同的症状。然而，MSA患者通常对用于帕金森氏病多巴胺药物响应极小(如果有的话)。

o.虚弱。虚弱综合征(“虚弱”)是老年性综合症，其特征在于功能和身体下降，包括活动能力下降、肌肉无力、身体迟缓、耐力差、身体活动力降低、营养不良和无意识体重减轻。这种下降通常是伴随的，并且是诸如认知障碍和癌症等疾病的后果。然而，即使没有疾病，虚弱也会发生。患有虚弱的个体因骨折、意外跌倒、残疾、伴随疾病(comorbidity)和过早死亡而具有增加的阴性预后风险。(C.Buigues等Effect of a Prebiotic Formulationon Frailty Syndrome:A Randomized,Double-Blind Clinical Trial,Int.J.Mol.Sci.2016,17,932)。另外，患有虚弱的个体具有更高的医疗保健支出。(同前)

虚弱的常见症状可通过某些类型的测试来确定。例如，无意识体重减轻涉及至少10磅或超过前一年体重的5％的减轻；肌肉无力可通过处于基线最低20％(针对性别和BMI进行调整的)处的握力减小来确定；身体迟缓可根据步行15英尺所需的时间来确定；耐力差可通过个体的疲惫自我报告来确定；身体活动力低可使用标准化问卷调查进行测量。(Z.Palace等，The Frailty Syndrome,Today’s Geriatric Medicine 7(1),at 18(2014))。

在一些实施方案中，主题方法和组合物可用于减缓衰老相关认知障碍、运动障碍、神经炎或其它年龄相关损伤或病患的进展。换句话说，与通过公开的方法进行治疗之前或在通过公开的方法进行的治疗不存在的情况相比，在通过公开的方法进行治疗之后，个体的认知、运动、神经炎症或其它能力或状况的下降将更加缓慢。在一些此类情况下，主题治疗方法包括在治疗后测量认知、运动、神经炎症或其它年龄相关能力或症状下降的进展，并确定下降的进展减缓。在一些此类情况下，通过与参考(例如，如通过在主题血液制品施用之前的两个或更多个时间点测量认知、运动、神经炎症或其它年龄相关能力或状况所测定的治疗前个体的下降速率)相比较来进行确定。

主题方法和组合物还可用于稳定个体(例如，患有衰老相关认知能力下降的个体或有患衰老相关认知能力下降的风险的个体)的认知、运动、神经炎症或其它能力或状况。例如，个体可表现出一些衰老相关认知障碍，并且在通过公开的方法治疗之后，在用公开的方法治疗之前观察到的认知障碍的进展将被停止。作为另一个实例，个体可处于发展衰老相关认知能力下降的风险中(例如，个体的年龄可以为50岁或以上，或者可能已被诊断出患有衰老相关病症)，并且个体的认知能力在通过公开的方法治疗之后与使用公开的方法治疗之前相比基本上没有变化，即，未能检测认知能力下降。

主题方法和组合物还可用于减少患有衰老相关损伤的个体的认知障碍、运动障碍、神经炎或其它年龄相关损伤。换句话说，通过主题方法治疗后个体的受累的能力得到改善。例如，个体的认知或运动能力在通过主题方法治疗后相对于在通过所述主题方法治疗前的所述个体中观察到的认知或运动能力，增强了例如2倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，30倍或更多，或40倍或更多，包括50倍或更多，60倍或更多，70倍或更多，80倍或更多，90倍或更多，或100倍或更多。

在一些情况下，通过主题方法和组合物进行的治疗将患有衰老相关认知或运动能力下降的个体的认知、运动或其它能力恢复到例如所述个体在约40岁或以下时的其水平。换句话说，消除了认知障碍或运动障碍。诊断和监测改善的方法

13.在一些情况下，在众多诊断认知疾病、运动障碍、神经变性疾病和/或神经炎性疾病和监测其疾病进展和改善的方法当中，以下评估类型的评估可根据需要单独使用，或者与患有神经变性疾病的受试者组合使用。以下类型的方法作为实例提出，并且不限于所列举的方法。根据需要，可在实施本发明时使用任何方便的监测疾病的方法。本发明的方法也设想了这些方法。

a.一般认识

本发明的方法的实施方案还包括监测用以治疗认知障碍和/或年龄相关痴呆的药物或治疗对受试者的作用的方法，所述方法包括比较治疗前后的认知功能。本领域普通技术人员认识到存在评估认知功能的公知方法。例如，但不限于，所述方法可包括基于病史、家族史、由专门研究痴呆和认知功能的临床医生进行的身体和神经检查、实验室测试和神经心理学评估来评估认知功能。本发明设想的另外实施方案包括：意识评估，诸如使用格拉斯哥昏迷量表(EMV)；精神状态检查，包括简式心理测验分数(abbreviated mental testscore)(AMTS)或简明精神状态检查(mini-mental state examination)(MMSE)(Folstein等，J.Psychiatr.Res 1975；12:1289-198)；高级功能的总体评估(global assessment ofhigher functions)；诸如通过眼底镜检查进行的颅内压评估。在一个实施方案中，监测对认知障碍和/或年龄相关痴呆的作用包括使用阿尔茨海默氏病评估量表-认知子量表(ADAS-COG)的1-点、2-点、3-点、4-点、5-点、6-点、7-点、8-点、9-点、10-点、11-点或12-点改善。

在一个实施方案中，周围神经系统的检查可用于评估认知功能，包括以下的任一项：嗅觉、视野和视力、眼球运动和瞳孔(交感神经的和副交感神经的)、面部的感觉功能、面部和肩胛带肌肉的力量、听力、味觉、咽部运动和反射、舌头运动，所述方面可单独测试(例如，视力可通过Snellen图表进行测试；反射锤用于测试反射(包括咀嚼肌、二头肌和三头肌肌腱、膝盖肌腱、踝反射和趾(即Babinski体征))；通常在MRC量表1至5上的肌肉力量；肌肉张力和僵硬的体征。

b.帕金森氏病

本发明的方法的实施方案还包括监测用以治疗运动障碍的药物或治疗对受试者的作用方法，所述方法包括比较治疗前后的运动功能。本领域普通技术人员认识到存在评估运动功能的公知方法。例如，但不限于，所述方法可包括基于病史、家族史、由专门研究神经变性和运动障碍的临床医生进行的身体和神经检查、实验室测试和神经变性评估来评运动功能。本发明设想的另外的实施方案包括采用以下论述的评定量表。

一些评定量表已用于评估PD的进展。使用最广泛的量表包括帕金森氏病统一评定量表(UPDRS，于1987年推出)(J.Rehabil Res.Dev.,2012 49(8):1269-76)以及Hoehn和Yahr量表(Neruology,1967 17(5):427-42)。另外的量表包括运动障碍协会(MDS)更新UPDRS量表(MDS-UPDRS)以及Schwab和England日常生活活动(ADL)量表。

UPDRS量表评估了31个项目，所述项目构成了三个子量表：(1)心理状态、行为和情绪；(2)日常生活活动；(3)运动检查。Hoehn和Yahr量表将PD分为五个阶段，每个阶段都有单独的子阶段：0–无疾病体征；1–仅在一侧出现症状；1.5–一侧出现症状，但也累及颈部和脊柱；2–双侧出现症状，但均无平衡受损；2.5–两侧出现轻微症状，给予“牵引”测试时可恢复；3–具有轻度至中度疾病的平衡障碍；4–严重残疾，但具有独立行走或站立的能力；以及5–需要轮椅或卧床不起，无需帮助。Schwab和England量表将PD分为若干百分比(从100％-完全独立至10％-完全依赖)。

可使用包括一般运动功能量表(GMF)在内的广泛使用的量来来评估一般运动功能。这测试了三个组成部分：依赖性、痛苦和不安全感。(Aberg A.C.,等.(2003)Disabil.Rehabil.2003May 6；25(9):462-72.)。还可使用家庭监控或可穿戴式传感器评估运动功能。例如：步态(运动速度、变化性、腿部僵硬)可以通过加速度计来感测；姿势(躯体倾斜度)通过陀螺仪来感测；腿部移动通过加速度计来感测；手的移动通过加速度计和陀螺仪来感测；震颤(振幅、频率、持续时间、不对称性)通过加速度计来感测；跌倒通过加速度计来感测；步态冻结通过加速度计来感测；运动障碍通过加速度计、陀螺仪和惯性传感器来感测；运动迟缓(持续时间和频率)通过加速度计加陀螺仪来感测，以及失语症(音调)使用麦克风来感测。(Pastorino M,等.,Journal of Physics:Conference Series 450(2013)012055)。

c.多发性硬化

除了监测与认知相关的症状的改善以外，还可使用本领域普通技术人员熟知的技术来监测与多发性硬化(MS)相关的神经变性的进展或改善。作为实例而非限制，可通过诸如以下的技术来执行监视：脑脊液(CSF)监测；检测病变和脱髓鞘斑的发展的磁共振成像(MRI)；诱发电位研究；和步态监测。

可以例如通过腰椎穿刺术来执行CSF分析以获得压力、外观和CSF含量。正常值通常在以下范围内：压力(70-180mm H20)；外观澄清无色；总蛋白质(15–60mg/100mL)；IgG占总蛋白质的3-12％；葡萄糖为50–80mg/100mL；细胞计数为0-5个白细胞，没有红细胞；氯化物(110–125mEq/L)。异常结果可表明MS的存在或进展。

MRI是可执行以用来监测疾病进展和改善的另一种技术。用MRI监测MS的典型标准包括在脑半球和脑室旁区域中出现异常白质的斑片状区域、小脑和/或脑干以及脊髓的颈或胸区域中存在的病变。

诱发电位可用于监测受试者的MS的进展和改善。诱发电位测量诸如视觉诱发反应(VER)、脑干听觉诱发反应(BAER)和体感诱发反应(SSER)中的电脉冲的减慢。异常反应有助于表明中枢感觉途径的传导速度降低。

步态监测还可用于监测MS受试者的疾病进展和改善。MS通常伴有部分归因于疲劳的移动障碍和步态异常。可以例如通过使用受试者佩戴的移动监测设备来执行监测。(Moon,Y.等，Monitoring gait in multiple sclerosis with novel wearable motionsensors,PLOS One,12(2):e0171346(2017))。

d.亨廷顿氏病

除了监测与认知相关的症状的改善以外，还可使用本领域普通技术人员熟知的技术来监测与亨廷顿氏病(HD)相关的神经变性的进展或改善。作为实例而非限制，可通过诸如以下的技术来执行监视：运动功能；行为；功能评估；以及成像。

可作为疾病进展或改善的指示进行监测的运动功能的实例包括舞蹈病和肌张力障碍、僵硬、运动迟缓、动眼神经功能障碍和步态/平衡变化。用于执行这些度量的监测的技术是本领域普通技术人员公知的。(参见Tang C等，Monitoring Huntington’s diseaseprogression through preclinical and early stages,Neurodegener Dis Manag 2(4):421-35(2012))。

HD的精神病效应为监测疾病的进展和改善提供了机会。例如，可以执行精神病学诊断以确定受试者是否患有抑郁症、易怒、躁动、焦虑、情感冷漠和偏执性精神病。(同前)

功能评估也可用于监测疾病的进展或改善。总功能评分技术已有报道(同上)，并且在一些HD组中，每年通常下降1个点。

MRI或PET也可用于监测疾病的进展或改善。例如，HD中纹状体投射神经元丢失，并且可在受试者中监测这些神经元数量的变化。确定HD受试者中神经元变化的技术包括对多巴胺D2受体结合进行成像。(同前)

e.ALS

除了监测与认知相关的症状的改善以外，还可使用本领域普通技术人员公知的技术来监测与肌萎缩侧索硬化(ALS)相关的神经变性的进展或改善。作为实例而非限制，可通过诸如以下的技术来执行监测：功能评估；测定肌肉力量；测量呼吸功能；测量下运动神经元(LMN)丢失；以及测量上运动神经元(UMN)功能障碍。

可使用本领域普通技术人员公知的功能量表(诸如评估与延髓、四肢和呼吸功能相关的症状的ALS功能评定量表(ALSFRS-R))进行功能评估。变化率可用于预测存活率以及疾病的进展或改善。另一项措施包括通过组合存活时间与ALSFRS-R的变化对受试者的临床结局进行等级评定的功能与生存的联合评估(CAFS)。(Simon NG等，Quantifying DiseaseProgression in Amyotrophic Lateral Sclerosis,Ann Neurol 76:643-57(2014))。

可通过使用复合人工肌肉测试(MMT)评分来测试和定量肌肉力量。这需要使用医学研究理事会(MRC)肌肉力量分级量表从若干肌肉组获取的平均测量值。(同前)除其它技术外，还可使用手持式测力法(HHD)。(同前)

可以使用便携式肺活量测定仪执行呼吸功能，用于获得基线时的用力肺活量(FVC)以预测疾病的进展或改善。另外，可以测定最大吸气压、嗅鼻吸气压(SNIP)和吸气FVC(supping FVC)，并将其用于监测疾病的进展/改善。(同前)

下运动神经元的丢失是可用于监测ALS的疾病进展或改善的另一个度量。可通过测量运动神经传导研究中的复合肌肉动作电位(CMAP)来测定神经生理指数，其中的参数包括CMAP振幅和F波频率。(同前以及de Carvalho M等，Nerve conduction studies inamyotrophic lateral sclerosis.Muscle Nerve 23:344–352,(2000))。也可以估算下运动神经元单位数(MUNE)。在MUNE中，通过估计各个运动单位对最大CMAP响应的贡献来估算供应肌肉的残余运动轴突的数量，并将其用于测定疾病的进展或改善。(Simon NG等，同上)。用于测定LMN丢失的其它技术包括测试神经兴奋性、电阻抗肌动描记法以及使用肌肉超声检测肌肉厚度的变化。(同前)

上运动神经元的功能障碍是可用于监测ALS的疾病进展或改善的另一个度量。用于测定功能障碍的技术包括对脑和脊髓进行MRI或PET扫描、经颅磁刺激；以及测定脑脊液(CSF)中的生物标志物水平。

f.青光眼

除了监测与认知有关的症状的改善以外，还可使用本领域普通技术人员公知的技术来监测与青光眼有关的神经变性的进展或改善。作为实例而非限制，可以通过诸如以下的技术来执行监测：测定眼内压；评估视盘或视神经头是否受损；周边视力丧失的视野测试；以及用于型态分析的视盘和视网膜的成像。

g.进行性核上性麻痹(PSP)

除了监测与认知相关的症状的改善以外，还可使用本领域普通技术人员熟知的技术来监测与进行性核上性麻痹(PSP)相关的神经变性的进展或改善。作为实例而非限制，可通过诸如以下的技术来执行监测：功能评估(日常生活活动或ADL)；运动评估；精神症状的确定；以及容积和功能磁共振成像(MRI)。

就独立性、对他人的部分依赖性或完全依赖性而言，受试者的功能水平可用于确定疾病的进展或改善。(参见Duff,K等，Functional impairment in progressivesupranuclear palsy,Neurology 80:380-84,(2013))。进行性核上性麻痹评定量表(PSPRS)是一种评定量表，其包括六大类的28个度量：日常活动(按历史记录)；行为；延髓、眼球运动、肢体运动和步态/中线。结果是范围为0至100的得分。六个项目的等级为0–2，并且22个项目的等级为0-4，总共可能为100。PSPRS得分是实用的度量，也是患者生存率的可靠预测指标。它们对疾病进展也很敏感，并且可用于监测疾病的进展或改善。(Golbe LI等，A clinical rating scale for progressive supranuclear palsy,Brain 130:1552-65,(2007))。

来自UPDRS(统一帕金森氏病评定量表)的ADL部分也可用于定量患有PSP的受试者的功能活动。(Duff K等，同上)。类似地，Schwab及England日常生活活动得分(SE-ADL)可用于评估独立性。(同前)另外，UPDRS的运动功能部分可用作评估PSP患者的疾病进展的可靠度量。运动部分可包含例如27种不同的度量，以定量PSP患者的运动功能。这些度量的实例包括静止性震颤、僵硬、手指敲击、姿势和步态)。还可通过进行由受过训练的医务人员完成基线神经心理学评估来评估受试者的疾病进展或改善，所述评估使用神经精神症状问卷(NPI)来确定行为异常(例如妄想、幻觉、躁动、抑郁、焦虑、欣快、情感冷漠、去抑制、易怒和异常运动行为)的频率和严重度。(同前)

功能MRI(fMRI)也可用于监测疾病的进展或改善。fMRI是使用MRI来测量脑某些区域的脑活动变化的技术，其通常基于流向这些区域的血液流量来进行。血流被认为与大脑区域激活相关。患有如PSP的神经变性病症的患者可以在MRI扫描仪扫描之前或期间接受身体或心理测试。作为实例而非限制，测试可以是良好建立的力控制范式，其中患者被要求用受PSP影响最大的手产生力，并在测试发生后立即通过fMRI测量最大随意收缩(MVC)。Burciu,RG等，Distinct patterns of brain activity in progressive supranuclearpalsy and Parkinson’s disease,Mov.Disord.30(9):1248-58(2015))。

容积MRI是其中MRI扫描仪测定局部脑容积的容积差异的技术。例如，这可通过对比不同的疾病或通过测定患者脑部区域的容积随时间推移的差异来完成。容积MRI可用来测定神经变性病症如PSP的疾病进展或改善。该技术是本领域普通技术人员公知的。(Messina D等，Patterns of brain atrophy in Parkinson’s disease,progressivesupranuclear palsy and multiple system atrophy,Parkinsonism and RelatedDisorders,17(3):172-76(2011))。可测量的脑区域的实例包括但不限于颅内容积、大脑皮层、小脑皮层、丘脑、尾状物(caudate)、壳核、苍白球、海马、杏仁核、侧脑室、第三脑室、第四脑室和脑干。

h.神经发生

本发明还设想了治疗或改善患有神经发生减少或受损的受试者的神经发生，这可以例如通过降低的认知或运动功能或通过与神经炎症的关联来表现其本身。本发明的实施方案包括使用脉冲式给药治疗方案向患有神经发生减少或受损的受试者施例如但非限制的血浆、血浆级分或PPF。

本发明的实施方案还设想了在施用血浆、血浆级分或PPF之前、期间和/或之后测定神经发生的水平。已经报道了用于评估神经发生的非侵入性技术。(Tamura Y.等，J.Neurosci.(2016)36(31):8123-31)。与示踪剂[18F]FLT一起使用的正电子发射断层摄影术(PET)与BBB转运蛋白抑制剂丙磺舒组合可使示踪剂在脑的神经源性区域积聚。这样的成像允许评估接受神经变性疾病治疗的患者的神经发生。

i.神经炎症

本发明还设想了治疗或改善患有加剧的神经炎症的受试者的神经炎症，这可以例如通过降低的认知或运动功能或通过与减少的神经发生或神经变性的关联来表现其本身。本发明的实施方案包括使用脉冲式给药治疗方案向患有神经炎症的受试者施用例如但非限制的血浆、血浆级分或PPF。

本发明的实施方案还设想了在施用血浆、血浆级分或PPF之前、期间和/或之后测定神经炎症的水平。已经报道了用于评估神经炎症的非侵入性技术，诸如使用¹¹C-PK11195和其它此类示踪剂的TSPO正电子发射断层摄影术(TSPO PET)。(参见Vivash L,等,J.Nucl.Med.2016,57:165-68；和Janssen B,等,Biochim.et Biophys.Acta,2016,425-41，通过引用并入本文)。用于评估神经炎症的侵入性技术包括抽取脑脊液并检测例如神经炎症标志物或因子(诸如(但不限于)前列腺素E2、环氧合酶2、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10、嗜酸性粒细胞趋化因子、β-2微球蛋白、VEGF、胶质细胞系源性神经营养因子、壳三糖苷酶-1、MMP-9、CXC基序趋化因子13、末端补体复合物、壳多糖酶-3-样蛋白1和骨桥蛋白)的表达水平。(参见Vinther-Jensen T,等,Neruol Neurimmunol Neuroinflamm,2016,3(6):e287；和Mishra等,J.Neuroinflamm.,2017,14:251，通过引用并入本文)。

14.干细胞与脉冲式给药联合疗法

本发明的实施方案包括通过向受试者施用有效量的正在进行干细胞疗法，将进行干细胞疗法或已接受了干细胞疗法的受试者中的血浆或血浆级分来治疗经诊断患有认知障碍、运动功能受损、神经炎症或神经发生减少的受试者。本发明的另一个实施方案包括向受试者施用有效量的血浆或血浆级分，其中受试者正在进行干细胞疗法，将要进行干细胞疗法或已经接受干细胞疗法，并且其中用于疗法的干细胞可以是胚胎干细胞、非胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞等。

干细胞疗法和进行这种疗法的技术是本领域普通技术人员已知的。(Andres RH,等,Brain 2011,134；1777-89；Daadi MM,等,Cell Transplant 2013,22(5):881-92；HorieN,等,Stem Cells 2011 29(2):doi:10.1002/stem.584；Thomsen GM,等,Stem Cells2018,doi:10.1002/stem.2825；美国专利申请第09/973,198号、第12/258,210号、第12/596,884号和第13/290,439号，其全部通过引用并入)。本发明的另一个实施方案包括用有效量的血浆或血浆级分治疗经诊断患有创伤性脊髓损伤、中风、视网膜疾病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、听力丧失、心脏病、类风湿性关节炎或严重烧伤的受试者，或需要骨髓移植的受试者以及正在进行、将要进行或已接受了干细胞疗法的受试者。

15.筛选组合物的方法

还提供了筛选组合物的在治疗认知障碍或运动障碍、减少神经炎症或增加神经发生方面的活性的方法。此类方法是本发明所设想的，并且包括以下实验实施例中描述的那些方法。可通过本发明的实施方案筛选的组合物包括：生物组合物(例如蛋白质、蛋白质的组合、抗体、小分子拮抗剂)；血浆组分或其它血液组合物。来自筛选组合物的方法的结果包括但不限于：海马(例如齿状回)或其它CNS区域中的炎症/炎症标志物的结果；海马或其它CNS区域中细胞增殖的结果；海马或其它CNS区域中的细胞存活率；海马或其它CNS区域中的增殖性神经祖细胞(NPC)的细胞命运(例如，星形胶质细胞、新神经元)；以及海马或其它CNS区域中的神经发生。

筛选组合物的在治疗认知障碍或运动障碍、减少神经炎症或增加神经发生方面的活性的方法的另外的实施方案包括确定组合物对海马体炎症和增殖的急性作用，包括：在啮齿动物或另一动物模型中连续5-7天施用BrdU的日剂量并且同时连续5-7天每天施用筛选的组合物或对照(脉冲式给药)。筛选的组合物的脉冲式给药结束后最多10天(即1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天)，可通过BrdU染色测定齿状回中的细胞数量，并测定表现出CD-68染色(炎症的指标)的面积百分比。

筛选组合物的在治疗认知障碍或运动障碍、减少神经炎症或增加神经发生方面的活性的方法的另一个实施方案包括在啮齿动物或其它动物模型中开始筛选的组合物或对照的5-7天的脉冲式给药方案之前，连续5天(每天一次)施用BrdU。4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周后，将海马细胞存活率测定为用BrdU染色的齿状回中的细胞数，将神经发生测定为用双皮质素(DCX)染色的齿状回中的细胞数，以及分别通过BrdU与GFAP或NeuN标志物的共定位来确定神经祖细胞变成星形胶质细胞(与衰老相关)或神经元(与衰老无关)的细胞命运。

筛选组合物的在治疗认知能力障碍或运动障碍、减少神经炎症或增加神经发生方面的活性的方法的另一个实施方案包括同时(和每天)施用BrdU和筛选的组合物或对照，持续5-7天，随后如上所述测定海马中神经发生的程度(通过DCX染色)或增殖性NPC的细胞命运。

筛选组合物的在治疗认知障碍或运动障碍、减少神经炎症或增加神经发生方面的活性的方法的另一个实施方案包括施用待筛选的组合物或对照的脉冲式剂量方案，并如以下实施例中所述测定啮齿动物或另一动物模型中的认知或运动功能的改善。

16.试剂、装置和工具包

还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、装置及其工具包。主题试剂、装置及其工具包可以有很大的不同。

目标试剂和装置包括以上关于制备含血浆的血液制品以输注到有此需要的受试者的方法所提到的那些，例如抗凝剂、低温贮存剂、缓冲液、等渗溶液等。

工具包还可包括血液收集袋、管、针头、离心管等。在其它实施方案中，本文所述的工具包包括两个或更多个血浆制品诸如血浆蛋白质级分的容器，诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个(包括六个或更多个)血浆制品的容器。在一些情况下，工具包中血浆制品的不同容器的数量可以是9个或更多，12个或更多，15个或更多，18个或更多，21个或更多，24个或更多，30个或更多，包括36个或更多，例如48个或更多。每个容器可具有与其相关联的识别信息，该识别信息包括关于其中所包含的血浆制品的各种数据，该识别信息可包括血浆制品的供体年龄、关于血浆制品的加工细节(例如，血浆制品是否经处理以去除高于平均分子量(诸如上文所述的)的蛋白质)、血型详细信息等中的一项或多项。在一些情况下，工具包中的每个容器都包括关于其中所包含的血浆的识别信息，并且该识别信息包括关于血浆制品的供体年龄的信息，例如该识别信息提供确认血浆制品供体的年龄相关数据(其中，该识别信息可以是采集时供体的年龄)。在一些情况下，工具包的每个容器都包含来自年龄基本上相同的供体的血浆制品，即，所有容器均包含来自年龄基本上相同(如果不相同的话)的供体的制品。基本上相同的年龄意指从其获得工具包的血浆制品的不同供体在一些情况下各自相差5岁或更少，例如4岁或更少，例如3岁或更少，包括2岁或更少，诸如1岁或更少，例如9个月或更少，6个月或更少，3个月或更少，包括1个月或更少。识别信息可以存在于容器的任何方便的部件上，诸如标签、RFID芯片等。根据需要，识别信息可以是人可读的、计算机可读的等。容器可具有任何方便的配置。尽管容器的体积可以变化，但在一些情况下，容积范围为10ml至5000mL，诸如25mL至2500mL，例如50ml至1000mL，包括100mL至500mL。容器可以是刚性的或挠性的，并且可以由任何方便的材料(例如聚合材料，包括医用级塑料材料)制成。在一些情况下，容器具有袋或小袋配置。除了容器以外，此类工具包还可包括例如如上所述的施用装置。此类工具包的组件可以以被配置为容纳容器和其它工具包的组件的任何合适的包装提供，例如，箱或类似的结构。

除了上述组件以外，主题工具包还可包括用于实施主题方法的说明书。这些说明书可以以多种形式存在于主题工具包中，其中的一种或多种可以存在于工具包中。这些说明书可存在的一种形式是如适合的介质或基材(例如，在其上打印信息的一张或多张纸)上、工具包的包装中、包装插页等中的打印信息。另一种方式可以是在其上记录信息的计算机可读介质，例如软盘、CD、便携式闪存驱动器等。另一种可能存在的方式是可以通过互联网使用的网站地址，以在远端位点访问信息。任何适宜的装置都可存在于工具包中。

17.锻炼

锻炼的特征可在于有氧或无氧运动，并且可涉及高卡路里燃烧活动和中度卡路里燃烧活动。锻炼可涉及力量训练(例如，重量训练或等距锻炼)。锻炼还可包括，例如跑步、骑自行车、步行、跳舞、行军、游泳、瑜伽、太极拳、平衡运动、曲腿、跳绳、冲浪、划船、旋转或屈曲手臂或双腿、园艺、清洁、诸保龄球、有氧运动、普拉提和武术等活动性游戏。

锻炼方案可包括以某一频率执行单一锻炼或以某一频率执行锻炼的组合。频率可以是每周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次。频率可以每周不同。锻炼方案可以以与受试者在施用本发明的组合物之前所练习的强度和/或频率处于同一水平。锻炼方案可以以与受试者在施用本发明的组合物之前所练习的强度和/或频率相比处于更高的水平。锻炼方案可由健康或健身专业人士建议或开具，或者锻炼方案可由受试者自己发起。

18.实验实施例

a.实施例1

向免疫功能低下的老年小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用澄清的年轻人血浆(年轻血浆)或市售PPF(“PPF1”)。PPF1是如通过电泳测定的具有约88％的正常人白蛋白(相对于总蛋白质)、12％的α和β球蛋白以及不超过1％的γ球蛋白的PPF。除非另有说明，否则在本文的实施例中使用5％溶液(w/v，50g/L)体内施用PPF1。根据以下4个不同的标准，将所有小鼠在处理组之间进行均化：居住笼小巢评分(nestletscoring)、初始体重、行进的旷场距离和旷场中央时间百分比。在确定组之后，以10mg/mL的终浓度(以150mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。之后，每周给小鼠静脉内(IV)注射3次150μL的PPF1，持续4周。行为测试在第5周和第6周进行，其中小鼠每周接受2次注射，以避免在同时进行的测试日注射。最后一次IV注射后24小时对小鼠实施安乐死，在6周内总共进行了16次注射。连续7天用150μL的PPF1或盐水(脉冲给药)静脉内(IV)注射两个另外的小鼠群组。行为测试在第5周和第6周在与每周3次的组相同的时间进行。

行为测定使用CleverSys软件(Reston,VA)进行分析。CleverSys TopScan V3.0用于跟踪零迷宫、Barnes迷宫、旷场和Y型迷宫中的小鼠行为。Barnes迷宫由CleverSys构建。握力计由Columbus Instruments(Columbus,OH)设计和生产。根据San Diego Instruments(San Diego,CA)的规范构建了Y型迷宫和旷场室(Open field chambers)。在具有DCF7000T明场/荧光彩色显微镜照相机的型号为DM5500B的Leica(Buffalo Grove,IL)、成像显微镜上进行海马切片的组织学分析。

行为测试：图1A显示，与盐水对照组和每周用PPF1处理3次的组相比，使用PPF1进行脉冲给药的组在旷场测试中的行进距离趋于增加。该结果表明脉冲给药组中运动性增加的趋势。图1B：显示，与盐水对照组和每周用PPF1处理3次的组相比，使用PPF1进行脉冲给药的组在旷场中央花费的时间百分比趋于增加。该结果表明脉冲给药组中焦虑减少的趋势。

体重：图2绘制PPF1对体重的影响。两个PPF1处理的组(通过脉冲式给药或每周三次)均未显示来自注射的有害作用。

组织学：图3报告了齿状回的颗粒层内DCX阳性标记细胞的数量。与每周三次处理的组和盐水组相比，脉冲式剂量的PPF1处理的组的神经发生显著增加。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。**P<0.01，采用杜奈特多重比较事后分析的单因素ANOVA(n：盐水＝8，PPF1脉冲式给药＝10，PPF1 3次/周＝10)。图4报告了三个单独处理的小鼠组的齿状回的颗粒层中BrdU阳性标记细胞的数量。与每周三次处理的组和盐水组相比，脉冲式剂量的PPF1处理的组的细胞存活率显著增加。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。****P<0.0001,*P<0.05，采用杜奈特多重比较事后分析的单因素ANOVA(n：盐水＝8，PPF1脉冲＝10，PPF1 3次/周＝10)。

在具有DCF7000T明场/荧光彩色显微镜照相机的型号为DM5500B的Leica(BuffaloGrove,IL)成像显微镜上进行海马切片的分析。Ki67染色Abcam(ab15580)为1:500，并且二抗为1:300的山羊抗兔(Alex Fluor 555)(ab150090)。

b.实施例2

向免疫功能低下的老年小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用澄清的年轻人血浆(YP)、老年人血浆(OP)或市售PPF(“PPF1”)。根据以下4个不同的标准，将所有小鼠在处理组之间进行均化：居住笼小巢评分、初始体重、行进的旷场距离和旷场中央时间百分比。在确定组后，以10mg/mL的终浓度(以150mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的BrdU腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。之后，如下对小鼠进行静脉内(IV)注射：1)每周3次，持续6周(“3次/周”)；2)仅在一周内进行三次(“3次”)；3)一周7天，使用150μL澄清的年轻人血浆或PPF1。以脉冲方式对另外一组小鼠IV施用盐水7天。最后一组小鼠在一周内接受了3次老年人血浆或在一周内7天接受老年人血浆。在开始年轻或老年血浆、PPF1或媒介物给药后6周，将所有小鼠处死。

组织学：图5报告了用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)、PPF1或盐水处理的小鼠的9个单独处理的组的齿状回的颗粒层内DCX阳性标记细胞的数量。与其另外的组相比，脉冲给药或每周处理三次的PPF1处理的小鼠均表现出增加的神经发生。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA，PPF1(脉冲或3次/周)处理和盐水处理(n：盐水＝4,PPF1脉冲＝5,PPF1 3次/周＝5,PPF1 3次＝4,YP脉冲＝6,YP 3次/周＝6,YP 3次＝4,AP脉冲＝6,AP 3次＝6)

图6报告了用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)、PPF1或盐水处理的小鼠的9个单独处理的组的齿状回的颗粒层内BrdU阳性标记细胞的数量。与另外的组相比，PPF1处理的小鼠表现出细胞存活率的显著增加，其中脉冲式给药的PPF1处理的小鼠表现出比每周三次给药的PPF1处理的小鼠更大的显著差异。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；**P<0.01,*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA，PPF1(脉冲或3次/周)处理和盐水处理(n：盐水＝4,PPF1脉冲＝5,PPF1 3次/周＝5,PPF1 3次＝4,YP脉冲＝6,YP 3次/周＝6,YP 3次＝4,AP脉冲＝6,AP 3次＝6)

c.实施例3

向免疫功能低下的老年小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用澄清的年轻人血浆(YP)、老年人血浆(OP)或市售PPF(“PPF1”)。小鼠在1周方案中用每天7次静脉内(IV)剂量处理。

根据以下4个不同的标准，将所有小鼠在处理组之间进行均化：居住笼小巢评分、初始体重、行进的旷场距离和旷场中央时间百分比。在确定组后，以10mg/mL的终浓度(以150mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的BrdU腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。对所有小鼠连续七天静脉内(IV)注射(称为脉冲式给药)150uL的年轻人或老年人血浆、PPF1或盐水。在脉冲式给药完成后3周，以10mg/mL的终浓度(以30mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。在第8周(脉冲给药结束后的6周)期间进行了Barnes迷宫测试。

行为测定使用CleverSys软件(Reston,VA)进行分析。CleverSys TopScan V3.0用于跟踪Barnes迷宫中的小鼠行为。Barnes迷宫由CleverSys构建。在具有DCF7000T明场/荧光彩色显微镜照相机的型号为DM5500B的Leica(Buffalo Grove,IL)成像显微镜上进行海马切片的分析。

行为测试：图7报告了如通过Barnes迷宫所测试的每个处理组的每天每次试验发现目标洞的时延。PPF1脉冲式给药处理的小鼠表现出几个单独的测试阶段的试验时延均显著增加，表明认知能力得到改善。*P<0.05平均值±s.e.m；非配对t-检验(n：盐水＝13，PPF1＝13，AP＝14，YP＝14)。

组织学：图8报告了用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)、PPF1或盐水处理的小鼠的4个单独处理的组的齿状回的颗粒层内DCX阳性标记细胞的数量。与盐水处理相比，脉冲式给药的PPF1和脉冲给药的年轻人血浆中神经发生显著增加。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；****P<0.0001，**P<0.01，采用杜奈特多重比较事后分析的单因素ANOVA。(n：盐水＝14，PPF1＝14，AP＝14，YP＝15)

图9报告了用年轻人血浆(YP)、老人血浆(OP)、PPF1或盐水处理的小鼠的齿状回的颗粒层内BrdU阳性标记细胞的数量。与盐水处理相比，脉冲给药的PPF1和脉冲给药的YP中细胞存活率显著增加。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；****P<0.0001；平均值±s.e.m；采用杜奈特多重比较事后分析的单因素ANOVA。(n：盐水＝14，PPF1＝14，AP＝14，YP＝15)。

d.实施例4

向免疫功能低下的老年小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用市售PPF(“PPF1”)。12月龄小鼠在1周方案中用每天7次尾静脉静脉内(IV)剂量处理。处理后，在行为测试之前，使小鼠在其居住笼环境中停留4.5周。每个群组的所有注射和行为测试均在7周的过程中进行，并且以总共9周时间跨度进行。在首次给药之前，所有小鼠均接受了5天的BrdU IP。最后一次行为测试结束后一天，处死小鼠。

行为测定使用CleverSys软件(Reston,VA)进行分析。CleverSys TopScan V3.0用于跟踪Y型迷宫中的小鼠行为。

行为测试：图10报告了在Y型迷宫测试中，处理组进入熟悉臂或新异臂的进入总次数占进入每个臂的总进入次数的百分比。用盐水、PPF1或5倍浓缩的PPF1以脉冲剂量处理12月龄小鼠。PPF1和PPF1(5倍)脉冲剂量处理的小鼠与盐水处理的小鼠进入新异臂的进入数量相比，均显示出进入新异臂的显著增加，表明认知能力得到了改善。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。*P<0.05，配对t检验。

图11报告了每个处理组的进入Y型迷宫的新异臂对比熟悉臂的次数比率。用盐水、PPF1或5倍浓缩的PPF1以脉冲剂量处理12月龄小鼠。与盐水处理的小鼠相比，PPF1和PPF1(5倍)脉冲剂量处理的小鼠均表现出进入新异臂增加的趋势。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。

组织学：图12报告了所有海马切片内的BrdU阳性标记细胞的数量。与盐水和PPF1(5倍)处理的小鼠相比，PPF1脉冲给药的小鼠表现出细胞存活率增加的趋势。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。

图13报告了所有海马切片内的DCX阳性标记细胞的数量。与盐水处理的小鼠相比，PPF1和PPF1(5倍)脉冲给药的小鼠表现神经发生增加的趋势。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。

e.实施例5

向免疫功能低下的老年(10.5月龄)小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1 Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用市售PPF(“PPF1”)。根据以下4个不同的标准，将所有小鼠在处理组之间进行均化：居住笼小巢评分、初始体重、行进的旷场距离和旷场中央时间百分比。在确定组后，以10mg/mL的终浓度(以150mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的BrdU腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。之后，使用以下方案之一用PPF1静脉内(IV)注射小鼠：1)连续5天[PPF1-5d]；2)连续7天[PPF1-7d]；3)连续5天，在完成初始给药后6周，又进行连续5天的加强型(B)给药[PPF1-5d-B]；4)连续7天，在完成初始给药后6周，又进行连续7天的加强型(B)给药[PPF1-7d-B]。另外的一组连续7天注射盐水，在完成初始给药后6周又进行连续7天的给药[SAL-7d-B]。在脉冲式给药后5周，以10mg/mL的终浓度(以30mg/kg给药)用配制于PBS中的EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。在完成PPF1或媒介物的脉冲给药后12周，将所有小鼠处死。

在具有DCF7000T明场/荧光彩色显微镜照相机的型号为DM5500B的Leica(BuffaloGrove,IL)成像显微镜上进行海马切片的分析。图14报告了PPF1和盐水处理的动物中的齿状回的颗粒层内的DCX阳性标记细胞的数量。这些结果表明，连续5天处理，随后加强处理的组中有显著改善，所述改善与连续7天处理的组相当。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；PPF1-7d、PPF1-5d-B对比盐水*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA(n：盐水＝5，PPF1-5d＝8，PPF1-7d＝7，PPF1-5d-B＝8，PPF1-7d-B＝7)。

图15报告了PPF1和盐水处理的动物中的齿状回的颗粒层内的BrdU阳性标记细胞的数量。这些结果表明，在增殖细胞方面，与无加强处理的连续5天或连续7天处理的组相比，在连续5天处理后进行加强处理的组中诱导作用明显增加。另外，加强处理总体上显著增加细胞存活率。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。PPF1-5d-B、PPF1-7d-B对比盐水***，P<0.001，*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA。PPF1-5d对比PPF1-5d-B+P<0.05，未配对T检验。(n：盐水＝7，PPF1-5d＝8，PPF1-7d＝7，PPF1-5d-B＝8，PPF1-7d-B＝7)。

图16报告了年轻血浆、PPF1和盐水处理的动物中的齿状回的颗粒层内的EdU阳性标记细胞的数量。这些结果表明对于加强给药观察到的效应不是由于存在的增殖性细胞总数增加，而是由于加强施用引起的存活机制增强引起的。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；(n：盐水＝4，PPF1-5d＝7，PPF1-7d＝6，PPF1-5d-B＝7，PPF1-7d-B＝6)。

f.实施例6

向免疫功能低下的成年(3月龄和6月龄)小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1 Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用市售PPF(“PPF1”)。根据以下4个不同的标准，将所有小鼠在处理组之间进行均化：居住笼小巢评分、初始体重、行进的旷场距离和旷场中央时间百分比。在确定组后，以10mg/mL的终浓度(以150mg/kg给药)用配制于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的BrdU腹膜内(IP)注射小鼠，持续5天。之后，连续7天给小鼠静脉内(IV)注射盐水或PPF1(脉冲给药)。在居住笼中为来自盐水和PPF1处理的小鼠的亚组提供转轮。在完成脉冲给药后3天、10天或42天处死小鼠。

图17报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水-处理处理的3月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的DCX阳性标记细胞的数量。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；转轮+PPF1 42天后，转轮42天后对比盐水42天后****P<0.0001，*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA。转轮对比PPF1 42天后+++P<0.001,非配对t-检验。(n：盐水3天后＝8，PPF1 3天后＝8，PPF1 10天后＝7，媒介物42天后＝8，PPF1 42天后＝8，转轮42天后＝8，转轮+PPF1 42天后＝8)。图17报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水-处理处理的6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的DCX阳性标记细胞的数量。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；转轮+PPF1 42天后，转轮42天后对比盐水42天后****P<0.0001，**P<0.01，采用杜奈特事后分析的ANOVA。转轮对比PPF1 42天后+++P<0.001,非配对t-检验。PPF1 42后对比盐水42天后+P<0.05,非配对t-检验。(n：盐水3天后＝7，PPF1 3天后＝8，PPF1 10天后＝6，盐水42天后＝8，PPF1 42天后＝6，转轮42天后＝8，转轮+PPF1 42天后＝9)。

图18报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水-处理处理的3月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的Ki67阳性标记细胞的数量。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；转轮+PPF1 42天后对比盐水42天后***P<0.001，采用杜奈特事后分析的ANOVA。(n：盐水3天后＝6，PPF1 3天后＝6，PPF1 10天后＝7，盐水42天后＝8，PPF1 42天后＝8，转轮42天后＝8，转轮+PPF1 42天后＝8)。

图18还报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水-处理处理的6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的Ki67阳性标记细胞的数量。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；转轮+PPF1 42天后，转轮42天后对比盐水42天后***P<0.001，*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA(n：盐水3天后＝7，PPF1 3天后＝7，PPF1 10天后＝8，盐水42天后＝8，PPF1 42天后＝7，转轮42天后＝7，转轮+PPF1 42天后＝9)。

图19报告了在使用或不使用转轮的情况下用PPF1或盐水处理的3月龄和6月龄NSG动物中的齿状回的颗粒层内的BrdU阳性标记细胞的数量。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；转轮+PPF1 42天后对比盐水42天后***P<0.001，采用杜奈特事后分析的ANOVA。(****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05，采用杜奈特事后分析的ANOVA。

这些结果表明，在3月龄NSG小鼠中在给药后6周与媒介物相比，采用PPF1和转轮的神经发生显著增强。另外，在3月龄NSG小鼠中在给药后6周与媒介物相比，采用PPF1和转轮的神经发生显著增强。在6月龄NSG小鼠中在给药后6周与媒介物相比，采用PPF1和转轮的神经发生也显著增强。这些结果还表明，在6月龄NSG小鼠中在给药后6周与单独的转轮相比，采用PPF1和转轮的神经发生显著增强。另外，在3月龄和6月龄NSG小鼠中在给药后6周与媒介物相比，采用PPF1和转轮的祖细胞增殖显著增强。

这些在6月龄成年NSG小鼠中的发现表明了采用锻炼和PPF1施用的潜在协同作用，与单独的锻炼或PPF1处理相比，所述锻炼和PPF1施用导致神经发生的显著增强。这支持PPF1处理与锻炼方案的结合在临床情况下的潜在效用。另外，这些数据表明，脑中神经发生的能力很强，这可通过多种独立或重叠的机制进行评估。

g.实施例7

向免疫功能低下的11月龄小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1 Wj1/SzJ,“NSG”品系)的两个处理组施用PPF1或盐水对照。所有小鼠连续7天接受每剂150μL PPF1或盐水的IV注射。从研究的第7周开始，将转轮(MedAssociates)置于指定为跑步者的小鼠的笼子中(对于PPF1和盐水，n＝8，n＝8)。连续5天(白天和黑夜)记录了轮转数。

图20报告了在给定的时间段内的轮转数，其中阴影区域表示黑暗周期。使用未配对t检验来评估在明暗周期中处理组和未处理组的总跑步的统计显着性。分别地对于来自处理组和未处理组的每只小鼠(其中每只小鼠5个13-时间点系列)，使用13-时间点系列的时域和频域分析提取和表征节律性表达谱。周期、相位和振幅是为每个节律定义的参数，并使用非配对双侧t检验进行两组之间的比较。用PPF1处理的小鼠比未处理的动物跑得显著更多，这是运动活动改善的指标。对小鼠进行热板测试以控制其爪中的正常疼痛感觉。失去知觉可影响先前的行为读数。如通过图20的加框部分所示的轮旋转的峰值所表明的，热板测试导致返回转轮笼环境后活动略有增加。

h.实施例8

向免疫功能低下的10.5月龄小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1 Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用重组人白蛋白(“rh白蛋白,”Albumedix,Ltd,Nottingham,UK)、澄清的年轻人血浆(“YP”)或盐水对照。在7天脉冲给药之前的第1周，所有动物均接受50mg/kg BrdU IP。将rh白蛋白和YP在注射用水(WFI，0.9％盐水)中稀释至50mg/mL。所有小鼠连续7天接受每剂150μL rh白蛋白、YP或盐水的IV注射。在处理的最后一天后6周处死小鼠。

图21A显示了如通过齿状回(“DG”)中BrdU标记细胞数测定的所有3个处理组中的细胞存活量。与盐水和rh白蛋白相比，年轻血浆显著增加了细胞存活率，而rh白蛋白对细胞存活率没有显著影响。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(***P<0.001，根据非配对t-检验)。

图21B显示了如通过齿状回(“DG”)中DCX阳性细胞数确定的所有3个处理组中的DCX染色量。与盐水和rh白蛋白相比，年轻血浆显著增加了神经发生，然而与盐水对照相比较rh白蛋白与细胞形成的增加相关。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(**P<0.01；***P<0.001，根据非配对t-检验)。

i.实施例9

将源自小鼠E16皮层的解离的混合神经元细胞铺板在48孔多电极阵列板(AxionBiosystems)上并在其上生长。每个孔包含有16个与铺板的神经元细胞物理接触，并测量细胞膜特性的细微变化的电极。此设置允许评估各种不同的参数，以获取关于单电极水平上的神经元放电活动和放电行为的信息，以及通过评估孔内多个电极间神经元放电特性的同步性而获取的关于神经元连接程度的信息。

从第1天开始，在存在处理条件的情况下维持神经元培养物。处理条件包括Neurobasal培养基+含10％(v/v)：重组人白蛋白((“rh白蛋白,”Albumedix,Ltd,Nottingham,UK)；PPF1；或HAS1的B27补充剂。PBS构成对照。在培养的第7天和第14天测量神经元活性。

图22显示，与对照、rh白蛋白或HAS1处理相比，7天的PPF1处理导致神经元网络活动增强。HAS1是在5％溶液(w/v，50g/L)中含有超过95％的人白蛋白(相对于总蛋白)的市售HAS，其通过冷酒精分级分离法制得的，并源于合并的来自供体的人血浆。PPF1和HAS1均以5％的溶液(w/v/，50g/L)存在，并将其在Neurobasal培养基+B27补充剂中以1:10稀释。PPF1对神经元网络活动的影响持续至培养14天。这表明PPF1与促进神经元网络成熟相关。数据显示为平均值±s.e.m。(*P<0.05，根据非配对t-检验)。

j.实施例10

向免疫功能低下的8周龄(年轻)小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1 Wjl/SzJ,“NSG”品系)施用澄清的老年人血浆(OP)或无菌盐水。在每个实验中，按重量将小鼠在处理组之间均化。连续5天给所有小鼠IP注射无菌PBS中的150mg/kg的BrdU。BrdU注射后，以不同的处理范式以每剂150μL IV施用老年血浆。所有范式都概述于图23中。

范式1涉及每周两次注射，在5周内总共进行10次注射。在最后一次血浆剂量后48小时进行组织学分析。范式2包括每周三次注射，在4周内总共进行10次注射，在最后一剂后48小时进行组织学分析。在范式3中，连续7天每天注射小鼠，并在最后一剂后48小时进行组织学分析。在范式4中，连续7天每天注射小鼠，并在最后一剂后21小时进行分析。分析了老年血浆处理的小鼠的脑的内皮炎症的标志物(海马中的VCAM-1)以及如通过齿状回中的双皮质素(DCX)阳性细胞所标记的新生神经元数量。在对30μm自由浮动切片进行免疫组织化学后，在Hamamatsu NanoZoomer HT(Hamamatsu)上对VCAM-1进行成像，并使用Image Pro软件(Media Cybernetics)进行分析。在Leica宽视场显微镜(Leica)上对齿状回中的DCX阳性细胞进行活计数。

海马中VCAM-1阳性面积百分比的分析(图24)显示，在每周两次给药(图24A)的情况下，在最后一次血浆施用后48小时，内皮炎症显著增加，并且在每周三次给药(图24B)和脉冲式给药(图24C)后内皮炎症均显著增加。在施用最后一个血浆剂量后21天，VCAM-1水平不再显著升高(图24D)。

只有在3至4周的时间段后才可能观察到对双皮质素的作用，因此在范式1、2和4中在齿状回中分析了DCX阳性细胞的数量。分析显示，对于每周两次(图25A)或每周三次(图25B)的给药范式，老年血浆对神经发生没有影响，然而连续7天的脉冲式给药(图25C)导致DCX阳性细胞数量显著减少。该数据表明，只有老年人血浆的脉冲式给药才对神经发生有重大影响。

k.实施例11

在最后一次注射老年血浆后4周，使用改良的Barnes迷宫测试了用老年人血浆(65-68岁来源)连续处理7天的八周龄NSG小鼠。图26显示了Barnes迷宫逃离时延时间过程，并报告了老年血浆和盐水处理的NSG小鼠到达和进入逃离洞的时间。两组之间的逃离时延没有显著差异，但在第4天，老年血浆处理的小鼠的表现不如盐水对照。该数据表明与海马功能相关的空间记忆任务中的学习和记忆下降。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。双因素ANOVA，Sidak事后检验)。

图27描述了第4天最近三次Barnes迷宫试验中的平均逃离时延。老年血浆处理的小鼠显示出趋向更高的逃离时延的趋势，表明记忆功能受损。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(非配对t-检验)。

图28描述了Barnes迷宫试验1与3之间在逃离时延上的差异，并表明这些试验可用作一天之内学习的度量。老年血浆处理的小鼠在这些试验之间的逃离时延上具有显著较低的差异，表明学习能力下降。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05，根据非配对t-检验)。

图29报告了qPCR的结果，该结果用于定量与神经发生和突触功能相关的不同标志物的mRNA水平。新生神经元的标志物双皮质素(DCX)的相对表达水平降低，这与同一标志物的组织学分析一致。另外，vglut1(囊泡谷氨酸转运蛋白1)(谷氨酸能突触的标志物)、突触标志物syn1(突触蛋白1)、tuj1(βIII微管蛋白)和bdnf(脑源性神经营养因子)水平也有下降的趋势。这些下降表明老年血浆注射小鼠的脑中突触和神经元网络整体受损。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05，根据非配对t-检验)。

l.实施例12

在处理组间按重量将免疫能力低下的年轻(8周龄)小鼠(NOD.Cg-PrkdscidIl2rgtm 1Wjl/SzJ,“NSG”品系)均化。用35mg/kg的无菌盐水中的红藻氨酸(Sigma)或盐水对照皮下(s.c)注射动物。外周红藻氨酸施用导致急性癫痫发作活动、海马的炎症以及在一个亚组的小鼠还导致海马CA1区的神经元丢失。红藻氨酸注射后两小时，给小鼠静脉内施用150μl的PPF1或盐水。每天继续施用PPF1或盐水，持续总共5天(图30)。在第6天收集组织用于分析。在对小神经胶质细胞激活(CD68)和星形胶质细胞激活(GFAP)进行免疫荧光染色后，分析了海马CA1区的炎症变化。在对30μm自由浮动切片进行免疫组织化学后，在Hamamatsu NanoZoomer HT(Hamamatsu)上对切片进行成像，并使用Image Pro软件(MediaCybernetics)进行分析。

对海马的CA1区中的CD68阳性面积百分比的分析表明，红藻氨酸施用导致CD68免疫反应性增强，表明小神经胶质细胞活动增加(图31A)。5天的PPF1施用导致CD68阳性面积百分比显著减少，因此导致小神经胶质细胞活动减少。类似地，GFAP阳性面积百分比的分析(图31B)显示在施用红藻氨酸后显著增加，所述GFAP阳性面积百分比在PPF1给药后显著减少。数据表明，PPF1在已用红藻氨酸给药的小鼠的脑中具有急性抗炎作用。*P<0.05，采用杜奈特多重比较事后分析的单因素ANOVA。

m.实施例13

每天以150μL(10mg/mL)的剂量用PPF1或盐水对照IV注射6月龄NSG小鼠，持续1周(7天)。在小鼠接受PPF1或盐水对照的同一天，每天用BrdU 50mg/kg的BrdU Ip处理所有所述小鼠。然后将小鼠分成两个群组。在同时用BrdU和PPF1处理7天后的第一天就处死了第一群组。第二群组在7天后处死，并且接受另外7天的每日BrdU施用。

图32显示了群组1和群组2(左至右)的齿状回中染色的细胞的数量。与盐水对照相比，两个群组在齿状回中均显示出增加的细胞增殖。(***p<0.001，非配对t-检验)。

n.实施例14

每天用PPF1或盐水媒介物IV注射3或6周龄NSG小鼠，持续1周(7天)。随后在施用7次日剂量后3天、10天或42天处死小鼠。将脑用Ki67染色，Ki67是仅存在于增殖性细胞中的一种核标志物，其可标记齿状回叶片中的神经干细胞和祖细胞。图33显示，在使用PPF1的连续7天脉冲给药方案结束后第10天，6月龄小鼠在齿状回中的总祖细胞(Ki67阳性或“Ki67+”)增加。图34显示了在使用PPF1的连续7天脉冲给药方案结束后第10天时的NSG小鼠的齿状回中的Ki67的染色(亮区)。这表明在停止给药后第42天，PPF1增加总细胞存活率和神经发生的一种可能的作用机理可能是由于总祖细胞(神经干细胞)的增加。

o.实施例15

向免疫功能低下的6月龄和12月龄小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)的两个不同群体施用市售PPF(“PPF1”)或盐水对照。在测试剂的7天脉冲给药之前的第1周中，所有动物均接受50mg/kg的BrdU。所有小鼠连续7天接受每剂150μL PPF1或盐水的IV注射。来自每个处理组的一个群组用于研究增殖，并在最后一剂施用后6周处死所述群组。

图35A报告了与盐水对照相比，用PPF1处理的6月龄小鼠的群组表现出分化为神经元(NeuN+)的祖细胞数量显著增加，并且与对照相比分化为星形胶质细胞(GFAP+)的祖细胞数量减少。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(**P<0.01，根据非配对t-检验)。

图35B报告了与盐水对照相比，用PPF1处理的12月龄小鼠群组表现出分化为神经元(NeuN+)的祖细胞数量显著增加，并且与对照相比分化为星形胶质细胞的祖细胞数量在统计学上无显著差异。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(**P<0.01，根据非配对t-检验)。

p.实施例16

向3月龄小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用澄清的老年人血浆(老年血浆)或无菌盐水。在每个实验中，按重量将小鼠在处理组之间均化。连续5天给所有小鼠IP注射150mg/kg的无菌盐水中的BrdU。在BrdU注射后，连续7天每天以每剂150μL IV施用老年血浆或无菌盐水，并在最后一剂后4周进行组织学分析。

图36描绘了最后一剂后4周BrdU标记的增殖性神经祖细胞的细胞命运。在注射了老年血浆的小鼠中，存活的BrdU标记细胞向神经元的分化明显少于向星形胶质细胞的分化。这表明，老年人血浆将年轻小鼠中的神经祖细胞的细胞命运朝向星形胶质细胞谱系改变(图37B)，并且负面地影响齿状回中的新生神经元的数量(图36A)(n＝12/组)。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(***P<0.001；****P<0.0001，根据非配对t-检验)。

q.实施例17

皮层激活。老年(18月龄)C57BL/6小鼠每天接受150ul PPF1或0.9％无菌盐水的IV注射，持续7天。在最后一次测试剂施用后两个半小时(2.5)小时，在用氯胺酮和甲苯噻嗪深度麻醉下通过用0.9％的盐水穿心灌注，随后用4％甲醛穿心灌注来处死小鼠。解剖大脑，进行后固定，然后用iDisco程序进行处理，以以2x 2x 3微米体素分辨率通过光片荧光显微镜(LSFM)使cFos阳性细胞可视化。将成像的大脑按3D体积对齐，并通过计算检测激活的cFos阳性细胞。通过利用错误发现率对多重比较进行了校正的负二项回归进行组间的统计比较(*表示小于0.05的q值)。

小鼠脑的分析显示，在用PPF1处理的18月龄小鼠中全脑以及皮层和同形皮层中cFos阳性细胞的数量总体增加(图37)。通过使用对多重比较进行了校正的二项回归，总cFos阳性数量的这些增加的差异没有达到显著性。然而，对更明确的皮层区域(诸如额叶皮层、眶皮层、下边缘皮层和前边缘皮层)的分析显示了表明神经元活动增强的cFos阳性细胞数量显著增加(图38)。前额叶皮层区中的活动增强与认知性能的增强相关，表明PPF1处理可导致老年的C57BL/6小鼠的认知能力改善。在副嗅核和嗅结节中也发现了cFos阳性细胞数量的类似的显著增加(图39)。这些区域与嗅觉信息的加工相关，并且活动的增强表明嗅觉功能增强。以红色标示的cFos激活的基于体素统计的可视化显示了用PPF1处理的小鼠的皮层中cFos信号增强(图40)。

r.实施例18

向22月龄野生型(WT)小鼠(C57BL/6J,“WT”，品系代码0664,Jackson Labs,BarHarbor,ME)施用市售PPF(“PPF1”)或盐水对照。在7天的脉冲给药之前的第1周中，所有动物均接受50mg/kg BrdU。随后，所有小鼠连续7天接受每剂150μL PPF1或盐水的IV注射。在最后一次PPF1或盐水注射后10天处死小鼠，并对脑进行处理以用于组织学研究。

图41A报告了海马中的CD68免疫反应面积百分比(n＝10，10)。图41B报告了海马中的Iba-1免疫反应面积百分比(n＝10，10)。图41C报告了海马中的GFAP免疫反应面积百分比(n＝10，10)。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05；**P<0.01，根据非配对t-检验)。这些结果表明PPF1处理的老年小鼠海马中的小神经胶质细胞标志物CD68和Iba-1明显减少。

s.实施例19

向23月龄野生型小鼠(C57BL/6J,“WT”，品系代码0664,Jackson Labs,BarHarbor,ME)施用市售PPF(“PPF1”)或盐水对照。在连续7天的脉冲给药之前的第1周中，所有动物均接受50mg/kg BrdU。随后，所有小鼠连续7天接受每剂150μL PPF1或盐水的IV注射。来自每个处理组的一个群组用于研究神经炎症的组织学标志物，并在最后一剂施用后6周处死所述群组。

图42A报告了在给药后6周、9周和12周与盐水对照相比的BrdU表达的变化百分比，这是海马中细胞存活的指标。用连续7天的脉冲式给药方案处理动物。

图42B报告了在给药后6周、9周和12周与盐水对照相比的双皮质素(DCX)表达的变化百分比，这是海马中神经发生的指标。用连续7天的脉冲式给药方案处理动物。

t.实施例20

将年龄在4至4.5月龄的三十(30)只雄性α-突触核蛋白转基因小鼠(品系61，野生型背景C57BL/6J)分成两组，每组15只，并用PPF1或媒介物处理连续七(7)天。以5μL/克体重IV施用PPF1处理。α-突触核蛋白小鼠充当帕金森氏病的转基因模型，并过表达α-突触核蛋白。与NSG小鼠不同，该转基因模型不是免疫功能低下的。

在最后一次PPF1或媒介物处理后1天，对所有小鼠进行了行为和运动功能测试，诸如筑巢、意大利面食啃咬、钢丝悬挂、旋转杆梁行走。在研究结束时，第二次进行了意大利面食啃咬、钢丝悬挂和横梁行走。测试以随机顺序进行。

每周对动物称重一次。图43A和图43B表明，PPF1处理与媒介物处理的(veh)α-突触核蛋白转基因小鼠(“Tg”)之间没有显著差异。

图44报告了筑巢的结果。将小鼠单独地关在笼子里，所述笼子里装有木屑垫层和一块方压制棉布(“小巢”)。没有其它筑巢材料(例如刨花)存在。在黑暗期开始前约2至3小时内，在评估巢状态的前一天引入小巢，并在实验的第二天在光照期开始后约2至3小时内评估下一个筑巢行为。对于所有检查，从引入棉方块至评估下一个状态之间的时间间隔是相同的。根据五点量表(Deacon,RM 2006,Assessing nest building in mice.Nat Protoc1:1117-19.)评估了小巢的操作和筑巢的构造。如图44所示，与媒介物处理的小鼠相比，PPF1处理的小鼠的筑巢行为有增加的趋势。

图45A和图45B显示在最后一次处理后3周，与媒介物处理组相比，PPF1处理组的意大利面食啃咬显著增加，表明运动改善(图45B)。该测试被开发来研究小型啮齿动物的运动缺陷。在测试之前至少2小时将动物带入实验室。移走笼子顶部、水瓶和食物颗粒，并将一小片干意大利面条(约5mm)放入笼子中。将麦克风放在面条片上。一旦动物开始进食，便开始记录。评估每次啃咬事件的啃咬次数和啃咬频率，并使用Avisoft SASLab Pro软件分析啃咬模式。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05，根据非配对t-检验)。

图46显示了钢丝悬挂测试的结果，该测试评估了运动强度的神经肌肉异常。在最后一次处理后3周，与媒介物处理组相比，PPF1处理组的至跌落的时间显著增加。为了进行测试，使用了钢丝笼盖，并在周围放置了布基胶带(duct tape)，以防止小鼠从壁架上走离。将动物放在笼盖的顶部。轻轻摇动盖子三次，以迫使小鼠抓住钢丝，然后将盖子翻转过来。将盖子保持在柔软的衬垫上方约50-60cm的高度，高度足以防止小鼠跳下，但高度又不足以在跌落时造成伤害。定量跌落的时延，并使用了300秒的截止时间。通常，野生型小鼠可以倒挂数分钟。

图47A、图47B和图47C描述了横梁行走测试的结果。图47A显示了在难度递增的五个不同试验中使用的不同横梁形状和尺寸(方形或圆柱形杆)。图47B描绘了最后一次处理后72小时五个试验的结果。图47C描绘了最后一次处理后3周的五个试验的结果。在测试1的试验5(处理后72小时)期间和测试2的试验4(处理后3周)期间，用PPF1处理的小鼠在横穿横梁方面显示出显著更高的成功率。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(**P<0.01，根据二项检验)。

图48A至图48F显示纹状体和海马染色的组织学结果。图48A报告纹状体CD68染色。图48B报告海马CD68染色。图48C报告纹状体Iba-1染色。图48D报告海马Iba-1染色。

图48E报告纹状体NeuN染色。图48F报告海马NeuN染色。这些附图表明，用PPF1处理的小鼠在纹状体和海马中均表现出通过Iba-1和CD68显示的小神经胶质增生(microgliosis)(神经炎症)减少，而在纹状体和海马中均表现出通过NeuN染色显示的神经元存活增加。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，根据非配对t-检验)。

u.实施例21

向12月龄小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm 1Wj1/SzJ,“NSG”品系)施用PPF1、HAS1或盐水对照。HAS1是在5％溶液(w/v，50g/L)中含有超过95％的人白蛋白(相对于总蛋白)的市售HAS，其通过冷酒精分级分离法制得的，并源于合并的来自供体的人血浆。除注明的以外，在本文的实施例中使用5％体内施用HAS1。连续7天每天通过以每剂150μL IV施用PPF1,HAS1或无菌盐水来注射小鼠，并在最后一剂后4周进行行为分析。

图49报告了PPF1、HAS1和媒介物处理的小鼠的小鼠进入逃离洞的Barnes迷宫逃离时延。PPF1处理的动物比媒介物处理的动物明显更快地发现逃离洞。该数据表明PPF1高效地增强了老年的NSG动物的认知能力，而HAS1处理对海马依赖性记忆没有影响。显示的所有数据均为平均值±s.e.m。(*P<0.05，根据非配对t-检验)。

v.实施例22

使用PPF的临床范式。

(1)轻度至中度AD。在总持续时间为6个月的研究的第1周和第13周，将具有轻度至中度AD的60岁或以上的男性和女性随机分配以每天一次接受100mL或250mL的PPF1，连续5天(“脉冲式给药”)。在2个5天的给药期中，受试者居住在住院观察室以有利于安全性评估，并且所有受试者均经历筛查访视、基线访视、治疗访视、随访访视以及研究结束/提前终止访视。每次访视都会进行安全性和耐受性评估。在基线时和给药后定期临时访视时进行神经认知和运动评估。

主要终点是每种给药方案的安全性、耐受性和可行性。安全性通过治疗突发不良事件的发生率来测量。耐受性通过在接受至少5次输注后8周完成的受试者和在接受至少10次输注后24周完成的受试者的数量来测量。研究的可行性通过完成5次和10次输注的受试者的数量来测量。次要终点使用各种已建立的认知测量(包括阿尔茨海默氏病评估量表-认知子量表)评估对认知的潜在影响。探索性终点包括基于血液的生物标志物的组成和分布的变化以及磁共振成像的变化的评估。

(2)轻度至中度AD。将两组经诊断患有轻度至中度AD的受试者以双盲方式随机接受积极治疗。所有受试者在持续总共6个月的研究的第1周和第13周期间连续5天每天接受一次随机剂量的输注。将受试者随机分为以下两个剂量水平之一：100mL和250mL的PPF1。给药组也按性别分层。施用持续时间为2–2.5小时，并按照剂量特异性指南滴定流速，使得能够施用整个剂量。

受试者参与任选的CSF生物标志物研究。此类受试者经历两次腰椎穿刺以采集CSF，第一次在初始给药之前，第二次在最终给药之后。在基线时进行神经认知和运动评估，以及在给药后进行定期临时评估。

确定每个给药方案的安全性、耐受性和可行性。在研究中确定并概括认知分数，包括：简明精神状态检查(MMSE)；11项阿尔茨海默氏病评估量表-认知子量表(ADAS-Cog/11)；凹槽钉板测试；归类流畅性测试(CFT)；临床痴呆评定量表–盒子总数(CDR-SOB)；阿尔茨海默氏病合作研究–日常生活活动(ADCS-ADL)；阿尔茨海默氏病合作研究–临床变化总体印象(ADCS-CGIC)；神经精神病学问卷调查表(NPI-Q)；和Savonix神经认知评估和数字广度。

(3)帕金森氏病。患有帕金森氏病和认知障碍的受试者被随机分为两组：2期的积极治疗和安慰剂。在研究的第1周内，受试者连续5天每天接受一次积极治疗或安慰剂治疗的输注(“脉冲式给药”)。在第13周中，两组均连续5天接受积极治疗，并且研究持续时间约为7个月。施用持续时间为2–2.5小时，并按照剂量特异性指南滴定流速，使得能够施用整个剂量。

确定每个给药方案的安全性、耐受性和可行性。这项研究总结了认知和运动功能，包括：MoCA；CDR-CCB上的注意力的连续性和强度、工作记忆和情景记忆；MDS-UPDRS3；MDS-UPDRS2；SE-ADL和CISI-PD。

应当理解，本发明不限于所描述的特定方面，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且无意是限制性的，因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求书。

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除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述示例性方法和材料。

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如在阅读本公开内容后对于本领域技术人员是很显然的，在不背离本发明的范围或精神的情况下，本文中描述的和举例说明的单个方面的每一个具有可容易地与另外几个方面的任一个的特征分开或组合的分立的组分和特征。任何所陈述方法均可以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

尽管为了理解清楚的目的已经通过说明和实例较详细地描述了上述发明，但是鉴于本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下可以对本发明作出某些改变和修改。

因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应理解，本领域的技术人员将能够设计不同的安排，其尽管未被本文明确地描述或显示，但体现了本发明的原理，且包含在其精神和范围内。此外，本文中引用的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由本发明者提供以推进现有技术的概念，而不被解释为限定于这些明确引述的实例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和方面以及其具体的实施例的所有声明意欲包括其结构和功能等同物。

另外，期望此类等效物包括目前已知的等同物和未来开发的等效物，即无论结构如何，进行相同功能的开发的任何元件。因此，本发明的范围不意图限于本文所示和描述的示例性方面。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。

Claims (16)

1.一种治疗经诊断患有认知障碍的受试者的方法，所述方法包括使用脉冲给药给药方案施用有效量的血浆级分。

2.如权利要求2所述的方法，其中所述血浆级分是血浆蛋白质级分。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述血浆蛋白质级分包含83％至95％的白蛋白。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述血浆蛋白质级分是市售血浆蛋白质级分。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述血浆级分是富含蛋白质的血浆蛋白质制品。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血浆级分源自年轻个体的集合的血浆。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从哺乳动物血液制品产生所述血浆级分。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物血液制品是人血液制品。

9.一种治疗经诊断患有认知障碍的受试者的方法，所述方法包括使用脉冲给药给药方案施用有效量的年轻血浆。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述受试者的改善的认知功能。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血浆级分或年轻血浆源自年轻个体的集合。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脉冲给药给药方案包括连续五天至七天施用所述血浆级分或年轻血浆。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在已完全施用所述脉冲式给药给药方案之后，所述受试者遵循锻炼方案。

16.一种用于治疗受试者的认知障碍的工具包，所述工具包包括包含如权利要求1至8和13中任一项所述的血浆级分的容器。

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