CN110702563A - 一种无标记化学生物反应检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无标记化学生物反应检测方法,包括:S100,使管道中充满电解质溶液;S200,选取能与目标分子B发生反应的受体分子A,并在管道内壁修饰受体分子A;S300,在管道内通入分散相使其形成分散相区域,并将其保持在管道内;S400,测量并记录分散相区域在管道内的接触角,以及与目标分子反应前管道内溶液的总阻抗;S500,使可能含有目标分子B的溶液或流体进入管道,与受体分子A进行反应;S600,重复步骤S300到步骤S400,对比反应前后分散相的接触角及阻抗变化:若变化较大则溶液或流体中含有目标分子B;否则,不含目标分子B。本发明是一种低成本、高灵敏度、快速、无需标记的对化学生物分子反应的无标记检测方法。
Description
技术领域
本发明属于化学生物传感器的领域,具体涉及一种无标记化学生物反应检测方法。
背景技术
许多分子或分子团簇之间存在化学生物反应,例如抗原抗体之间的特异性结合,可用于化学分析、生物医疗、免疫诊断等领域的研究。用于检测这类分子反应的传统方法如荧光免疫检分析、放射免疫分析(RIA),一般都存在检测工序繁琐、检测效率低、检测成本高等局限性。利用酶可以代替荧光标记分子或同位素标记物,通过检测连接在抗原或抗体上的酶活性来测定分子反应,常见的如酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等等。
随着显微技术和纳米加工技术的发展,基于硅、多晶硅及硅的氧化物(玻璃)等材料制成的纳米通道开始被应用于免疫检测。相比传统的生物化学检测手段,利用纳米孔道检测分子反应属于物理检测方法。纳米孔道内壁存在双电层,由带电离子组成的双电层发生重叠,会对孔道内的阻抗产生影响。由于待检测的分子或反应后形成的分子上往往带有电荷,在纳米孔道壁上发生结合时伴随有电荷的变化,在反应前后对纳米通道进行电测量,可以检测到阻抗的显著变化,这就是纳米流体检测的实现原理。但固体纳米通道本身存在一些限制,如制备成本较高,制作难度大,需要使用强腐蚀剂作为刻蚀的试剂,操作时比较危险,对环境也有一定的污染等等。
发明内容
针对传统化学生物分子反应检测方法的高成本、高技术壁垒、检测时间缓慢、检测灵敏度偏低等问题,本发明提出一种无标记化学生物反应检测方法,是一种低成本、高灵敏度、快速、无需标记、低样本量损耗的对化学生物分子反应的无标记检测方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术手段:
一种无标记化学生物反应检测方法,包括以下步骤:
S100,使管道中充满电解质溶液;
S200,选取能与目标分子B发生反应的受体分子A,并在管道内壁修饰受体分子A;
S300,在管道内通入分散相使其形成分散相区域,并将其保持在管道内;
S400,测量并记录分散相区域在管道内的接触角,以及有分散相存在时管道内溶液的总电阻;
S500,使可能含有目标分子B的溶液或流体进入管道,与受体分子A进行反应;
S600,重复步骤S300到步骤S400,对比反应前后分散相的接触角及阻抗变化:
若变化较大则溶液或流体中含有目标分子B;否则,不含目标分子B。
步骤S100具体是将一段圆柱形管道的一端插入装有电解质水溶液的水池中,并在另一端提供压力使管道中充满电解质溶液。
所述的受体分子A采取涂敷、浸泡或其他任意可行的修饰方式修饰在管道内壁。
所述的管道为圆柱形管道,管道材质为透明或半透明材料。
所述的电解质为中性的强电解质盐或缓冲盐。
所述的目标分子B和受体分子A是能够发生反应的化学或生物分子,反应包括任何伴随有电荷或亲疏水性等能够引起阻抗变化的过程。
所述的分散相为不易溶于溶液的分散相。
所述的分散相形成的分散相区域长度不应短于管道直径;分散相区域可为气体、液体、固体等任何不相溶物质。
所述的接触角为分散相在水相表面的接触角,并在反应前后发生变化;反应前后的液膜阻抗发生变化,测量这一变化进行定性和定量分析,可以确定反应的进行。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的检测方法可以检测一切有电荷量变化或亲疏水性变化的分子反应,反应前后的电荷变化或亲疏水性变化可分别用薄膜通道的电阻变化或接触角的变化来鉴定,避免了传统检测手段的标记过程。与固体纳米通道相比,一方面由于利用到了分子反应带来的亲疏水性的变化,使检测具有高灵敏度;另一方面在管道内进行分子修饰和反应,比直接在狭小的固态通道内更简便易行且快捷。本检测方法,也适用于几乎所有的分子检测情况,而这主要取决于所选的反应分子的类型,理论上可以完成免疫反应检测,气体检测或其他任何涉及界面电荷或接触角变化的检测工作。
进一步,由于分散相的获取更为简单,只需要向与溶液相连通的圆柱形管道内注入分散相,即可得到纳米通道,检测所需主要材料成本极低,制备无需特殊的加工步骤。不同分子的修饰以及相互反应是在圆柱形管道的内壁,而通道尺寸可以在微米量级甚至更大,修饰的操作工艺更加简便易行,更容易避免分子在传统纳米通道的缓慢扩散,加快了检测分子反应的速度,提高了检测效率。
进一步,能够在反应的初始阶段即具有即有浸润性和阻抗的变化,从而能在反应早期检测到化学、生物反应差异,缩短了检测所需时间。
进一步,由于反应发生在狭窄的管道内表面,能够针对较小含量的样品(小至pL甚至以下)进行检测,降低了样本量的损耗。
进一步,检测依据的阻抗变化不受环境盐浓度的影响,无需对待测液体盐浓度进行选择性和预处理,如可直接用于血液检测(生理盐水浓度),简化了检测步骤,提高了检测速度。
进一步,对于任何涉及电荷或亲疏水性变化的化学或生物的分子反应,理论上都可以用本检测手段实现检测,并且具有前述的检测优点。任何能够满足在界面产生浸润性变化或阻抗变化的受体分子和目标分子均可进行检测。
附图说明
图1分散相在圆柱形管道内形成的薄膜通道示意图,用于进行分子反应检测。1为圆柱形管道,2为水溶液,3为分散相区域。
图2圆柱形管道的功能性表面示意图,受体分子与目标分子在此界面(固/液界面)上进行结合。其中1为管道,2为由溶液形成的薄膜通道,3为分散相区域,4为修饰在管道和薄膜通道界面处的受体分子,5为可与4反应的目标分子,可来自于连续相,也可来自分散相。
图3薄膜通道检测到目标分子后分散相的变化示意图,即分子反应前后,分散相在通道中的接触角发生变化。1为可测量阻抗变化的仪表,记录并监测反应前后的阻抗变化,来进行反应检测。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的结构和工作原理作进一步详细说明。
本发明一种化学或生物分子反应的检测方法,这里反应包含任何引起分散相在连续相界面引起阻抗变化的反应。包括步骤如下:
步骤1:将一段圆柱形透明管道的一端插入装有电解质水溶液的水池中,并使管道中充满带检测溶液;
步骤2:选取一对可发生反应的分子:受体分子A和目标分子B,通过修饰管道内壁修饰受体分子A;
步骤3:利用溶液和气体在圆柱形管道内形成气泡,在管道两端口控制液体所受压力平衡以使气泡保持在管道内;或使其他分散相在溶液中形成一个分散相区域,并将其保持在管道内;
步骤4:测量并记录此时分散相在管道内的接触角,以及分子反应前有分散相存在时管道内溶液的阻抗;
步骤5:使可能含有目标分子B的溶液或流体进入管道,与受体分子A反应一段时间;
步骤6:重复步骤3到4,对比反应前后气泡的接触角及阻抗变化,如果有较大差别即证明溶液或流体中含有目标分子B;否则,不含目标分子B。
本检测方法利用的是分散相在圆柱形管道内形成的“薄膜纳米通道”进行一类分子反应的检测,此类分子反应会引起接触角的变化,利用接触角在反应前后的变化,能够采用电/阻抗检测以及接触角观察等方式进行反应的测量,最终实现检测目的。
具体的,各个步骤中的注意事项如下:
步骤1所用圆柱形管道可选玻璃、有机玻璃等硬质材料,材料类型不限,材质应为透明或半透明,以便控制管道内的分散相及测量接触角;管道长度不限,管口内直径不限。管道一端浸入装有电解质水溶液的水池,所用电解质一般为中性的强电解质盐或缓冲盐,以维持酸碱度平衡。管道另一端可连接压力泵或也浸入装有溶液的水池,保证管道内可以充满溶液及满足后续注入分散相的需求。
步骤2中所选反应分子不限,可以为任意一对或多对可发生反应的化学或生物分子,所选分子决定了薄膜通道最后可实现的检测功能,例如选择冠醚和钾离子、APTE与二氧化碳、抗原和抗体、病毒和病毒抗体等。这里反应表示在含有各种分子的混合体系中,一种分子只与某一种分子结合反应。两种分子的反应伴随有可检测的显著变化如电荷或亲疏水性的变化等,如一种分子携带额外的可水解化学基团,或一对分子的可水解化学基团可相互反应至电中性,或两种分子的亲疏水性有差异等等。其中之一的分子可修饰在管道内壁,并保持稳定存在。
步骤3中所用分散相可选任意不易溶于溶液的分散相,除非有特殊要求如检测目标分子即为分散相的分子。分散相形成的分散相区域长度不限,为形成薄膜纳米通道,避免缩成球状,长度不应短于管道直径。
步骤4所测接触角为分散相在水相表面的接触角,可用摄像机记录并测量(微米级的较小分散相区域可用显微镜观察并测量),以便后续反应后进行对比。测量液膜的阻抗,测量结束后将分散相排出管道,准备进行分子的反应。
步骤5中将可能含有目标分子的溶液注入管道内保持或使之流动,具体反应方式不限,反应条件不限,反应时间应以两种分子可充分反应为前提,保证如果存在待检测目标分子,受体分子应来得及与其接触结合。
步骤6反应结束后再次向管道内注入分散相,待其稳定后观察测量接触角,测量反应后液膜的阻抗,对比接触角或液膜阻抗的变化,从而确认所检测目标分子的存在。
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述:
这里以生物素与亲和素分子的反应为例。首先按照前述的步骤2,将含有200nMFITC-SAv分子的HEPES溶液注入毛细管,修饰内壁。同时也可以观察到,在链霉亲和素反应前后,气泡在毛细管内的接触角从50°变为28°,接触角的变化带来了液膜厚度的变化,从而导致了更显著的液膜电导变化。
通过使用不同浓度的磷酸盐溶液产生气泡,测量气泡液膜的电导,发现在0.1×PBS~10×PBS范围内,薄膜通道在高浓度溶液中的检测利用的是毛细管壁的浸润性变化,反应前后的电导变化最高达到200以上。而固体通道检测仅仅能在低浓度发生,并且灵敏度是4左右,由此可见液体薄膜传感能够将检测灵敏度提高了2个数量级。在测试薄膜通道所能检测的链霉亲和素的浓度时,发现最低可以检测到10nM的链霉亲和素分子。生物素与链霉亲和素分子的反应需要一定的时间,对于200nM的链霉亲和素分子,使用固体纳米通道完全反应至可以检测到需要1小时以上。在利用薄膜纳米通道检测200nM的链霉亲和素分子时,将链霉亲和素分子的溶液以35毫米/秒的速度注入毛细管,10分钟电导变化60倍,即可以检测到显著的电导变化。
所以,采用本发明具有以下优点:
低技术成本与经济成本:由于分散相的获取更为简单,只需要向与溶液相连通的圆柱形管道内注入分散相,即可得到纳米通道,检测所需主要材料成本极低,制备无需特殊的加工步骤。不同分子的修饰以及相互反应是在圆柱形管道的内壁,而通道尺寸可以在微米量级甚至更大,修饰的操作工艺更加简便易行,更容易避免分子在传统纳米通道的缓慢扩散,加快了检测分子反应的速度,提高了检测效率。
检测时间快速:反应开始即有亲疏水性的变化,从而可以观测测量到反应引起的差异,因此能够在反应达到平衡之前的初始阶段实现检测,缩短了检测所需时间。
高灵敏度:通过接触角以及薄膜液体的变化,能够产生较大的阻抗差异,实现高灵敏度的检测。
无需标记:检测反应的发生依据接触角或阻抗变化,无需任何用于识别反应进行的标记物,免除了繁琐的标记过程,使检测更简捷。
适用于各种盐浓度:检测依据的接触角变化不受环境盐浓度的影响,无需对环境盐浓度进行预处理,简化了检测步骤,增强了检测准确度。
低样本损耗:该方法能够针对较小含量的样品(小至pL甚至更小)进行检测,降低了样本量的损耗。
适用于多种化学及生物反应检测:对于任何涉及电荷或亲疏水性变化的化学或生物的分子反应,理论上都可以用本检测手段实现检测,并且具有前述的检测优点。具体的检测功能取决于所选的受体分子和目标分子类型,换用不同的分子可以完成免疫反应检测、气体检测或其他任何涉及界面电荷或接触角变化的检测工作。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方案进行修改或者等同替换,而这些并未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换,其均在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (9)
1.一种无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S100,使管道中充满电解质溶液;
S200,选取能与目标分子B发生反应的受体分子A,并在管道内壁修饰受体分子A;
S300,在管道内通入分散相使其形成分散相区域,并将其保持在管道内;
S400,测量并记录分散相区域在管道内的接触角,以及有分散相存在时管道内溶液的总电阻;
S500,使可能含有目标分子B的溶液或流体进入管道,与受体分子A进行反应;
S600,重复步骤S300到步骤S400,对比反应前后分散相的接触角及阻抗变化:
若变化较大则溶液或流体中含有目标分子B;否则,不含目标分子B。
2.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,步骤S100具体是将一段圆柱形管道的一端插入装有电解质水溶液的水池中,并在另一端提供压力使管道中充满电解质溶液。
3.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的受体分子A采取涂敷、浸泡或其他任意可行的修饰方式修饰在管道内壁。
4.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的管道为圆柱形管道,管道材质为透明或半透明材料。
5.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的电解质为中性的强电解质盐或缓冲盐。
6.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的目标分子B和受体分子A是能够发生反应的化学或生物分子,反应包括任何伴随有电荷或亲疏水性等能够引起阻抗变化的过程。
7.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的分散相为不易溶于溶液的分散相。
8.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的分散相形成的分散相区域长度不应短于管道直径;分散相区域可为气体、液体、固体等任何不相溶物质。
9.根据权利要求1所述的无标记化学生物反应检测方法,其特征在于,所述的接触角为分散相在水相表面的接触角,并在反应前后发生变化;反应前后的液膜阻抗发生变化,测量这一变化进行定性和定量分析,可以确定反应的进行。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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