CN110658269A - 一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法 - Google Patents

一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属医学检验领域，涉及体内酶活性的分析测定方法，具体涉及一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法。本发明方法包括，对人血样经外周血单个核细胞提取及体外酶促反应后，液相色谱柱分离后，用紫外检测器进行检测。该法样品取样少，测定速度快，专属性强，分析结果准确，精密度高，可适用于临床上次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶抑制药物的药效学研究，以及有助于促进相关药物的个体化给药。

Description

一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法
技术领域
本发明属医学检验技术领域，涉及体内酶活性的分析测定方法，具体涉及一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法。
背景技术
现有技术公开了次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(inosine 5’-monophosphatedehydrogenase，IMPDH)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，NAD)依赖酶，广泛存在于全身各分化细胞。研究表明，IMPDH是嘌呤代谢过程中的限速酶，可催化次黄嘌呤核苷酸(inosine monophosphate，IMP)转化生成黄嘌呤核苷酸(xanthosine monophosphate，XMP)，继而合成鸟嘌呤核苷酸，在细胞的生长、分化和凋亡中起着重要作用；IMPDH被抑制时可导致细胞内鸟嘌呤核苷三磷酸储存量的消耗，减缓炎症部位与异体组织内单核细胞和淋巴细胞的增殖与补充。
目前上市的IMPDH相关药物主要是IMPDH抑制剂，包括麦考酚酸(mycophenolicacid，MPA)制剂、咪唑立宾、利巴韦林和NAD类似物等，其应用于抗免疫排斥、抗肿瘤、抗病毒或抗寄生虫等领域。临床实践显示，IMPDH抑制剂的血药浓度与临床疗效之间存在一定关联性，但该关联的个体间变异常较大，测定IMPDH活性可作为一种监测其药物效应的有效手段，但目前临床检测中，尚缺乏准确、灵敏、简便的测定外周血中IMPDH酶活性的方法。了解患者体内IMPDH抑制水平，可有助于弥补血药浓度监测的局限性，更全面地描述患者特异性的剂量-浓度-效应关系，进一步辅以优化药物治疗方案。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种体内酶活性的分析测定方法，具体涉及一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种体内酶活性的分析测定方法，具体涉及一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法。本方法能准确、灵敏、简便的测定外周血中IMPDH酶活性，所用设备和试剂易得，操作便捷，血液用量少，适用于临床药效学研究，进一步为IMPDH抑制药物的个体化给药提供参考。
本方法的目的通过下述技术方案施现：
从静脉血中提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，进行体外酶促反应，采用高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)及紫外检测器同时检测细胞内含物腺嘌呤核苷酸(adenosinemonophosphate，AMP)和酶促反应产物XMP，并通过以下公式计算IMPDH酶活性：
Figure BSA0000166403090000021
本发明的测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法，其包括：
1)样品预处理
PBMC提取：取肝素抗凝外周血，使用淋巴细胞分离液进行细胞提取，PBS缓冲液清洗后得到PBMC细胞沉淀，-80℃冻存；
体外酶促反应：取冻存PBMC细胞于室温融解，加入孵育液进行体外酶促反应，终止反应后离心取上清液进样；
2)样品分离与测定
采用极性的C18柱(CNW Athena C18-W)，通用型的紫外检测器以及高压泵，含离子对试剂酸性流动相等度洗脱(pH＝5.0～6.0)，分别检测AMP和XMP的峰面积，用标准曲线方程计算出浓度并扣去空白，再根据公式计算得到IMPDH的酶活性值。
本方法中，使用细胞内含物AMP的浓度对提取的PBMC数量进行标准化，同时还通过平行操作扣除空白的方法消除外源AMP可能产生的干扰，且由于AMP与XMP浓度可在相同条件下进行定量测定，能提高所述方法的准确性和稳定性。
具体的，
本发明的测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法，其包括步骤：
步骤一：PBMC提取
①取适量肝素抗凝静脉血，加入等量PBS缓冲液稀释混匀，另取1～1.5倍血样(未稀释)体积的淋巴细胞分离液，将稀释血样小心加至淋巴细胞分离液上层，20℃下缓升缓降、水平离心(400～800g，40～20min)；
②取中间单核细胞层，加适量PBMC清洗，20℃下500～800g离心10min，弃去上清液；
③重复清洗两次，在细胞沉淀加入适量超滤水，吹打混匀，分装，于-80℃冻存备用；
步骤二：体外酶促反应
①取适量PBMC冻存液，室温放置约30min待其溶解后，加入3倍体积孵育液，底物IMP浓度0.5～1.0mmol/L，辅酶NAD浓度0.5～1mmol/L，涡旋混匀30s，37℃下振摇进行酶促反应；
②另取6份适量1mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，加入3倍体积不含底物和辅酶的孵育液，涡旋混匀30s，37℃下振摇进行酶促反应；
③反应90～150min后取出孵育体系，加入等体积的4℃乙腈，涡旋混匀1min。14000g下离心10min，取上清液进样；
步骤三：HPLC测定
色谱条件为：
①谱柱：CNWAthena C18-WP色谱柱(150×4.6mm，3μm)；
②流动相：甲醇∶(5～10mmol·L-1 KH2PO4+0.3～0.8mmol·L-1 TBAS)＝15∶85(v/v)pH＝5～6；
③进样量：10～20μL；
④温：35℃；
⑤流速：1.0mL·min-1的情况下，
紫外检测器(波长245nm)检测AMP和XMP的峰面积，用标准曲线方程计算AMP和XMP浓度。其中AMP浓度需扣除BSA样品中AMP浓度均值，最后采用公式计算得到IMPDH的酶活性值。
本发明方法快速准确、操作便捷、灵敏度高，测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定，外周血中AMP和XMP测定的线性范围均为2.0～100.0μmoL/L，测定偏差均在±15％以内，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于10％，可适用于IMPDH酶活性的测定，有利于在临床开展常用IMPDH抑制药物MPA等的药效学研究。
附图说明
图1：IMPDH作用原理。
图2：典型色谱图：其中，A：空白基质BSA色谱图；B：20μmoL/LAMP和XMP标准品色谱图；C：健康志愿者血样色谱图；D：肾移植患者服用麦考酚钠肠溶片(EC-MPS)(1180mg bid)、他克莫司和泼尼松的血样色谱图。
具体实施方式
实施例1：测定健康志愿者外周血中IMPDH酶活性
血液样品预处理：取2.0mL肝素抗凝静脉血加入2.0mL PBS缓冲液混匀，加到3.0mL淋巴细胞分离液上层，20℃下400g离心40min，移取单核细胞层，加入6mL PBS，吹打使细胞悬浮，20℃下500g离心10min，弃去上清液，加入3mL PBS再次清洗，在得到的细胞沉淀中加入200μL超滤水，吹打混匀后分装至1.5mL EP管中，每管体积为50μL，于-80℃冻存30min；
取50μL PBMC冻存液，室温融解后，加入150μL孵育液，底物IMP浓度1.0mmol/L，辅酶NAD浓度1mmol/L；另取6份50μL 1mg/mL BSA加入150μL不含底物和辅酶的孵育液，涡旋混匀30s后，37℃下振摇进行酶促反应，150min后取出孵育体系，加入200μL 4℃乙腈，涡旋混匀1min，14000g下离心10min，取上清液10μL进样，采用外标法以峰面积定量；
色谱条件：色谱柱CNW Athena C18-WP色谱柱(150×4.6mm，3μm)；流动相采用甲醇-(5mmol·L-1KH2PO4+0.3mmol·L-1 TBAS)(15∶85，V/V)等度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；紫外检测波长256nm；
专属性：取1mg/mL BSA溶液、不同来源的6名健康志愿者血样，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现空白替代基质和内源性物质对AMP与XMP测定有干扰。此外，常见合并用药他克莫司、泼尼松、托拉塞米、氨氯地平、美托洛尔、兰索拉唑、奥美拉唑和伏立康唑等对测定组分亦无干扰。AMP和XMP的典型色谱保留时间分别为分别为9.609和12.104min，一个色谱分析周期为15.0min；
线性试验：取1mg/mL BSA溶液作为替代基质，加入适量AMP和XMP储备液配制成两者浓度均为2.0-5.0-20.0-50.0-75.0-100.0μmol/L的标准溶液，各取50μL加入150μL不含底物与辅酶的孵育液进行酶促反应后，进样到液相色谱系统进行分析，测得AMP和XMP的色谱峰面积。分别以AMP和XMP的浓度为横坐标X(μmol/L)，以其对应AMP的峰面积和XMP的峰面积为纵坐标Y，采用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，得到两者的标准曲线分别为：AMP Y＝1080X-99.8，r＝0.999；XMP Y＝645X-395，r＝0.999；
准确度和精密度：在BSA溶液中加入适量AMP和XMP储备液配制成两者浓度均为4.0-40.0-80.0μmol/L的质控溶液，取BSA溶液与质控溶液各50μL，加入150μL孵育液进行酶促反应后，进样到液相色谱系统进行分析，考察日内和日间的精密度和准确度。，计算每种浓度的实测平均值、偏差(RE)和相对标准差(RSD)，其中(实测浓度-理论浓度)/理论浓度×100％为偏差；
表1显示了替代基质中AMP和XMP的日内、日间精密度和准确度。结果表明两种待测物的日内和日间精密度均小于10％，偏差小于±15％；
表1替代基质中AMP与XMP分析测定准确度与精密度
Figure BSA0000166403090000051
Figure BSA0000166403090000061
IMPDH酶活性精密度：采集6名健康志愿者的肝素抗凝全血各2mL，按照“血液样品预处理”方法操作，测得的AMP和XMP色谱峰面积，根据标准曲线计算质控溶液中各组分浓度，并扣除BSA空白样品中AMP浓度得到最终的实测浓度，计算IMPDH酶活性的平均值与相对标准差(RSD)。
表2显示了健康志愿者外周血中的IMPDH酶活性与精密度，结果表明其精密度均小于15％。
表2健康志愿者IMPDH酶活性测定结果
实施例2：测定肾移植患者外周血中IMPDH酶活性
血液样品预处理：
取2.0mL肝素抗凝静脉血加入2.0mL PBS缓冲液混匀，加到3.0mL淋巴细胞分离液上层，20℃下400g离心40min，移取单核细胞层。加入6mL PBS，吹打使细胞悬浮，20℃下500g离心10min，弃去上清液，加入3mL PBS再次清洗，在得到的细胞沉淀中加入200μL超滤水，吹打混匀后分装至1.5mL EP管中，每管体积为50μL，于-80℃冻存30min；
取50μL PBMC冻存液，室温融解后，加入150μL孵育液，底物IMP浓度0.5mmol/L，辅酶NAD浓度0.5mmol/L；另取6份50μL 1mg/mL BSA加入150μL不含底物和辅酶的孵育液。涡旋混匀30s后，37℃下振摇进行酶促反应，120min后取出孵育体系，加入200μL 4℃乙腈，涡旋混匀1min，14000g下离心10min，取上清液10μL进样，采用外标法以峰面积定量；
色谱条件：
色谱柱CNWAthena C18-WP色谱柱(150×4.6mm，3μm)；流动相采用甲醇-(6.25mmol·L-1KH2PO4+0.5mmol·L-1TBAS)(15∶85，V/V)等度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；紫外检测波长256nm；
专属性：
取1mg/mL BSA溶液、2名服用EC-MPS肾移植患者血样，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现空白替代基质和内源性物质对AMP与XMP测定有干扰。此外，实施示例1所列常见合并用药对测定组分亦无干扰。AMP和XMP的典型色谱保留时间分别为分别为9.741和12.000min，一个色谱分析周期为15.0min；
线性试验：
取1mg/mL BSA溶液作为替代基质，加入适量AMP和XMP储备液配制成两者浓度均为2.0-5.0-20.0-50.0-75.0-100.0μmol/L的标准溶液，各取50μL加入150μL不含底物与辅酶的孵育液进行酶促反应后，进样到液相色谱系统进行分析，测得AMP和XMP的色谱峰面积，分别以AMP和XMP的浓度为横坐标X(μmol/L)，以其对应AMP的峰面积和XMP的峰面积为纵坐标Y，采用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，得到两者的标准曲线分别为：AMPY＝1050X-198，r＝0.999；XMPY＝624X-233，r＝0.997；准确度和精密度
在BSA溶液中加入适量AMP和XMP储备液配制成两者浓度均为4.0-40.0-80.0μmol/L的质控溶液，取BSA溶液与质控溶液各50μL，加入150μL孵育液进行酶促反应后，进样到液相色谱系统进行分析，考察日内和日间的精密度和准确度，计算每种浓度的实测平均值、偏差(RE)和相对标准差(RSD)，其中(实测浓度-理论浓度)/理论浓度×100％为偏差；
表3显示了替代基质中AMP和XMP的日内、日间精密度和准确度。结果表明两种待测物的日内和日间精密度均小于10％，偏差小于±15％。
表3替代基质中AMP与XMP分析测定准确度与精密度
Figure BSA0000166403090000081
IMPDH酶活性精密度：
采集2名服用EC-MPS肾移植患者的肝素抗凝全血各2mL，按照“血液样品预处理”方法操作，测得的AMP和XMP色谱峰面积，根据标准曲线计算质控溶液中各组分浓度，并扣除BSA空白样品中AMP浓度得到最终的实测浓度，计算IMPDH酶活性的平均值与相对标准差(RSD)。
表4显示了肾移植患者服药后不同时间点外周血中的IMPDH酶活性。
表4服用EC-MPS肾移植患者IMPDH酶活性测定结果
Figure BSA0000166403090000091

Claims (5)

1.一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)酶活性的方法，其特征在于，其包括，血样经外周血单个核细胞(PBMC)提取和体外酶促反应后，采用高效液相色谱HPLC分离及紫光检测器检测，计算IMPDH酶活性：包括以下步骤：
1)样品预处理
PBMC提取：取肝素抗凝外周血，使用淋巴细胞分离液进行细胞提取，PBS缓冲液清洗后得到PBMC细胞沉淀，-80℃冻存。
体外酶促反应：取冻存PBMC细胞于室温融解，加入孵育液进行体外酶促反应，终止反应后离心取上清液进样；
2)样品分离与测定
采用极性的C18柱(CNW Athena C18-W)，通用型的紫外检测器以及高压泵，含离子对试剂酸性流动相等度洗脱(pH＝5.0～6.0)，分别检测AMP和XMP的峰面积，用标准曲线方程计算出浓度并扣去空白，再根据公式计算得到IMPDH的酶活性值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
通过下述公式计算IMPDH酶活性：
Figure FSA0000166403080000011
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用细胞内含物AMP的浓度对提取的PBMC数量进行标准化，同时通过平行操作扣除空白的方法消除外源AMP产生的干扰。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的酶促反应条件中，IMP和NAD浓度为0.5～1.0mmol/L，孵育时间90～150min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，
色谱条件是，色谱柱采用CNW Athena C18-WP柱(150×4.6mm，3μm)；
流动相采用甲醇-(5～10mmol·L-1 KH2PO4+0.3～0.8mmol·L-1 TBAS)(15∶85，V/V)等度洗脱；
流速1.0ml/min；柱温35℃；紫外检测波长256nm。
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