CN110655560A - T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽及其应用 - Google Patents

T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽及其应用 Download PDF

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CN110655560A CN201810711797.4A CN201810711797A CN110655560A CN 110655560 A CN110655560 A CN 110655560A CN 201810711797 A CN201810711797 A CN 201810711797A CN 110655560 A CN110655560 A CN 110655560A
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Abstract

本发明属基因工程技术领域，涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(P17)及其应用，本发明通过溶解度测定发现P17能提高三种不同单链抗体在大肠杆菌中的溶解度2‑8倍；该P17连接于原核表达的单链抗体氨基或羧基末端均能提高所述单链抗体的溶解度；通过缺失突变和点突变发现P17多肽的氨基和羧基末端序列以及位于羧基末端的α螺旋二级结构为其促溶作用所必需；偶联了P17多肽的单链抗体仍能高效结合靶抗原。所述P17多肽可用于制备提高大肠杆菌表达有结合活性的可溶性单链抗体产量的多肽或其他制品中。

Description

T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽及其应用
技术领域
本发明书基因工程技术领域，涉及一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用
背景技术
研究表明，抗体(Antibody，Ab)是由浆细胞分泌且能特异性识别外来抗原(如细菌和病毒等)的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，其由两条重链和两条轻链通过非共价键和二硫键结合组装成Y形蛋白；抗体重链和轻链可变区都包含能特异识别抗原表位的互补决定区(Complementary determining region，CDR)；而重链羧基末端的2或3个恒定区形成可结晶区域片段(Fragment crystallizable region，Fc)，后者介导诸多免疫调节功能(如激活免疫细胞和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)。研究显示，单克隆抗体(Monoclonalantibody，mAb)只识别某一特定抗原表位。因其均一性和特异性高而在诊断和治疗中广泛应用。目前mAb主要通过杂交瘤技术制备，mAb分子量约150kDa，组织和细胞渗透性较差；不同种属来源mAb(主要为Fc区)在人体使用时可诱生免疫反应；另外，目前mAb的生产成本还较高。
随着基因工程技术的发展，mAb已被改造成具有不同特征的多种衍生物，它们包括抗原结合片段(antigen binding fragment，Fab)、可变区抗体(variable fragment，Fv)、单链抗体(single chain variable fragment，scFv)和纳米抗体等；scFv是将mAb的轻、重链可变区经一柔性多肽连接而成的重组蛋白。一般地，scFv和初始mAb识别和结合相同的抗原表位，但scFv分子量更小(约30kDa)，因此组织渗透能力更强；而且scFv不会引发Fc段介导的免疫反应，这些优点使scFv在生物检测、细胞内免疫、影像诊断和靶向治疗等领域具有较高的应用价值。
有研究报道，scFv可在原核细胞(如大肠杆菌)，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，酵母和昆虫细胞等多种系统中表达，尽管分子量明显小于mAb，scFv重链和轻链可变区仍各包含能形成链内二硫键的半胱氨酸，而形成链内二硫键对于mAb和scFv正确折叠可能非常重要；普通大肠杆菌表达菌的细胞浆为还原性，这可能不利于链内二硫键形成而导致scFv形成无活性的包涵体，这些包涵体只能通过精致的复性方法获得活性，为了获得有活性的scFv，一种常用的方法是表达scFv与不同促溶蛋白标签的融合蛋白，这些具有促溶作用的标签蛋白包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白A(TrxA)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和氮源利用物质A(NusA)等，但是它们的促溶作用可能与scFv序列相关，并不总能提高scFv的溶解度；另一方法是在大肠杆菌氧化性的周浆间隙(Periplasmic space)中表达scFv，但产量较低。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用。本发明尤其提供了一段来自T7噬菌体尾部纤维蛋白的33个氨基酸多肽P17可以提高不同scFv在大肠杆菌SHuffle表达株中的溶解度。
本发明的T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽，为T7噬菌体尾部纤维蛋白第186至218位氨 基酸组成的P17多肽，该P17的氨基酸序列为KNESSTNATNTKQWRDETKGFRDEAKRFKNTAG。
本发明中，T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽的氨基酸序列及其基因序列可来自天然存在的T7噬菌体或人工合成的氨基酸片段或基因片段，或任何其它来源具有同样序列的制品。
本发明中，T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽的氨基酸序列为该段序列的氨基酸的全部或部分，或大部分(大于或等于50％)与本序列相同的序列。
本发明基于研究显示的基因工程改造的大肠杆菌SHuffle菌株因缺失了trxB(thioredoxin)和gor(glutathione)二硫键还原通路而使细胞浆呈氧化性；另外，该菌株还组成性表达二硫键异构酶(DsbC)，因此，SHuffle菌株有利于靶蛋白二硫键形成和正确折叠；本发明确定了scFv在常用的大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中主要以包涵体形式表达，而在大肠杆菌SHuffle菌株的溶解度明显提高。
本发明依据T7噬菌体尾部纤维蛋白第186-218位氨基酸组成的P17多肽可将偶联的小分子、蛋白质、siRNA、DNA多聚体和脂质体导入肝细胞，本发明将P17连接在不同scFv的羧基末端，通过溶解度检测显示P17能提高不同scFv在SHuffle菌株中的溶解度；P17对不同scFv的促溶效应与scFv序列相关，促溶效应为2-8倍；
本发明通过对P17缺失突变确定了P17氨基末端和羧基末端序列均为促溶效应所必需；通过A25P点突变破坏P17羧基末端α螺旋结构，P17变异体的促溶作用消失，最后，偶联了P17多肽的scFv仍能高效结合靶抗原。
本发明中，利用已知的基因克隆技术将编码P17多肽的DNA序列按蛋白阅读框架连接于三种不同scFv基因的3’端，再将这三个scFv-P17基因克融入大肠杆菌表达载体pET28a，作为对照，将不连接P17的三种不同scFv基因克隆入pET28a载体，这三种scFv(命名为G12，MA18/7和VRC01)结合的抗原分别为乙肝病毒小包膜蛋白，乙肝病毒大包膜蛋白PreS1区和HIV-1gp120蛋白；
通过热激的方法将以上scFv和scFv-P17表达载体分别转化感受态的大肠杆SHuffle表达株，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达scFv和scFv-P17蛋白，按如下方法：
接种单个包含scFv或scFv-P17表达载体的菌落到2ml LB培养液，在37℃培养6h至LB浑浊后转种入200ml LB中，继续在37℃培养至菌液OD600值为0.8-1，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在30℃摇床内诱导表达scFv或scFv-P17蛋白，16h后离心收获细菌；
采用超声波处理裂解细菌(简称超声碎菌)，再制备细菌总蛋白和可溶性细菌蛋白样品：每克湿重细菌用10ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.5％TritonX-100，10mM MgCl2，1mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂，50μg/mlRNase A和5μg/ml DNase I)重悬，并在室温孵育20min，在冰上用超声波破碎仪破碎细菌(功率80W，超声处理1s，间隔1s，循环99次；共12个循环)，取10μl细菌裂解液加入到40μl 5×SDS上样缓冲液中，100℃变性10min作为细菌总蛋白样品，剩余的细菌裂解液在4℃、12000g离心20min，取10μl裂解液上清与40μl 5×SDS上样缓冲液混合，100℃变性10min作为可溶性细菌蛋白。
本发明还通过细菌蛋白提取液裂解细菌(简称液体碎菌)，再制备细菌总蛋白和可溶性细菌蛋白样品：每克湿重细菌用10ml EZLysTM细菌蛋白提取试剂(购自BioVision公司)重悬细菌，并补充终浓度1mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂，50μg/ml RNase A和5μg/mlDNase I，室温下轻柔晃动20min裂解细菌，按上述方法获取细菌总蛋白和可溶性细菌蛋白。
本发明中，通过以下技术测定和比较scFv和scFv-P17蛋白的溶解度：首先将细菌总蛋白和可溶性细菌蛋白作倍比稀释(如1/5，1/10，1/20，1/40，1/80和1/160)，将稀释后的蛋白样品作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用6个组氨酸(histidine，His)的多肽标签鼠单克隆抗体作Western Blotting检测scFv或scFv-P17，用MultiGauge V2.2软件作WesternBlotting化学发光信号扫描和定量，根据稀释比例和scFv定量值进行线性拟合，从而确定倍比稀释的线性范围；将细菌总蛋白和可溶性细菌蛋白在线性范围内稀释后作Westernblotting定量，最后溶解度用可溶蛋白/总蛋白的百分比表示。
通过上述实验，结果显示，在三种不同单链抗体的C末端偶联了P17多肽后能够提高单链抗体在大肠杆菌SHuffle菌株中的溶解度2-8倍。
本发明中，确定了位于scFv氨基末端和羧基末端的P17多肽都具有促溶效应，其方法为：通过已知的PCR技术将编码P17的DNA序列克隆在scFv基因的5’端和3’端，按上述方法在大肠杆菌SHuffle菌株中表达P17位于scFv氨基末端或羧基末端的融合蛋白，测定它们的溶解度，并和无P17的scFv的溶解度比较。
本发明中，确定了影响P17多肽促溶效应的氨基酸序列和二级结构因素，其方法为：通过已知的PCR技术将scFv-P17蛋白中的P17的氨基末端和羧基末端序列缺失，按上述方法在大肠杆菌SHuffle菌株中表达这些突变体蛋白，测定它们的溶解度，并和scFv-P17蛋白的溶解度比较，通过已知且英特网上免费使用的蛋白二级结构预测软件JPred分析，本发明确定了P17的羧基末端形成α螺旋二级结构；通过已知的PCR技术在P17的羧基末端引入A25P突变，通过JPred软件分析发现该突变破坏了α螺旋二级结构；上述方法在大肠杆菌SHuffle菌株中表达这些突变体蛋白，测定它们的溶解度，并和scFv-P17蛋白的溶解度比较；实验研究结果显示，氨基末端的18个氨基酸以及羧基末端的α螺旋二级结构均为P17促溶作用所必需。
本发明中，确定了偶联了P17多肽的scFv仍能高效结合靶抗原，其方法为：按上述方法在大肠杆菌SHuffle菌株中表达G12-scFv-P17融合蛋白，通过已知的镍例子亲和层析技术纯化G12-scFv-P17融合蛋白，再通过蛋白相互作用测定技术测量G12-scFv-P17与乙肝病毒小包膜蛋白的亲和力，结果显示为G12-scFv-P17高亲和力结合乙肝病毒小包膜蛋白，两者亲和力为10.9nM。
本发明提供了一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)，尤其涉及一段来自T7噬菌体尾部纤维蛋白的33个氨基酸多肽P17可以提高不同scFv在大肠杆菌SHuffle表达株中的溶解度；本发明通过实验鉴定了该来自T7噬菌体的33个氨基酸多肽P17可以提高不同scFv在大肠杆菌SHuffle表达菌株中的溶解度；P17在scFv的氨基或羧基末端均具有促溶效应。
本发明所述的P17多肽可用于提高scFv在大肠杆菌SHuffle菌株中的可溶性蛋白产量。
本发明所述的P17多肽可用于制备提高单链抗体溶解度和产量的多肽或其他制品中；所述的的P17多肽或包含其序列或部分序列的多肽可用于制备提高单链抗体溶解度和产量的多肽或其他制品中；以及，进一步，基于本发明P17多肽序列可用于制备开发提高单链抗体溶解度和产量的多肽或其他类似制品。
附图说明
图1显示了G12-scFv在大肠杆菌SHuffle菌株中可溶性表达，
其中，将G12-scFv表达质粒分别转化SHuffle和BL21 Star菌株，将IPTG诱导前(-)和后(+)的SDS裂解的细菌总蛋白、超声裂解后总蛋白(total)和可溶蛋白(soluble)先通过SDS-PAGE分离再作考马斯亮蓝染色；三角箭头表示scFv的位置。
图2显示了倍比稀释和Western blotting确定细菌蛋白样品的线性稀释范围，
其中，A.将超声碎菌制备的G12-scFv-P17总蛋白及上清蛋白样品各按1/5、1/10、1/20、1/40、1/80和1/160倍比稀释后用His抗体作Western Blotting；B.以1/5-1/160稀释比为横坐标，G12-scFv-P17总蛋白或可溶蛋白的灰度扫描值为纵坐标做对数拟合；C.以1/20-1/160稀释比为横坐标，G12-scFv-P17总蛋白或可溶蛋白的灰度扫描值为纵坐标做线性拟合。
图3显示了P17能提高三种scFv融合蛋白在大肠杆菌SHuffle菌株中的溶解度，以及位于氨基末端和羧基末端的P17都具有促溶效应；
其中显示了，将VRC01、MA18/7和G12的重组表达载体转化SHuffle菌株，再通过超声及液体两种碎菌方法制备细菌总蛋白和可溶蛋白，分别将这两份蛋白样品在1/20-1/160线性区间稀释，再通过His标签抗体作Western blotting检测和用MultiGauge软件作灰度扫描定量，最后计算和比较溶解度；其中scFv的溶解度用可溶性蛋白/总蛋白的百分比值表示：A和B为检测P17与VRC01-scFv或MA18/7-scFv融合蛋白的溶解度，C为检测P17与G12-scFv融合蛋白的溶解度以及检测P17位于G12-scFv氨基或羧基末端的融合蛋白的溶解度，D显示scFv-P17和scFv的溶解度比值，E为G12-scFv氨基或羧基末端偶联P17后的溶解度与G12-scFv溶解度的比值。
图4显示了分析影响P17促溶效应的序列和结构元件，
其中显示了，通过PCR技术和分子克隆技术构建P17羧基端8个或15个氨基酸，或N端18个氨基酸的缺失突变体(C8del、C15del和N18del)和K26E及A25P定点突变体，测定和比较这些P17突变体和G12-scFv融合蛋白的溶解度，其中，A为野生P17，缺失突变和点突变序列示意图，α螺旋结构用红色圆柱体显示，点突变用红字标示；G12-scFv-P17突变体溶解度与G12-scFv溶解度的比值在右侧显示；B和C为检测P17及其突变体与G12-scFv融合蛋白的溶解度。
图5，显示了生物膜干涉技术检测G12-scF-P17与乙肝病毒小包膜蛋白结合和解离动态过程，其中，解离常数为10.9nM。
具体实施方式
实施例1：G12-scFv在SHuffle T7菌株中的可溶性表达及纯化
将表达G12-scFv的pET28a-His-G12-scFv-HA重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)star和SHuffle菌株；在相同的培养条件下，用0.5mM IPTG在30℃诱导蛋白表达。根据菌体重量按比例加入细菌裂解液，再通过超声波破碎细菌，经离心分为可溶性和不溶性成分；将IPTG诱导前/后的SDS裂解获得的细菌总蛋白、超声破碎获得的细菌总蛋白和可溶性蛋白先通过SDS-PAGE分离，再通过考马斯亮蓝染色分析。在无ITPG诱导时，SHuffle和BL21Star表达菌几乎不表达G12-scFv(图1，IPTG-)；用0.5mM ITPG诱导后，G12-scFv在两种菌株中的表达量明显增多(图1，IPTG+和total)；G12-scFv在BL21 Star菌株中几乎不溶(图1，BL21 Star-soluble)，而在SHuffle T7菌株中可溶(图1，SHuffle-soluble)；因此，具有氧化性胞浆的大肠杆菌SHuffle T7菌株可能有利于G12-scFv链内二硫键形成和蛋白正确折叠而提高G12-scFv溶解度。
实施例2：倍比稀释和Western blotting确定细菌蛋白样品的线性稀释范围
本发明中scFv的溶解度用可溶性蛋白/总蛋白的百分比值表示；首先按实施例1的方法获得细菌总蛋白和可溶性蛋白，再对这两份样品作倍比稀释，再通过已知的Westernblotting技术检测G12-scFv-P17总蛋白和可溶性蛋白(图2A)，最后通过MultiGauge软件作灰度扫描定量并确定线性稀释范围(图2B和2C)，如图2B和2C所示，细菌总蛋白和可溶性蛋白的稀释比在1/20-1/160区间时，灰度扫描值与稀释比呈线性相关，因此，为测定不同scFv的溶解度本发明将蛋白样品的稀释比控制在1/20-1/160之间。
实施例3：
P17能提高三种scFv融合蛋白在大肠杆菌SHuffle菌株中的溶解度2-8倍
将G12，MA18/7和VRC01的重组表达载体转化SHuffle菌株，再按实施例1所述方法通过超声及液体两种碎菌方法制备细菌总蛋白和可溶蛋白，分别将这两份蛋白样品在1/20-1/160线性区间稀释，再通过His标签抗体作Western blotting检测和用MultiGauge软件作灰度扫描定量，最后计算和比较溶解度，位于scFv羧基末端的P17均能提高VRC01-scFv(图3A)，MA18/7-scFv(图3B)和G12-scFv(图3C)在SHuffle菌株中的溶解度，而且促溶效应不依赖于细菌裂解方式，促溶效应为2-8倍(图3D)。
实施例4：位于氨基末端和羧基末端的P17都能提高scFv融合蛋白在SHuffle菌株中的溶解度
通过已知的基因克隆技术将P17编码基因分别克隆在G12-scFv基因的5’和3’端，将该样的P17-G12-scFv和G12-scFv-P17表达载体转化SHuffle菌株，再按实施例1所述方法通过超声及液体两种碎菌方法制备细菌总蛋白和可溶蛋白，分别将该两份蛋白样品在1/20-1/160线性区间稀释，再通过His标签抗体作Western blotting检测和用MultiGauge软件作灰度扫描定量，最后计算和比较溶解度，位于scFv氨基末端和羧基末端的P17均能不依赖于细菌裂解方式地提高G12-scFv的溶解度(图3C)，促溶效应约为2-4倍。
实施例5：P17多肽N端和C端的氨基酸序列均为其促溶效应所必需
通过已知的PCR技术扩增P17羧基端8个或15个氨基酸，或N端18个氨基酸分别缺失的变异体基因，再通过分子克隆技术连接于G12-scFv的羧基末端(图4A)，将这些突变体表达质粒转化SHuffle菌株，按实施例1所述方法测定和比较溶解度，当P17羧基端8个氨基酸缺失时，其促溶能力略有减弱(图4C)；进一步缺失15个氨基酸时，促溶能力基本丧失(图4C)；而P17氨基端18个氨基酸缺失时，促溶能力完全丧失(图4B)。
实施，例6：P17多肽羧基端的α螺旋二级结构为促溶效应所必需
通过已知且英特网上免费使用的蛋白二级结构预测软件JPred分析，本发明确定了P17的羧基末端形成α螺旋结构，通过已知的PCR技术在P17的羧基末端分别引入A25P和K26E突变，通过JPred软件分析发现A25P突变破坏了α螺旋结构，而K26E突变不影响α螺旋结构，将这两个突变体表达质粒转化SHuffle菌株，再诱导表达突变体蛋白，测定和比较它们的溶解度，结果显示：A25P突变导致P17完全丧失了促溶效应；而K26E突变不影响P17的促溶效应(图4A，4B和4C)。
实施例7：G12-scFv羧基末端连接P17多肽仍能高亲合力结合乙肝病毒小包膜蛋白
采用SHuffle菌株大量表达和纯化G12-scFv-P17蛋白，通过已知的生物膜干涉技术测定G12-scFv-P17与靶抗原-乙肝病毒小包膜蛋白的亲合力，如图5所示，G12-scFv-P17高亲合力乙肝病毒小包膜蛋白，两者结合的解离常数为10.9nM。

Claims (5)

1.T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽，其特征在于，该多肽为T7噬菌体尾部纤维蛋白第186至218位氨基酸组成的P17多肽，该P17的氨基酸序列为KNESSTNATNTKQWRDETKGFRDEAKRFKNTAG。
2.根据权利要求1所述的T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列及其基因序列来自天然存在的T7噬菌体或人工合成的氨基酸片段或基因片段，或任何其它来源具有同样序列的制品。
3.根据权利要求2所述的T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽，，其特征在于，还包括与所述的多肽序列的氨基酸的全部或部分，或大部分，大于或等于50％，与所述的多肽序列相同的序列。
4.权利要求1的T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽在用于制备提高单链抗体溶解度和产量的多肽或其他制品中的用途。
5.权利要求1的P17多肽或包含其序列或部分序列的多肽在用于制备提高单链抗体溶解度和产量的多肽或其他制品中的用途。
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