CN110643736B - 基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法 - Google Patents
基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，具体包括以下过程：S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，采集幼嫩叶片置于自封袋中，抽干后封口置于4℃冷藏；S2，使用CTAB法提取大蒜叶片的基因组DNA，检测DNA的质量；S3，合成SSR引物，从合成的引物中筛选出具有多态性的引物；S4，使用筛选的引物对大蒜叶片的DNA进行PCR扩增，获得SSR位点的DNA富集片段；S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，对其进行测序；S6，根据检测结果对大蒜种质资源进行分类；本发明基于SSRseq分子标记对大蒜种质资源进行分类，分类结果准确、可靠性高，且分类过程简单、易操作。
Description
技术领域
本发明属于遗传学技术领域，特别是涉及一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法。
背景技术
国家无性繁殖及多年生蔬菜种质资源圃保存了来自34个国家和地区的大蒜资源，Wang在2016年利用SSR引物，结合AFLP和InDel标记对资源圃中212份大蒜资源进行了遗传多样性分析，鉴于目前表型和基因型鉴定是种质资源高效利用的前提，分子标记相对于表型评价，具有稳定性强、重复性好、操作简单、不受时空限制等优势，能够快速、准确的对种质资源的遗传多样性进行分析，基于此Wang的研究结果为了解资源圃保存种质的遗传多样性提供了一定的分子基础，但由于其使用的引物数量较少，对大蒜种质资源的分类考虑不够全面，分类结果不准确，对资源圃保存资源的亲缘关系和遗传背景分析尚不够全面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，基于基因型对大蒜种质资源进行分类，不受外界环境的干扰，分类结果更加准确，且本发明筛选出24对SSR引物用于大蒜种质资源分类，考虑的基因组更为全面，分类也更加细致、准确。
本发明所采用的技术方案是，基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，包括以下过程：
S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，待种苗长出4片叶时，采取幼嫩叶片置于自封袋中，使用冷冻抽干机抽干后封口置于4℃冷藏；
S2，使用改良的CTAB法提取大蒜叶片中的基因组DNA，并用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量；
S3，合成SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物的结构要求对SSR引物进行初级筛选，使用8％聚丙烯凝胶电泳对SSR引物进行复筛，筛选出具有多态性的24对引物；
按照以下结构标准对SSR引物进行初筛：(1)重复单元不少于3bp；(2)重复单元的重复数不超过10个；(3)重复单元不完全由AT或GC组成；(4)目标SSR位点周围不存在其他的SSR位点；
S4，使用筛选的SSR引物对大蒜叶片的基因组DNA进行PCR扩增，质控后将用相同基因组模块获得的扩增产物混合得到SSR位点的DNA富集片段，其中每个SSR位点扩增产物的量相同；
S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，定量后使用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；
S6，将测序结果输入Popgene32计算得到等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析大蒜种质资源的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。
进一步的，所述S2中提取基因组DNA的过程如下：
S21，称取100mg大蒜叶片干粉置于2.0mL离心管中，在离心管中加入700μL 65℃含1β-巯基乙醇的2CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
S22，在离心管中加入700μL的氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，抽提液由氯仿和异戊醇按照体积比24：1配制而成，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S23，吸取400μL离心上清液置于另一个2.0mL的离心管中，在上清液中加入400μL氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S24，吸取400μL离心上清液置于1.5mL离心管中，加入两倍体积的异丙醇在-20℃预冷，轻轻翻转5次，于-20℃沉淀至DNA抱团析出；
S25，弃去上清液，用70％乙醇清洗沉淀1～2次，将沉淀置于50℃烘箱中烘干；
S26，向1.5mL离心管中加入100μL含1％RNase的ddH2O溶解DNA，37℃水浴1h；
S27，用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和1μL琼脂糖凝胶检测DNA的浓度和质量，将合格的DNA样本置于-20℃冰箱保存备用。
进一步的，所述S3筛选的24对SSR引物均包括正向引物和反向引物，各SSR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.48所示。
进一步的，所述S4中PCR扩增体系如下：2μL质量浓度为50ng/μL的DNA模板、2μL的10XBuffer、0.5μL摩尔浓度为2.5mmol/L的dNTPs、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的正向引物、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的反向引物、0.5μL 2.5U/μL的Taq酶和14.5μL的超纯水。
进一步的，所述S4中PCR扩增过程如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变形30s，55℃退火30s，94℃预变性1min，72℃延伸5min，循环30个周期；(3)72℃延伸5min后置于4℃冷藏保存。
本发明的有益效果是：本发明实施例基于基因型对大蒜种质资源进行分类，分类结果更加准确，且本发明实施例基于引物结构和8％聚丙烯凝胶电泳筛选出24对SSR引物，利用SSR分子标记技术对大蒜资源进行基因分型、遗传多样性分析和种群结构分析，进而对大蒜种质资源进行分类，该过程省时省力、稳定性好，获得的分类结果可靠性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的流程图。
图2是本发明实施例的系统进化树图。
图3是本发明实施例的主成分分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法流程如图1所示，具体包括以下过程：
S1，培育大蒜种质资源获得大蒜种苗，待植株长到4片叶时，单株取样，采取幼嫩叶片置于自封袋中，使用冷冻抽干机抽干后封口置于4℃冷藏；
S2，采用改良的CTAB法提取大蒜幼叶基因组的DNA，使用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，以确定提取的DNA质量满足后续实验的需求，不会出现不降解或轻微降解的问题；
S3，根据SSRseq设计要求合成397对SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物结构的要求和8％聚丙烯凝胶电泳筛选出具有多态性的24对SSR引物，24对SSR引物的基因信息如表1所示，24对SSR引物均包括正向引物和反向引物，各SSR引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.48所示，其中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别表示第1对SSR引物的正向引物核苷酸序列和反向引物核苷酸序列，以此类推；
按照以下结构标准对SSR引物进行初级筛选：(1)重复单元不少于3bp；(2)重复单元的重复数不超过10个；(3)重复单元不完全由AT或GC组成；(4)目标SSR位点周围不存在其他的SSR位点；
使用8％聚丙烯凝胶电泳进行复筛，筛选出具有多态性的24对SSR引物；
S4，使用筛选的SSR引物对大蒜种质资源的DNA进行多重PCR扩增，质控后将以同一样本基因组为模板获得的扩增产物混合保证每个位点扩增产物的量相当，获得SSR位点的DNA富集片段；
PCR扩增体系由以下物质构成：2μL质量浓度为50ng/μL的DNA模板、2μL的10XBuffer、0.5μL摩尔浓度为2.5mmol/L的dNTPs、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的正向引物、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的反向引物、0.5μL 2.5U/μL的Taq酶和14.5μL的超纯水；
PCR扩增过程如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变形30s，55℃退火30s，94℃预变性1min，72℃延伸5min，循环30个周期；(3)72℃延伸5min后置于4℃冷藏保存；
S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列：adapter和样本特异index标签序列，定量后利用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；
S6，将测序结果输入Popgene32计算得到等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析大蒜种质资源的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。
基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法在S2中采用改良的CTAB法提取基因组DNA的过程如下：
S21，称取100mg大蒜叶片干粉置于2.0mL离心管中，在离心管中加入700μL 65℃含1β-巯基乙醇的2CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
S22，在离心管中加入700μL的氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，抽提液由氯仿和异戊醇按照体积比24：1配制而成，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S23，吸取400μL离心上清液置于另一2.0mL的离心管中，在上清液中加入400μL氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S24，吸取400μL离心上清液置于1.5mL离心管中，加入两倍体积的异丙醇在-20℃预冷，轻轻翻转5次，于-20℃沉淀至DNA抱团析出；
S25，弃去上清液，用70％乙醇清洗沉淀1～2次，将沉淀置于50℃烘箱中烘干；
S26，向1.5mL离心管中加入100μL含1％RNase的ddH2O溶解DNA，37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；
S27，用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和1μL琼脂糖凝胶检测DNA的浓度和质量，将合格的DNA样本置于-20℃冰箱保存备用。
表1 24对引物信息
续表：
实施例
对国家无性繁殖及多年生蔬菜种质资源圃中来自34个国家和地区的678份大蒜资源进行分类，678份大蒜资源中含有国内资源384份、国外引进资源294份，具体过程如下：
S1，种植678份大蒜资源，待植株长到约4片叶时，单株取样，选取幼嫩叶片置于抽干封口的自封袋中于4℃下保藏；
S2，采用改良的2％CTAB法提取大蒜资源基因组DNA，用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量；
S3，设计合成SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物结构的要求进行初筛，通过聚丙烯凝胶电泳法复筛出具有多态性的SSR引物，利用筛选出的SSR引物对大蒜DNA进行多重PCR扩增获得SSR位点的DNA富集片段，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，定量后利用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；
S4，采用Popgene32计算等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析供试材料的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。
大蒜资源的系统进化树如图2所示，在系统进化树分类中，我们将资源分为四大类群，类群I的资源主要为来自于我国的新疆、西藏、山东、河南以及中亚的哈萨克斯坦、塔吉克斯坦等地的大蒜资源；类群II的资源主要来自于我国的广东、贵州、湖南、四川等省份，但也包含少量来自欧洲和北美洲的资源；欧洲资源与北美洲资源遗传距离较近，该两大洲的资源主要集中于类群III；类群IV大蒜资源较为复杂，其来源丰富，覆盖五个大洲，同时包含在田间观测到的特殊材料，如开花的8N0022、8N0157、8N0353、8N0540和8N1013，智利超级大蒜8N1076(单头鳞茎重超过800g)也聚类在该类群中，说明该些材料可能具有特殊的基因型。
大蒜资源的主成分分类如图3所示，类群I大蒜资源来源较单一，可能具有大蒜原始类型的某些特征；类群II主要为亚洲大蒜资源，还包含少量的欧洲、北美洲大蒜资源，我国是大蒜出口的主产国，所以类群II可能为中国出口的大蒜在欧洲、北美洲栽培获得的后代与我国原始大蒜资源的集群；类群III包含的大蒜资源最多、且来源丰富，涉及五个大洲，大蒜为无性繁殖，不能通过杂交获得可育后代，只能通过低频率的基因突变产生变异，故大部分大蒜资源可能保持较为一致的基因型。
大蒜资源的群体遗传结构分类表明，当分类K值为4时，各群体内大蒜资源相似性最大，可将678份大蒜资源划分为4大类群，类群I～类群IV包含的资源数分别为149、102、104、323份；类群I的大蒜资源主要来自于我国青藏高原地区的新疆、西藏和四川以及中亚的乌兹别克斯坦、哈萨克斯塔、塔吉克斯坦等地，我们推测可能具有栽培大蒜原始类型的某些特征；类群II主要包括部分非洲大蒜资源和来自于我国四川、广东、湖南、湖北、云南、福建、贵州的大蒜资源，主要为来源于低纬度地区的大蒜资源；类群III主要为欧洲和北美洲的大蒜资源；类群IV包含5个大洲的大蒜资源，此类群资源最多，较接近于主成分分类中的类群III。
本发明实施例不考虑环境对大蒜表型的影响，通过检测各大蒜种质资源的基因型，从根源上对大蒜种质资源进行分类，分类结果准确、稳定性好，本发明实施例筛选了24对SSR引物对大蒜DNA进行PCR扩增进而进行分类，能全面考虑基因组上各片段的基因表达，使得分类结果更加准确、细致；根据不同的计算结果将大蒜种质资源划分不同的类群，分类结果稍有异同，如三种分类中类群I都多为中亚地区搜集的大蒜资源，系统进化树分类的类群I还包含我国华北地区的部分大蒜资源，主成分分类结果包含少量的欧洲资源；类群II主要为来自亚非两洲的低纬度地区；系统进化树分类和群体遗传结构分类的类群III主要为来自于欧洲和北美洲的大蒜资源；系统进化树分类和群体遗传结构分类的类群IV以及主成分分类的类群III大蒜资源来源较为复杂，覆盖五个大洲，说明本发明实施例的分类结果彼此之间能相互验证，分类结果准确可靠，能够根据分类结果对大蒜种质资源的来源和基因产生原因进行分析，进而更为精确的了解大蒜的发展过程。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法
<130> 2019.11.14
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
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<400> 34
ccggtgaact cttgaaccat 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 35
ccaggagtga agtttgccat 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 36
agcaaagccg caagaaataa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 37
gcaaagcctc aaatgtaccc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 38
tgtgtctgag ccgctagatg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 39
attcctggta gacacgcaca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 40
gtccacccca aaatatgcag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 41
ccacgaacaa catcacgatt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 42
aggttggtca tttcgtcgtc 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 43
aaacgcagat tccaaagtaa tga 23
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 44
ccagcaaatt tggttgaaaa a 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 45
gcttcagagc caccattagc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 46
acgtttcgaa cggaggagta 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 47
ggtcaatcgc agggtaccta 20
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 48
aagcaatatc agtcatcgtc aca 23
Claims (1)
1.基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，其特征在于，包括以下过程：
S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，待种苗长出4片叶时，采取幼嫩叶片置于自封袋中，使用冷冻抽干机抽干后封口置于4℃冷藏；
S2，使用改良的CTAB法提取大蒜叶片中的基因组DNA，并用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量；
提取基因组DNA的过程如下：
S21，称取100mg大蒜叶片干粉置于2.0mL离心管中，在离心管中加入700μL 65℃含1β-巯基乙醇的2CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
S22，在离心管中加入700μL的氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，抽提液由氯仿和异戊醇按照体积比24：1配制而成，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S23，吸取400μL离心上清液置于另一个2.0mL的离心管中，在上清液中加入400μL氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；
S24，吸取400μL离心上清液置于1.5mL离心管中，加入两倍体积的异丙醇在-20℃预冷，轻轻翻转5次，于-20℃沉淀至DNA抱团析出；
S25，弃去上清液，用70％乙醇清洗沉淀1～2次，将沉淀置于50℃烘箱中烘干；
S26，向1.5mL离心管中加入100μL含1％RNase的ddH2O溶解DNA，37℃水浴1h；
S27，用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和1μL琼脂糖凝胶检测DNA的浓度和质量，将合格的DNA样本置于-20℃冰箱保存备用；
S3，合成SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物的结构要求对SSR引物进行初级筛选，使用8％聚丙烯凝胶电泳对SSR引物进行复筛，筛选出具有多态性的24对引物；
筛选的24对SSR引物均包括正向引物和反向引物，各SSR引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.48所示；
按照以下结构标准对SSR引物进行初筛：(1)重复单元不少于3bp；(2)重复单元的重复数不超过10个；(3)重复单元不完全由AT或GC组成；(4)目标SSR位点周围不存在其他的SSR位点；
S4，使用筛选的SSR引物对大蒜叶片的基因组DNA进行PCR扩增，质控后将用相同基因组模块获得的扩增产物混合得到SSR位点的DNA富集片段，其中每个SSR位点扩增产物的量相同；
PCR扩增体系如下：2μL质量浓度为50ng/μL的DNA模板、2μL的10×Buffer、0.5μL摩尔浓度为2.5mmol/L的dNTPs、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的正向引物、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的反向引物、0.5μL 2.5U/μL的Taq酶和14.5μL的超纯水；
PCR扩增过程如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性 30s，55℃退火30s，94℃预变性1min，72℃延伸5min，循环30个周期；(3)72℃延伸5min后置于4℃冷藏保存；
S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，定量后使用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；
S6，将测序结果输入Popgene32计算得到等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析大蒜种质资源的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008083456A1 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-17 | Canavialis S.A. | Microsatellite-based fingerprinting system for saccharum complex |
| CN106636377A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-05-10 | 广西壮族自治区农业科学院玉米研究所 | 一种基于ssr分子标记构建甘薯核心种质资源库的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8664473B2 (en) * | 2010-01-09 | 2014-03-04 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Methods and compositions for producing aluminum tolerant alfalfa |
| US20150101074A1 (en) * | 2012-03-01 | 2015-04-09 | The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agriculture Research | Male sterile garlic plants, hybrid offspring of same and methods of generating and using same |
| CN105039506A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-11-11 | 浙江省农业科学院 | Est-ssr标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用 |
| CN105512513B (zh) * | 2015-12-02 | 2018-04-13 | 新疆农业大学 | 一种基于ssr分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法 |
| CN105713984B (zh) * | 2016-04-21 | 2020-02-07 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 肉果草微卫星分子标记 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008083456A1 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-17 | Canavialis S.A. | Microsatellite-based fingerprinting system for saccharum complex |
| CN106636377A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-05-10 | 广西壮族自治区农业科学院玉米研究所 | 一种基于ssr分子标记构建甘薯核心种质资源库的方法 |
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