CN110643686A - 在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在体的对具有潜在微生物调节能力的药物进行筛选的体系，用于评价不同药物对肠道菌群活性的影响，所述药物能够抑制或促进细菌生长代谢，其步骤包括：药物施加时或之后，利用细菌广谱荧光物质原位标记肠道菌群，所述细菌广谱荧光物质能够特异性标记细菌；分离肠道菌群，利用细菌特异性标记物质或其组合标记不同种属细菌，统计肠道菌群中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质组合的荧光强度用于分析不同种属细菌的代谢活性，以得出药物活性结果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术或检测领域，特别是涉及在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，用于体内筛选调节微生物代谢药物的方法，用于评价药物影响肠道菌群活性，所述药物能够抑制或促进肠道细菌生长代谢。
背景技术
肠道菌群在动物和人的肠道内以极高的密度存在，这些菌群发挥了众多的功能，而其菌群活性反映了生命机体的健康状况，各类药物使用是否对肠道菌群产生影响以及对具体细菌产生某种影响，通常采用动物实验结合深度细菌DNA测序并综合复杂的生物信息学分析以得知药物服用后对菌群中各种类型细菌相对组分变化的影响情况。但此方法存在测序繁琐、成本高、数据分析难度大、不精确(只能反映细菌相对丰度的变化情况)、不灵敏(即使是死细菌，只要有相应的DNA分子在，也存在被测出的可能)等问题。
近期发表的文章中所使用的STAMP技术(A strategy using sequential taggingwith D-amino acid-based metabolic probes)[参考文献1]，即是带有荧光基团标记的DAA探针标记供体小鼠的肠道菌群，取出被标记的肠道菌群灌给受体小鼠，再用不同的荧光基团标记的DAA探针标记受体小鼠的肠道菌群，取受体小鼠的肠道菌群，之后利用荧光显微镜或者流式细胞仪对两种探针双标的细菌进行分析，可以得出植入菌在受体体内存活的比例，这种技术主要应用于评判移植菌在体内的代谢活性，未涉及使用可以用于评估筛选各类药物对肠道菌群代谢活性的影响。而本发明中的技术方案主要应用于评估筛选评价各类药物对肠道菌群中各类细菌代谢活性的影响。
发明内容
本发明提供了用于评估、评价药物的方法，具体是评估、评价影响肠道细菌代谢的药物。
本发明一方面涉及在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，所述药物能够抑制或促进细菌生长代谢，其步骤包括：
药物施加时或之后，利用细菌广谱荧光物质原位标记肠道菌群，所述细菌广谱荧光物质能够特异性标记细菌；
分离肠道菌群，利用细菌特异性标记物质组合标记不同种属细菌，统计肠道菌群中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质或其组合的荧光强度用于分析不同种属细菌的代谢活性，以得出药物活性结果。
优选地，所述细菌广谱荧光物质通过代谢标记方式标记细菌；优选的，所述细菌广谱荧光物质在肽聚糖合成和\或代谢时取代正常氨基酸；更优选的，所述细菌广谱荧光物质为带有荧光基团的D-型氨基酸，最优选为D-型氨基酸-Cy5。
优选地，所述细菌特异性标记物质或其组合用于特异性区分不同种类种属细菌，优选地用于分别标记革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，优选地用于分别标记梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、拟杆菌S24-7簇(Bacteroidales cluster S24-7)、普雷沃菌属(Prevotella)、艾克曼菌属(Akkermansia)、另枝菌属(Alistipes)、副杆菌属(Parabacteroides)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)、理研菌属(Rikenella)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Lachnoclostridium菌属、罗斯氏菌属(Roseburia)、Lachnospiracea_incertae_sedis菌属、Segmented filamentous bacteria菌属、颤杆菌克属(Oscillibacter)、Anaerotruncus菌属、Acetatifactor菌属、梭菌属(Clostridium)、Clostridium_sp._ASF502菌、Clostridium_sp._KNHs209菌、Clostridium_sp._ATCC_BAA-442菌、Alistipes putredinis菌、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)。
优选地，所述细菌特异性标记物质或其组合为荧光探针组合或带荧光标记物的抗体组合；优选地FISH探针组合。优选地，所述FISH探针组合为包含至少一种FISH探针的混合液，优选地所述FISH探针包含序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25所示探针的一种或两种及以上。
优选地，统计菌群中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质的荧光强度的步骤包括识别双荧光信号的细菌群，分析实验组和对照组的双荧光信号细菌群的细菌广谱荧光物质的信号强度的差别，以用于判断细菌的代谢活性。
本发明另一方面涉及在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，所述药物能够抑制或促进细菌生长代谢，其步骤包括：
药物注入待测试受体体内之时或之后，将带有标记的D-氨基酸注入受体体内用于标记肠道菌群，并以安慰剂和带有标记的D-氨基酸的受体组作为对照组；
取盲肠中细菌或粪便分离出肠道菌群，利用FISH探针标记不同种属细菌，利用FCM和\或荧光显微镜识别和分离双荧光阳性的细菌群，分析实验组和对照组细菌群中带有标记的D-氨基酸荧光强度差别，以用于判断细菌的代谢活性。
本发明另一方面涉及FISH探针组合，其用于药物活性检测，其包括包含序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25所示探针的一种或两种及以上。
本发明另一方面涉及在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的检测试剂盒，其包括，
细菌广谱荧光物质；
细菌特异性标记物质组合；
注射器械。
优选地，所述细菌广谱荧光物质通过代谢标记方式的标记细菌；优选的，所述细菌广谱荧光物质在肽聚糖合成和\或代谢时取代正常氨基酸；更优选的，所述细菌广谱荧光物质为带有荧光基团的D-型氨基酸，最优选为D-型氨基酸-Cy5。
所述细菌特异性标记物质组合为荧光探针组合或带荧光标记物的抗体组合；优选地FISH探针；所述FISH探针为至少两种FISH探针混合液，优选地所述FISH探针包含序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25所示探针的一种或两种及以上。
附图说明
图1是本发明实施例中涉及在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法的流程示意图；
图2是本发明实施例中涉及使用D-氨基酸探针的结构示意图；
图3是本发明实施例的槲皮素的实验组和空白对照组的肠道菌群流式细胞仪检测结果图；
图4是本发明实施例的槲皮素的实验组和空白对照组的肠道菌群的代谢活性柱状图。
具体实施方式
在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成优选的技术方案。
在评价各类药物对肠道菌群活性的技术中，如16S rDNA测序，不能快速直观和有效地筛选和评估各类药物对肠道菌群活性的影响。本发明提供了在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，用于评价药物活性，其步骤包括：
药物施加时或之后，利用细菌广谱荧光物质原位标记肠道菌群，所述细菌广谱荧光物质能够特异性标记细菌；
分离肠道菌群，利用细菌特异性标记物质或其组合标记不同种属细菌，统计肠道菌群中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质组合的荧光强度用于分析不同种属细菌的代谢活性，以得出药物活性结果。其中，所述药物能够潜在地调节菌群，即能够抑制或促进细菌生长代谢。
本发明涉及的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，可用于体内筛选、评价药物对肠道菌群的活性影响情况，例如用于评价抗生素、二甲双胍、小蘖碱等药物或食源性小分子物质对肠道菌群的影响情况或对模型动物肠道菌群中各类肠道细菌在体内生长代谢活性的影响以用于筛选能够改善肠道菌群的药物或小分子物质。
本发明具体实施方式中，利用细菌特异性标记物质组合标记不同种属细菌之后，(如利用荧光显微镜或流式细胞仪)识别双荧光信号的细菌群，分析实验组和对照组中双荧光信号细菌群的细菌广谱荧光物质的信号强度差别，以用于判断细菌的代谢活性。
本发明中，细菌广谱荧光物质能够特异性地标记大部分细菌，并且不能或很少标记非细菌细胞或组织(如哺乳动物细胞)。在本发明具体实施例中，细菌广谱荧光物通过代谢标记方式标记细菌。例如，本发明具体实施例中，细菌广谱荧光物质在肽聚糖合成和\或代谢过程中取代D-型丙氨酸，具体实施方式中，细菌广谱荧光物质为氨基酸侧链带有荧光基团的D-型氨基酸。D-型丙氨酸存在于细菌肽聚糖的五肽结构末端的特殊氨基酸，细菌在肽聚糖的合成和代谢过程中会在五肽结构位置通过青霉素结合蛋白(PBPs,penicillinbinding proteins)等酶类中的转肽酶结构域与邻近的肽段进行交联、水解(如去掉最末端的D-丙氨酸)、替换(与周围环境中的D-型氨基酸)等修饰(如参考文献2记载)，其中部分青霉素结合蛋白对侧链带有修饰基团的D-型氨基酸具有较高宽容度，因此，带有荧光基团的D-氨基酸能够通过代谢标记的方式连接到细菌肽聚糖结构上以起到标记细菌的作用，同时由于哺乳动物细胞中不存在肽聚糖结构，能够实现利用带有荧光基团的D-氨基酸特异性标记细菌，而且肽聚糖结构广泛存在于各种属细菌中，其标记的广谱性较高(如参考文献3记载)。本发明具体实施方式中，采用D-型氨基酸-Cy5。
本发明中，细菌特异性标记物质或其组合作为菌群的分类标记物，能够特异性标记不同种属细菌以用于区分不同种属的细菌。本发明具体实施方式中，细菌特异性标记物组合用于分别标记革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以区分和识别此两类细菌。本发明具体实施方式中，细菌特异性标记物质组合可以分别标记梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、拟杆菌S24-7簇(Bacteroidalescluster S24-7)、普雷沃菌属(Prevotella)、艾克曼菌属(Akkermansia)、另枝菌属(Alistipes)、副杆菌属(Parabacteroides)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)、理研菌属(Rikenella)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Lachnoclostridium菌属、罗斯氏菌属(Roseburia)、Lachnospiracea_incertae_sedis菌属、Segmented filamentous bacteria菌属、颤杆菌克属(Oscillibacter)、Anaerotruncus菌属、Acetatifactor菌属、梭菌属(Clostridium)、Clostridium_sp._ASF502菌、Clostridium_sp._KNHs209菌、Clostridium_sp._ATCC_BAA-442菌、Alistipes putredinis菌、狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)。
本发明具体实施方式中，细菌特异性标记物质或其组合可以为荧光探针组合或带有荧光标记物的抗体组合。其中此荧光探针组合或带有荧光标记物的抗体组合中的各荧光探针或抗体能特异性识别或结合不同种属细菌，并通过其荧光标记物的不同得以区分不同种属细菌。本发明具体实施方式中，采用FISH荧光探针组合。其中FISH(荧光原位杂交技术，fluorescence in situ hybridization)是将带有荧光基团标记的DNA探针与待测样品中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交，通过荧光显微镜观察样品的荧光，或通过流式细胞仪检测标记细菌的荧光信号强弱或分离不同种属细菌，实现肠道菌群特定种属的标记识别。
本发明具体实施方式提供了FISH探针组合以用于肠道菌群特定种属的标记识别，其中FISH探针包含至少一种FISH探针，具体地FISH探针可以为如下序列所示的探针：
SEQ IN NO:1,5’-GCT TCT TAG TCARGT ACC G-3’；
SEQ IN NO:2,5’-TCT TCC CTG CTG ATA GA-3’；
SEQ IN NO:3,5’-GTC CGG CTACCG ATC GCG-3’；
SEQ IN NO:4,5’-CGC CCT TTG CTC CCT GAC AAAA-3’；
SEQ IN NO:5,5’-CTT TAC TCC CCAACAAAAGCAGTT TAC AA-3’；
SEQ IN NO:6,5’-TTC CCC CGC GCG GCG TCG CAC CAT C-3’；
SEQ IN NO:7,5’-CTC TCA GTC CCC CTA TGT ATC GTA G-3’；
SEQ IN NO:8,5’-CCA TAG ATC CTT CAT CCC TCA CGC G-3’；
SEQ IN NO:9,5’-CTT GCG CCG GCA GTC TCA ACA GAG TCC T-3’；
SEQ IN NO:10,5’-TGC GCA ATC GGT GTT CTG AGT AAT A-3’；
SEQ IN NO:11,5’-CAC GGA ATT AGC CGG TCC TTT TTA T-3’；
SEQ IN NO:12,5’-CCA GTT ACC GGC TCC ACC-3’；
SEQ IN NO:13,5’-TCA GAC TTG CCG YAC CGC-3’；
SEQ IN NO:14,5’-GCG CTT ATG CGG TAT CAC CAG CCG T-3’；
SEQ IN NO:15,5’-GGG TAC TTA TTG CGT TTG CGA CGG CAC-3’；
SEQ IN NO:16,5’-ATC TCT TTC CAA GGC ACT CCG TTC-3’；
SEQ IN NO:17,5’-GTT AGC CGG AGC TTC CTC TTT GAG T-3’；
SEQ IN NO:18,5’-GTC CGC CCC CTC AGG CCG GCT ACC G-3’；
SEQ IN NO:19,5’-TTA TTC TTC GTT TAC GGC GTG GAC T-3’；
SEQ IN NO:20,5’-AAG GAA AAC GAA CAT TAC TTC GCT G-3’；
SEQ IN NO:21,5’-AAG GTC TAA TAG CCC CCG ACA CCT A-3’；
SEQ IN NO:22,5’-AAT GCA GGC TGG AGG TTG AGC CCC C-3’；
SEQ IN NO:23,5’-GTT CTG TAT GAT CTC TAA GC-3’；
SEQ IN NO:24,5’-CGC AAA CGG CTA TTG CTA G-3’；
SEQ IN NO:25,5’-CCT TGC GGT TGG CTT CAG AT-3’；
本发明还提供了一种在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的检测试剂盒，包括细菌广谱荧光物质、细菌特异性标记物质组合和\或医用器材。其中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质组合如上所示；其中所述的医药器材用于将所述的细菌广谱荧光物质注入实验组体内和分离肠道菌群等，本发明具体实施方式中采用医药器材将细菌广谱荧光物质通过灌胃腹腔注射/静脉注射等方式注入到实验组体内等。
本发明提供的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法中，可以用于检测具有潜在菌群调节能力药物的动物模型中，利用细菌广谱荧光物质原位标记肠道菌群，如带有荧光基团的D-氨基酸采用例如灌胃/腹腔注射/静脉注射等方式原位代谢标记肠道菌群；然后分离肠道菌群，利用细菌特异性标记物质组合标记不同种属细菌，比如取盲肠中细菌或粪便分离出肠道菌群，采用FISH探针特异性标记不同种属细菌，采用FISH以及流式细胞仪检测体内标记的细菌荧光强弱，评估细菌在用药后的代谢活性情况。
本发明申请相对于现有技术具有如下的优点：
现有技术在检测时耗时较长，比如现有技术的测序技术来研究用药前后菌群中各类细菌相对丰度变化时得出检测结果需要10-20天，而本发明申请提供的技术方案需要3-4天；并且测序技术的定量结果不准确，比如现有技术中采用16s rDNA测序来比较菌群中各种细菌的变化，样品中会包含死菌DNA，导致肠道细菌活性的评估结果不准确。另外测得的各类细菌16s rDNA的丰度与相应细菌的本身的丰度也不能直接对应(不同种类细菌，其rDNA的拷贝数不同)。
另外采用测序方法导致成本高。本发明申请提供的检测方法直接标记活菌，检测结果更为准确，成本相对低，能够快速直观有效地筛选以及评价各类药物对肠道菌群活性的影响。
本发明的部分实施例如下，实施例中未提及的其它方法及所用材料，均为本领域常规的方法和材料。药物处理组和空白对照组的实验方法如图1所示。
实施例1药物处理组
药物处理组(实验组)：将槲皮素(0.4mg/100μL)通过灌胃的方式给药给小鼠，每次100μL，每隔12h灌一次，共两次，在第二次灌胃槲皮素后12h，给小鼠灌胃200μL DAA-Cy5(0.75mM，其结构如图2所示)，4h后处死小鼠，取出盲肠段内容物，分离出其中的肠道菌群，PBS洗涤三次后，将菌群固定后再用PBS洗涤一次，离心后使用冻存液(PBS:无水乙醇＝1：1)重悬，并置于-20℃冰箱保存，间隔12h后用作后续FISH实验。
实施例2空白对照组
空白对照组：通过灌胃的方式将100μL ddH2O灌入小鼠体内，每隔12h灌一次，一共灌两次，在第二次灌ddH2O 12h后，给小鼠灌200μL DAA-Cy5(0.75mM)，4h后处死小鼠，取出盲肠段的内容物，分离出其中的肠道菌群，PBS洗涤三次后，将菌群固定后再洗涤，离心后使用冻存液(PBS:无水乙醇＝1：1)重悬，并置于-20℃冰箱保存，间隔12h后用作后续FISH实验。
实施例3FISH实验
FISH实验：将实施例1和实施例2中制备的冰箱冻存的菌液混匀后均匀分成多管(与所作FISH探针样品数一致)，离心后冻存液，使用杂交液重悬[0.9M NaCl，0.02M Tris(pH 7.5)，0.01％SDS，一定百分比的甲酰胺]，加入FISH探针(5ng/μL，如表1所示)，在适当的温度条件下孵育一段时间，使用杂交液洗涤第一遍，再使用未添加甲酰胺的杂交液洗涤第二遍，使用重悬液[0.025M NaCl，0.02M Tris(pH7.5)]重悬细菌。
表1.FISH探针
a，LIS：Lachnospiracoa_incortae_sedis
b，SFB：Sogmonted filamontous bactorin
利用流式细胞仪检测待测药物使用后，与空白对照组相比，被标记的各类肠道菌荧光强弱的变化。识别出实验组和空白对照组的双阳性细菌细胞群(同时具有FISH信号和DAA信号)，统计该细胞群DAA信号强度的中位数值或平均值，即可用于比较不同药物处理后各类细菌的DAA信号强度(即细菌的代谢活性)的差别。
实施例4
如图3所示，实验组和空白对照组的双阳性细菌细胞群的流式细胞仪检测分布，各种属细菌的结果如表2所示，
表2.细菌种属分布
同时，参照图4所示的槲皮素实验组和空白对照组的细菌代谢变化情况柱形图。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
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参考文献3：Erkin K,Srinivas T,Edward H,et al.荧光D-氨基酸的合成及其用于探测肽聚糖合成和原位细菌生长的用途[J].Nature Protocols.2015,10(1):33.
Claims (10)
1.在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，所述方法用于评价药物影响肠道菌群的活性，所述药物能够抑制或促进肠道细菌生长代谢，其步骤包括：
药物施加时或之后，利用细菌广谱荧光物质原位标记肠道菌群，所述细菌广谱荧光物质能够特异性标记细菌；
分离肠道菌群，利用细菌特异性标记物质或其组合标记不同种属细菌，统计肠道菌群中细菌广谱荧光物质和细菌特异性标记物质或其组合的荧光强度用于分析不同种属细菌的代谢活性，以得出药物活性结果。
2.如权利要求1所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，其特征在于，所述细菌广谱荧光物质通过代谢标记方式标记细菌；优选的，所述细菌广谱荧光物质在肽聚糖合成和\或代谢时取代D-型丙氨酸；更优选的，所述细菌广谱荧光物质为带有荧光基团的D-型氨基酸，优选为D-型氨基酸-Cy5。
3.如权利要求1所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，其特征在于，所述细菌特异性标记物质或其组合用于特异性区分不同种属细菌，优选地用于分别标记革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，优选地用于分别标记梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、拟杆菌S24-7簇(Bacteroidalescluster S24-7)、普雷沃菌属(Prevotella)、艾克曼菌属(Akkermansia)、另枝菌属(Alistipes)、副杆菌属(Parabacteroides)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)、理研菌属(Rikenella)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Lachnoclostridium菌属、罗斯氏菌属(Roseburia)、Lachnospiracea_incertae_sedis菌属、Segmented filamentous bacteria菌属、颤杆菌克属(Oscillibacter)、Anaerotruncus菌属、Acetatifactor菌属、梭菌属(Clostridium)、Clostridium_sp._ASF502菌、Clostridium_sp._KNHs209菌、Clostridium_sp._ATCC_BAA-442菌、Alistipes putredinis菌、狄氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)。
4.如权利要求1-3任一项所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，其特征在于，所述细菌特异性标记物质或其组合为荧光探针组合或带荧光标记物的抗体组合；优选地FISH探针组合。
5.如权利要求4所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，其特征在于，所述FISH探针组合为包含至少一种FISH探针的混合液，优选地所述FISH探针包含序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25所示探针的一种或两种及以上。
6.如权利要求1-5任一项所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，进一步包括如下步骤：识别双荧光信号的细菌群，分析实验组和对照组的双荧光信号细菌群的细菌广谱性荧光物质的信号强度的差别，以用于判断细菌的代谢活性。
7.一种在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的方法，所述药物能够抑制或促进细菌生长代谢，其步骤包括：
药物注入待测试受体体内之时或之后，将带有标记的D-氨基酸注入受体体内用于标记肠道菌群，并以安慰剂和带有标记的D-氨基酸的受体组作为对照组；
取盲肠中细菌或粪便分离出肠道菌群，利用FISH探针标记不同种属细菌，利用FCM和\或荧光显微镜识别和分离双荧光阳性的细菌群，分析实验组和对照组细菌群中带有标记的D-氨基酸荧光强度差别，以用于判断细菌的代谢活性。
8.FISH探针组合，其用于药物活性检测，其包括包含序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25所示探针的一种或两种及以上。
9.一种在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的检测试剂盒，其包括，
细菌广谱荧光物质；
细菌特异性标记物质组合；
医用器械。
10.如权利要求9所述的在体筛选具有潜在微生物调节能力的药物的检测试剂盒，其特征在于，
所述细菌广谱荧光物质通过代谢标记方式的标记细菌；优选的，所述细菌广谱荧光物质在肽聚糖合成和\或代谢时取代D-丙氨酸；更优选的，所述细菌广谱荧光物质为带有荧光基团的D-型氨基酸，最优选为D-型氨基酸-Cy5；
所述细菌特异性标记物质组合为荧光探针组合或带荧光标记物的抗体组合，优选地FISH探针；所述FISH探针为至少一种FISH探针混合液，优选地所述FISH探针包含序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25所示探针的一种或两种及以上。
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