CN110643488A - 微流控液滴操纵分割装置及其操纵分割方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流控技术领域，具体提供一种微流控液滴操纵分割装置及其操纵分割方法。该微流控液滴操纵分割装置包括一体化顺次连通的进样部、连接部、液滴切分部、液滴收集部；液滴切分部由若干Y型三通管顺次连接构成，液滴切分部具有一个进液口和若干出液口，进液口与连接部接通；每个Y型三通管分叉的夹角为45°～180°，并且顺次连接的相邻Y型三通管中前一个Y型三通管的通道宽度大于或等于后两个Y型三通管的通道宽度，后两个Y型三通管道的宽度相同；液滴收集部成型于液滴切分部的出液口处以实现对液滴的收集。本发明的分割装置可以快速高效地获得均一、无形变、高通量的液滴阵列，能有效提高数字PCR后续反应的稳定性和准确性。

Description

微流控液滴操纵分割装置及其操纵分割方法

技术领域

本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种微流控液滴操纵分割装置及其操纵分割方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)在分子生物学领域具有极其重要的地位，已经发展成一项常规的实验技术。从最初的普通PCR，逐渐衍生出反转录PCR、多重PCR、巢式PCR、免疫PCR等，同时也从最初的定性分析逐渐演变为定量分析。其中，实时定量分析PCR(real time PCR，简称qPCR)因其灵敏度高，特异性强以及定量精确等优势逐渐成为基因分析最常用的技术手段并在疾病诊断中得到广泛应用。但是，由于多种因素可对qPCR的扩增过程产生较大的影响，导致其定量分析的循环阈值(ct)不能保证恒定不变，即qPCR也只能进行“相对定量”。因此，需要一种可以“绝对定量”的新技术来解决核酸定量中灵敏度和准确度都受限的问题-数字PCR(digital PCR，dPCR)技术应运而生。该技术不必依靠任何标准物或者外标，仅仅通过直接计数单个核酸分子的阳性信号便会达到绝对定量的目的。因此，其灵敏度及精确度都极具优势，只需要非常少的样本量便可用于定量分析，这些特点使数字PCR技术迅速在各个领域中得到广泛应用。数字PCR主要包括三大类，即微反应室/孔板(Micro-chamber)、微流控芯片(Microfluidic chip)和微滴PCR系统(droplet digital PCR system，ddPCR)。

微流控技术中，生成微液滴是微流控技术及应用的第一步，而在微液滴生成后的下游流程中实现对液滴精准控制，是微流控液滴技术获得各种应用的关键。液滴分裂即将上级产生的液滴分成较小的液滴，进而实现高通量的液滴生成，在短时间内迅速分散样品到单个反应单元，同时保证单个反应单元的样品浓度，目前主要有主动发和被动法实现液滴切分。主动法实现液滴切分通常是利用外加气动阀或者是超高压电场的方式，通过外界作用力使液滴界面形变从而一分为二，但是外加的设备方法会增加技术操作的复杂性，难以满足实际应用中数字PCR芯片快速高效便携的特点。被动法通过构造具有障碍的分叉通道进行切分，然而液滴的均一度并没有很好地保证，障碍会导致液滴不均匀甚至发生变形，液滴的大小偏差会造成后续数字PCR芯片中的微反应单元在温度变化过程中产生缩小、挥干、融合、变形等现象，并影响最后样品浓度的结果准确性，这些问题在一定程度上限制了该技术的应用。

发明内容

针对目前微流控液滴切分不能保证液滴均一、液滴生产工艺复杂等会影响样品检测准确度等问题，本发明提供一种微流控液滴操纵分割装置及其操纵分割方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：一种微流控液滴操纵分割装置，包括进样部、连接部、液滴切分部、液滴收集部；所述进样部、连接部、液滴切分部、液滴收集部一体化顺次连通；

所述进样部包括油相进样通道和样品进样通道，所述油相进样通道与所述连接部连通，所述样品进样通道与所述连接部连通，并由所述连接部将所述进样部输出的油相和样品混合液输送至所述液滴切分部；

所述液滴切分部由若干一体化的Y型三通管顺次连接构成，使所述液滴切分部具有一个进液口和若干出液口，所述进液口与所述连接部接通；每个所述Y型三通管分叉的夹角为45°～180°，并且顺次连接的相邻Y型三通管中前一个Y型三通管的通道宽度大于或等于后两个Y型三通管的通道宽度，后两个Y型三通管的通道宽度相同；

所述液滴收集部一体成型于所述液滴切分部的出液口处以实现对所述液滴切分部分割得到的液滴的收集。

相应地，一种微流控液滴操纵分割方法，利用上述所述的微流控液滴操纵分割装置进行槽中分割，包括以下步骤：

将表面活性剂、乳化剂与油相混合均匀后通入油相进样通道里，同时将样品通入样品进样通道，并同时对油相进样通道和样品进样通道施加(0～100)kPa的压力，压力不能为0，使加压后的油相经油相进样通道及加压后的样品经样品进样通道流过连接部，在剪切力作用下，产生初生液滴，初生液滴经过液滴切分部被多次切分，形成均一的液滴，并被液滴收集部收集。

本发明的技术效果为：

相对于现有技术，本发明上述提供的微流控液滴操纵分割装置，通过将液滴切分装置设计成特定角度及逐渐减小的通道宽度结构，可实现对液滴高效、均一的切分，并抑制切分的液滴发生变形，最终获得均一度良好的液滴，而且本分割装置分割效率高，能够在短时间内获得高通量的液滴阵列，能提高数字PCR后续反应的稳定性和准确性。

本发明提供的微流控液滴操纵分割方法，由于其采用的设备是上述微流控液滴操纵分割装置，因而能对液滴进行高效、均一的切分，并且可以抑制切分后的液滴发生变形，最终获得均一度良好的液滴。此外，该操纵分割方法具有分割效率高，能在短时间内获得高通量的液滴阵列，能够提高数字PCR后续反应的稳定性和准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的微流控液滴操纵分割装置结构示意图；

图2为本发明提供的微流控液滴操纵分割装置的进样部结构示意图；

图3为本发明提供的微流控液滴操纵分割装置的连接部结构示意图；

图4为本发明提供的微流控液滴操纵分割装置的液滴切分部结构示意图；

图5为本发明提供的微流控液滴操纵分割装置的液滴收集部结构示意图；

其中，100-微流控液滴操纵分割装置；

1-进样部，11-油相进样通道，111-油相进样口，112-第一油相通道，113-第二油相通道，114-第一油相通道出口，115-第二油相通道出口；

12-样品进样通道，121-样品进样口，122-曲线管，123-样品出样口；

2-连接部；21-第一接口；22-第二接口；23-第三接口；24-第四接口；

3-液滴切分部，31-进液口，32-出液口；α表示Y型三通管的夹角；

4-液滴收集部；41-液滴收集腔，411-液滴收集进口，412-液滴排放口。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，本发明提供一种微流控液滴操纵分割装置。

请参阅图1，本发明微流控液滴操纵分割装置是一种一体化成型的装置，为了便于描述，将该一体化成型的装置分成进样部1、连接部2、液滴切分部3及液滴收集部4，进样部1、连接部2、液滴切分部3及液滴收集部4顺次连通。

液滴切分部3具有进液口31和若干出液口32，其中进样部1和液滴切分部3通过连接部2连通，而液滴收集部4成型于液滴切分部3的出液口32处，以实现对液滴切分部3分割得到的液滴的收集。

请参阅图2，对于进样部1，其包括油相进样管道11和样品进样管道12，油相进样管道11和样品进样管道12相互独立，并且均与连接部2连通。

作为一个优选的方式，油相进样管道11具有油相进样口111，并且自油相进样口111后叉分成两条并行的通道，即第一油相通道112、第二油相通道113，也就是油相进样管11具有一个油相进样口111，经分裂成两条并行的通道后，具有两个油相出液口，即第一油相通道出口114，第二油相通道出口115，第一油相通道出口114和第二油相通道出口115分别与连接部2连通，从而实现油相样品从油相进样口111经第一油相通道112、第二油相通道113达到连接部2并进入液滴切分部3。样品进样管道12具有样品进样口121和样品出样口123，自样品进样口121至样品出样口123之间为一段曲线管122，通过曲线管122将样品进样口121和样品出样口123连通，当然样品进样口121、曲线管122及样品出样口123为一体化连通的管道，通过样品进样通道12实现将样品进样至输送至连接部2，在连接部2中与油相组分进行混合，并经由连接部2进入液滴切分部3。

请参阅图3，作为一个优选的方式，连接部2为“T”型四通管，该“T”型四通管具有第一接口21、第二接口22、第三接口23、第四接口24。其中，第一接口21与油相进样通道11的第一油相通道112一体化连通，具体是第一接口21与第一油相通道出口114对接，第二接口22与样品进样通道12一体化连通，具体是第二接口与样品出样口123对接，第三接口23与油相进样通道11的第二油相通道113一体化连通，具体是第三接口23与第二油相通道出口115对接，通过这样的一体化连接方式，实现油相和样品在连接部2中均匀混合，均匀混合后的液体从第四接口24进入液滴切分部3，因此第四接口24与液滴切分部3的进液口31一体化对接。

请参阅图4，液滴切分部3由若干Y型三通管顺次连接构成，若干个Y型三通管顺次连接构成的液滴切分部3具有一个进液口31和若干出液口32。进液口31与有连接部2一体化连通，经过逐渐增多的分叉Y型三通管，最终形成若干个出液口32；每个Y型三通管分叉的夹角α为45°～180°，并且顺次连接的相邻Y型三通管中前一个Y型三通管的通道宽度大于或等于后两个Y型三通管的通道宽度，后两个Y型三通管道的宽度相同。

作为一种优选方式，若干Y型三通管包括1个第一Y型三通管、2个第二Y型三通管、4个第三Y型三通管、8个第四Y型三通管、16个第五Y型三通管、32个第六Y型三通管，其中两个第二Y型三通管分别与第一Y型三通管连通，即两个第二Y型三通管与第一Y型三通管α夹角对应的两个通道口接通，从而实现从只有两个出口的第一Y型三通管变成具有四个出口，在两个第二Y型三通管出口的每个出口处连接一个第三Y型三通管，由于一共连接有四个第三Y型三通管，故形成八个出口，在这八个出口处均连接上第四Y型三通管，由此获得十六个出口，在这十六个出口处连接上第五Y型三通管，由此获得三十二个出口，在这三十二个出口处连接上第六Y型三通管，由此获得六十四个出口，这六十四个出口即为出液口32，由此构成液滴切分部3。

所有的Y型三通管，分叉的通道形成的夹角α均为45°～180°，且自第一Y型三通管至所述第六Y型三通管的通道宽度逐渐减小，具体来说就是第一Y型三通管的两个分叉管道大小与第二Y型三通管的进口大小相同，第二Y型三叉通道的两个分叉通道大小与第三Y型三通管的进口大小相同，依次类推，直至第六Y型三通管。第一Y型三通管至第六Y型三通管是一体成型的管道。

优选地，所述第一Y型三通管进液口处的通道宽度为(100～120)μm，分叉后的通道宽度为(70～80)μm；所述第二Y型三通管至第六Y型三通管的通道宽度为(70～80)μm，按照第一、第二、第三、第四、第五、第六的排列顺序，排在前端的通道宽度大于或等于排在后端的通道宽度，以实现对液滴的逐渐切割。

优选地，每个所述Y型三通管的高度为(80～120)μm。通道高度过小，形成的液滴容易发生变形，而通道高度过大，容易造成液滴重叠，无法使所有液滴都平铺于液滴收集部4，从而影响观察。

请参阅图5，作为优选地实施方式，液滴收集部4具有一个液滴收集腔41，该液滴收集腔41内可盛装切割得到的最终液滴，因此在液滴收集腔41上开设有液滴收集进口411，液滴收集进口411直接与液滴切分部3的出液口32连接，以快速承接切割得到的最终液滴，同时在液滴收集腔41与液滴收集进口411相对的部位上还开设有液滴排放口412，以实现对液滴的排放。

优选地，在液滴切分部3的64个出液口32与液滴收集部4之间，还具有64根直线管道(图中未标出)，该64根直线管道将64个液滴出口32与液滴收集部4之间一体化连通，从而实现液滴切分部3切分的液滴更顺畅的进入液滴收集部4。

本发明的微流控液滴操纵分割装置，将液滴切分装置设计成便于对液滴进行切分的特定角度范围内的通道，并且通道的宽度逐渐减小，可实现对液滴高效、均一的切分，并抑制切分的液滴发生变形，最终获得均一度良好的液滴，而且本分割装置分割效率高，能够在短时间内获得高通量的液滴阵列，能提高数字PCR后续反应的稳定性和准确性。采用本发明的微流控液滴操纵分割部对液滴进行操纵分割后，得到的液滴粒径为(60～80)μm。

由此，本发明还提供一种微流控液滴操纵分割的方法，该微流控液滴操纵分割的方法利用到上述的微流控液滴操纵分割部，其包括以下步骤：

将表面活性剂、乳化剂与油相混合均匀后通入油相进样通道11里，同时将样品通入样品进样通道12，并同时对油相进样通道11和样品进样通道12施加(0～100)kPa的压力，压力不能为0，使经过加压的油相经油相进样通道11及经过加压的样品经样品进样通道12流过连接部2，在连接部2处汇合，并在剪切力作用下，产生初生液滴，初生液滴经过液滴切分部3而被切分，形成均一的液滴，并被液滴收集部4收集。

上述分割涉及到的压力，可以通过将油相进样通道11、样品进样通道12与泵连接来获得压力，具体是向油相进样通道11、样品进样通道12分别注入油相、样品之后，将泵连接在油相进样通道11的进口以及连接在样品进样通道12的进口，从而实现提供压力。

经过分割，获得的液滴粒径为(60～80)μm。

作为优选地，所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚(trionx-100)，所述乳化剂为鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷(EM90)。

通过表面活性剂和乳化剂的作用，维持分割得到的液滴的粒径恒定，可以避免进入液滴收集部4后的液滴重新融合成大液滴。

优选地，将表面活性剂、乳化剂油相混合后得到的混合物中，按照质量百分比计，油相94.5％～100％；表面活性剂0～0.5％；乳化剂0～5％，其中表面活性剂与乳化剂均不取0值。

本发明的油相为石蜡油。

为更好的说明本发明的技术方案，下面通过例子做进一步的说明。

实施例1

一种微流控液滴操纵分割方法，涉及如图1～5所示的一体化成型的微流控液滴操纵分割装置，该装置中，进样部1通过连接部2将进样部1和液滴切分部3连通，液滴收集部4一体化成型于液滴切分部3的出液端，其中液滴切分部3中，第一Y型三通管进液口处的通道宽度为100μm，高度为80μm，第一Y型三通管两个分叉通道宽度为80μm，高度为80μm，两个第二Y型三通管与第一Y型三通管连接处的通道宽度为80μm，高度为80μm，分叉后的通道宽度均为80μm；4个第三Y型三通管与第二Y型三通管连接处的通道宽度为80μm，高度为80μm，分叉后的通道宽度均为80μm；8个第四Y型三通管与第三Y型三通管连接处的通道宽度为80μm，高度为80μm，分叉后的通道宽度均为80μm；16个第五Y型三通管与第四Y型三通管连接处的通道宽度为80μm，高度为80μm，分叉后的通道宽度均为80μm；32个第六Y型三通管与第五Y型三通管连接处的通道宽度为80μm，高度为80μm，分叉后的通道宽度均为80μm；64个与第六Y型三通管出口处连接的直线管道宽度为80μm，高度为80μm；液滴收集部4一体化成型于第六Y型三通管连接的64个直线管道出口处，上述第一Y型三通管至第六Y型三通管的夹角α均为60°，并且第一Y型三通管至第六Y型三通管一体化成型。

具体分割方法为：将聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷(EM90)乳化剂与石蜡油以0.1％:3％:1的比例进行混合，然后通入进样部1中的油相进样通道里，同时将水通入进样部1中的样品进样通道里，油相和样品分别施加50kPa的压力，油相和样品在连接部2中混合后，经液滴切分部3的切分，在液滴收集部4中可以收集到粒径均一的液滴，经检测液滴粒径为70μm。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，所述微流控液滴操纵分割装置包括进样部、连接部、液滴切分部、液滴收集部；所述进样部、连接部、液滴切分部、液滴收集部一体化顺次连通；

所述进样部包括油相进样通道和样品进样通道，所述油相进样通道与所述连接部连通，所述样品进样通道与所述连接部连通，并由所述连接部将所述进样部输出的油相和样品混合液输送至所述液滴切分部；

所述液滴切分部由若干一体化的Y型三通管顺次连接构成，使所述液滴切分部具有一个进液口和若干出液口，所述进液口与所述连接部接通；每个所述Y型三通管分叉的夹角为45°～180°，并且顺次连接的相邻Y型三通管中前一个Y型三通管的通道宽度大于或等于后两个Y型三通管的通道宽度，后两个Y型三通管的通道宽度相同；

所述液滴收集部一体成型于所述液滴切分部的出液口处以实现对所述液滴切分部分割得到的液滴的收集。

2.如权利要求1所述的微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，若干所述Y型三通管包括1个第一Y型三通管、2个第二Y型三通管、4个第三Y型三通管、8个第四Y型三通管、16个第五Y型三通管、32个第六Y型三通管，且自第一Y型三通管至所述第六Y型三通管顺次连通。

3.如权利要求2所述的微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，所述第一Y型三通管进液口处的通道宽度为(100～120)μm，分叉后的通道宽度为(70～80)μm；所述第二Y型三通管至第六Y型三通管的通道宽度为(70～80)μm，且第二Y型三通管至第六Y型三通管的通道宽度逐渐递减。

4.如权利要求1的微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，若干所述Y型三通管的高度为(80～120)μm。

5.如权利要求1所述的微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，所述油相进样通道具有一进样口和两出样口，且所述油相进样通道自进样口分成第一油相通道和第二油相通道，所述第一油相通道和第二油相通道分别与连接部连通，从而使油相样品从进样口输送至连接部；

所述样品进样通道具有进样口和连接在进样口的曲线管，所述曲线管末端为样品出样口。

6.如权利要求5所述的微流控液滴操纵分割装置，其特征在于，所述连接部为“T”型四通管，所述油相进样通道的第一油相通道和第二油相通道分别与“T”型四通管的两个接口连接，所述样品出样口与所述“T”型四通道的第三个接口连接。

7.一种微流控液滴操纵分割方法，其特征在于，利用权利要求1～6任一项所述的微流控液滴操纵分割装置进行槽中分割，包括以下步骤：

将表面活性剂、乳化剂与油相混合均匀后通入油相进样通道里，同时将样品通入样品进样通道，并同时对油相进样通道和样品进样通道施加(0～100)kPa的压力，压力不能为0，使加压后的油相经油相进样通道及加压后的样品经样品进样通道流过连接部，在剪切力作用下，产生初生液滴，初生液滴经过液滴切分部的多次切分，形成均一的液滴，并被液滴收集部收集。

8.如权利要求7所述的微流控液滴操纵分割方法，其特征在于，获得的液滴粒径为(60～80)μm。

9.如权利要求7所述的微流控液滴操纵分割方法，其特征在于，所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚，所述乳化剂为鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷。

10.如权利要求7所述的微流控液滴操纵分割方法，其特征在于，按照体积百分比计，表面活性剂、乳化剂与油相混合后的物料中，各组分含量为：

油相 94.5～100％；

表面活性剂 0～0.5％；

乳化剂 0～5％；

其中，表面活性剂和乳化剂均不取0值。

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