CN110632142A - 一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，公开了一种基于金钯‑石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，用于检测啶虫脒的含量以及用于评估毒死婢和啶虫脒对细胞的联合毒性，所述制备方法包括以下步骤：称取原料柠檬酸和天冬氨酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液蒸发之后放入烘箱内反应，反应结束后直接得到天冬氨酸石墨烯量子点Asp‑GQD，Asp‑GQD用作还原剂和稳定剂，以在单宁酸存在下产生Asp‑GQD@AuPd杂化物。本发明的有益效果为：电催化活性高，灵敏度，稳定性和易用性高；检测具有高特异性。

Description

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器 的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法及其应用，用于检测啶虫脒的含量同时也用于评估毒死婢和啶虫脒对细胞的联合毒性。

背景技术

有机磷农药（OP）的使用在过去十年中有所增加，因为它们优于氨基甲酸酯和有机氯杀虫剂，在环境中的半衰期较短，并且在害虫控制方面具有高效率。在目标生物体中，有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致昆虫抽搐，麻痹和死亡。毒死蜱（Chlorpyrifos）是一种非系统性氯化有机磷化合物，对多种害虫具有杀虫活性，占传统农业中使用的所有杀虫剂的38％，然而，它在人体中表现出许多不利影响，例如内分泌紊乱，出生缺陷，神经系统影响和呼吸衰竭。它每年导致大约200,000人死亡，并被世界卫生组织归类为严重的全球健康风险和环境威胁。

新烟碱类杀虫剂因其高效，低毒和广谱活性而广泛用于农业和家庭害虫防治，它的年销售额接近34亿美元，约占全球农药市场的20％。啶虫脒是新烟碱类的杀虫剂，通过激活烟碱乙酰胆碱受体并导致害虫生物的麻痹和死亡，具有新的作用方式。由于哺乳动物的毒性和特殊作用特性相对较低，啶虫脒被广泛用作有机磷和其他传统杀虫剂的替代杀虫剂，以控制各种作物，特别是叶类蔬菜的摄食昆虫。然而，啶虫脒在农业和家庭中的应用越来越多，可能会产生严重的食物和环境污染。这增加了动物和人类的健康风险。

据报道，许多现代纳米技术用于测定痕量农药残留，包括使用铜纳米粒子，碳点，G-四链体，上转换纳米粒子和比率荧光量子点的荧光方法。作为光学探针，比色法用四甲基联苯胺和金纳米粒子，表面增强拉曼散射（SERS）基于金纳米粒子，银纳米棒，银涂层玻璃纸和银树突，免疫层析条，酶联免疫吸附试验（ELISA），电化学方法，高效液相色谱（HPLC），共振光散射和电喷雾离子阱质谱（ESI-MS）。荧光法快速，灵敏，有选择性。然而，当它用于新鲜食品分析时，它经常遭受严重的基质干扰。在新鲜食品中，许多生物大分子如蛋白质和核酸在紫外线辐射下会产生强烈的荧光发射，并导致荧光背景的干扰。为了获得可靠的结果，强烈需要复杂的样品预处理来分离干扰组分。SERS具有高灵敏度和选择性，但不稳定性限制了其在常规分析中的应用。ELISA主要提供相对较差的检测限，主要用于农药残留的高通量筛选。HPLC和ESI-MS主要用于常规杀虫剂分析。然而，这些方法需要使用昂贵的仪器和高技术人员。由于低成本，快速响应，特异性识别和高灵敏度，电化学适体传感器受到更多关注。

纳米技术的快速发展已经展示出纳米材料作为基本构件和信号元件的巨大潜力，用于制造具有优异分析性能的电化学传感器。由于其独特的结构和性质，石墨烯气凝胶（GA），石墨烯量子点（GQDs）和金纳米粒子（Au NPs）是最重要的传感材料，并广泛应用于电化学传感器的设计中。GA可以提供由石墨烯网络组成的一种三维结构。与普通石墨烯相比，GA具有更高的电催化活性，因为它具有优异的电子/离子传导性。与石墨烯不同，GQD由具有丰富官能团的小石墨烯片组成，这些基团可以赋予GQDs催化，分子识别和与其他组分连接的特殊功能。作为贵金属纳米材料之一，Au NPs具有良好的导电性和对许多分子的特殊催化作用，此外，Au NP还用于通过Au-S键将诸如DNA，酶和蛋白质的生物分子固定在电极表面上。最近，Au-GQD，GQD-GA和Au-GQD-GA杂交体被报道并应用于电化学传感器的制造。与单个Au NP，GA和GQD相比，杂化物通常表现出更好的催化活性。更重要的是，它们的混合物提供了满足生物传感器设计的多方面要求的机会。然而，目前基于杂交的适体传感器仍然需要使用额外的氧化还原探针来产生用于检测非电活性分析物的电化学信号，因为该杂交体不具有氧化还原探针的功能。这不仅给适体传感器的实际使用带来了不便，而且由于氧化还原探针和分析物的组合，也可能对检测带来干扰。金纳米粒子（AuNPs）具有独特的化学和物理特性，已在基础研究中得到广泛应用，特别是在生物学和传感应用。金纳米粒子（AuNPs）目前是广泛研究领域的主题，由于它们与导线或电子传导隧道的相似性而增强了传感器的电催化响应。此外，AuNPs还提供额外的结合位点，用于偶联多种分子，包括酶，抗体和细胞。

发明内容

本发明旨在提供一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法及其应用，用于检测啶虫脒的含量同时也用于评估毒死婢和啶虫脒对细胞的联合毒性。

按照本发明的技术方案，所述基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取摩尔比为1:1的柠檬酸和天冬氨酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150-250℃的条件下反应0.5-10h，得到天冬氨酸量子点固体产物，将天冬氨酸量子点固体产物配制成25-200mg/mL的水溶液；

（2）将5-50mL浓度为0.1-0.5mg/mL的HAuCl₄和PdCl₂溶液与1-5mL浓度为1-10mg m/L的单宁酸溶液混合，添加0.1-2.0 mL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液，并在40-100℃加热直至溶液颜色变为深红色，保持温度3-10分钟，然后冷却至环境温度，制得金种子溶液；

（3）将5-100μL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液与体积比为1:1的HAuCl₄和PdCl₂溶液分散在另一个容器中，HAuCl₄和PdCl₂溶液均为0.5-5.0mL，浓度均为25-200mg /mL，然后加入1-20mL超纯水，温育2-10分钟后，加入0.1-0.5mL浓度为2-15mM的AgNO ₃溶液、10-80μL步骤（2）所得金种子溶液以及5-20mL浓度为30％的H ₂ O ₂溶液得到混合溶液A，待混合溶液A的颜色变为蓝色后，继续搅拌10-80秒，再经过5000-10000rpm离心5-15分钟处理后收集所得天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物（Asp-GQD @ AuPd）；将收集的天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物用超纯水洗涤2-5次，然后再分散在0.5-2.0mL,pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中；

（4）将1-8mg石墨烯气凝胶分散在2-20mL超纯水中并与体积比为40:1-10:1的0.5-5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液B，取3-10μL混合溶液B滴在预处理的玻璃碳电极的表面上，然后在N ₂中干燥，得到石墨烯气凝胶-玻璃碳电极传感器；

（5）将步骤（3）所得天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体与体积比为40:1-10:1的0.5-5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液C，取3-10μL混合溶液C滴在石墨烯气凝胶-玻璃碳电极传感器的表面上，然后在N ₂中干燥；滴加3-10μL浓度为0.5-2.0μM的DNA适体溶液，在25-45℃下孵育1-3小时，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，最后在N 2中干燥，滴加3-10μL浓度为0.5-2.0mM的6-巯基己-1-醇溶液以关闭天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物表面上的电活性位点得到电极，将电极温育0.5-2.0小时，然后用磷酸缓冲盐溶液洗涤，获得适体传感器。

进一步的，步骤（3）中天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体和步骤（5）中的适体传感器在使用前储存在2-8℃的冰箱中。

本发明另一方面提供了一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的应用，用于啶虫脒的检测，所述基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物制得的适体传感器，包括以下步骤：将5μL啶虫脒溶液滴加到适体传感器的表面上；温育1小时后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤并用N ₂干燥；浸入10mM ,pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液中，采用差分脉冲伏安法测量，参数设置为4mV/ s的扫描速率，50mV脉冲幅度，20ms脉冲宽度和-0.2V初始电位，记录在-0.3V和0.5V之间的差分脉冲伏安曲线。

本发明还提供了一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感的应用，用于二元有机磷农药在细胞水平上的联合毒性评价，所述基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物制得的适体传感器，包括以下步骤：

取处理后的生长至对数期的人肝癌细胞，向其中加入以浓度比为1:1配制的毒死婢和啶虫脒的混合溶液，毒死婢和啶虫脒在使用前用丙酮稀释，再加入细胞培养基配制至丙酮的体积浓度低于0.5%，并以含0.5%体积浓度丙酮的细胞基作为实验的对照组；

在抛光布上用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料连续抛光玻璃碳电极，用双蒸水彻底冲洗，然后在乙醇和双蒸水中超声处理10分钟；再滴加5μl石墨烯气凝胶溶液，待电极干燥后，滴加5μl 天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体，然后将修饰的玻璃碳电极在室温下用 0.1M N-N-羟基琥珀酰亚胺-0.4M 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的混合物浸入5mM叶酸中4小时，并用去离子水冲洗，得到叶酸/金钯@石墨烯量子点/石墨烯气凝胶/玻碳电极；然后将10μL浓度为5×10 ⁵ 细胞/ ml 的人肝癌细胞悬浮液滴加到叶酸/金钯@石墨烯量子点/石墨烯气凝胶/玻碳电极表面上，在37 ℃下孵育8 小时，然后浸入磷酸缓冲盐溶液中，去除未捕获的细胞；在电化学测量之前，修饰的电极在-0.2和0.6V之间DPV循环几次直到获得可重现的反应。

本发明的有益效果在于：

（1）电催化活性高，相比较于其他单金属纳米材料而言，该Asp-GQD @ AuPd合金纳米材料具有较高的催化功能，合成后的杂化物具有纳米级结构，由几个纳米级的金钯纳米粒子组成，具有丰富的锐边和角落，以及出色的氧化还原行为；通过天冬氨酸量子点合成该复合材料，纳米金表面富含氮元素，水溶性强；

（2）与其他农药电化学适体传感器相比，基于Asp-GQD @ AuPd /石墨烯气凝胶的适体传感器具有高灵敏度，稳定性和易用性的优点；

（3）检测具有高特异性，检测体系中引入了可以与目标特异性结合的适配体序列。

附图说明

图1为本发明中Asp-GQD @ AuPd的SEM（图1A）、TEM（图1B）和元素分析图（图1C-D）。

图2为本发明中Asp-GQD @ AuPd的XRD。

图3为本发明中Asp-GQD @ AuPd的HRTEM。

图4为本发明中Asp-GQD的电化学CV行为。

图5为本发明中Asp-GQD @ AuPd的电化学CV行为。

图6、7为本发明中Asp-GQD @ AuPd在玻碳电极上检测啶虫脒的条件优化图。

图8为本发明中电化学生物传感平台检测的线性范围。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明所用的CHI660D电化学工作站(上海辰华)；HITACHI S4800场发射扫描电子显微镜；JEM-2100(HR)透射电子显微镜（日本JEOL公司）；Nicolet iS50 FT-IR 傅立叶红外光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；CuKα辐射在D8 Advance上测量X射线衍射（XRD）（德国布鲁克）。

一单宁酸（TA），柠檬酸，天冬氨酸（Asp），氯金酸（HAuCl4），氯化钯（PdCl₂），硝酸银（AgNO3），啶虫脒和6-巯基己-1-醇（MCH）购自Sigma-Aldrich。制备磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01M，pH7.4）。适体由Sangon Biotechnology Limited Company合成和纯化，其序列为：5'-SH-（CH2）6TGT AAT TTG TCT GCA GCG GTT CTT GAT CGC TGA CAC CAT ATT ATG AAGA-3'。在含有20mM Tris-HCl，1mM MgCl ₂，1mM CaCl ₂和5mM KCl（pH7.4）的Tris / Mg / K缓冲液中制备探针原液，并储存在-20℃。

实施例一

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取摩尔比为1:1的柠檬酸和天冬氨酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150℃的条件下反应10h，得到天冬氨酸量子点固体产物，将天冬氨酸量子点固体产物Asp-GQD配制成25mg/mL的水溶液；

（2）将5mL浓度为0.5mg/mL的HAuCl₄溶液与5mL浓度为1mg m/L的单宁酸溶液混合，添加0.1 mL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点Asp-GQD水溶液，并在40℃加热直至溶液颜色变为深红色，保持温度10分钟，然后冷却至环境温度，制得金种子溶液；

（3）将100μL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液与0.5mL浓度为200mg /mL的HAuCl₄溶液、0.5mL浓度为200mg /mL的PdCl₂溶液分散在另一个容器中，然后加入20mL超纯水，室温下温育2分钟后，加入0.1mL浓度为15mM的AgNO ₃溶液、10μL步骤（2）所得金种子溶液以及20mL浓度为30％的H ₂ O ₂溶液得到混合溶液A，待混合溶液A的颜色变为蓝色后，继续搅拌10秒，再经过5000rpm离心15分钟处理后收集所得Asp-GQD @ AuPd；将收集的Asp-GQD @ AuPd用超纯水洗涤5次，然后再分散在0.5mL,pH 6.0的Tris-HCl（三（羟甲基）氨基甲烷）缓冲液中；所得Asp-GQD @ AuPd分散液在使用前保存在2-8℃的冰箱中；

（4）将1mg石墨烯气凝胶GA分散在2mL超纯水中并与体积比为40:1的5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液B，取3μL混合溶液B滴在预处理的玻璃碳电极（GCE，直径1.0mm）的表面上，然后在N ₂中干燥，得到石墨烯气凝胶-玻璃碳电极传感器（GA / GCE传感器）；

（5）将步骤（3）所得Asp-GQD @ AuPd分散体与体积比为40:1的0.5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液C，取3μL混合溶液C滴在GA / GCE传感器的表面上，然后在N ₂中干燥；滴加3μL浓度为2.0μM的DNA适体溶液，在25℃下孵育3小时，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，最后在N ₂中干燥，滴加3μL浓度为2.0mM的6-巯基己-1-醇（MCH）溶液以关闭Asp-GQD @ AuPd表面上的电活性位点得到电极，将电极在室温下温育0.5小时，然后用PBS（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，获得适体传感器。准备好的适体传感器在使用前储存在2-8℃的冰箱中。

实施例二

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取摩尔比为1:1的柠檬酸和天冬氨酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为200℃的条件下反应5h，得到天冬氨酸量子点固体产物，将天冬氨酸量子点固体产物Asp-GQD配制成100mg/mL的水溶液；

（2）将25mL浓度为0.2mg/mL的HAuCl₄溶液与3mL浓度为6mg m/L的单宁酸溶液混合，添加1.2 mL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点Asp-GQD水溶液，并在70℃加热直至溶液颜色变为深红色，保持温度6分钟，然后冷却至环境温度，制得金种子溶液；

（3）将50μL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液和与2.5mL浓度为100mg /mL的HAuCl₄溶液、2.5mL浓度为100mg /mL的PdCl₂溶液分散在另一个容器中，然后加入10mL超纯水，室温下温育6分钟后，加入0.3mL浓度为10mM的AgNO ₃溶液、50μL步骤（2）所得金种子溶液以及12mL浓度为30％的H ₂ O ₂溶液得到混合溶液A，待混合溶液A的颜色变为蓝色后，继续搅拌45秒，再经过7000rpm离心10分钟处理后收集所得Asp-GQD @ AuPd；将收集的Asp-GQD @ AuPd用超纯水洗涤3次，然后再分散在1mL,pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中；所得Asp-GQD @ AuPd分散液在使用前保存在2-8℃；

（4）将5mg石墨烯气凝胶GA分散在10mL超纯水中并与体积比为20:1的3％壳聚糖溶液混合得到混合溶液B，取6μL混合溶液B滴在预处理的玻璃碳电极（GCE，直径1.0mm）的表面上，然后在N ₂中干燥，得到GA / GCE传感器；

（5）将步骤（3）所得Asp-GQD @ AuPd分散体与体积比为20:1的3％壳聚糖溶液混合得到混合溶液C，取6μL混合溶液C滴在GA / GCE传感器的表面上，然后在N ₂中干燥；滴加6μL浓度为1.0μM的DNA适体溶液，在35℃下孵育2小时，用PBS（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，最后在N ₂中干燥，滴加6μL浓度为1.0mM的MCH溶液以关闭Asp-GQD @ AuPd表面上的电活性位点得到电极，将电极在室温下温育1小时，然后用PBS（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，获得适体传感器。准备好的适体传感器在使用前储存在2-8℃的冰箱中。

实施例三

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取摩尔比为1:1的柠檬酸和天冬氨酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为250℃的条件下反应0.5h，得到天冬氨酸量子点固体产物，将天冬氨酸量子点固体产物Asp-GQD配制成200mg/mL的水溶液；

（2）将50mL浓度为0.1mg/mL的HAuCl₄溶液与1mL浓度为10mg m/L的单宁酸溶液混合，添加、2.0 mL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点Asp-GQD水溶液，并在100℃加热直至溶液颜色变为深红色，保持温度3分钟，然后冷却至环境温度，制得金种子溶液；

（3）将5μL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液与5.0mL浓度为25mg /mL的HAuCl₄溶液、5.0mL浓度为25mg /mL的PdCl₂溶液分散在另一个容器中，然后加入1mL超纯水，室温下温育10分钟后，加入0.5mL浓度为2mM的AgNO ₃溶液、80μL步骤（2）所得金种子溶液以及5mL浓度为30％的H ₂ O ₂溶液得到混合溶液A，待混合溶液A的颜色变为蓝色后，继续搅拌80秒，再经过10000rpm离心5分钟处理后收集所得Asp-GQD @ AuPd；将收集的Asp-GQD @ AuPd用超纯水洗涤2次，然后再分散在2.0mL,pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中；所得Asp-GQD @ AuPd分散液在使用前保存在2-8℃；

（4）将8mg石墨烯气凝胶GA分散在20mL超纯水中并与体积比为10:1的0.5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液B，取10μL混合溶液B滴在预处理的玻璃碳电极（GCE，直径1.0mm）的表面上，然后在N ₂中干燥，得到GA / GCE传感器；

（5）将步骤（3）所得Asp-GQD @ AuPd分散体与体积比为10:1的0.5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液C，取10μL混合溶液C滴在GA / GCE传感器的表面上，然后在N ₂中干燥；滴加10μL浓度为0.5μM的DNA适体溶液，在45℃下孵育1小时，用PBS（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，最后在N ₂中干燥，滴加10μL浓度为0.5mM的MCH溶液以关闭Asp-GQD @ AuPd表面上的电活性位点得到电极，将电极在室温下温育2小时，然后用PBS（pH 6.0-8.0,0.05-0.25M）洗涤，获得适体传感器。准备好的适体传感器在使用前储存在2-8℃的冰箱中。

应用实施例一

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的应用，用于啶虫脒的检测，所述基于金钯@石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为Asp-GQD @ AuPd制得的适体传感器，可以采用上述实施例中的方法制得，包括以下步骤：将5μL啶虫脒溶液滴加到适体传感器的表面上；温育1小时后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤并用N ₂干燥；浸入10mM ,pH7.4的磷酸缓冲盐溶液中，采用差分脉冲伏安法测量，参数设置为4mV/ s的扫描速率，50mV脉冲幅度，20ms脉冲宽度和-0.2V初始电位，记录在-0.3V和0.5V之间的DPV曲线。

应用实施例二

一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的应用，用于二元有机磷农药在细胞水平上的联合毒性评价，所述基于金钯@石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为Asp-GQD @ AuPd制得的适体传感器，可以采用上述实施例中的方法制得，包括以下步骤：

细胞培养：取处理后的生长至对数期的人肝癌细胞（BEL-7402）（BEL-7402细胞在RPMI-1640培养基中培养，所述培养基在37 ℃，含有5％CO ₂的潮湿气氛中补充有10％胎牛血清，在3天后的生长迟缓阶段，细胞达到对数生长期），向其中加入以浓度比为1:1配制的毒死婢和啶虫脒的混合溶液，毒死婢和啶虫脒在使用前用丙酮稀释，再加入细胞培养基配制至丙酮的体积浓度低于0.5%，并以含0.5%体积浓度丙酮的细胞基作为实验的对照组；

细胞电化学检测：在抛光布上用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料连续抛光玻璃碳电极，用双蒸水彻底冲洗，然后在乙醇和双蒸水中超声处理10分钟；再滴加5μl石墨烯气凝胶溶液，待电极干燥后，滴加5μl 天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体，然后将修饰的玻璃碳电极在室温下用 0.1M N-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-0.4M 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）的混合物浸入5mM叶酸中4小时，并用去离子水冲洗，得到叶酸/金钯@石墨烯量子点/石墨烯气凝胶/玻碳电极（FA / Asp-GQD @ AuPd / GA / GCE）；然后将10μL浓度为5×10 ⁵ 细胞/ ml 的BEL-7402细胞悬浮液滴加到FA / Asp-GQD @ AuPd / GA/ GCE表面上，在37 ℃下孵育8 小时，然后浸入磷酸缓冲盐溶液中，去除未捕获的细胞；在电化学测量之前，修饰的电极在-0.2和0.6V之间DPV循环（扫描速率100mV/ s）几次直到获得可重现的反应。

对制备得到的Asp-GQD @ AuPd进行表征，图1显示：Asp-GQD @ AuPd呈星形纳米结构，平均粒径为102.5 nm，由几个纳米级的AuPd纳米粒子组成，边缘和边角丰富。元素映射显示Asp-GQD @ AuPd中金（Au）、钯（Pd）的空间分布。

图2显示了Asp-GQD @ AuPd的XRD图谱。从图2可以看出，XRD图案包括在38.2°，44.4°，66.1°和78.4°处的四个衍射峰。这些峰分别对应于AuPd纳米晶体的（111），（200），（220）和（311）平面。

图3 IR光谱包含六个主要的IR吸收峰或带。 3300-3600cm ^-1的吸收带是由O-H和N-H键的对称伸缩振动引起的IR吸收。 2909cm^-1处的吸收峰是由于饱和C-H键的对称伸缩振动。 1700cm ^-1处的峰值是-C = O键的拉伸振动的IR吸收。1380cm ^-1处的峰值是C-O键的伸缩振动的IR吸收。由于Au纳米晶体在600和4000cm^-1之间具有明显的IR吸收，因此上述IR吸收峰和带应主要归因于杂化体中的Asp-GQD。

图4表明Asp-GQD / GCE的CV曲线在-0.02 / 0.12V处给出一对可逆的氧化还原峰。在50mV s-重复扫描50次后，其峰值电位和峰值电流几乎保持恒定。这些结果表明Asp-GQD是一种电活性材料，它可以在电极表面上进行准可逆的氧化还原过程。

图5是Asp-GQD @ AuPd在PBS溶液中的电化学行为，Asp-GQD @ AuPd可用作具有催化剂的氧化还原物的电化学传感器。

图6，图7为了优化啶虫脒的检测条件，在pH 7.4的PBS中研究了孵育时间和适体浓度对所提出的适体传感器的DPV峰值电流的变化（ΔIp）的影响。图6表明，如果时间小于60分钟，ΔIp随着培养时间的增加而增加。这是因为随着孵育时间的增加，更多的啶虫脒分子被适形传感器表面上的啶虫脒捕获，导致ΔIp值增加。该值在60分钟的孵育时间达到最大值，然后保持几乎恒定，验证啶虫脒的捕获过程已完成。为了获得高灵敏度和减少分析时间，选择60分钟的孵育时间用于电化学测定啶虫脒。图7显示ΔIp值与DNA探针（适体）浓度的关系曲线，孵育时间为60分钟。图7显示ΔIp值随着DNA探针浓度的增加而迅速增加。随着DNA探针的增加，DNA探针可以捕获更多的啶虫脒分子。这将导致DPV峰值电流的更大降低，表明ΔIp值增加。当DNA探针浓度大于1.0μM时，ΔIp值达到最大值，证实DNA探针的数量足以捕获溶液中的所有分子。因此，继续增加DNA探针浓度不会带来ΔIp值的任何变化。为了达到高灵敏度，使用1.0μM的DNA探针制备适体传感器。

在最佳条件下，本发明公开了基于功能化石墨烯量子点和金钯@石墨烯量子点复合材料用于检测啶虫脒含量的电化学生物传感器的分析特性。通过改变啶虫脒浓度来测试所提出的适体传感器对啶虫脒的DPV行为。图8显示了在不同浓度的啶虫脒中孵育的适体传感器的DPV曲线以及DPV峰值电流（Ip）与啶虫脒浓度的对数的关系曲线。随着啶虫脒的增加，DPV反应将迅速减少。在图8B中，Ip值显示出良好的线性关系，其中啶虫脒浓度的对数在1.0^-1×10⁵fM的范围内。相应的回归方程为：Ip（nA）= -347.13×Log [Cacetamiprid，fM] -2004.6，相关系数为0.997。基于3次的信号/标准偏差，对于啶虫脒检测，发现检测限（LOD）为0.37fM。灵敏度远远优于现有技术中乙酰咪唑的其他分析技术。超高灵敏度主要归因于Asp-GQD @ AuPd的优异催化活性。此外，通过检测100fM啶虫脒测试了适体传感器的再现性。50次重复测量得出1.9％的相对标准偏差，验证了高重复性。通过将适体传感器在4℃下储存两周来研究适体传感器的稳定性。DPV对100 fM啶虫脒的响应保持至少98.4％，表明高稳定性。

本发明首次公开了一种合成Asp-GQD @ AuPd的概念，检测结果表明，Asp-GQD @AuPd提供纳米星状结构，平均粒径为102.5 nm。每个纳米级由几个纳米尺寸的金纳米粒子组成，具有丰富的尖锐边缘和角落。独特的结构和与Asp -GQD的杂交大大提高了金纳米星的催化活性。Asp-GQD具有高电活性，可在电极表面进行可逆的氧化还原反应。金纳米星原位催化Asp-GQD的氧化还原反应，并导致改善的电化学行为。适体特异性地与啶虫脒结合并引起敏感和选择性的电化学反应。基于Asp-GQD @ AuPd-Apt /石墨烯气凝胶的aptasensor对啶虫脒具有超高灵敏度和选择性。随着啶虫脒浓度的增加，差分脉冲伏安信号线性降低，范围为1.0 fM至1×10⁵ fM，检出限为0.37 fM（S / N = 3）。同时也用于真实细胞的联合毒性的评价。近年来，叶酸被发现是一种重要的B类维生素，专门针对叶酸受体，以高亲和力锚定在细胞膜上，以促进其细胞内化。通过将叶酸功能连接到Asp-GQD @ AuPd上，然后特异性识别细胞。其中，细胞是经过毒死婢和啶虫脒培养过的，然后滴加到修饰有功能化纳米金的玻碳电极上，进行电化学测量。

Claims (4)

1.一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取摩尔比为1:1的柠檬酸和天冬氨酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150-250℃的条件下反应0.5-10h，得到天冬氨酸量子点固体产物，将天冬氨酸量子点固体产物配制成25-200mg/mL的水溶液；

（2）将5-50mL浓度为0.1-0.5mg/mL的HAuCl₄溶液与1-5mL浓度为1-10mg m/L的单宁酸溶液混合，添加0.1-2.0 mL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液，并在40-100℃加热直至溶液颜色变为深红色，保持温度3-10分钟，然后冷却至环境温度，制得金种子溶液；

（3）将5-100μL步骤（1）中所得的天冬氨酸量子点水溶液与体积比为1:1的HAuCl₄和PdCl₂溶液分散在另一个容器中，HAuCl₄和PdCl₂溶液均为0.5-5.0mL，浓度均为25-200mg /mL，然后加入1-20mL超纯水，温育2-10分钟后，加入0.1-0.5mL浓度为2-15mM的AgNO ₃溶液、10-80μL步骤（2）所得金种子溶液以及5-20mL浓度为30％的H ₂ O ₂溶液得到混合溶液A，待混合溶液A的颜色变为蓝色后，继续搅拌10-80秒，再经过5000-10000rpm离心5-15分钟处理后收集所得天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物；将收集的天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物用超纯水洗涤2-5次，然后再分散在0.5-2.0mL,pH 6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中；

（4）将1-8mg石墨烯气凝胶分散在2-20mL超纯水中并与体积比为40:1-10:1的0.5-5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液B，取3-10μL混合溶液B滴在预处理的玻璃碳电极的表面上，然后在N ₂中干燥，得到石墨烯气凝胶-玻璃碳电极传感器；

（5）将步骤（3）所得天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体与体积比为40:1-10:1的0.5-5％壳聚糖溶液混合得到混合溶液C，取3-10μL混合溶液C滴在石墨烯气凝胶-玻璃碳电极传感器的表面上，然后在N ₂中干燥；滴加3-10μL浓度为0.5-2.0μM的DNA适体溶液，在25-45℃下孵育1-3小时，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，最后在N ₂中干燥，滴加3-10μL浓度为0.5-2.0mM的6-巯基己-1-醇溶液以关闭天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物表面上的电活性位点得到电极，将电极温育0.5-2.0小时，然后用磷酸缓冲盐溶液洗涤，获得适体传感器。

2.如权利要求1所述的基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体和步骤（5）中的适体传感器在使用前储存在2-8℃的冰箱中。

3.一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的应用，其特征在于，用于啶虫脒的检测，所述基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物制得的适体传感器，包括以下步骤：将5μL啶虫脒溶液滴加到适体传感器的表面上；温育1小时后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤并用N ₂干燥；浸入10mM ,pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液中，采用差分脉冲伏安法测量，参数设置为4mV/ s的扫描速率，50mV脉冲幅度，20ms脉冲宽度和-0.2V初始电位，记录在-0.3V和0.5V之间的差分脉冲伏安曲线。

4.一种基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感的应用，其特征在于，用于二元有机磷农药在细胞水平上的联合毒性评价，所述基于金钯-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器为天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物制得的适体传感器，包括以下步骤：

取处理后的生长至对数期的人肝癌细胞，向其中加入以浓度比为1:1配制的毒死婢和啶虫脒的混合溶液，毒死婢和啶虫脒在使用前用丙酮稀释，再加入细胞培养基配制至丙酮的体积浓度低于0.5%，并以含0.5%体积浓度丙酮的细胞基作为实验的对照组；

在抛光布上用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料连续抛光玻璃碳电极，用双蒸水彻底冲洗，然后在乙醇和双蒸水中超声处理10分钟；再滴加5μl石墨烯气凝胶溶液，待电极干燥后，滴加5μl 天冬氨酸功能化石墨烯量子点-金钯杂化物分散体，然后将修饰的玻璃碳电极在室温下用 0.1M N-N-羟基琥珀酰亚胺-0.4M 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的混合物浸入5mM叶酸中4小时，并用去离子水冲洗，得到叶酸/金钯@石墨烯量子点/石墨烯气凝胶/玻碳电极；然后将10μL浓度为5×10 ⁵ 细胞/ ml 的人肝癌细胞悬浮液滴加到叶酸/金钯@石墨烯量子点/石墨烯气凝胶/玻碳电极表面上，在37 ℃下孵育8 小时，然后浸入磷酸缓冲盐溶液中，去除未捕获的细胞；在电化学测量之前，修饰的电极在-0.2和0.6V之间DPV循环几次直到获得可重现的反应。

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